Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Udvikling af en uterosacral ligament suspension rottemodel

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64311
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,3, 4
1Department of Chemical Engineering, University of Virginia, 2Electrophysiology Division, Abbott, 3Department of Biomedical Engineering, University of Virginia, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Division of Pelvic Medicine and Reconstructive Surgery, University of Virginia

Summary

Bækkenorganprolaps påvirker millioner af kvinder verden over, og alligevel har nogle almindelige kirurgiske indgreb fejlrater så høje som 40%. Manglen på standarddyremodeller til at undersøge denne tilstand hindrer fremskridt. Vi foreslår følgende protokol som model for uterosacral ligamentsuspension og in vivo trækprøvning.

Abstract

Bækkenorganprolaps (POP) er en almindelig bækkenbundsforstyrrelse (PFD) med potentiale til at påvirke en kvindes livskvalitet betydeligt. Ca. 10% -20% af kvinderne gennemgår bækkenbundsreparationskirurgi til behandling af prolaps i USA. PFD-sager resulterer i en samlet årlig omkostning på 26,3 milliarder dollars alene i USA. Denne multifaktorielle tilstand har en negativ indvirkning på livskvaliteten, og alligevel er behandlingsmulighederne kun svundet ind i den seneste tid. En almindelig kirurgisk mulighed er uterosacral ligament suspension (USLS), som typisk udføres ved at fastgøre vaginal hvælving til uterosacral ligament i bækkenet. Denne reparation har en lavere forekomst af komplikationer sammenlignet med dem med mesh-forstørrelse, men er kendt for en relativt høj fejlrate på op til 40%. I betragtning af manglen på standard dyremodeller til at studere bækkenbundsdysfunktion er der et presserende klinisk behov for innovation på dette område med fokus på at udvikle omkostningseffektive og tilgængelige dyremodeller. I dette manuskript beskriver vi en rottemodel af USLS, der involverer en komplet hysterektomi efterfulgt af fiksering af den resterende vaginale hvælving til det uterosakrale ledbånd. Målet med denne model er at efterligne proceduren udført på kvinder for at kunne bruge modellen til derefter at undersøge reparative strategier, der forbedrer den mekaniske integritet af ledbåndfastgørelsen. Det er vigtigt, at vi også beskriver udviklingen af en in situ trækprøvningsprocedure for at karakterisere grænsefladeintegritet på valgte tidspunkter efter kirurgisk indgreb. Samlet set vil denne model være et nyttigt værktøj til fremtidige undersøgelser, der undersøger behandlingsmuligheder for POP-reparation via USLS.

Introduction

Bækkenorganprolaps (POP) er en almindelig bækkenbundsforstyrrelse, der påvirker millioner af kvinder verden over med potentiale til at påvirke mange aspekter af en kvindes liv betydeligt, især medalderen 1. Især vil ca. 13% af kvinderne i USA blive opereret for prolaps eller urininkontinens2. En tilstand mest almindelig efter graviditet og fødsel, prolaps er karakteriseret ved nedstigning af bækkenorganer, overvejende de forskellige rum i vagina og / eller livmoder, ud over deres normale position i bughulen. Dette fører til generende symptomer på vaginal bule eller tryk, tarm, blære og seksuel dysfunktion og generelt nedsat livskvalitet. Andre risikofaktorer for POP omfatter fedme, tobaksbrug, kronisk hoste og forstoppelse3.

Hos raske kvinder understøttes bækkenbundsorganerne af levator ani-musklerne, uterosakrale ledbånd (USL'er), kardinalbånd, bindevævsfastgørelser til bækkenets sidevæg og perineallegemets distale strukturer 4,5. USL'erne er blandt de vigtigste apikale understøttende strukturer for både livmoderen og apikal vagina og bruges derfor ofte til kirurgisk korrektion af POP (figur 1). Strukturel støtte fra USL stammer fra det tætte kollagenøse bindevæv i det sakrale område, der overgår til tæt pakket glat muskel. På grund af denne sammensætningsgradient bliver USL sammenvævet med livmoder- og vaginalmuskulaturen for at give robust støtte til bækkenorganerne 6,7. I den uterosacral ligamentsuspension (USLS) er USL'erne fastgjort til vaginalhvelvet efter en hysterektomi, hvilket genopretter vagina og de omgivende strukturer til deres anatomiske position i abdominalrummet. Uanset en transvaginal eller laparoskopisk rute er USLS-proceduren imidlertid plaget af en relativt høj fejlrate på op til 40% i nogle undersøgelser 8,9. Gentagelseshastigheden af generende vaginale bulesymptomer 5 år efter reparation for apikal rumprolaps, såsom USL'er, var ca. 40% i et stort randomiseret kontrolleret multicenterforsøg9. I samme studie var genbehandling for recidiverende prolaps efter 5 år ca. 10%. Mekanismen bag denne høje fejlrate er ikke blevet undersøgt, men genopretning af vagina og de omgivende strukturer til deres anatomiske position kræver suturplacering i den tætte kollagenøse region af USL10,11 snarere end den glatte muskelregion. Derfor kan den høje fejlrate skyldes den mekaniske og sammensætningsmæssige uoverensstemmelse mellem den kirurgisk dannede vagina-USL-grænseflade sammenlignet med den komplette integration, der ses i den oprindelige cervikal-USL-vedhæftning.

Den økonomiske virkning af behandling af disse lidelser er også bemærkelsesværdig, med ca. 300 millioner dollars brugt årligt i USA på ambulant pleje12 og mere end 1 milliard dollars brugt årligt i direkte omkostninger til kirurgiske procedurer13. På trods af de enorme økonomiske ressourcer, der er afsat til behandling af disse tilstande, forbliver komplikationerne som følge af mange prolapsoperationer nedslående. For eksempel tilbyder polypropylennetbaserede apikale prolapsreparationer, såsom sacrocolpopexy, højere succesrater sammenlignet med indfødte vævsreparationer14, men på bekostning af potentielle komplikationer såsom maskeeksponering eller erosion. FDA modtog næsten 3.000 klager relateret til mesh komplikationer mellem 2008 og 2010 alene. Dette kulminerede i en ordre fra FDA om at standse fremstilling og salg af alle transvaginalt placerede mesh-produkter til POP i april 201915. Derfor er der et stærkt klinisk behov for andre materialer end polypropylen og modeller til at teste dem med, der kan øge reparationer af indfødt vævsprolaps og øge succesraten sammenlignet med traditionelle teknikker med sutur alene.

Siden FDA-meddelelsen i 2019 er de fleste bækkenkirurger stoppet med at bruge transvaginalt placeret mesh til prolapsreparationer, hvilket får efterforskere til at søge nye vævstekniske tilgange til at øge indfødte vævsreparationer16,17,18 såsom med mesenkymale stromale celler (MSC'er)9,20 . Med dette skift i fokus er der et presserende behov for forfining af dyremodeller, der kan hjælpe med udvikling af nye materialer; Udfordringen i denne proces er at afbalancere klinisk relevans med omkostninger. Til dette formål har grundvidenskab og kliniske efterforskere, der studerer bækkenorganprolaps, hidtil draget fordel af flere dyremodeller, herunder rotter, mus, kaniner, får, svin og ikke-menneskelige primater19. Processen med at identificere en optimal dyremodel er udfordrende, da mennesker er tobenede, ikke har nogen hale og har en traumatisk fødselsproces sammenlignet med andre pattedyrarter20. Svin21 er blevet brugt til at simulere robotsacrocolpopexy, mens får er blevet brugt til at simulere vaginale prolapsreparationer22. Disse dyremodeller, selvom de er klinisk relevante, er begrænset i gennemførlighed af omkostninger og vedligeholdelse. Ikke-menneskelige primater er blevet anvendt til at undersøge patogenesen af prolaps; Især egernaber, er en af de eneste andre arter end mennesker, der kan udvikle spontan prolaps, hvilket gør dem til en af de mest relevante dyremodeller20. Ikke-menneskelige primater er også blevet brugt til at studere gynækologiske kirurgiske procedurer såsom sacrocolpopexy23 og livmodertransplantation24. I lighed med deres fåre- og svinekolleger er den primære begrænsning af ikke-menneskelige primater som en dyremodel for prolaps omkostningerne ved vedligeholdelse, pleje og boarding19.

Selvom gnaverbækkenet er orienteret vandret med et meget mindre forhold mellem hoved og fødselskanal sammenlignet med mennesker19, er rotter velegnede til smådyrsundersøgelser af USLS-kirurgi, da de har lignende USL-anatomi, cellularitet, histologisk arkitektur og matrixsammensætning sammenlignet med den menneskelige USL25. Desuden er de gavnlige med hensyn til vedligeholdelse og boarding. På trods af disse gavnlige egenskaber er der ingen offentliggjorte rapporter om en rottemodel af USLS-reparation. Derfor er målet at beskrive en protokol for hysterektomi og USLS i den multiparøse Lewis-rotte. Denne protokol vil være gavnlig for efterforskere, der sigter mod at studere patofysiologi og kirurgiske komponenter i POP ved hjælp af denne tilgængelige dyremodel.

Figure 1
Figur 1: Prolaps af bækkenorganer . (A) Den normale orientering af organer i bughulen og (B) den dramatiske organnedtrapning, når prolaps opstår. Efter hysterektomi, (C) uterosacral ligament suspension genopretter vagina og omgivende strukturer til deres rette anatomiske position. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

Følg alle IACUC-retningslinjerne (Institutional Animal Care and Use Committee), og opnå godkendelse til alle dyreforsøg, inden du begynder. Krav til aseptisk kirurgi teknik kan findes i Guide26 og Animal Welfare Regulations27. Undersøgelsen blev godkendt af University of Virginia Institutional Animal Care and Use Committee protokolnummer 4332-11-20. Få multiparous (to kuld) kvindelige opdrættere. Rotter bør parres i et vivarium, der er akkrediteret af American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care og forsynet med mad og vand ad libitum. Dyrene i denne undersøgelse var Lewis-rotter opnået fra Charles River og var mellem 4 og 6 måneder gamle for at imødekomme kravet om to kuld. Dyrene blev opretholdt på en 12 timers lys-mørk cyklus.

1. Reparation af bækkenorganprolaps ved hjælp af uterosacral ligamentsuspension

  1. Udstyr og kirurgisk områdeforberedelse til levende dyrekirurgi
    1. Forbered det kirurgiske område således, at operationspladen opvarmes til 37 °C ved hjælp af recirkulerende varmtvandsopvarmningspuder sammen med en steril vandtæt pude. Sørg for sterilitet af operationspladen og det kirurgiske område ved hjælp af et blegemiddelfrit overfladedesinfektionsmiddel efterfulgt af 70% ethanolserviet.
    2. Brug autoklavevarmesterilisering til at sterilisere alle autoklavesikre forsyninger, herunder kirurgiske instrumenter, kirurgiske svampe (gasbind), vatpinde og en engangsgardin. Få sterile emballerede kirurgiske handsker.
    3. Få elektriske klippere, oftalmisk salve, ethanolservietter, vatpinde og jodopløsning sammen med sterilt pakket skalpelblad og suturer, og læg dem på arbejdsbænken.
  2. Dyreforberedelse til levende dyr kirurgi
    1. Anbring forsigtigt dyret i et anæstesikammer, der leveres med 2% isofluran, og vej dyret, når det rette anæstesiplan er nået. Korrekt bedøvelse bekræftes, når dyret ikke reagerer på en tåklemme.
    2. Placer dyret på operationsbrættet i den udsatte position med næsen sikkert i anæstesikeglen, der leveres med 2% isofluran. Påfør oftalmisk salve på hvert af dyrenes øjne.
    3. Administrer opioide analgetika og NSAID smertestillende subkutant (materialetabel).
    4. Placer dyret i liggende stilling, som vist i figur 2, og barber mavepelsen fra xiphoidprocessen ned til urinrørsåbningen (8 cm x 4 cm). Steriliser maven med tre ladninger jod og alkohol for at forberede snitstedet.
      BEMÆRK: Hvis barbering resulterer i blødning, skal du opnå hæmostase med tryk, inden du forbereder huden med jod og alkoholforberedelsespude. Oprethold jod på huden i 30 s.
    5. Hvis der ikke er nogen kirurgisk assistent til rådighed, skal du deponere sterile forsyninger og instrumenter på en steril instrumentbakke, herunder sterile vatpinde, draper, svampe (gasbind), kirurgisk blad, suturer og kirurgisk markør (valgfrit). Hvis en kirurgisk assistent er tilgængelig, kan dette trin udelades, og assistenten kan levere de sterile instrumenter efter trin 1.3.1.
  3. Hysterektomi og uterosacral ligament suspension (USLS)
    1. Don en kirurgisk kjole, hoveddæksel, maske og sterile handsker. Drape dyret med et sterilt felt, og lad kun maven udsættes.
    2. Lav et 7 cm snit ned ad linea alba fra lige under xiphoid-processen til den nederste brystvortelinje ved hjælp af et skalpelblad. Snittet skal ende ~ 0,5-1,0 cm rostral fra urinrørsåbningen. Lav derefter et snit gennem muskellaget nedenunder. Undgå bugvæggen blodkar for at forhindre blødning.
    3. Saml abdominal retractor og inspicere bughulen (figur 3A). Brug iristang til forsigtigt at lokalisere det venstre livmoderhorn. Livmoderen er dybt inde i tarmen, hvilket ofte er den struktur, der først opstår, når man kommer ind i bughulen. Det er gavnligt først at identificere æggestokken (figur 3B) og den tilhørende ovariefedtpude.
    4. Løft forsigtigt det venstre livmoderhorn med en gribe- eller mygklemme og start hysterektomi ved at ligere hornet under æggestokken og ovidukten ved hjælp af en mygklemme. Æggestokkene er sarte strukturer og beskadiges eller devaskulariseres let ved manipulation. Pas på, når du hæver livmoderhornene; Tag fat i hornet i sikker afstand fra æggestokken for at opnå dette.
    5. Fortsæt hysterektomi ved at klemme og trimme tilstødende vaskulatur, bindevæv og fedt fra livmoderhornet ved hjælp af mikrosaks. Klem bindevævet før fjernelse for at reducere blødning. Placer klemmerne så tæt på livmodergrænsefladen som muligt, helt ned til uterocervikal krydset (også kaldet hornbifurcation).
    6. Klem over livmoderhornet nær bifurcationspunktet ved hjælp af mygtang (figur 4A-C). Punktafgifter det ipsilaterale horn bare cephalad til klemmen for at undgå blødning. Dette er placeret mellem utero-cervikal krydset (bare rostral til livmoderhalsen) og utero-tubal ligeringspunktet. Den vaginale hvælving forbliver efter hysterektomi (figur 4D).
      BEMÆRK: På grund af rottekarrenes lille kaliber var ligering af livmoderstubben med en midlertidig klemme tilstrækkelig til denne operation. Denne teknik kan imidlertid ændres efter behov med enten forsegling af pediklerne med elektrokauteri eller suturligering.
    7. Gentag trin 1.3.3-1.3.6 på højre livmoderhorn for at udføre en total hysterektomi.
    8. Juster abdominal retractor for at udsætte det nedre bækken. Undersøg den udsatte vaginale hvælving og bækkenbunden understøtter ligamentale og bindevæv, som kan ses fastgjort til vagina og livmoderhalsen. Hvis det er muligt, identificere urinlederen bilateralt, som kun er medial til æggestokkene.
    9. Identificer de uterosakrale ledbånd28,29, vist i figur 5A, som kan findes fastgjort til livmoderhalsen lige under de resterende stubbe af livmoderhornene (vaginal hvælving). Ledbåndet spores i en cephalad-medial orientering mod korsbenet.
    10. Brug en 3-0 polydiaxanon sutur på en lille, tilspidset nål, placer en søm gennem venstre uterosacral ligament. Placer sømmen højt på ledbåndet, tæt på korsbenet.
    11. Træk i sømmen for at sikre, at den har fanget det uterosakrale ledbånd - USL-strukturen indsættes i livmoderhalsen med oprindelsen dykning bag endetarmen, hvor den fastgøres til korsbenet. Igen skal du identificere urinlederen for at sikre, at den ikke er blevet inkorporeret i eller knækket med den uterosakrale søm.
    12. Før derefter den venstre polydiaxanonsøm gennem det venstre aspekt af vaginalhvelvet (figur 5B) med omhu for at inkorporere både de forreste og bageste aspekter af vaginalmanchetten. Gentag trinene for at fuldføre USLS-proceduren på højre side. Flere sømme kan placeres bilateralt, hvis det ønskes.
    13. Når de uterosakrale sting er placeret bilateralt, skal du binde suturen sikkert ved hjælp af en firkantet knude, som vist i figur 5C, således at vaginalhvelvet er forhøjet cephalad mod korsbenet; Dette fuldender den uterosacral ligamentsuspension.
  4. Lukning af det kirurgiske sår
    1. Udskift abdominalindholdet tilbage i deres anatomiske position i bughulen. Luk de dybe lag af abdominalvæggen (peritoneum, fascia, muskel) med kontinuerligt suturmønster på 4-0 til 6-0 polyglactin 910 eller polydiaxanon sutur.
    2. Luk huden med en løbende subkutikulær (eller afbrudt) søm på 4-0 til 6-0 polydiaxanon eller polyglactin 910. Administrer antibiotika subkutant efter behov til profylakse for infektion på operationsstedet.
    3. Udfør postkirurgisk overvågning, indtil dyret har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende. Returner ikke dyret til sociale boliger, før det er fuldt genoprettet.

Figure 2
Figur 2: Forberedelse af dyr til levende kirurgi. Fjernelse af pels fra området omkring snitstedet er nødvendigt for korrekt aseptisk teknik. Det område, der vises i panel (A) og (B), er retningslinjer. Forskere bør fjerne nok hår, så sterile instrumenter ikke kommer i kontakt med hår under operationen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Bevarelse af æggestokkene. Livmoderhornene er typisk ikke synlige, når maven først åbnes, som vist i (A). Når et horn er placeret og fulgt for at finde (B) æggestokken og ovidukten, hvor de forbinder til hornet, kan toppen af hornet fastspændes, og hornet adskilles for at begynde hysterektomi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Fjernelse af livmoderhornene. Hysterektomi i rotten involverer (A) begge livmoderhorn (B) fastspændt ved uterocervikale kryds og (C) udskåret. Den vaginale hvælving fra hvert horn forbliver med (D) cervikal / livmoderstump (pil), der forbinder dem. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Uterosacral ligament suspension. (A) Orientering af de uterosakrale ledbånd i forhold til de skabte vaginale hvælvingsstrukturer. Når du placerer suturer til reparation af uterosacral ligamentsuspension (USLS), (B) suturer fanger det uterosacral ledbånd og passerer derefter gennem både de forreste og bageste aspekter af vaginalmanchetten. (C) Fastgjort til det uterosacrale ledbånd er vaginalhvelvet nu forhøjet cephalad mod korsbenet. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Uniaxial trækprøvning

BEMÆRK: Det anvendte testsystem og software blev betjent i henhold til producentens retningslinjer for kalibrering og test. Alle test fandt sted ved 22 °C.

  1. Forberedelse af prøver
    1. Aflive rotten ved hjælp af en IACUC-godkendt farmakologisk procedure. Sørg for død via sekundær fysisk metode. Her blev CO2 -indånding brugt efterfulgt af hjertepunktering. Udsæt vaginalhvelvet som forberedelse til trækmekanisk test. I den aktuelle undersøgelse skal du udføre træktest på indfødte uterosakrale ledbånd (kontrol) såvel som på dyr, der havde gennemgået uterosacral ligamentsuspension som beskrevet ovenfor (POP).
    2. Test ledbånd in situ 24 uger efter operationen. Et terminalt tidspunkt på mindst 8 uger foreslås for at muliggøre fuldstændig reabsorption af suturerne.
      1. Efter human eutanasi skal du lave et snit ned ad linea alba for at udsætte maven.
      2. Begynd at dissekere fedtvævet, indtil vaginalhvelvet er synligt. Fortsæt med at dissekere de abdominale fedtpuder, indtil de intakte USL'er er tydeligt synlige (kontroldyr, figur 6A), eller krydset mellem det uterosakrale ledbånd og vaginalhvelvet er synligt (POP-dyr, figur 6C). Vær forsigtig med ikke at trække i krydset for at fjerne fedtvæv, men brug snarere omhyggelige snit med mikrosaks for at opretholde konsistens mellem prøver.
      3. Brug en fleksibel lineal til at måle afstanden mellem den uterosacral indsættelse (bageste til endetarmen) og vaginalhvelvet. Denne værdi er vævets oprindelige længde.
        BEMÆRK: Den oprindelige længde af vævet, målerlængden, til kontrol USL'er målt 13,4 ± 0,5 mm, mens målerlængden til USL-reparation målte 12,8 ± 0,4 mm.
      4. Træk navlestrengen bag den intakte USL (kontrol, figur 6B) eller USLS-krydset (POP, figur 6D), således at vævet er centreret på navlestrengen. Mål højden og bredden af vævet, hvor det skærer navlestrengen ved hjælp af digitale kalibre. Disse værdier vil blive brugt til at beregne tværsnitsareal.
      5. Fastgør en stor kompressionsplade (materialebord) via basisadapteren, og placer dyret ovenpå, så prøven er centreret under grebsholderen.
  2. Trækprøvning
    1. Programmér trækprøvningsregimet i softwaren: forudindlæsning, forudtilstand, træk til fiasko. Dette følger tidligere bækkenbund29 og reproduktivt væv30 mekaniske testprotokoller.
    2. Opsæt instrumentet som forberedelse til trækprøvning. Til den aktuelle undersøgelse skal du bruge en 10 N-vejecelle, et 3D-printet greb og en basisadapter til at fastgøre en kompressionsplade som vist i figur 7.
      BEMÆRK: Enhver basisopstilling, der kan understøtte dyrets fulde størrelse, er acceptabel. Brug ethvert greb, der sikkert kan holde navlestrengen. En brugerdefineret 3D-printet holder og greb fra tidligere undersøgelser31,32 blev brugt i denne test. STL-filer blev inkluderet som supplerende filer.
      1. Dyret anbringes således, at prøveemnet er centreret under grebet (figur 8A). Immobiliser bækkenområdet omkring prøven ved at fastgøre dyret til pladen (figur 8B).
      2. Sænk vejecellen, så navlestrengens haler let når grebet. Fastgør navlestrengen i grebet, og lad tapen være slap for at undgå prøvemanipulation.
    3. Åbn prækonditioneringstesten i softwaregrænsefladen, og mærk testen med prøvenavnet. Sørg for, at forkonditioneringsmetoden omfatter forbelastningstrinnet.
    4. Klik for at starte prækonditioneringstesten, som forudindlæser prøven ved 0,015 N. Når forbelastningskraften er stabil, klargør prøvningen prøven med en forlængelseshastighed på 0,1 mm/s i 30 sekunder. Lad vævet hvile i 1 min. Mens du venter, skal du indlæse pull-to-fail-testregimet.
      BEMÆRK: Forspændingskraften kan variere afhængigt af instrumentets begrænsninger og testbetingelserne. Der henvises til tidligere undersøgelser, hvor den rapporterede forbelastning varierer fra 0,015 N til 0,1 N 29,33,34,35,36.
    5. Åbn testregimet, der er programmeret til at trække til fiasko. Mærk testen med prøvenavnet, og klik på Okay for at komme til næste vindue. Indtast målerlængden på prøven, og klik derefter på Næste for at overgå til testsiden.
    6. Balance alle og klik på Start. Lad testen køre med en forlængelseshastighed på 0,1 mm/s, indtil vævet er trukket til svigt. Testen vil producere belastningsforskydningsdata.
  3. Beregning af spænding, belastning og modul til trækprøvning
    1. Ved hjælp af belastningsforskydningsdataene, tværsnitsarealet og målelængden fra prøven beregnes spændingen (MPa) og belastningen (%) som tidligere rapporteret 37,38,39,40,41. Brug ligning 1 og ligning 2 vist nedenfor. Bemærk, at strækning af båndet under test også skal tages i betragtning i disse beregninger.
      Equation 1     Ligning 1
      Equation 2     Ligning 2
      1. Ud fra belastningsforskydningskurven (figur 9A,D) beregnes stivheden (lineær hældning, N/mm) og den endelige belastning. Ud fra spændingsbelastningskurven beregnes tangentmodulet (lineær hældning, MPa) og den ultimative spænding. Det lineære område af spændingsbelastningskurven er noteret i figur 9B,E med det beregnede tangentmodul fra dette område vist i figur 9C,F for begge forsøgsgrupper.
        BEMÆRK: For både stivheds- og tangentmodulet skal du identificere den lineære del ved at vælge et vindue med punkter, der maksimererR2-værdien for en lineær regression 37,41.

Figure 6
Figur 6: Prøveforberedelse til uniaxial trækprøvning. (A) De eksponerede USL'er før (B) navlestrengen trækkes bag vævet. (C) USL-vaginal hvælvingsforbindelse efter fuldstændig opløsning af suturerne med (B) navlestrengen gevind bag vævet som forberedelse til trækprøvning. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Det mekaniske testsystem . (A) Testsystemet i trækprøvningstilstand, der anvendes med (B) 3D-printet holder og (C) 3D-printet prøvegreb komplet med en tekstureret strimmel for at forbedre grebet. Konfiguration af stykkerne vist i panel (D). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Opsætning af trækprøvningen . A) Prøveemnet er centreret under grebet og holderen. B) Dyret og vævet omkring prøven holdes stille, inden trækprøven påbegyndes. Som det fremgår af det indsatte billede, er det vigtigt at sikre det omgivende væv for at isolere vævet af interesse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Eksempel på output og analyse af trækprøvningsdata. (A) Belastningsforskydningskurven for en kontrolprøve efterfulgt af (B) spændingsbelastningsanalysen og (C) hældningen af linjekurvetilpasningsligningen, der viser tangentmodulet i MPa. (D-F) viser den samme proces for en USLS-prøve. Klik her for at se en større version af denne figur.

Representative Results

Kirurgisk gennemførlighed og placering af uterosacral sutur
Der var ingen intraoperative komplikationer relateret til hysterektomi eller uterosacral ligamentsuspension hos nogen af dyrene. Der var minimal blødning under fjernelse af livmoderhornene, forudsat at den tilstødende vaskulatur blev fastspændt før fjernelse. Begrænset blødning tillod god visualisering af de uterosakrale ledbånd til suturplacering og forhindrede intraoperativ tarm-, endetarms-, ureteral- eller blæreskade. Efter placering af suturerne forhindrede det nydannede USL-vaginale hvælvingskryds bevægelse af livmoderhals-/livmoderstubben som vist i figur 5C. I løbet af de første tre postoperative dage blev dyrene kontrolleret dagligt og derefter hver anden uge indtil forsøgets afslutning. Med opioide og NSAID-analgetika med forlænget frigivelse administreret på operationstidspunktet blev yderligere analgetika fundet unødvendige. Baseret på vores erfaring med 16 dyreoperationer (n = 8 for både kontrol- og USLS-grupper) bør der forventes et vægttab i den første uge efter operationen med et gennemsnitligt vægttab på 5,7 ± 1,4% fra operationsdagsvægten. Som forventet tog rotterne langsomt på i vægt i løbet af de efterfølgende 23 uger med en gennemsnitlig vægtøgning på 15,1 ± 4,5% i løbet af forsøget.

Mekanisk test af USLS-reparationen
For at demonstrere funktionaliteten af USLS-reparationen blev der udført uniaxial trækprøvning. Efter eutanasi af dyret på det valgte postoperative tidspunkt, 24 uger i denne undersøgelse, skal det kirurgiske område omhyggeligt dissekeres for at visualisere USL-vaginal hvælvingskrydset som vist i figur 6A. Sammenlignet med andre metoder til test af rottens USL'er sammen med andre understøttende strukturer og bækkenorganer29,42 er metoden beskrevet her den første til at teste rottens USL på en isoleret måde. Navlestrengen, der blev brugt i denne undersøgelse, blev strategisk valgt for sin fleksibilitet, da båndets overholdelse tillod minimal forstyrrelse af vævet under forberedelse af træktest. Belastningsforskydningsdata skal derfor justeres for at tage højde for den lille mængde strækning, som navlestrengen bidrager med. Figur 9 giver et eksempel på data opnået ved trækprøvning, hvor figur 9A giver et eksempel på et typisk spændingsbelastningsplot. Det anbefales at rapportere stressbelastningsdata, da disse oplysninger er normaliserede og uafhængige af prøvernes størrelse34 og bedre kan sammenlignes på tværs af undersøgelser. For det intakte uterosakrale ledbånd rapporterer vi strukturelle egenskaber såsom ultimativ belastning (2,9 ± 0,5 N) og stivhed (0,4 ± 0,1 N / mm) samt normaliserede materialeegenskaber såsom ultimativ spænding (2,1 ± 0,4 MPa), ultimativ belastning (1,6 ± 0,5) og tangentmodul (4,0 ± 1,1 MPa). I de uniaxiale tests udført på rotternes reproduktive organer og alle deres støttende vævsforbindelser af Moalli et al., rapporterede de en ultimativ belastning ved svigt (13,2 ± 1,1 N) og stivhed (2,9 ± 0,9 N/mm) højere end den isolerede USL29. Arbejdet udført af Moalli et al. og anden litteratur34,35 nævner den høje variabilitet mellem testede prøver som vist i de data, der præsenteres her. Til reparation af det uterosakrale ledbånd fandt vi, at alle strukturelle materialeegenskaber (stivhed, 0,33 ± 0,13 N/mm; ultimativ belastning, 2,6 ± 1,3 N) og normaliserede materialeegenskaber (ultimativ spænding, 1,8 ± 0,7 MPa; ultimativ belastning 1,3 ± 0,3; tangentmodul, 3,0 ± 0,9 MPa) var lavere end den oprindelige USL.

Discussion

Protokollen er kendt for flere fordele. Så vidt vi ved, er det den første offentliggjorte beskrivelse af USLS i rottemodellen og vil give fremtidige efterforskere reproducerbare trin til at udføre denne procedure i forskningsmiljøet. For det andet inkluderer vi en ny protokol til trækprøvning af USL's oprindelige og kirurgiske grænseflade. Trækprøvningsprotokollen kunne bruges i lignende undersøgelser, der undersøger nye vævstekniske tilgange til at øge indfødte vævsreparationer såsom USLS. Desuden er rottemodellen i sig selv nyttig til undersøgelse af bækkenbundslidelser på grund af nem håndtering / boarding, kort levetid og omkostningseffektivitet sammenlignet med større dyremodeller. Begrænsninger i protokollen inkluderer manglende evne til at vurdere en af de vigtigste komplikationer ved USLS, ureteral kinking. På trods af dette havde vi ingen tilfælde af formodet ureteral skade i denne undersøgelse. En anden overvejelse er, at bækkenets vandrette orientering, forholdet mellem det lille føtale hoved og fødselskanalforhold og manglen på spontan prolaps i rottemodellen begrænser en vis anvendelighed af resultaterne for mennesker. Brugen af multiparøse rotter er dog en styrke ved denne undersøgelse, da dette tegner sig for den førende risikofaktor i udviklingen af POP3.

Etableringen af en vellykket protokol for hysterektomi og USLS i Lewis-rotten vil være et nyttigt værktøj for fremtidige forskere, der undersøger kirurgiske komponenter i POP, samtidig med at variabiliteten i test af USL's mekaniske opførsel minimeres. Kirurgiske dyremodeller er gavnlige, fordi de giver forskere mulighed for at designe klinisk relevante eksperimenter, der kontrollerer paritet, kropsmasse, sygdom og ernæring34, samtidig med at den etiske risiko ved indledende undersøgelse hos mennesker mindskes. Desuden giver standardiserede modeller for POP forskere mulighed for at omgå begrænsningerne ved indsamling af humant væv. Navnlig vil de trækprøvningsmetoder, der er beskrevet i denne protokol, muliggøre overensstemmelse mellem undersøgelserne. Tidligere gnavermodeller testede de mekaniske egenskaber i hele bækkenområdet, som inkluderer livmoderhalsen, vagina og de mange bækkenstøttebånd29,42. De metoder, der er beskrevet her, giver mulighed for måling af USL på en måde, der opretholder de oprindelige rygmarvs- og livmoderhalsbindinger. Det skal bemærkes, at trækprøvningsmetoderne ikke vurderer USL alene, men snarere USL i kombination med dets indsættelse ved korsbenet og livmoderhalsen. Dette er en styrke ved undersøgelsen, da den afspejler de sædvanlige in situ-kræfter, som ledbåndet udsættes for. Vi anerkender, at den mekaniske opførsel af det isolerede ledbånd ville være anderledes, hvis det blev testet ex vivo uden dets oprindelige vedhæftede filer. Dette gælder især, da rottestrukturerne er små og begrænser muligheden for at indsamle en prøve, der er egnet til ex vivo-testning. USL'erne oplever belastning i flere retninger in situ, så testens uniaxiale karakter er en begrænsning, men ved hjælp af denne metode giver mulighed for meningsfulde sammenligninger mellem tidligere undersøgelser af rotte USL-mekanik29,42. Selvom der i øjeblikket ikke er nogen bredt accepteret standard mekanisk testprotokol, vil denne model være et nyttigt værktøj til fremtidige vævstekniske undersøgelser på området.

Flere trin beskrevet i denne protokol er kritiske for dyrenes sundhed og trivsel samt reproducerbarheden af USLS-operationen og efterfølgende trækprøvning. For det første er det vigtigt at opnå både smertestillende og antiinflammatoriske lægemidler beskrevet som smertestillende alene viste sig at være utilstrækkelige til smertebehandling. Det profylaktiske antibiotikum nedsætter risikoen for infektion på operationsstedet og er standardplejen i human kirurgi. Med hensyn til USLS kirurgiske procedure er det vigtigt at undgå skader på æggestokkene og minimere blodtab for en vellykket operation. Trin 1.3.3 og 1.3.4 beskriver adskillelse af toppen af livmoderhornet fra den tilstødende æggestok; Der skal udvises forsigtighed for at opretholde denne dissektion på siden af livmoderhornet for at forhindre forstyrrelse af sarte kar omkring æggestokken, hvilket kan resultere i overdreven blødning. Det skal bemærkes, at andre forskere har vist, at ovariefunktionen bevares efter fjernelse af livmoderhornene43. Desuden, hvis æggestokkene forstyrres eller fjernes, vil den samlede kollagenfibrilleret arkitektur blive forstyrret, hvilket ændrer de mekaniske egenskaber af dets væv44,45. Når livmoderhornet er sikkert adskilt fra æggestokken, er der et klart dissektionsplan, der tillader isolering af livmoderhornet fra de omgivende fedtpuder og vaskulatur. På trods af det klare dissektionsplan skal pediklerne langs livmoderhornet sikres med en klemme inden transsektion med mikrosaks. I modsætning til kirurgisk praksis hos mennesker har vi fundet ud af, at suturligering af hysterektomipediklerne er unødvendig, da fastspænding af pedicle før transsektion sikrer tilstrækkelig hæmostase. Trin 1.3.6 i protokollen beskriver denne omhyggelige proces for at minimere blodtab. Da hysterektomi udføres, skal der udvises stor omhu for at identificere urinlederne som nævnt i trin 1.3.6 og 1.3.8. Forståelse af urinlederens anatomiske nærhed er kritisk, da en af de mest almindelige komplikationer forbundet med USL'erne hos mennesker er ureteral skade46.

Afslutningsvis præsenterer vi en ny protokol til udførelse af hysterektomi, uterosacral ligamentsuspension og trækprøvning af USL i en rottemodel. Vi forventer, at vores resultater vil hjælpe fremtidige grundvidenskabelige forskere ved at give en klar, reproducerbar beskrivelse af disse procedurer og dermed give mulighed for fremskridt inden for bækkenorganprolapsforskning.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Prof. Silvia Blemker for brugen af hendes Instron og Prof. George Christ for brugen af hans kirurgiske rum samt den 3D-printede holder og greb. Dette arbejde blev støttet af UVA-Coulter Translational Research Partnership og DoD (W81XWH-19-1-0157).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol prep pad BD 326895
Artificial Tear Ointment American Health Service Sales Corp PH-PARALUBE-O
Bluehill software Instron Bluehill 3
Cavicide 1 disinfectant Fisher Scientific 22 998 800
Compression platean Instron 2501-163
Cotton swabs Puritan Medical 806-WC
Gauze Sponge, 8-Ply VWR 95038-728
Mosquito Forceps Medline Industries MMDS1222115
Needle Holder Medline Industries DYND04045
Operating Scissors, 5½", Sharp American Health Service Sales Corp 4-222
Opioid Analgesic (Buprenorphine XR) Fidelis Animal Health Ethiqa XR 0.65 mg/kg SC Q72
NSAID Analgesic (Meloxicam SR) Wildlife Pharmaceuticals, LLC Meloxicam SR 1 mg/kg SC q72
PDS II, 3-0 Polydioxanone Suture, SH-1 Ethicon Z316H
PDS II, 5-0 P olydioxanone Suture, RB-1 Ethicon Z303H
Retractor Medline Industries MDS1862107
Scalpel Blade Stainless Surgical #10 Miltex 4-310
Scalpel Handle Medline Industries MDS15210
Scissor, Micro, Curved, 4.5" Westcott MDS0910311
Single Column Universal Testing System Instron 5943 S3873 1 kN force capacity, 10 N load cell
Sterile Natural Rubber Latex Gloves Accutech 91225075
Suture,Vicryl,6-0,P-3 Ethicon J492G
Tape,Umbilical,Cotton,1/8X18" Ethicon U10T
Tension and Compression Load Cell Instron 2530-10N 10N load cell (1 kgf, 2 lbf)
Veterinary surgical adhesive (skin glue) Covetrus 31477

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Olsen, A. L., et al. Epidemiology of surgically managed pelvic organ prolapse and urinary incontinence. Obstetrics and Gynecology. 89 (4), 501-506 (1997).
  2. Wu, J. M., et al. Lifetime risk of stress urinary incontinence or pelvic organ prolapse surgery. Obstetrics and Gynecology. 123 (6), 1201-1206 (2014).
  3. Kenton, K., Mueller, E. R. The global burden of female pelvic floor disorders. BJU International. 98, 1-7 (2006).
  4. Herschorn, S. Female pelvic floor anatomy The pelvic floor, supporting structures, and pelvic organs. Reviews in Urology. 6, 2-10 (2004).
  5. Jelovsek, J. E., Maher, C., Barber, M. D. Pelvic organ prolapse. The Lancet. 369 (9566), 1027-1038 (2007).
  6. Campbell, R. M. The anatomy and histology of the sacrouterine ligaments. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 59 (1), 1-12 (1950).
  7. Reisenauer, C., et al. The role of smooth muscle in the pathogenesis of pelvic organ prolapse - An immunohistochemical and morphometric analysis of the cervical third of the uterosacral ligament. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 19 (3), 383-389 (2008).
  8. Lavelle, R. S., Christie, A. L., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. Risk of prolapse recurrence after native tissue anterior vaginal suspension procedure with intermediate to long-term followup. Journal of Urology. 195 (4), 1014-1020 (2016).
  9. Jelovsek, J. E., et al. Effect of uterosacral ligament suspension vs sacrospinous ligament fixation with or without perioperative behavioral therapy for pelvic organ vaginal prolapse on surgical outcomes and prolapse symptoms at 5 years in the OPTIMAL randomized clinical trial. JAMA - Journal of the American Medical Association. 319 (15), 1554-1565 (2018).
  10. Bradley, M. S., et al. Vaginal uterosacral ligament suspension: A retrospective cohort of absorbable and permanent suture groups. Female Pelvic Medicine & Reconstructive Surgery. 24 (3), 207-212 (2018).
  11. Cola, A., et al. Native-tissue prolapse repair: Efficacy and adverse effects of uterosacral ligaments suspension at 10-year follow up. International Journal of Gynecology and Obstetrics. , (2022).
  12. Sung, V. W., Washington, B., Raker, C. A. Costs of ambulatory care related to female pelvic floor disorders in the United States. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 202 (5), 1-4 (2010).
  13. Subak, L. L., et al. Cost of pelvic organ prolapse surgery in the United States. Obstetrics and Gynecology. 98 (4), 646-651 (2001).
  14. Siddiqui, N. Y., et al. Mesh sacrocolpopexy compared with native tissue vaginal repair: A systematic review and meta-analysis. Obstetrics & Gynecology. 125 (1), 44-55 (2015).
  15. FDA takes action to protect women's health, orders manufacturers of surgical mesh intended for transvaginal repair of pelvic organ prolapse to stop selling all devices. FDA News Release. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-takes-action-protect-womens-health-orders-manufacturers-surgical-mesh-intended-transvaginal (2019).
  16. Brincat, C. A. Pelvic organ prolapse reconsidering treatment, innovation, and failure. JAMA - Journal of the American Medical Association. 322 (11), 1047-1048 (2019).
  17. Cundiff, G. W. Surgical innovation and the US Food and Drug Administration. Female Pelvic Medicine & Reconstructive Surgery. 25 (4), 263-264 (2019).
  18. Luchristt, D., Weidner, A. C., Siddiqui, N. Y. Urinary basement membrane graft-augmented sacrospinous ligament suspension: a description of technique and short-term outcomes. International Urogynecology Journal. 33 (5), 1347-1350 (2022).
  19. Couri, B. M., et al. Animal models of female pelvic organ prolapse: Lessons learned. Expert Review of Obstetrics and Gynecology. 7 (3), 249-260 (2012).
  20. Mori da Cunha, M. G. M. C., et al. Animal models for pelvic organ prolapse: systematic review. International Urogynecology Journal. 32 (6), 1331-1344 (2021).
  21. Kasabwala, K., Goueli, R., Culligan, P. J. A live porcine model for robotic sacrocolpopexy training. International Urogynecology Journal. 30 (8), 1371-1375 (2019).
  22. Mansoor, A., et al. Development of an ovine model for training in vaginal surgery for pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal. 28 (10), 1595-1597 (2017).
  23. Liang, R., et al. Impact of prolapse meshes on the metabolism of vaginal extracellular matrix in rhesus macaque. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 212 (2), 1-7 (2015).
  24. Johannesson, L., et al. Preclinical report on allogeneic uterus transplantation in non-human primates. Human Reproduction. 28 (1), 189-198 (2013).
  25. Iwanaga, R., et al. Comparative histology of mouse, rat, and human pelvic ligaments. International Urogynecology Journal. 27 (11), 1697-1704 (2016).
  26. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , National Academies Press. (2011).
  27. Federal Animal Welfare Regulations. National Archives. , Available from: https://www.ecfr.gov/current/title-9/chapter-l/subchapter-A/part-2/subpart-C/section-2.31 (2022).
  28. Ma, Y., et al. Knockdown of Hoxa11 in vivo in the uterosacral ligament and uterus of mice results in altered collagen and matrix metalloproteinase activity. Biology of Reproduction. 86 (4), 100 (2012).
  29. Moalli, P. A., et al. A rat model to study the structural properties of the vagina and its supportive tissues. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 192 (1), 80-88 (2005).
  30. Yoshida, K., et al. Mechanics of cervical remodelling: Insights from rodent models of pregnancy. Interface Focus. 9 (5), 20190026 (2019).
  31. Christ, G. J., Sharma, P., Hess, W., Bour, R. Modular biofabrication platform for diverse tissue engineering applications and related method thereof. , (2020).
  32. Smith, K., Christ, G. J. Incorporation of in vitro double seeding for enhanced development of tissue engineered skeletal muscle implants. , University of Virginia. (2019).
  33. Becker, W. R., De Vita, R. Biaxial mechanical properties of swine uterosacral and cardinal ligaments. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 14 (3), 549-560 (2015).
  34. Donaldson, K., Huntington, A., De Vita, R. Mechanics of uterosacral ligaments: Current knowledge, existing gaps, and future directions. Annals of Biomedical Engineering. 49 (8), 1788-1804 (2021).
  35. Baah-Dwomoh, A., McGuire, J., Tan, T., De Vita, R. Mechanical properties of female reproductive organs and supporting connective tissues: A review of the current state of knowledge. Applied Mechanics Reviews. 68 (6), 1-12 (2016).
  36. Tan, T., Cholewa, N. M., Case, S. W., De Vita, R. Micro-structural and biaxial creep properties of the swine uterosacral-cardinal ligament complex. Annals of Biomedical Engineering. 44 (11), 3225-3237 (2016).
  37. Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S. Biomechanical testing of murine tendons. Journal of Visualized Experiments. (152), e60280 (2019).
  38. Griffin, M., et al. Biomechanical characterization of human soft tissues using indentation and tensile testing. Journal of Visualized Experiments. (118), e54872 (2016).
  39. Feola, A., et al. Parity negatively impacts vaginal mechanical properties and collagen structure in rhesus macaques. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 203 (6), 1-8 (2010).
  40. Tan, T., et al. Histo-mechanical properties of the swine cardinal and uterosacral ligaments. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 42, 129-137 (2015).
  41. Abramowitch, S. D., Feola, A., Jallah, Z., Moalli, P. A. Tissue mechanics, animal models, and pelvic organ prolapse: A review. European Journal of Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology. 144, Suppl 1 146-158 (2009).
  42. Lowder, J. L., et al. Adaptations of the rat vagina in pregnancy to accommodate delivery. Obstetrics and Gynecology. 109 (1), 128-135 (2007).
  43. Koebele, S. V., et al. Hysterectomy uniquely impacts spatial memory in a rat model: A role for the nonpregnant uterus in cognitive processes. Endocrinology. 160 (1), 1-19 (2019).
  44. Kafantari, H., et al. Structural alterations in rat skin and bone collagen fibrils induced by ovariectomy. Bone. 26 (4), 349-353 (2000).
  45. Daghma, D. E. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers in bone matrix indicates bone quality in ovariectomized rat spine. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 36 (3), 297-306 (2018).
  46. Manodoro, S., Frigerio, M., Milani, R., Spelzini, F. Tips and tricks for uterosacral ligament suspension: how to avoid ureteral injury. International Urogynecology Journal. 29 (1), 161-163 (2018).

Tags

Medicin udgave 186 rotte vævsmekanik bækkenbund livmoder kirurgi
Udvikling af en uterosacral ligament suspension rottemodel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miller, B. J., Jones, B. K., Turner, … More

Miller, B. J., Jones, B. K., Turner, J. S., Caliari, S. R., Vaughan, M. H. Development of a Uterosacral Ligament Suspension Rat Model. J. Vis. Exp. (186), e64311, doi:10.3791/64311 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter