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Desenvolvimento de um modelo de rato de suspensão do ligamento uterossacro

Published: August 17, 2022 doi: 10.3791/64311
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,3, 4
1Department of Chemical Engineering, University of Virginia, 2Electrophysiology Division, Abbott, 3Department of Biomedical Engineering, University of Virginia, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Division of Pelvic Medicine and Reconstructive Surgery, University of Virginia

Summary

O prolapso de órgãos pélvicos afeta milhões de mulheres em todo o mundo e, no entanto, algumas intervenções cirúrgicas comuns têm taxas de falha de até 40%. A falta de modelos animais padronizados para investigar essa condição impede o progresso. Propomos o seguinte protocolo como modelo para suspensão do ligamento uterossacro e ensaio de tração in vivo .

Abstract

O prolapso de órgãos pélvicos (POP) é um distúrbio comum do assoalho pélvico (DFP) com potencial para impactar significativamente a qualidade de vida da mulher. Aproximadamente 10%-20% das mulheres são submetidas à cirurgia de reparo do assoalho pélvico para tratar o prolapso nos Estados Unidos. Os casos de DFP resultam em um custo anual total de US$ 26,3 bilhões apenas nos Estados Unidos. Essa condição multifatorial tem um impacto negativo na qualidade de vida e, no entanto, as opções de tratamento só diminuíram no passado recente. Uma opção cirúrgica comum é a suspensão do ligamento uterossacro (USLS), que geralmente é realizada através da fixação da abóbada vaginal ao ligamento uterossacro na pelve. Esse reparo tem menor incidência de complicações em comparação com aqueles com aumento de tela, mas é notável por uma taxa de falha relativamente alta, de até 40%. Considerando a falta de modelos animais padronizados para estudar a disfunção do assoalho pélvico, há uma necessidade clínica urgente de inovação nesse campo, com foco no desenvolvimento de modelos animais acessíveis e custo-efetivos. Neste manuscrito, descrevemos um modelo de USLS em ratos envolvendo uma histerectomia completa seguida de fixação da abóbada vaginal remanescente ao ligamento uterossacro. O objetivo desse modelo é mimetizar o procedimento realizado em mulheres para poder usá-lo para, então, investigar estratégias reparadoras que melhorem a integridade mecânica da fixação ligamentar. É importante ressaltar que também descrevemos o desenvolvimento de um procedimento de ensaio de tração in situ para caracterizar a integridade da interface em momentos escolhidos após a intervenção cirúrgica. De modo geral, este modelo será uma ferramenta útil para estudos futuros que investiguem opções de tratamento para reparo de DPO via USLS.

Introduction

O prolapso de órgãos pélvicos (POP) é uma doença comum do assoalho pélvico que afeta milhões de mulheres em todo o mundo com o potencial de impactar significativamente muitos aspectos da vida de uma mulher, particularmente com a idadede 1. Notadamente, aproximadamente 13% das mulheres nos Estados Unidos serão submetidas à cirurgia por prolapso ou incontinência urinária2. Condição mais comum após a gravidez e o parto, o prolapso é caracterizado pela descida de órgãos pélvicos, predominantemente dos diversos compartimentos da vagina e/ou útero, além de sua posição normal na cavidade peritoneal. Isso leva a sintomas incômodos de protuberância ou pressão vaginal, intestino, bexiga e disfunção sexual, e qualidade de vida geral reduzida. Outros fatores de risco para DPO incluem obesidade, tabagismo, tosse crônica e constipação3.

Em mulheres saudáveis, os órgãos do assoalho pélvico são sustentados pelos músculos elevadores do ânus, ligamentos uterossacrais (USLs), ligamentos cardinais, anexos do tecido conjuntivo à parede lateral pélvica e estruturas distais do corpo perineal 4,5. As USLs estão entre as estruturas de suporte apicais mais importantes tanto para o útero quanto para a vagina apical, sendo, portanto, frequentemente utilizadas na correção cirúrgica da DPO (Figura 1). O suporte estrutural da USL provém do tecido conjuntivo colágeno denso na região sacral que faz a transição para o músculo liso intimamente compactado. Devido a esse gradiente composicional, a USL se entrelaça com a musculatura uterina e vaginal para fornecer suporte robusto aos órgãos pélvicos 6,7. Na suspensão do ligamento uterossacro (USLS), as USLs são fixadas à abóbada vaginal após uma histerectomia, restaurando a vagina e as estruturas circundantes à sua posição anatômica no compartimento abdominal. No entanto, independentemente de uma via transvaginal ou laparoscópica, o procedimento de USLS é atormentado por uma taxa de falha relativamente alta, de até 40% em alguns estudos 8,9. A taxa de recorrência de sintomas incômodos de abaulamento vaginal em 5 anos após o reparo para prolapso do compartimento apical, como USLs, foi de aproximadamente 40% em um grande ensaio clínico randomizado e controlado multicêntrico9. No mesmo estudo, o retratamento para prolapso recorrente em 5 anos foi de aproximadamente 10%. O mecanismo dessa alta taxa de falha não foi estudado, mas restaurar a vagina e as estruturas adjacentes à sua posição anatômica requer a colocação de sutura na região colágena densa da USL10,11 e não na região da musculatura lisa. Portanto, a alta taxa de falha pode ser devida ao descompasso mecânico e composicional da interface vagina-USL cirurgicamente formada em comparação com a integração completa observada na fixação cervical-USL nativa.

O impacto econômico do tratamento desses distúrbios também é notável, com aproximadamente US$ 300 milhões gastos anualmente nos EUA em assistência ambulatorial12 e mais de US$ 1 bilhão gasto anualmente em custos diretos para procedimentos cirúrgicos13. Apesar dos vastos recursos econômicos dedicados ao tratamento dessas condições, as complicações decorrentes de muitas cirurgias de prolapso permanecem desanimadoras. Por exemplo, reparos de prolapso apical à base de tela de polipropileno, como a sacrocolpopexia, oferecem maiores taxas de sucesso em comparação com reparos de tecidos nativos14, mas à custa de complicações potenciais, como exposição ou erosão da tela. A FDA recebeu quase 3.000 queixas relacionadas a complicações da malha apenas entre 2008 e 2010. Isso culminou em uma ordem da FDA para interromper a fabricação e venda de todos os produtos de malha transvaginalmente colocados para POP em abril de 201915. Portanto, há uma forte necessidade clínica de outros materiais além do polipropileno e modelos com os quais testá-los, que possam aumentar o reparo do prolapso do tecido nativo e aumentar as taxas de sucesso em comparação com as técnicas tradicionais com sutura isolada.

Desde o anúncio da FDA em 2019, a maioria dos cirurgiões pélvicos parou de usar telas transvaginais para reparos de prolapso, levando os pesquisadores a buscar novas abordagens de engenharia de tecidos para aumentar os reparos de tecidos nativos16,17,18, como com células estromais mesenquimais (CTMs)9,20 . Com essa mudança de foco, há uma necessidade urgente de refinamento de modelos animais que possam auxiliar no desenvolvimento de novos materiais; O desafio nesse processo é equilibrar relevância clínica com custo. Para esse fim, a ciência básica e os investigadores clínicos que estudam o prolapso de órgãos pélvicos têm se aproveitado de vários modelos animais até o momento, incluindo ratos, camundongos, coelhos, ovinos, suínos e primatas não humanos19. O processo de identificação de um modelo animal ótimo é desafiador, pois os seres humanos são bípedes, não têm cauda e têm um processo de nascimento traumático em comparação com outras espécies de mamíferos20. Suínos21 têm sido utilizados para simular sacrocolpopexia robótica, enquanto ovinos têm sido utilizados para simular reparos de prolapso vaginal22. Esses modelos animais, embora clinicamente relevantes, são limitados em viabilidade pelo custo e manutenção. Primatas não humanos têm sido usados para estudar a patogênese do prolapso; Os macacos-de-cheiro, em particular, são uma das únicas espécies além do homem que podem desenvolver prolapso espontâneo, tornando-os um dos modelos animais mais relevantes20. Primatas não humanos também têm sido utilizados para estudar procedimentos cirúrgicos ginecológicos, como a sacrocolpopexia23 e o transplante uterino24. Semelhante aos seus homólogos ovinos e suínos, a principal limitação dos primatas não humanos como modelo animal de prolapso é o custo de manutenção, cuidados e embarque19.

Embora a pelve de roedores esteja orientada horizontalmente com uma proporção de tamanho do canal cabeça/parto muito menor em comparação com os seres humanos19, os ratos são adequados para estudos em pequenos animais de cirurgia de USLS porque têm anatomia de USL, celularidade, arquitetura histológica e composição de matriz semelhantes às USL25 humanas. Além disso, são benéficos em termos de manutenção e embarque. Apesar desses atributos benéficos, não há relatos publicados de um modelo de reparo de USLS em ratos. Portanto, o objetivo é descrever um protocolo para histerectomia e USLS em ratas Lewis multíparas. Este protocolo será benéfico para os investigadores que pretendem estudar a fisiopatologia e os componentes cirúrgicos da DPO utilizando este modelo animal acessível.

Figure 1
Figura 1: Prolapso de órgão pélvico. (A) A orientação normal dos órgãos na cavidade peritoneal e (B) a dramática descida do órgão quando ocorre prolapso. Após a histerectomia, (C) a suspensão do ligamento uterossacro restaura a vagina e as estruturas adjacentes à sua posição anatômica adequada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Seguir todas as diretrizes da Comissão Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC), obtendo aprovação para todos os procedimentos com animais antes de começar. Os requisitos para a técnica de cirurgia asséptica podem ser encontrados no Guia26 e nos Regulamentos de Bem-Estar Animal27. O estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Virgínia, protocolo número 4332-11-20. Obter matrizes multíparas (duas ninhadas). Os ratos devem ser alojados em um biotério credenciado pela Associação Americana para a Acreditação de Cuidados com Animais de Laboratório e fornecidos com comida e água ad libitum. Os animais deste estudo eram ratos Lewis obtidos de Charles River e tinham entre 4 e 6 meses de idade para acomodar a exigência de duas ninhadas. Os animais foram mantidos em um ciclo claro-escuro de 12 h.

1. Reparo do prolapso de órgão pélvico com suspensão do ligamento uterossacro

  1. Preparação de equipamentos e área cirúrgica para cirurgia de animais vivos
    1. Preparar a área cirúrgica de forma que a prancha cirúrgica seja aquecida a 37 °C usando almofadas de aquecimento de água quente recirculantes juntamente com uma almofada impermeável estéril. Garanta a esterilidade da prancha cirúrgica e da área cirúrgica usando um desinfetante de superfície livre de água sanitária seguido de lenço com etanol a 70%.
    2. Use esterilização térmica em autoclave para esterilizar todos os suprimentos seguros para autoclave, incluindo instrumentos cirúrgicos, esponjas cirúrgicas (gaze), cotonetes e um campo descartável. Obter luvas cirúrgicas estéreis embaladas.
    3. Obtenha cortadores elétricos, pomada oftálmica, lenços umedecidos com etanol, cotonetes e solução de iodo, juntamente com lâmina de bisturi estéril embalado e suturas, e coloque na bancada de trabalho.
  2. Preparação de animais para cirurgia de animais vivos
    1. Colocar cuidadosamente o animal em uma câmara de anestesia provida de isoflurano a 2% e pesá-lo após atingir o plano adequado de anestesia. A anestesia adequada é confirmada quando o animal não responde a uma pinça do dedo do pé.
    2. Colocar o animal na prancha cirúrgica em decúbito ventral com o nariz firmemente no cone de anestesia fornecido com isoflurano a 2%. Aplique pomada oftálmica nos olhos de cada um dos animais.
    3. Administrar analgésico opioide e analgésico AINEO por via subcutânea (Tabela de Materiais).
    4. Colocar o animal em decúbito dorsal, como mostra a Figura 2, e raspar a pele abdominal desde o processo xifoide até o orifício uretral (8 cm x 4 cm). Esterilizar o abdome com três cargas de iodo e álcool para preparar o local da incisão.
      NOTA: Se o barbear resultar em sangramento, obtenha hemostasia com pressão antes de preparar a pele com iodo e almofada de preparação de álcool. Manter o iodo na pele por 30 s.
    5. Se não houver assistente cirúrgico disponível, deposite suprimentos e instrumentos estéreis em uma bandeja de instrumentos estéril, incluindo cotonetes estéreis, cortinas, esponjas (gaze), lâmina cirúrgica, suturas e marcador cirúrgico (opcional). Se um assistente cirúrgico estiver disponível, essa etapa pode ser omitida, e o assistente pode fornecer os instrumentos estéreis seguindo a etapa 1.3.1.
  3. Histerectomia e suspensão do ligamento uterossacro (USLS)
    1. Use um avental cirúrgico, cobertura para a cabeça, máscara e luvas estéreis. Escorra o animal com um campo estéril, deixando apenas o abdômen exposto.
    2. Faça uma incisão de 7 cm pela linha alba logo abaixo do processo xifoide até a linha inferior do mamilo usando uma lâmina de bisturi. A incisão deve terminar ~0,5-1,0 cm rostral do orifício uretral. Em seguida, faça uma incisão através da camada muscular abaixo. Evite o vaso sanguíneo da parede abdominal para evitar sangramento.
    3. Montar o afastador abdominal e inspecionar a cavidade abdominal (Figura 3A). Usando pinça de íris, localize suavemente o corno uterino esquerdo. O útero é profundo dentro do intestino, que é muitas vezes a estrutura encontrada pela primeira vez ao entrar na cavidade peritoneal. É benéfico identificar primeiramente o ovário (Figura 3B) e o coxim adiposo ovariano associado.
    4. Eleve suavemente o corno uterino esquerdo com um pinça de mosquito ou pinça de mosquito e comece a histerectomia ligando o chifre abaixo do ovário e do oviduto usando uma braçadeira de mosquito. Os ovários são estruturas delicadas e são facilmente danificados ou desvascularizados com manipulação. Tome cuidado ao elevar os chifres uterinos; Segure o chifre a uma distância segura do ovário para conseguir isso.
    5. Continuar a histerectomia pinçando e aparando a vasculatura adjacente, o tecido conjuntivo e a gordura do corno uterino usando microtesoura. Aperte o tecido conjuntivo antes da remoção para reduzir o sangramento. Coloque as pinças o mais próximo possível da interface uterina, até a junção uterocervical (também chamada de bifurcação dos cornos).
    6. Pinça o corno uterino próximo ao ponto de bifurcação com pinça de mosquito (Figura 4A-C). Excise o corno ipsilateral apenas cefálico à pinça para evitar sangramento. Esta está localizada entre a junção útero-cervical (apenas rostral ao colo uterino) e o ponto de laqueadura útero-tubária. A abóbada vaginal permanecerá após a histerectomia (Figura 4D).
      OBS: Devido ao pequeno calibre dos vasos das ratas, a ligadura dos cotos uterinos com pinça temporária foi suficiente para esta cirurgia. No entanto, essa técnica pode ser modificada conforme a necessidade com o selamento dos pedículos com eletrocautério ou ligadura de sutura.
    7. Repita os passos 1.3.3-1.3.6 no corno uterino direito para realizar uma histerectomia total.
    8. Ajustar o afastador abdominal para expor a pelve inferior. Inspecione a abóbada vaginal exposta e os tecidos ligamentares e conjuntivos de suporte do assoalho pélvico, que podem ser vistos ligados à vagina e ao colo do útero. Se possível, identifique o ureter bilateralmente, que é apenas medial aos ovários.
    9. Identificar os ligamentos uterossacrais28,29, mostrados na Figura 5A, que podem ser encontrados aderidos ao colo do útero logo abaixo dos cotos remanescentes dos cornos uterinos (abóbada vaginal). O ligamento é traçado em uma orientação céfalo-medial em direção ao sacro.
    10. Usando uma sutura de polidiaxanona 3-0 em uma agulha pequena e cônica, coloque um ponto através do ligamento uterossacro esquerdo. Coloque o ponto no alto do ligamento, próximo ao sacro.
    11. Puxe o ponto para garantir que ele tenha capturado o ligamento uterossacro - a estrutura USL se insere no colo do útero com a origem mergulhando atrás do reto onde se liga ao sacro. Novamente, identifique o ureter para garantir que ele não tenha sido incorporado ou torcido com o ponto uterossacral.
    12. Em seguida, passar o ponto de polidiaxanona esquerda através da face esquerda da abóbada vaginal (Figura 5B), com o cuidado de incorporar tanto a face anterior quanto a posterior do manguito vaginal. Repita as etapas para concluir o procedimento USLS no lado direito. Múltiplos pontos podem ser colocados bilateralmente, se desejado.
    13. Uma vez colocados os pontos uterossacrais bilateralmente, amarre firmemente a sutura com um nó quadrado, como mostra a Figura 5C, de modo que a abóbada vaginal seja elevada cefálica em direção ao sacro; Isso completa a suspensão do ligamento uterossacro.
  4. Fechamento da ferida operatória
    1. Substitua o conteúdo abdominal de volta à sua posição anatômica dentro da cavidade peritoneal. Fechar as camadas profundas da parede abdominal (peritônio, fáscia, músculo) com padrão de sutura contínua de fio de poliglactina 910 4-0 a 6-0 ou fio de polidiaxanona.
    2. Feche a pele com um ponto subcuticular (ou interrompido) de polidiaxanona ou poliglactina 910 4-0 a 6-0. Administrar antibiótico por via subcutânea, conforme necessário para profilaxia de infecção do sítio cirúrgico.
    3. Realizar monitorização pós-cirúrgica até que o animal recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Não devolva o animal à habitação social até estar totalmente recuperado.

Figure 2
Figura 2: Preparo do animal para cirurgia ao vivo. A remoção de pelos da área ao redor do local da incisão é necessária para uma técnica asséptica adequada. A área mostrada nos painéis (A) e (B) são diretrizes. Os pesquisadores devem remover pelos suficientes para que os instrumentos estéreis não entrem em contato com o cabelo durante a cirurgia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Preservando os ovários. Os cornos uterinos normalmente não são visíveis quando o abdome é aberto pela primeira vez, como mostrado em (A). Uma vez que um chifre é localizado e seguido para encontrar (B) o ovário e o oviduto onde eles se conectam ao chifre, o topo do chifre pode ser pinçado, e o chifre separado para iniciar a histerectomia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Retirada dos cornos uterinos. A histerectomia no rato envolve (A) ambos os cornos uterinos (B) pinçados na junção útero-cervical e (C) excisados. A abóbada vaginal de cada corno permanece com o coto (D) cervical/uterino (seta) conectando-os. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Suspensão do ligamento uterossacro. (A) Orientação dos ligamentos uterossacrais em relação às estruturas da abóbada vaginal criadas. Ao colocar suturas para o reparo da suspensão do ligamento uterossacro (USLS), (B) as suturas capturam o ligamento uterossacro e, em seguida, passam pelas faces anterior e posterior do manguito vaginal. (C) Presa ao ligamento uterossacro, a abóbada vaginal encontra-se agora elevada cefálica em direção ao sacro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Ensaio de tração uniaxial

NOTA: O sistema de teste e o software utilizados foram operados seguindo as diretrizes do fabricante para calibração e testes. Todos os testes ocorreram a 22 °C.

  1. Preparação do espécime
    1. Eutanasiar o rato usando um procedimento farmacológico aprovado pela IACUC. Garantir a morte através de método físico secundário. Neste caso, utilizou-se inalação de CO2 seguida de punção cardíaca. Expor a abóbada vaginal em preparação para o teste mecânico de tração. No presente estudo, realizar testes de tração em ligamentos uterossacrais nativos (controle), bem como em animais submetidos à suspensão do ligamento uterossacro conforme descrito acima (POP).
    2. Testar ligamentos in situ 24 semanas após a cirurgia. Sugere-se um tempo terminal de no mínimo 8 semanas para permitir a reabsorção completa das suturas.
      1. Após a eutanásia humana, faça uma incisão na linha alba para expor o abdômen.
      2. Comece a dissecar o tecido adiposo até que a abóbada vaginal seja visível. Continuar a dissecar os coxins gordurosos abdominais até que as USLs intactas sejam claramente visíveis (animais controle, Figura 6A) ou a junção entre o ligamento uterossacro e a abóbada vaginal seja visível (animais POP, Figura 6C). Tenha cuidado para não puxar a junção para remover o tecido adiposo, mas sim usar cortes cuidadosos com microtesouras para manter a consistência entre as amostras.
      3. Com régua flexível, meça a distância entre a inserção uterossacra (posterior ao reto) e a abóbada vaginal. Este valor é o comprimento original do tecido.
        NOTA: O comprimento original do tecido, o comprimento do calibre, para USLs de controle mediu 13,4 ± 0,5 mm, enquanto o comprimento do calibre para reparo de USLs mediu 12,8 ± 0,4 mm.
      4. Rosquear a fita umbilical atrás do USL intacto (controle, Figura 6B) ou da junção USLS (POP, Figura 6D) de forma que o tecido fique centrado na fita umbilical. Medir a altura e a largura do tecido onde ele se cruza com a fita umbilical usando paquímetro digital. Esses valores serão utilizados para o cálculo da área de secção transversal.
      5. Fixe uma placa de compressão grande (Tabela de Materiais) através do adaptador de base e posicione o animal em cima de tal forma que o espécime fique centralizado sob o suporte de aderência.
  2. Ensaios de tração
    1. Programe o regime de teste de tração no software: pré-carga, pré-condição, tração até a falha. Isso segue protocolos prévios de testes mecânicos do assoalho pélvico29 e do tecido reprodutivo30 .
    2. Montar o instrumento na preparação do ensaio de tração. Para o estudo atual, use uma célula de carga de 10 N, uma pega impressa em 3D e um adaptador de base para conectar uma placa de compressão, conforme mostrado na Figura 7.
      NOTA: Qualquer configuração de base que possa suportar o tamanho total do animal é aceitável. Use qualquer pega que possa segurar com segurança a fita umbilical. Um suporte impresso em 3D personalizado e uma pega de estudos anteriores31,32 foram usados neste teste. Os arquivos STL foram incluídos como arquivos suplementares.
      1. Posicione o animal de forma que o espécime fique centralizado sob a pega (Figura 8A). Imobilizar a região pélvica ao redor do espécime fixando o animal à placa (Figura 8B).
      2. Abaixe a célula de carga de tal forma que as caudas da fita umbilical alcancem facilmente a aderência. Fixe a fita umbilical no punho, deixando a fita frouxa para evitar a manipulação do espécime.
    3. Abra o teste de pré-condicionamento na interface do software e rotule o teste com o nome da amostra. Certifique-se de que o método de pré-condicionamento inclua a etapa de pré-carga.
    4. Clique para iniciar o teste de pré-condicionamento, que pré-carregará a amostra a 0,015 N. Uma vez que a força de pré-carga esteja estável, o ensaio irá pré-condicionar a amostra a uma taxa de alongamento de 0,1 mm/s por 30 s. Deixe o tecido descansar por 1 min. Enquanto espera, carregue o regime de teste pull-to-failure.
      NOTA: A força de pré-carga pode variar dependendo das limitações do instrumento e das condições de teste. Referem-se estudos anteriores em que a pré-carga relatada varia de 0,015 N a 0,1 N 29,33,34,35,36.
    5. Abra o regime de teste programado para falhar. Rotule o teste com o nome da amostra e clique em OK para ir para a próxima janela. Insira o comprimento do medidor da amostra e, em seguida, clique em Avançar para fazer a transição para a página de teste.
    6. Salve tudo e clique em Iniciar. Permitir que o ensaio seja executado a uma taxa de alongamento de 0,1 mm/s até que o tecido tenha sido tracionado até à falha. O teste produzirá dados de deslocamento de carga.
  3. Cálculo de tensão, deformação e módulo para ensaios de tração
    1. Usando os dados de deslocamento de carga, área de secção transversal e comprimento do manômetro da amostra, calcule a tensão (MPa) e a deformação (%) conforme relatado anteriormente 37,38,39,40,41. Use a Equação 1 e a Equação 2 mostradas abaixo. Observe que o alongamento da fita durante o teste também deve ser considerado nesses cálculos.
      Equation 1     Equação 1
      Equation 2     Equação 2
      1. A partir da curva carga-deslocamento (Figura 9A,D), calcule-se a rigidez (inclinação linear, N/mm) e a carga última. A partir da curva de deformação de tensões, calcule-se o módulo tangente (inclinação linear, MPa) e a tensão máxima. A região linear da curva de tensão é notada na Figura 9B,E com o módulo tangente calculado a partir dessa região mostrado na Figura 9C,F para ambos os grupos experimentais.
        OBS: Tanto para a rigidez quanto para o módulo de tangência, identificar a porção linear escolhendo uma janela de pontos que maximize o valor de R2 para uma regressão linear37,41.

Figure 6
Figura 6: Preparo do corpo de prova para ensaio de tração uniaxial. (A) Os USLs de controle expostos antes de (B) a fita umbilical ser rosqueada atrás do tecido. (C) USL-junção da cúpula vaginal após a dissolução completa das suturas com (B) a fita umbilical rosqueada atrás do tecido em preparação para o teste de tração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: O sistema de ensaio mecânico. (A) O sistema de ensaio em modo de ensaio de tracção utilizado com (B) suporte impresso em 3D e (C) pega de amostra impressa em 3D completa com uma tira texturizada para melhorar a aderência. Configuração das peças mostradas no painel (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Configuração do ensaio de tração . (A) O espécime está centralizado sob o punho e o suporte. (B) O animal e o tecido que circundam o espécime são mantidos estacionários antes do início do ensaio de tração. Como mostrado pela imagem de inserção, a fixação do tecido circundante é essencial para isolar o tecido de interesse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Exemplo de saída e análise de dados de ensaio de tração. (A) A curva carga-deslocamento para uma amostra controle seguida de (B) a análise da deformação de tensão e (C) a inclinação da equação de ajuste da curva de reta mostrando o módulo tangente em MPa. (D-F) mostra o mesmo processo para uma amostra USLS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Representative Results

Viabilidade cirúrgica e colocação da sutura uterossacral
Não houve complicações intraoperatórias relacionadas à histerectomia ou suspensão do ligamento uterossacro em nenhum dos animais. Houve sangramento mínimo durante a remoção dos cornos uterinos, desde que a vasculatura adjacente fosse pinçada antes da remoção. O sangramento limitado permitiu boa visualização dos ligamentos uterossacrais para colocação de sutura e preveniu lesões intestinais, reto, ureterais ou vesicais intraoperatórias. Após a colocação das suturas, a junção recém-formada USL-cúpula-abóbada vaginal impediu a movimentação do coto cervical/uterino, como mostra a Figura 5C. Durante os três primeiros dias de pós-operatório, os animais foram submetidos a exames diários e quinzenais até o final do experimento. Com o opioide de liberação prolongada e os analgésicos AINEs administrados no momento da cirurgia, analgésicos adicionais foram considerados desnecessários. Com base em nossa experiência com 16 cirurgias em animais (n = 8 para ambos os grupos controle e USLS), uma queda de peso deve ser esperada na primeira semana após a cirurgia, com uma perda média de 5,7 ± 1,4% do peso do dia da cirurgia. Como esperado, os ratos ganharam peso lentamente nas 23 semanas subsequentes, com um ganho de peso médio de 15,1 ± 4,5% ao longo do experimento.

Teste mecânico do reparo USLS
Para demonstrar a funcionalidade do reparo da USLS, foi realizado ensaio uniaxial de tração. Após a eutanásia do animal no momento pós-operatório escolhido, 24 semanas neste estudo, a área cirúrgica deve ser cuidadosamente dissecada para visualização da junção USL-abóbada vaginal, como mostra a Figura 6A. Comparado a outras metodologias para testar as USLs de ratos em conjunto com outras estruturas de suporte e órgãos pélvicos29,42, o método aqui descrito é o primeiro a testar a USL de ratos de forma isolada. A fita umbilical utilizada neste estudo foi estrategicamente escolhida por sua flexibilidade, uma vez que a complacência da fita permitiu o mínimo de ruptura do tecido durante o preparo do ensaio de tração. Os dados de deslocamento da carga, portanto, devem ser ajustados para levar em conta a pequena quantidade de estiramento contribuída pela fita umbilical. A Figura 9 fornece um exemplo de dados obtidos por meio de ensaios de tração, com a Figura 9A fornecendo um exemplo de um gráfico típico de tensão-deformação. O relato de dados de tensão-deformação é recomendado, pois essas informações são normalizadas e independentes do tamanho dos espécimes34 e podem ser melhor comparadas entre os estudos. Para o ligamento uterossacro íntegro, relatamos propriedades estruturais como carga máxima (2,9 ± 0,5 N) e rigidez (0,4 ± 0,1 N/mm), bem como propriedades do material normalizado, como tensão máxima (2,1 ± 0,4 MPa), deformação máxima (1,6 ± 0,5) e módulo tangente (4,0 ± 1,1 MPa). Nos testes uniaxiais realizados nos órgãos reprodutivos de ratos e em todas as suas conexões teciduais de suporte por Moalli et al., eles relataram uma carga máxima na falha (13,2 ± 1,1 N) e rigidez (2,9 ± 0,9 N/mm) maior do que a USL isolada29. O trabalho de Moalli et al., e outros daliteratura34,35, mencionam a alta variabilidade entre os corpos de prova testados, como mostram os dados aqui apresentados. Para o reparo da suspensão do ligamento uterossacro, todas as propriedades estruturais do material (rigidez, 0,33 ± 0,13 N/mm; carga máxima, 2,6 ± 1,3 N) e normalizadas do material (tensão máxima, 1,8 ± 0,7 MPa; deformação final 1,3 ± 0,3; módulo tangente, 3,0 ± 0,9 MPa) foram menores que as da USL nativa.

Discussion

O protocolo é notável por várias vantagens. Até onde sabemos, é a primeira descrição publicada de USLS no modelo de ratos e fornecerá aos futuros investigadores passos reprodutíveis para a realização deste procedimento no ambiente de pesquisa. Em segundo lugar, incluímos um novo protocolo para teste de tração da interface nativa e cirúrgica da USL. O protocolo de ensaio de tração pode ser utilizado em estudos semelhantes que investigam novas abordagens de engenharia tecidual para aumentar o reparo tecidual nativo, como a USLS. Além disso, o próprio modelo de rato é útil para o estudo de distúrbios do assoalho pélvico devido à facilidade de manuseio/embarque, vida útil curta e eficiência de custo em comparação com modelos animais maiores. As limitações do protocolo incluem a incapacidade de avaliar uma das principais complicações da USLS, o acotovelamento ureteral. Apesar disso, não tivemos nenhum caso de lesão ureteral presumida neste estudo. Outra consideração é que a orientação horizontal da pelve, a pequena relação cabeça-canal fetal/parto e a ausência de prolapso espontâneo no modelo de rato limitam alguma aplicabilidade dos resultados em humanos. No entanto, o uso de ratos multíparas é um ponto forte deste estudo, uma vez que este é o principal fator de risco no desenvolvimento de POP3.

O estabelecimento de um protocolo bem-sucedido para histerectomia e USLS na rata Lewis será uma ferramenta útil para futuros pesquisadores que investigam componentes cirúrgicos da POP, minimizando a variabilidade no teste do comportamento mecânico da USL. Os modelos animais cirúrgicos são benéficos na medida em que permitem aos pesquisadores projetar experimentos clinicamente relevantes que controlam a paridade, a massa corporal, a doença e a nutrição34, ao mesmo tempo em que mitigam o risco ético do estudo inicial em humanos. Além disso, modelos padronizados para POP permitem que os pesquisadores contornem as limitações da coleta de tecidos humanos. Em particular, os métodos de ensaio de tração descritos neste protocolo permitirão a consistência entre os estudos. Modelos anteriores de roedores testaram as propriedades mecânicas de toda a região pélvica, que inclui o colo uterino, a vagina e os múltiplos ligamentos de sustentação pélvica29,42. Os métodos aqui descritos permitem a mensuração da USL de forma a manter as fixações nativas da coluna vertebral e cervical. Deve-se notar que os métodos de ensaio de tração não avaliam a USL isoladamente, mas sim a USL em combinação com sua inserção no sacro e no colo uterino. Este é um ponto forte do estudo, pois reflete as forças in situ usuais às quais o ligamento é submetido. Reconhecemos que o comportamento mecânico do ligamento isolado seria diferente se ele fosse testado ex vivo sem seus anexos nativos. Isto é especialmente verdadeiro uma vez que as estruturas dos ratos são pequenas e limitam a viabilidade de coletar uma amostra adequada para testes ex vivo. As USLs experimentam carregamento em múltiplas direções in situ, de modo que a natureza uniaxial do teste é uma limitação, mas o uso desse método permite comparações significativas entre estudos anteriores de USL mecânica de ratos29,42. Embora atualmente não haja um protocolo de ensaio mecânico padrão amplamente aceito, este modelo será uma ferramenta útil para futuros estudos de engenharia de tecidos na área.

Várias etapas descritas neste protocolo são fundamentais para a saúde e bem-estar dos animais, bem como para a reprodutibilidade da cirurgia de USLS e subsequente teste de tração. Primeiramente, é fundamental a obtenção tanto do analgésico quanto dos anti-inflamatórios descritos como o analgésico isolado mostrou-se inadequado para o manejo da dor. O antibiótico profilático diminui o risco de infecção do sítio cirúrgico e é o padrão de tratamento em cirurgia humana. Em relação ao procedimento cirúrgico da USLS, evitar danos aos ovários e minimizar a perda sanguínea são essenciais para o sucesso da cirurgia. Os passos 1.3.3 e 1.3.4 descrevem a separação do topo do corno uterino do ovário adjacente; Deve-se tomar cuidado para manter essa dissecção no lado do corno uterino para evitar o rompimento de vasos delicados ao redor do ovário, o que pode resultar em sangramento excessivo. É importante ressaltar que outros pesquisadores demonstraram que a função ovariana está preservada após a remoção dos cornos uterinos43. Além disso, se os ovários forem rompidos ou removidos, a arquitetura global da fibrila colágena será perturbada, alterando as propriedades mecânicas de seus tecidos44,45. Uma vez que o corno uterino é separado com segurança do ovário, há um plano claro de dissecção que permite o isolamento do corno uterino dos coxins de gordura e da vasculatura circundantes. Apesar do plano claro de dissecção, os pedículos ao longo do corno uterino devem ser fixados com uma pinça antes da transecção com microtesoura. Ao contrário da prática cirúrgica em humanos, verificamos que a ligadura de sutura dos pedículos da histerectomia é desnecessária, pois o pinçamento do pedículo antes da transecção garante hemostasia adequada. O passo 1.3.6 do protocolo descreve esse processo cuidadoso para minimizar a perda sanguínea. À medida que a histerectomia está sendo realizada, muito cuidado deve ser tomado para identificar os ureteres como mencionado nos passos 1.3.6 e 1.3.8. O entendimento da proximidade anatômica do ureter é fundamental, pois uma das complicações mais comuns associadas às USLs em humanos é a lesão ureteral46.

Em conclusão, apresentamos um novo protocolo para a realização de histerectomia, suspensão do ligamento uterossacro e teste de tração do USL em um modelo de rata. Antecipamos que nossos achados auxiliarão futuros pesquisadores da ciência básica, fornecendo uma descrição clara e reprodutível desses procedimentos e, assim, permitindo o avanço da pesquisa de prolapso de órgãos pélvicos.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos à Profª Silvia Blemker pelo uso de seu Instron e ao Prof. George Christ pelo uso de seu espaço cirúrgico, bem como ao suporte e pega impressos em 3D. Este trabalho foi apoiado pela UVA-Coulter Translational Research Partnership e pelo DoD (W81XWH-19-1-0157).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol prep pad BD 326895
Artificial Tear Ointment American Health Service Sales Corp PH-PARALUBE-O
Bluehill software Instron Bluehill 3
Cavicide 1 disinfectant Fisher Scientific 22 998 800
Compression platean Instron 2501-163
Cotton swabs Puritan Medical 806-WC
Gauze Sponge, 8-Ply VWR 95038-728
Mosquito Forceps Medline Industries MMDS1222115
Needle Holder Medline Industries DYND04045
Operating Scissors, 5½", Sharp American Health Service Sales Corp 4-222
Opioid Analgesic (Buprenorphine XR) Fidelis Animal Health Ethiqa XR 0.65 mg/kg SC Q72
NSAID Analgesic (Meloxicam SR) Wildlife Pharmaceuticals, LLC Meloxicam SR 1 mg/kg SC q72
PDS II, 3-0 Polydioxanone Suture, SH-1 Ethicon Z316H
PDS II, 5-0 P olydioxanone Suture, RB-1 Ethicon Z303H
Retractor Medline Industries MDS1862107
Scalpel Blade Stainless Surgical #10 Miltex 4-310
Scalpel Handle Medline Industries MDS15210
Scissor, Micro, Curved, 4.5" Westcott MDS0910311
Single Column Universal Testing System Instron 5943 S3873 1 kN force capacity, 10 N load cell
Sterile Natural Rubber Latex Gloves Accutech 91225075
Suture,Vicryl,6-0,P-3 Ethicon J492G
Tape,Umbilical,Cotton,1/8X18" Ethicon U10T
Tension and Compression Load Cell Instron 2530-10N 10N load cell (1 kgf, 2 lbf)
Veterinary surgical adhesive (skin glue) Covetrus 31477

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Medicina rato mecânica dos tecidos assoalho pélvico útero cirurgia
Desenvolvimento de um modelo de rato de suspensão do ligamento uterossacro
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Miller, B. J., Jones, B. K., Turner, … More

Miller, B. J., Jones, B. K., Turner, J. S., Caliari, S. R., Vaughan, M. H. Development of a Uterosacral Ligament Suspension Rat Model. J. Vis. Exp. (186), e64311, doi:10.3791/64311 (2022).

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