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Développement d’un modèle de ligament utéros-sacré en suspension chez le rat

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64311
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,3, 4
1Department of Chemical Engineering, University of Virginia, 2Electrophysiology Division, Abbott, 3Department of Biomedical Engineering, University of Virginia, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Division of Pelvic Medicine and Reconstructive Surgery, University of Virginia

Summary

Le prolapsus des organes pelviens affecte des millions de femmes dans le monde et pourtant, certaines interventions chirurgicales courantes ont des taux d’échec aussi élevés que 40%. L’absence de modèles animaux standard pour étudier cette condition entrave les progrès. Nous proposons le protocole suivant comme modèle pour la suspension du ligament utéro-sacré et les essais de traction in vivo .

Abstract

Le prolapsus des organes pelviens (POP) est un trouble courant du plancher pelvien (VFI) susceptible d’avoir un impact significatif sur la qualité de vie d’une femme. Environ 10% à 20% des femmes subissent une chirurgie de réparation du plancher pelvien pour traiter le prolapsus aux États-Unis. Les cas de VFI entraînent un coût annuel global de 26,3 milliards de dollars aux États-Unis seulement. Cette condition multifactorielle a un impact négatif sur la qualité de vie et pourtant les options de traitement n’ont fait que diminuer dans un passé récent. Une option chirurgicale courante est la suspension du ligament utéro-sacré (USLS), qui est généralement réalisée en apposant la voûte vaginale au ligament utéro-sacré dans le bassin. Cette réparation a une incidence de complications plus faible par rapport à celles avec une augmentation de maille, mais se distingue par un taux d’échec relativement élevé allant jusqu’à 40%. Compte tenu du manque de modèles animaux standard pour étudier le dysfonctionnement du plancher pelvien, il existe un besoin clinique urgent d’innovation dans ce domaine en mettant l’accent sur le développement de modèles animaux rentables et accessibles. Dans ce manuscrit, nous décrivons un modèle de LSU chez le rat impliquant une hystérectomie complète suivie d’une fixation de la voûte vaginale restante au ligament utéro-sacré. L’objectif de ce modèle est d’imiter la procédure effectuée sur les femmes pour pouvoir utiliser le modèle pour ensuite étudier des stratégies réparatrices qui améliorent l’intégrité mécanique de l’attachement ligamentaire. Il est important de noter que nous décrivons également le développement d’une procédure d’essai de traction in situ pour caractériser l’intégrité de l’interface à des moments choisis après une intervention chirurgicale. Dans l’ensemble, ce modèle sera un outil utile pour les futures études qui étudient les options de traitement pour la réparation des POP via USLS.

Introduction

Le prolapsus des organes pelviens (POP) est un trouble courant du plancher pelvien qui touche des millions de femmes dans le monde et qui peut avoir un impact significatif sur de nombreux aspects de la vie d’une femme, en particulier à l’âge de1 an. Notamment, environ 13% des femmes aux États-Unis subiront une intervention chirurgicale pour prolapsus ou incontinence urinaire2. Affection plus fréquente après la grossesse et l’accouchement, le prolapsus se caractérise par la descente des organes pelviens, principalement les différents compartiments du vagin et/ou de l’utérus, au-delà de leur position normale dans la cavité péritonéale. Cela entraîne des symptômes gênants de renflement ou de pression vaginale, d’intestin, de vessie et de dysfonction sexuelle, ainsi qu’une qualité de vie globalement réduite. Les autres facteurs de risque de POP comprennent l’obésité, le tabagisme, la toux chronique et la constipation3.

Chez les femmes en bonne santé, les organes du plancher pelvien sont soutenus par les muscles releveurs ani, les ligaments utéro-sacrés (LSU), les ligaments cardinaux, les attaches du tissu conjonctif à la paroi latérale pelvienne et les structures distales du corps périnéal 4,5. Les LSU sont parmi les structures de soutien apicales les plus importantes pour l’utérus et le vagin apical, et sont donc souvent utilisées dans la correction chirurgicale des POP (Figure 1). Le soutien structurel de l’USL provient du tissu conjonctif collagène dense dans la région sacrée qui se transforme en muscle lisse serré. En raison de ce gradient de composition, l’USL s’imbrique avec la musculature utérine et vaginale pour fournir un soutien solide aux organes pelviens 6,7. Dans la suspension du ligament utéros-sacré (USLS), les USL sont fixées à la voûte vaginale après une hystérectomie, restaurant le vagin et les structures environnantes à leur position anatomique dans le compartiment abdominal. Cependant, indépendamment d’une voie transvaginale ou laparoscopique, la procédure USLS est en proie à un taux d’échec relativement élevé allant jusqu’à 40% dans certaines études 8,9. Le taux de récurrence des symptômes de renflement vaginal gênants 5 ans après la réparation pour le prolapsus du compartiment apical, comme les LSU, était d’environ 40 % dans un vaste essai contrôlé randomisémulticentrique 9. Dans le même essai, le retraitement pour prolapsus récurrent à 5 ans était d’environ 10 %. Le mécanisme de ce taux d’échec élevé n’a pas été étudié, mais la restauration du vagin et des structures environnantes à leur position anatomique nécessite le placement de suture dans la région collagène dense de l’USL10,11 plutôt que dans la région musculaire lisse. Par conséquent, le taux d’échec élevé pourrait être dû à l’inadéquation mécanique et compositionnelle de l’interface vagin-USL formée chirurgicalement par rapport à l’intégration complète observée dans l’attachement col de l’utérus natif.

L’impact économique du traitement de ces troubles est également notable, avec environ 300 millions de dollars dépensés chaque année aux États-Unis pour les soins ambulatoires12, et plus de 1 milliard de dollars dépensés chaque année en coûts directs pour les interventions chirurgicales13. Malgré les vastes ressources économiques consacrées au traitement de ces affections, les complications découlant de nombreuses chirurgies de prolapsus restent décourageantes. Par exemple, les réparations du prolapsus apical à base de mailles de polypropylène, telles que la sacrocolpopexie, offrent des taux de réussite plus élevés que les réparations tissulaires natives14, mais au prix de complications potentielles telles que l’exposition aux mailles ou l’érosion. La FDA a reçu près de 3 000 plaintes liées à des complications de maillage entre 2008 et 2010 seulement. Cela a abouti à une ordonnance de la FDA d’arrêter la fabrication et la vente de tous les produits de mailles transvaginales pour POP en avril 201915. Par conséquent, il existe un fort besoin clinique de matériaux autres que le polypropylène et de modèles avec lesquels les tester, qui peuvent augmenter les réparations du prolapsus tissulaire natif et augmenter les taux de réussite par rapport aux techniques traditionnelles avec suture seule.

Depuis l’annonce de la FDA en 2019, la plupart des chirurgiens pelviens ont cessé d’utiliser des mailles placées par voie transvaginale pour les réparations du prolapsus, ce qui a incité les chercheurs à rechercher de nouvelles approches d’ingénierie tissulaire pour augmenter les réparations tissulaires natives16,17,18, comme avec les cellules stromales mésenchymateuses (CSM)9,20 . Avec ce changement d’orientation, il est urgent d’affiner les modèles animaux qui peuvent aider au développement de nouveaux matériaux; Le défi dans ce processus est d’équilibrer la pertinence clinique et le coût. À cette fin, les chercheurs en sciences fondamentales et cliniques qui étudient le prolapsus des organes pelviens ont tiré parti de plusieurs modèles animaux jusqu’à présent, notamment des rats, des souris, des lapins, des moutons, des porcs et des primates non humains19. Le processus d’identification d’un modèle animal optimal est difficile, car les humains sont bipèdes, n’ont pas de queue et ont un processus de naissance traumatisant par rapport aux autres espèces de mammifères20. Les porcs21 ont été utilisés pour simuler la sacrocolpopexie robotique, tandis que les moutons ont été utilisés pour simuler les réparations du prolapsus vaginal22. Ces modèles animaux, bien que cliniquement pertinents, sont limités en faisabilité par le coût et l’entretien. Des primates non humains ont été utilisés pour étudier la pathogenèse du prolapsus; Les singes-écureuils en particulier sont l’une des seules espèces autres que les humains à pouvoir développer un prolapsus spontané, ce qui en fait l’un des modèles animaux les plus pertinents20. Des primates non humains ont également été utilisés pour étudier des interventions chirurgicales gynécologiques telles que la sacrocolpopexie23 et la transplantation utérine24. À l’instar de leurs homologues ovins et porcins, la principale limite des primates non humains en tant que modèle animal de prolapsus est le coût de l’entretien, des soins et de la pension19.

Bien que le bassin du rongeur soit orienté horizontalement avec un rapport de taille de la tête au canal de naissance beaucoup plus faible que chez les humains19, les rats conviennent aux études sur les petits animaux de la chirurgie USLS car ils ont une anatomie, une cellularité, une architecture histologique et une composition matricielle similaires à celles de l’USL25 humaine. De plus, ils sont bénéfiques en termes d’entretien et d’embarquement. Malgré ces attributs bénéfiques, il n’y a pas de rapports publiés d’un modèle de réparation USLS chez le rat. Par conséquent, l’objectif est de décrire un protocole pour l’hystérectomie et l’USLS chez le rat de Lewis multipare. Ce protocole sera bénéfique pour les chercheurs qui visent à étudier la physiopathologie et les composantes chirurgicales des POP en utilisant ce modèle animal accessible.

Figure 1
Figure 1 : Prolapsus des organes pelviens. (A) L’orientation normale des organes dans la cavité péritonéale et (B) la descente dramatique des organes en cas de prolapsus. Après une hystérectomie, (C) la suspension du ligament utéros-sacré restaure le vagin et les structures environnantes à leur position anatomique appropriée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

Suivez toutes les lignes directrices du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC), en obtenant l’approbation pour toutes les procédures animales avant de commencer. Les exigences relatives à la technique de chirurgie aseptique peuvent être consultées dans le Guide26 et le Règlement sur le bien-être des animaux27. L’étude a été approuvée par le protocole 4332-11-20 du comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Virginie. Obtenir des reproductrices multipares (deux portées). Les rats devraient être logés dans un vivarium accrédité par l’American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care et recevoir de la nourriture et de l’eau ad libitum. Les animaux de cette étude étaient des rats Lewis obtenus de Charles River et étaient âgés de 4 à 6 mois pour répondre à l’exigence de deux portées. Les animaux ont été maintenus sur un cycle lumière-obscurité de 12 heures.

1. Réparation du prolapsus des organes pelviens par suspension du ligament utéro-sacré

  1. Préparation de l’équipement et de la zone chirurgicale pour la chirurgie des animaux vivants
    1. Préparez la zone chirurgicale de manière à ce que la planche chirurgicale soit chauffée à 37 °C à l’aide de coussins chauffants à eau chaude à recirculation et d’un tampon imperméable stérile. Assurez-vous de la stérilité de la carte chirurgicale et de la zone chirurgicale à l’aide d’un désinfectant de surface sans eau de Javel suivi d’une lingette à l’éthanol à 70%.
    2. Utilisez la stérilisation thermique en autoclave pour stériliser toutes les fournitures sécuritaires pour les autoclaves, y compris les instruments chirurgicaux, les éponges chirurgicales (gaze), les cotons-tiges et un champ jetable. Procurez-vous des gants chirurgicaux emballés stériles.
    3. Procurez-vous des tondeuses électriques, une pommade ophtalmique, des lingettes à l’éthanol, des cotons-tiges et une solution d’iode, ainsi qu’une lame et des sutures de scalpel emballées stériles, et placez-les sur l’établi.
  2. Préparation des animaux pour la chirurgie des animaux vivants
    1. Placez soigneusement l’animal dans une chambre d’anesthésie fournie avec 2% d’isoflurane et pesez l’animal après avoir atteint le plan d’anesthésie approprié. Une anesthésie adéquate est confirmée lorsque l’animal ne répond pas à un pincement d’orteil.
    2. Placez l’animal sur la planche chirurgicale en position couchée avec le nez solidement dans le cône d’anesthésie fourni avec 2% d’isoflurane. Appliquez une pommade ophtalmique sur chacun des yeux des animaux.
    3. Administrer un analgésique opioïde et un analgésique AINS par voie sous-cutanée (tableau des matières).
    4. Placer l’animal en décubitus dorsal, comme le montre la figure 2, et raser la fourrure abdominale depuis le processus xiphoïde jusqu’à l’orifice urétral (8 cm x 4 cm). Stérilisez l’abdomen avec trois charges d’iode et d’alcool pour préparer le site d’incision.
      REMARQUE: Si le rasage entraîne des saignements, obtenir une hémostase avec pression avant de préparer la peau avec de l’iode et un tampon de préparation à l’alcool. Maintenir l’iode sur la peau pendant 30 s.
    5. S’il n’y a pas d’assistant chirurgical disponible, déposez les fournitures et les instruments stériles sur un plateau d’instruments stérile, y compris des cotons-tiges stériles, des rideaux, des éponges (gaze), une lame chirurgicale, des sutures et un marqueur chirurgical (facultatif). Si un assistant chirurgical est disponible, cette étape peut être omise, et l’assistant peut fournir les instruments stériles après l’étape 1.3.1.
  3. Hystérectomie et suspension du ligament utéros-sacré (USLS)
    1. Enfilez une blouse chirurgicale, un couvre-chef, un masque et des gants stériles. Drapez l’animal avec un champ stérile, ne laissant que l’abdomen exposé.
    2. Faites une incision de 7 cm le long de la linea alba juste en dessous du processus xiphoïde jusqu’à la ligne inférieure du mamelon à l’aide d’une lame de scalpel. L’incision doit se terminer ~0,5-1,0 cm rostral de l’orifice urétral. Ensuite, faites une incision à travers la couche musculaire en dessous. Évitez le vaisseau sanguin de la paroi abdominale pour prévenir les saignements.
    3. Assemblez l’écarteur abdominal et inspectez la cavité abdominale (figure 3A). À l’aide d’une pince à iris, localisez doucement la corne utérine gauche. L’utérus est profondément à l’intérieur de l’intestin, qui est souvent la structure rencontrée pour la première fois en entrant dans la cavité péritonéale. Il est avantageux d’identifier d’abord l’ovaire (Figure 3B) et le coussinet graisseux ovarien associé.
    4. Élevez doucement la corne utérine gauche avec une pince de préhension ou de moustique et commencez l’hystérectomie en ligaturant la corne sous l’ovaire et l’oviducte à l’aide d’une pince anti-moustique. Les ovaires sont des structures délicates et sont facilement endommagés ou dévascularisés avec manipulation. Faites attention lorsque vous élevez les cornes utérines; Saisissez la corne à une distance sécuritaire de l’ovaire pour y parvenir.
    5. Continuez l’hystérectomie en serrant et en coupant le système vasculaire adjacent, le tissu conjonctif et la graisse de la corne utérine à l’aide de micro-ciseaux. Serrez le tissu conjonctif avant le retrait pour réduire les saignements. Placez les pinces aussi près que possible de l’interface utérine, jusqu’à la jonction utérocervicale (également appelée bifurcation de la corne).
    6. Serrez la corne utérine près du point de bifurcation à l’aide d’une pince anti-moustiques (figure 4A-C). Polir la corne ipsilatérale juste céphale à la pince pour éviter les saignements. Celui-ci est situé entre la jonction utéro-cervicale (juste rostrale au col de l’utérus) et le point de ligature utéro-tubaire. La voûte vaginale restera après l’hystérectomie (Figure 4D).
      REMARQUE: En raison du petit calibre des vaisseaux du rat, la ligature des moignons utérins avec une pince temporaire était suffisante pour cette chirurgie. Cependant, cette technique peut être modifiée au besoin avec le scellement des pédicules par électrocautérisation ou la ligature des sutures.
    7. Répétez les étapes 1.3.3-1.3.6 sur la corne utérine droite pour effectuer une hystérectomie totale.
    8. Ajustez l’écarteur abdominal pour exposer le bassin. Inspectez la voûte vaginale exposée et le plancher pelvien supporte les tissus ligamentaires et conjonctifs, qui peuvent être vus attachés au vagin et au col de l’utérus. Si possible, identifiez l’uretère bilatéralement, qui est juste médial aux ovaires.
    9. Identifier les ligaments utéro-sacrés28,29, illustrés à la figure 5A, qui se trouvent attachés au col de l’utérus juste en dessous des moignons restants des cornes utérines (voûte vaginale). Le ligament est tracé dans une orientation céphalade-médiale vers le sacrum.
    10. À l’aide d’une suture polydiaxanone 3-0 sur une petite aiguille effilée, placez un point de suture à travers le ligament utéro-sacré gauche. Placez le point haut sur le ligament, près du sacrum.
    11. Tirez sur le point pour vous assurer qu’il a capturé le ligament utéro-sacré - la structure USL s’insère dans le col de l’utérus avec l’origine plongeant derrière le rectum où il se fixe au sacrum. Encore une fois, identifiez l’uretère pour vous assurer qu’il n’a pas été incorporé ou plié avec le point utéro-sacré.
    12. Ensuite, passez le point de polydiaxanone gauche à travers la face gauche de la voûte vaginale (Figure 5B), en prenant soin d’incorporer les aspects antérieur et postérieur de la coiffe vaginale. Répétez les étapes pour terminer la procédure USLS sur le côté droit. Plusieurs points de suture peuvent être placés bilatéralement, si vous le souhaitez.
    13. Une fois que les points utéro-sacrés sont placés bilatéralement, attachez solidement la suture à l’aide d’un nœud carré, comme le montre la figure 5C, de sorte que la voûte vaginale soit élevée céphalade vers le sacrum; Cela complète la suspension du ligament utéros-sacré.
  4. Fermeture de la plaie chirurgicale
    1. Replacez le contenu abdominal dans sa position anatomique dans la cavité péritonéale. Fermer les couches profondes de la paroi abdominale (péritoine, fascia, muscle) avec un schéma de suture continu de 4-0 à 6-0 polyglactin 910 ou une suture polydiaxanone.
    2. Fermez la peau avec un point sous-cuticulaire courant (ou interrompu) de 4-0 à 6-0 polydiaxanone ou polyglactin 910. Administrer un antibiotique par voie sous-cutanée au besoin pour la prophylaxie des infections du site opératoire.
    3. Effectuer une surveillance post-chirurgicale jusqu’à ce que l’animal ait repris suffisamment conscience pour maintenir une position couchée sternale. Ne retournez pas l’animal dans un logement social avant d’être complètement rétabli.

Figure 2
Figure 2 : Préparation de l’animal pour la chirurgie vivante. L’enlèvement de la fourrure de la zone entourant le site d’incision est nécessaire pour une technique aseptique appropriée. La zone indiquée dans les panneaux (A) et (B) sont des lignes directrices. Les chercheurs devraient enlever suffisamment de poils pour que les instruments stériles n’entrent pas en contact avec les cheveux pendant la chirurgie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Préservation des ovaires. Les cornes utérines ne sont généralement pas visibles lorsque l’abdomen est ouvert pour la première fois, comme indiqué en (A). Une fois qu’une corne est localisée et suivie pour trouver (B) l’ovaire et l’oviducte où ils se connectent à la corne, le sommet de la corne peut être serré et la corne séparée pour commencer l’hystérectomie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Ablation des cornes utérines. L’hystérectomie chez le rat implique (A) les deux cornes utérines (B) serrées à la jonction utérocervicale et (C) excisées. La voûte vaginale de chaque corne reste avec le moignon cervical/utérin (flèche) (D) qui les relie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Suspension du ligament utéro-sacré. (A) Orientation des ligaments utéro-sacrés par rapport aux structures de la voûte vaginale créées. Lors de la mise en place de sutures pour la réparation de la suspension du ligament utéro-sacré (USLS), (B) les sutures capturent le ligament utéro-sacré et passent ensuite à travers les aspects antérieur et postérieur de la coiffe vaginale. (C) Fixée au ligament utéro-sacré, la voûte vaginale est maintenant élevée céphalad vers le sacrum. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Essai de traction uniaxial

REMARQUE : Le système d’essai et le logiciel utilisés ont été utilisés conformément aux directives du fabricant pour l’étalonnage et les essais. Tous les essais ont eu lieu à 22 °C.

  1. Préparation des échantillons
    1. Euthanasier le rat en utilisant une procédure pharmacologique approuvée par l’IACUC. Assurer la mort par une méthode physique secondaire. Ici, l’inhalation de CO2 a été utilisée suivie d’une ponction cardiaque. Exposer la voûte vaginale en vue des essais mécaniques de traction. Dans la présente étude, effectuer des essais de traction sur les ligaments utéro-sacrés natifs (témoin), ainsi que sur les animaux ayant subi une suspension du ligament utéro-sacré comme décrit ci-dessus (POP).
    2. Tester les ligaments in situ 24 semaines après la chirurgie. Un délai terminal d’au moins 8 semaines est suggéré pour permettre la réabsorption complète des sutures.
      1. Après une euthanasie sans cruauté, faites une incision le long de la linea alba pour exposer l’abdomen.
      2. Commencez à disséquer le tissu adipeux jusqu’à ce que la voûte vaginale soit visible. Continuer à disséquer les coussinets graisseux abdominaux jusqu’à ce que les LSU intactes soient clairement visibles (animaux témoins, figure 6A) ou que la jonction entre le ligament utéro-sacré et la voûte vaginale soit visible (animaux POP, figure 6C). Soyez prudent de ne pas tirer sur la jonction pour enlever le tissu adipeux, mais plutôt d’utiliser des coupes soigneuses avec des micro-ciseaux pour maintenir la cohérence entre les échantillons.
      3. À l’aide d’une règle flexible, mesurez la distance entre l’insertion utéro-sacrée (postérieure au rectum) et la voûte vaginale. Cette valeur est la longueur originale du tissu.
        REMARQUE : La longueur originale du tissu, la longueur de la jauge, pour les LSU témoins mesurait 13,4 ± 0,5 mm, tandis que la longueur de la jauge pour la réparation des LSU mesurait 12,8 ± 0,4 mm.
      4. Enfiler le ruban ombilical derrière la LSU intacte (témoin, figure 6B) ou la jonction USLS (POP, figure 6D) de sorte que le tissu soit centré sur le ruban ombilical. Mesurez la hauteur et la largeur du tissu à l’endroit où il croise le ruban ombilical à l’aide d’étriers numériques. Ces valeurs seront utilisées pour calculer la section transversale.
      5. Fixez une grande plaque de compression (table des matériaux) à l’aide de l’adaptateur de base et placez l’animal sur le dessus de manière à ce que le spécimen soit centré sous le porte-poignée.
  2. Essais de traction
    1. Programmez le régime d’essai de traction dans le logiciel : précharge, préconditionnement, traction vers la défaillance. Cela fait suite aux protocoles précédents d’essais mécaniques du plancher pelvien29 et du tissu reproducteur30 .
    2. Installer l’instrument en préparation des essais de traction. Pour l’étude actuelle, utilisez un capteur de pesage de 10 N, une poignée imprimée en 3D et un adaptateur de base pour fixer une plaque de compression, comme illustré à la figure 7.
      REMARQUE : Toute configuration de base pouvant supporter la taille totale de l’animal est acceptable. Utilisez n’importe quelle poignée qui peut maintenir solidement la bande ombilicale. Un support et une poignée personnalisés imprimés en 3D provenant d’études précédentes31,32 ont été utilisés dans ces tests. Les fichiers STL ont été inclus en tant que fichiers supplémentaires.
      1. Placez l’animal de manière à ce que le spécimen soit centré sous la poignée (figure 8A). Immobiliser la région pelvienne entourant le spécimen en fixant l’animal à la plaque (figure 8B).
      2. Abaissez le capteur de pesage de manière à ce que les queues du ruban ombilical atteignent facilement la poignée. Fixez le ruban ombilical dans la poignée, en laissant le ruban mou pour éviter la manipulation de l’échantillon.
    3. Ouvrez le test de préconditionnement dans l’interface du logiciel et étiquetez le test avec le nom de l’échantillon. Assurez-vous que la méthode de préconditionnement comprend l’étape de préchargement.
    4. Cliquez pour lancer le test de préconditionnement, qui préchargera l’échantillon à 0,015 N. Une fois que la force de précharge est stable, l’essai préconditionne l’échantillon à un taux d’allongement de 0,1 mm/s pendant 30 s. Laissez le tissu reposer pendant 1 min. En attendant, chargez le régime de test d’extraction vers défaillance.
      NOTE: La force de précharge peut varier en fonction des limites de l’instrument et des conditions d’essai. Se référer à des études antérieures où la précharge rapportée varie de 0,015 N à 0,1 N 29,33,34,35,36.
    5. Ouvrez le régime de test programmé pour tirer vers l’échec. Étiquetez le test avec le nom de l’échantillon et cliquez sur OK pour passer à la fenêtre suivante. Entrez la longueur de jauge de l’échantillon, puis cliquez sur Suivant pour passer à la page de test.
    6. Équilibrez le tout et cliquez sur Démarrer. Laisser l’essai fonctionner à une vitesse d’allongement de 0,1 mm/s jusqu’à ce que le tissu ait été retiré jusqu’à ce que le tissu ait été arraché. L’essai produira des données sur le déplacement de la charge.
  3. Calcul de la contrainte, de la déformation et du module pour les essais de traction
    1. À l’aide des données de déplacement de charge, de la section transversale et de la longueur du gabarit de l’échantillon, calculer la contrainte (MPa) et la déformation (%) comme indiqué précédemment 37,38,39,40,41. Utilisez les équations 1 et 2 ci-dessous. Notez que l’étirement de la bande pendant l’essai doit également être pris en compte dans ces calculs.
      Equation 1     Équation 1
      Equation 2     Équation 2
      1. À partir de la courbe charge-déplacement (figure 9A,D), calculer la rigidité (pente linéaire, N/mm) et la charge ultime. À partir de la courbe de contrainte et de déformation, calculer le module tangent (pente linéaire, MPa) et la contrainte ultime. La région linéaire de la courbe contrainte-déformation est notée à la figure 9B,E avec le module tangent calculé à partir de cette région représenté à la figure 9C,F pour les deux groupes expérimentaux.
        REMARQUE: Pour le module de rigidité et de tangente, identifiez la partie linéaire en choisissant une fenêtre de points qui maximise la valeur R2 pour une régression linéaire37,41.

Figure 6
Figure 6: Préparation de l’échantillon pour l’essai de traction uniaxiale. (A) Les LSU témoins exposés avant (B) que le ruban ombilical soit enfilé derrière le tissu. (C) jonction de la voûte vaginale USL après dissolution complète des sutures avec (B) la bande ombilicale enfilée derrière le tissu en préparation de l’essai de traction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Le système d’essais mécaniques. (A) Le système d’essai en mode d’essai de traction utilisé avec (B) support imprimé en 3D et (C) poignée d’échantillon imprimée en 3D avec une bande texturée pour améliorer l’adhérence. Configuration des pièces indiquées dans le panneau (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8: Mise en place de l’essai de traction . (A) L’échantillon est centré sous la poignée et le support. (B) L’animal et les tissus entourant l’échantillon sont maintenus immobiles avant le début de l’essai de traction. Comme le montre l’image en médaillon, la sécurisation du tissu environnant est essentielle pour isoler le tissu d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9: Exemple de sortie et d’analyse des données d’essai de traction. (A) La courbe charge-déplacement pour un échantillon témoin suivie (B) de l’analyse de la déformation sous contrainte et (C) de la pente de l’équation d’ajustement de la courbe linéaire montrant le module tangent en MPa. (D-F) montre le même processus pour un échantillon USLS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Representative Results

Faisabilité chirurgicale et mise en place de suture utéro-sacrée
Il n’y avait aucune complication peropératoire liée à l’hystérectomie ou à la suspension du ligament utéro-sacré chez aucun des animaux. Il y a eu peu de saignements lors de l’ablation des cornes utérines, à condition que le système vasculaire adjacent soit serré avant le retrait. Des saignements limités ont permis une bonne visualisation des ligaments utéro-sacrés pour la mise en place des points de suture et ont empêché les lésions peropératoires de l’intestin, du rectum, de l’urétéral ou de la vessie. Après la mise en place des sutures, la jonction nouvellement formée USL-voûte vaginale a empêché le mouvement du moignon cervical/utérin, comme le montre la figure 5C. Au cours des trois premiers jours postopératoires, les animaux ont été contrôlés quotidiennement, puis toutes les deux semaines jusqu’à la fin de l’expérience. Avec les analgésiques opioïdes et AINS à libération prolongée administrés au moment de la chirurgie, des analgésiques supplémentaires ont été jugés inutiles. D’après notre expérience avec 16 chirurgies animales (n = 8 pour les groupes témoin et USLS), une perte de poids devrait être attendue au cours de la première semaine suivant la chirurgie avec une perte moyenne de 5,7 ± 1,4% du poids du jour de la chirurgie. Comme prévu, les rats ont lentement pris du poids au cours des 23 semaines suivantes, avec un gain de poids moyen de 15,1 ± 4,5% au cours de l’expérience.

Essais mécaniques de la réparation de l’USLS
Pour démontrer la fonctionnalité de la réparation de l’USLS, des essais de traction uniaxiaux ont été effectués. Après l’euthanasie de l’animal au moment postopératoire choisi, 24 semaines dans cette étude, la zone chirurgicale doit être soigneusement disséquée pour visualiser la jonction de la voûte vaginale USL, comme le montre la figure 6A. Comparée à d’autres méthodologies pour tester les LSU du rat avec d’autres structures de soutien et organes pelviens29,42, la méthode décrite ici est la première à tester la LSU du rat de manière isolée. Le ruban ombilical utilisé dans cette étude a été stratégiquement choisi pour sa flexibilité, car la conformité du ruban permettait une perturbation minimale du tissu pendant la préparation des essais de traction. Les données sur le déplacement de la charge doivent donc être ajustées pour tenir compte de la faible quantité d’étirement apportée par la bande ombilicale. La figure 9 fournit un exemple de données obtenues par essai de traction et la figure 9A fournit un exemple de diagramme contrainte-déformation typique. La communication des données sur le stress et la déformation est recommandée, car cette information est normalisée et indépendante de la taille des échantillons34 et peut être mieux comparée d’une étude à l’autre. Pour le ligament utéro-sacré intact, nous rapportons des propriétés structurelles telles que la charge ultime (2,9 ± 0,5 N) et la rigidité (0,4 ± 0,1 N/mm) ainsi que des propriétés normalisées du matériau telles que la contrainte ultime (2,1 ± 0,4 MPa), la déformation ultime (1,6 ± 0,5) et le module tangent (4,0 ± 1,1 MPa). Dans les tests uniaxiaux effectués sur les organes reproducteurs du rat et toutes leurs connexions tissulaires de soutien par Moalli et al., ils ont signalé une charge ultime à la défaillance (13,2 ± 1,1 N) et une rigidité (2,9 ± 0,9 N/mm) supérieures à l’USL29 isolée. Les travaux effectués par Moalli et al. et d’autres ouvrages34,35 mentionnent la grande variabilité entre les spécimens testés, comme le montrent les données présentées ici. Pour la réparation de la suspension du ligament utéro-sacré, nous avons constaté que toutes les propriétés structurelles du matériau (rigidité, 0,33 ± 0,13 N/mm; charge ultime, 2,6 ± 1,3 N) et les propriétés normalisées du matériau (contrainte ultime, 1,8 ± 0,7 MPa; déformation ultime 1,3 ± 0,3; module tangent, 3,0 ± 0,9 MPa) étaient inférieures à celles de la LSU native.

Discussion

Le protocole se distingue par plusieurs avantages. À notre connaissance, il s’agit de la première description publiée de l’USLS dans le modèle du rat et fournira aux futurs chercheurs des étapes reproductibles pour effectuer cette procédure dans le cadre de la recherche. Deuxièmement, nous incluons un nouveau protocole pour les essais de traction de l’interface native et chirurgicale de l’USL. Le protocole d’essai de traction pourrait être utilisé dans des études similaires qui étudient de nouvelles approches d’ingénierie tissulaire pour augmenter les réparations tissulaires natives telles que USLS. De plus, le modèle de rat lui-même est utile pour l’étude des troubles du plancher pelvien en raison de la facilité de manipulation / embarquement, de la courte durée de vie et de la rentabilité par rapport aux modèles animaux plus grands. Les limites du protocole comprennent l’incapacité d’évaluer l’une des principales complications de l’USLS, le pliage urétéral. Malgré cela, nous n’avons eu aucun cas de lésion urétérale présumée dans cette étude. Une autre considération est que l’orientation horizontale du bassin, le petit rapport tête-canal natal fœtal et l’absence de prolapsus spontané dans le modèle de rat limitent une certaine applicabilité des résultats aux humains. Cependant, l’utilisation de rats multipares est une force de cette étude car elle représente le principal facteur de risque dans le développement du POP3.

L’établissement d’un protocole efficace pour l’hystérectomie et l’USLS chez le rat de Lewis sera un outil utile pour les futurs chercheurs qui étudieront les composants chirurgicaux des POP, tout en minimisant la variabilité dans les tests du comportement mécanique de l’USL. Les modèles chirurgicaux animaux sont bénéfiques en ce sens qu’ils permettent aux chercheurs de concevoir des expériences cliniquement pertinentes qui tiennent compte de la parité, de la masse corporelle, de la maladie et de la nutrition34 tout en atténuant le risque éthique de l’étude initiale chez l’homme. De plus, les modèles normalisés pour les POP permettent aux chercheurs de contourner les limites de la collecte de tissus humains. En particulier, les méthodes d’essai de traction décrites dans ce protocole permettront une cohérence entre les études. Des modèles de rongeurs précédents ont testé les propriétés mécaniques de toute la région pelvienne, qui comprend le col de l’utérus, le vagin et les multiples ligaments de soutien pelvien29,42. Les méthodes décrites ici permettent de mesurer la LSU d’une manière qui maintient les attaches vertébrales et cervicales natives. Il convient de noter que les méthodes d’essai de traction n’évaluent pas la LSU seule, mais plutôt la LSU en combinaison avec son insertion au niveau du sacrum et du col de l’utérus. C’est une force de l’étude car elle reflète les forces in situ habituelles auxquelles le ligament est soumis. Nous reconnaissons que le comportement mécanique du ligament isolé serait différent s’il était testé ex vivo sans ses attaches natives. Cela est d’autant plus vrai que les structures des rats sont petites et limitent la faisabilité du prélèvement d’un échantillon adapté aux tests ex vivo. Les LSU font l’expérience du chargement dans plusieurs directions in situ, de sorte que la nature uniaxiale de l’essai est une limitation, mais l’utilisation de cette méthode permet des comparaisons significatives entre les études antérieures sur la mécanique des LSU chez le rat29,42. Bien qu’il n’existe actuellement aucun protocole d’essai mécanique standard largement accepté, ce modèle sera un outil utile pour les futures études d’ingénierie tissulaire sur le terrain.

Plusieurs étapes décrites dans ce protocole sont essentielles à la santé et au bien-être des animaux ainsi qu’à la reproductibilité de la chirurgie USLS et des essais de traction ultérieurs. Tout d’abord, il est essentiel d’obtenir à la fois l’analgésique et les anti-inflammatoires décrits car l’analgésique seul s’est avéré inadéquat pour la gestion de la douleur. L’antibiotique prophylactique diminue le risque d’infection du site opératoire et constitue la norme de soins en chirurgie humaine. En ce qui concerne la procédure chirurgicale USLS, éviter les dommages aux ovaires et minimiser la perte de sang sont essentiels pour une chirurgie réussie. Les étapes 1.3.3 et 1.3.4 décrivent la séparation du sommet de la corne utérine de l’ovaire adjacent; Des précautions doivent être prises pour maintenir cette dissection sur le côté de la corne utérine afin d’éviter la perturbation des vaisseaux délicats autour de l’ovaire, ce qui peut entraîner des saignements excessifs. Il est à noter que d’autres chercheurs ont montré que la fonction ovarienne est préservée après l’ablation des cornes utérines43. De plus, si les ovaires sont perturbés ou enlevés, l’architecture globale des fibrilles de collagène sera perturbée, altérant les propriétés mécaniques de ses tissus44,45. Une fois que la corne utérine est séparée en toute sécurité de l’ovaire, il y a un plan de dissection clair permettant d’isoler la corne utérine des coussinets graisseux environnants et du système vasculaire. Malgré le plan de dissection clair, les pédicules le long de la corne utérine doivent être fixés avec une pince avant la transsection avec des micro-ciseaux. Contrairement à la pratique chirurgicale chez l’homme, nous avons constaté que la ligature des pédicules d’hystérectomie n’est pas nécessaire, car le serrage du pédicule avant la transsection assure une hémostase adéquate. L’étape 1.3.6 du protocole décrit ce processus minutieux pour minimiser les pertes de sang. Au cours de l’hystérectomie, il faut prendre grand soin d’identifier les uretères comme mentionné aux étapes 1.3.6 et 1.3.8. Il est essentiel de comprendre la proximité anatomique de l’uretère, car l’une des complications les plus courantes associées aux LSU chez les humains est la lésion urétérale46.

En conclusion, nous présentons un nouveau protocole pour effectuer une hystérectomie, une suspension ligamentaire utéro-sacrée et des tests de traction de la LSU dans un modèle de rat. Nous prévoyons que nos résultats aideront les futurs chercheurs en sciences fondamentales en fournissant une description claire et reproductible de ces procédures et permettront ainsi de faire progresser la recherche sur le prolapsus des organes pelviens.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions le professeur Silvia Blemker pour l’utilisation de son Instron et le professeur George Christ pour l’utilisation de son espace chirurgical ainsi que du support et de la poignée imprimés en 3D. Ce travail a été soutenu par le partenariat de recherche translationnelle UVA-Coulter et le DoD (W81XWH-19-1-0157).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol prep pad BD 326895
Artificial Tear Ointment American Health Service Sales Corp PH-PARALUBE-O
Bluehill software Instron Bluehill 3
Cavicide 1 disinfectant Fisher Scientific 22 998 800
Compression platean Instron 2501-163
Cotton swabs Puritan Medical 806-WC
Gauze Sponge, 8-Ply VWR 95038-728
Mosquito Forceps Medline Industries MMDS1222115
Needle Holder Medline Industries DYND04045
Operating Scissors, 5½", Sharp American Health Service Sales Corp 4-222
Opioid Analgesic (Buprenorphine XR) Fidelis Animal Health Ethiqa XR 0.65 mg/kg SC Q72
NSAID Analgesic (Meloxicam SR) Wildlife Pharmaceuticals, LLC Meloxicam SR 1 mg/kg SC q72
PDS II, 3-0 Polydioxanone Suture, SH-1 Ethicon Z316H
PDS II, 5-0 P olydioxanone Suture, RB-1 Ethicon Z303H
Retractor Medline Industries MDS1862107
Scalpel Blade Stainless Surgical #10 Miltex 4-310
Scalpel Handle Medline Industries MDS15210
Scissor, Micro, Curved, 4.5" Westcott MDS0910311
Single Column Universal Testing System Instron 5943 S3873 1 kN force capacity, 10 N load cell
Sterile Natural Rubber Latex Gloves Accutech 91225075
Suture,Vicryl,6-0,P-3 Ethicon J492G
Tape,Umbilical,Cotton,1/8X18" Ethicon U10T
Tension and Compression Load Cell Instron 2530-10N 10N load cell (1 kgf, 2 lbf)
Veterinary surgical adhesive (skin glue) Covetrus 31477

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Médecine numéro 186 rat mécanique tissulaire plancher pelvien utérus chirurgie
Développement d’un modèle de ligament utéros-sacré en suspension chez le rat
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Miller, B. J., Jones, B. K., Turner, … More

Miller, B. J., Jones, B. K., Turner, J. S., Caliari, S. R., Vaughan, M. H. Development of a Uterosacral Ligament Suspension Rat Model. J. Vis. Exp. (186), e64311, doi:10.3791/64311 (2022).

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