Summary
Bäckenorganprolaps påverkar miljontals kvinnor över hela världen och ändå har vissa vanliga kirurgiska ingrepp misslyckanden så höga som 40%. Bristen på standarddjurmodeller för att undersöka detta tillstånd hindrar framsteg. Vi föreslår följande protokoll som modell för uterosakral ligamentsuspension och in vivo dragprovning.
Abstract
Bäckenorganprolaps (POP) är en vanlig bäckenbottenstörning (PFD) med potential att avsevärt påverka kvinnans livskvalitet. Cirka 10% -20% av kvinnorna genomgår bäckenbottenreparationskirurgi för att behandla prolaps i USA. PFD-fall resulterar i en total årlig kostnad på 26,3 miljarder dollar enbart i USA. Detta multifaktoriella tillstånd har en negativ inverkan på livskvaliteten och ändå har behandlingsalternativen bara minskat under det senaste förflutna. Ett vanligt kirurgiskt alternativ är uterosacral ligament suspension (USLS), som vanligtvis utförs genom att fästa vaginalvalvet på uterosacral ligament i bäckenet. Denna reparation har en lägre förekomst av komplikationer jämfört med dem med nätförstoring, men är anmärkningsvärd för en relativt hög felfrekvens på upp till 40%. Med tanke på bristen på standarddjurmodeller för att studera bäckenbottendysfunktion finns det ett akut kliniskt behov av innovation inom detta område med fokus på att utveckla kostnadseffektiva och tillgängliga djurmodeller. I detta manuskript beskriver vi en råttmodell av USLS som involverar en fullständig hysterektomi följt av fixering av det återstående vaginala valvet till uterosacral ligament. Målet med denna modell är att efterlikna proceduren som utförs på kvinnor för att kunna använda modellen för att sedan undersöka reparativa strategier som förbättrar ligamentfästets mekaniska integritet. Viktigt är att vi också beskriver utvecklingen av en in situ dragtestprocedur för att karakterisera gränssnittsintegritet vid valda tidpunkter efter kirurgisk ingrepp. Sammantaget kommer denna modell att vara ett användbart verktyg för framtida studier som undersöker behandlingsalternativ för POP-reparation via USLS.
Introduction
Bäckenorganprolaps (POP) är en vanlig bäckenbottenstörning som påverkar miljontals kvinnor över hela världen med potential att väsentligt påverka många aspekter av en kvinnas liv, särskilt medålder 1. I synnerhet kommer cirka 13% av kvinnorna i USA att genomgå operation för prolaps eller urininkontinens2. Ett tillstånd som är vanligast efter graviditet och förlossning, prolaps kännetecknas av nedstigning av bäckenorganen, främst de olika facken i slidan och / eller livmodern, bortom deras normala position i bukhålan. Detta leder till besvärande symtom på vaginal utbuktning eller tryck, tarm, urinblåsa och sexuell dysfunktion och övergripande minskad livskvalitet. Andra riskfaktorer för POP inkluderar fetma, tobaksbruk, kronisk hosta och förstoppning3.
Hos friska kvinnor stöds bäckenbottenorganen av levator ani-musklerna, uterosacral ligament (USL), kardinalligament, bindvävsfästen till bäckens sidovägg och perinealkroppens distala strukturer 4,5. USL: erna är bland de viktigaste apikala stödjande strukturerna för både livmodern och apikal vagina, och används därför ofta vid kirurgisk korrigering av POP (figur 1). Strukturellt stöd från USL härrör från den täta kollagenösa bindväven i sakralområdet som övergår till tätt packad glatt muskulatur. På grund av denna kompositionsgradient blir USL sammanvävd med livmoder- och vaginalmuskulaturen för att ge robust stöd för bäckenorganen 6,7. I uterosacral ligamentupphängning (USLS) säkras USL: erna till vaginalvalvet efter en hysterektomi, vilket återställer vagina och de omgivande strukturerna till deras anatomiska position i bukfacket. Oavsett transvaginal eller laparoskopisk väg plågas USLS-proceduren av en relativt hög felfrekvens på upp till 40% i vissa studier 8,9. Återfallsfrekvensen av besvärande vaginala utbuktningssymtom vid 5 år efter reparation för apikal kompartmentprolaps, såsom USL, var cirka 40% i en stor randomiserad kontrollerad multicenterstudie9. I samma studie var återbehandling för återkommande framfall vid 5 år cirka 10%. Mekanismen för denna höga felfrekvens har inte studerats, men att återställa vagina och de omgivande strukturerna till deras anatomiska position kräver suturplacering i den täta kollagenregionen i USL10,11 snarare än den glatta muskelregionen. Därför kan den höga felfrekvensen bero på den mekaniska och kompositionella matchningen av det kirurgiskt bildade vagina-USL-gränssnittet jämfört med den fullständiga integrationen som ses i den ursprungliga livmoderhals-USL-bilagan.
Den ekonomiska effekten av att behandla dessa sjukdomar är också anmärkningsvärd, med cirka 300 miljoner dollar spenderade årligen i USA på ambulatorisk vård12 och mer än 1 miljard dollar spenderas årligen i direkta kostnader för kirurgiska ingrepp13. Trots de stora ekonomiska resurser som ägnas åt att behandla dessa tillstånd är komplikationerna som uppstår vid många prolapsoperationer fortfarande nedslående. Till exempel erbjuder polypropennätbaserade apikala prolapsreparationer, såsom sacrocolpopexy, högre framgångsgrader jämfört med inhemska vävnadsreparationer14, men på bekostnad av potentiella komplikationer som nätexponering eller erosion. FDA mottog nästan 3000 klagomål relaterade till nätkomplikationer mellan 2008 och 2010 ensam. Detta kulminerade i en order från FDA att stoppa tillverkningen och försäljningen av alla transvaginalt placerade nätprodukter för POP i april 201915. Därför finns det ett starkt kliniskt behov av andra material än polypropen, och modeller för att testa dem, som kan öka reparationer av nativ vävnadsprolaps och öka framgångsgraden jämfört med traditionella tekniker med sutur ensam.
Sedan FDA-tillkännagivandet 2019 har de flesta bäckenkirurger slutat använda transvaginalt placerat nät för prolapsreparationer, vilket får utredare att söka nya vävnadstekniska metoder för att öka inhemska vävnadsreparationer16,17,18 såsom med mesenkymala stromaceller (MSC) 9,20 . Med detta skifte i fokus finns det ett akut behov av förfining av djurmodeller som kan hjälpa till med utveckling av nya material; Utmaningen i denna process är att balansera klinisk relevans med kostnad. För detta ändamål har grundvetenskapliga och kliniska utredare som studerar bäckenorganprolaps utnyttjat flera djurmodeller hittills, inklusive råttor, möss, kaniner, får, svin och icke-mänskliga primater19. Processen att identifiera en optimal djurmodell är utmanande, eftersom människor är tvåbenta, har ingen svans och har en traumatisk födelseprocess jämfört med andra däggdjursarter20. Svin21 har använts för att simulera robotisk sacrocolpopexy, medan får har använts för att simulera vaginala prolapsreparationer22. Dessa djurmodeller, även om de är kliniskt relevanta, är begränsade i genomförbarhet genom kostnad och underhåll. Icke-mänskliga primater har använts för att studera patogenesen av prolaps; I synnerhet ekorrar är en av de enda andra arterna än människor som kan utveckla spontan prolaps, vilket gör dem till en av de mest relevanta djurmodellerna20. Icke-mänskliga primater har också använts för att studera gynekologiska kirurgiska ingrepp såsom sacrocolpopexy23 och livmodertransplantation24. I likhet med deras motsvarigheter till får och svin är den primära begränsningen av icke-mänskliga primater som en djurmodell för framfall kostnaden för underhåll, vård och ombordstigning19.
Även om gnagarbäckenet är orienterat horisontellt med ett mycket mindre förhållande mellan huvud och födelsekanal jämfört med människor19, är råttor lämpliga för smådjurstudier av USLS-kirurgi eftersom de har liknande USL-anatomi, cellularitet, histologisk arkitektur och matrissammansättning jämfört med den mänskliga USL25. Dessutom är de fördelaktiga när det gäller underhåll och ombordstigning. Trots dessa fördelaktiga attribut finns det inga publicerade rapporter om en råttmodell av USLS-reparation. Därför är syftet att beskriva ett protokoll för hysterektomi och USLS i den multiparösa Lewis-råttan. Detta protokoll kommer att vara fördelaktigt för utredare som syftar till att studera patofysiologin och kirurgiska komponenter i POP med hjälp av denna tillgängliga djurmodell.
Figur 1: Bäckenorganprolaps . (A) organens normala orientering i bukhålan och (B) den dramatiska organnedstigningen när prolaps inträffar. Efter hysterektomi, (C) uterosacral ligament suspension återställer vagina och omgivande strukturer till sin rätta anatomiska position. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Protocol
Följ alla riktlinjer från IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) och få godkännande för alla djurförsök innan du börjar. Krav på aseptisk kirurgisk teknik finns i Guide26 och Djurskyddsföreskrifter27. Studien godkändes av University of Virginia Institutional Animal Care and Use Committee protokollnummer 4332-11-20. Få multiparösa (två kull) kvinnliga uppfödare. Råttor bör vara par inrymda i ett vivarium ackrediterat av American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care och försedd med mat och vatten ad libitum. Djuren i denna studie var Lewis-råttor erhållna från Charles River och var mellan 4 och 6 månader gamla för att tillgodose kravet på två kullar. Djuren hölls på en 12 h ljus-mörk cykel.
1. Bäckenorganprolaps reparation med uterosacral ligamentsuspension
- Utrustning och kirurgisk områdesförberedelse för levande djurkirurgi
- Förbered operationsområdet så att operationsskivan värms upp till 37 °C med hjälp av återcirkulerande varmvattenvärmedynor tillsammans med en steril vattentät dyna. Se till att steriliteten hos operationskortet och operationsområdet använder ett blekfritt ytdesinfektionsmedel följt av 70% etanolservett.
- Använd autoklavvärmesterilisering för att sterilisera alla autoklavsäkra förnödenheter, inklusive kirurgiska instrument, kirurgiska svampar (gasväv), bomullspinne och ett engångsdraperi. Skaffa sterila förpackade kirurgiska handskar.
- Skaffa elektriska klippare, oftalmisk salva, etanoldukar, bomullspinne och jodlösning, tillsammans med sterilt förpackat skalpellblad och suturer, och placera vid arbetsbänken.
- Djurberedning för levande djurkirurgi
- Placera försiktigt djuret i en anestesikammare försedd med 2% isofluran och väg djuret efter att rätt anestesiplan har uppnåtts. Korrekt bedövning bekräftas när djuret inte svarar på en tåkupa.
- Placera djuret på operationstavlan i benägen position med näsan säkert i anestesikonen som levereras med 2% isofluran. Applicera oftalmisk salva på vart och ett av djurens ögon.
- Administrera opioidanalgetikum och NSAID-smärtstillande subkutant (materialtabell).
- Placera djuret i ryggläge, som visas i figur 2, och raka av bukpälsen från xiphoidprocessen ner till urinrörsöppningen (8 cm x 4 cm). Sterilisera buken med tre laddningar jod och alkohol för att förbereda snittet.
OBS: Om rakning resulterar i blödning, uppnå hemostas med tryck innan du förbereder huden med jod och alkoholberedning. Behåll jod på huden i 30 s. - Om det inte finns någon kirurgisk assistent tillgänglig, deponera sterila förnödenheter och instrument på ett sterilt instrumentfack, inklusive sterila bomullspinne, draperier, svampar (gasväv), kirurgiskt blad, suturer och kirurgisk markör (tillval). Om en kirurgisk assistent är tillgänglig kan detta steg utelämnas och assistenten kan tillhandahålla de sterila instrumenten enligt steg 1.3.1.
- Hysterektomi och uterosacral ligament suspension (USLS)
- Don en kirurgisk klänning, huvudskydd, mask och sterila handskar. Drapera djuret med ett sterilt fält och lämna endast buken utsatt.
- Gör ett snitt på 7 cm längs linea alba från strax under xiphoidprocessen till den nedre nippellinjen med ett skalpellblad. Snittet ska sluta ~ 0,5-1,0 cm rostral från urinrörets öppning. Gör sedan ett snitt genom muskelskiktet under. Undvik blodkärlet i bukväggen för att förhindra blödning.
- Montera bukupprullaren och inspektera bukhålan (figur 3A). Använd iriscett, försiktigt lokalisera vänster livmoderhorn. Livmodern är djupt inutitarmen, vilket ofta är den struktur som först uppstod när man kom in i bukhålan. Det är fördelaktigt att först identifiera äggstocken (figur 3B) och tillhörande äggstocksfettkudde.
- Höj försiktigt vänster livmoderhorn med en gripare eller myggklämma och börja hysterektomi genom att ligera hornet under äggstocken och äggledaren med en myggklämma. Äggstockarna är känsliga strukturer och skadas lätt eller devaskulariseras med manipulation. Var försiktig när du höjer livmoderhornen; Ta tag i hornet ett säkert avstånd från äggstocken för att uppnå detta.
- Fortsätt hysterektomi genom att klämma och trimma intilliggande vaskulatur, bindväv och fett från livmoderhornet med hjälp av mikrosax. Kläm fast bindväven före borttagning för att minska blödningen. Placera klämmorna så nära livmodergränssnittet som möjligt, hela vägen ner till den uterocervikala korsningen (även kallad hornförgrening).
- Kläm över livmoderhornet nära bifurkationspunkten med myggpincett (figur 4A-C). Punktmarkera det ipsilaterala hornet bara cephalad till klämman för att undvika blödning. Detta ligger mellan den utero-cervikala korsningen (bara rostral till livmoderhalsen) och utero-tuballigeringspunkten. Det vaginala valvet kommer att förbli efter hysterektomi (figur 4D).
OBS: På grund av råttkärlens lilla kaliber var ligering av livmoderstubbarna med en tillfällig klämma tillräcklig för denna operation. Denna teknik kan emellertid modifieras efter behov med antingen tätning av pediklarna med elektrocautery eller suturligering. - Upprepa steg 1.3.3-1.3.6 på höger livmoderhorn för att utföra en total hysterektomi.
- Justera bukupprullaren för att exponera det nedre bäckenet. Inspektera det exponerade vaginala valvet och bäckenbottenstödet ligamentala och bindväv, som kan ses fästa vid slidan och livmoderhalsen. Om möjligt, identifiera urinledaren bilateralt, vilket bara är medialt för äggstockarna.
- Identifiera de uterosakrala ligamenten28,29, som visas i figur 5A, som finns fästa vid livmoderhalsen strax under de återstående stubbarna i livmoderhornen (vaginalt valv). Ligamentet spåras i en cephalad-medial orientering mot korsbenet.
- Använd en 3-0 polydiaxanonsutur på en liten, avsmalnande nål, placera en söm genom vänster uterosacral ligament. Placera sömmen högt på ligamentet, nära korsbenet.
- Dra i sömmen för att säkerställa att den har fångat det uterosakrala ligamentet - USL-strukturen sätter in i livmoderhalsen med ursprunget som dyker bakom ändtarmen där den fäster vid korsbenet. Återigen, identifiera urinledaren för att säkerställa att den inte har införlivats i eller knäckts med uterosacral sömmen.
- För sedan den vänstra polydiaxanonsömmen genom den vänstra aspekten av vaginalvalvet (figur 5B), med försiktighet för att införliva både de främre och bakre aspekterna av vaginalmanschetten. Upprepa stegen för att slutföra USLS-proceduren på höger sida. Flera stygn kan placeras bilateralt, om så önskas.
- När uterosacral stygnen har placerats bilateralt, bind suturen säkert med en fyrkantig knut, som visas i figur 5C, så att vaginalvalvet är upphöjt cephalad mot korsbenet; Detta kompletterar uterosacral ligamentupphängningen.
- Stänger det kirurgiska såret
- Byt ut bukinnehållet tillbaka till deras anatomiska position i bukhålan. Stäng de djupa skikten i bukväggen (bukhinnan, fascia, muskel) med kontinuerligt suturmönster av 4-0 till 6-0 polyglaktin 910 eller polydiaxanonsutur.
- Stäng huden med en löpande subkutan (eller avbruten) söm av 4-0 till 6-0 polydiaxanon eller polyglaktin 910. Administrera antibiotika subkutant efter behov för profylax mot infektioner i operationsområdet.
- Utför postoperativ övervakning tills djuret har återfått tillräckligt med medvetande för att upprätthålla sternal liggande. Återför inte djuret till sociala bostäder förrän det är helt återställt.
Figur 2: Djurberedning för levande kirurgi. Att ta bort päls från området kring snittstället är nödvändigt för korrekt aseptisk teknik. Det område som visas i panelerna (A) och (B) är riktlinjer. Forskare bör ta bort tillräckligt med hår så att sterila instrument inte kommer i kontakt med hår under operationen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Bevara äggstockarna. Livmoderhornen är vanligtvis inte synliga när buken först öppnas, som visas i (A). När ett horn har lokaliserats och följts för att hitta (B) äggstocken och äggledaren där de ansluter till hornet, kan toppen av hornet klämmas fast och hornet separeras för att börja hysterektomi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Ta bort livmoderhornen. Hysterektomi hos råtta involverar (A) båda livmoderhornen, (B) klämda vid den uterocervikala korsningen och (C) utskurna. Vaginalvalvet från varje horn förblir med (D) livmoderhalsen / livmoderstubben (pilen) som förbinder dem. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Uterosacral ligamentupphängning. (A) Orientering av uterosacral ligament i förhållande till de skapade vaginala valvstrukturerna. När du placerar suturer för reparation av uterosacral ligamentsuspension (USLS), fångar (B) suturer det uterosakrala ligamentet och passerar sedan genom både de främre och bakre aspekterna av vaginalmanschetten. (C) Fäst vid uterosacral ligament, är vaginalvalvet nu upphöjt cephalad mot korsbenet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Uniaxiell dragprovning
OBS: Testsystemet och programvaran som användes användes enligt tillverkarens riktlinjer för kalibrering och testning. Alla tester utfördes vid 22 °C.
- Förberedelse av prov
- Avliva råttan med hjälp av en IACUC-godkänd farmakologisk procedur. Säkerställ döden via sekundär fysisk metod. Här användes CO2-inhalation följt av hjärtpunktering. Exponera vaginalvalvet som förberedelse för dragmekanisk testning. I den aktuella studien utföra dragprovning på inhemska uterosakrala ligament (kontroll), samt på djur som genomgått uterosakral ligamentsuspension enligt ovan (POP).
- Testa ligament in situ 24 veckor efter operationen. En terminal tidpunkt på minst 8 veckor föreslås för att möjliggöra fullständig reabsorption av suturerna.
- Efter human dödshjälp, gör ett snitt längs linea alba för att exponera buken.
- Börja dissekera bort fettvävnaden tills vaginalvalvet är synligt. Fortsätt att dissekera bukfettkuddarna tills de intakta USL: erna är tydligt synliga (kontrolldjur, figur 6A) eller korsningen mellan uterosacral ligament och vaginalvalvet är synlig (POP-djur, figur 6C). Var försiktig så att du inte drar i korsningen för att ta bort fettvävnad, utan använd försiktiga snitt med mikrosax för att upprätthålla konsistensen mellan proverna.
- Använd en flexibel linjal och mät avståndet mellan uterosacral insättning (bakom ändtarmen) och vaginalvalvet. Detta värde är vävnadens ursprungliga längd.
OBS: Den ursprungliga längden på vävnaden, mätlängden, för kontroll-USL mätte 13,4 ± 0,5 mm medan mätlängden för USL: s reparation mätte 12,8 ± 0,4 mm. - Trä naveltejp bakom den intakta USL (kontroll, figur 6B) eller USLS-korsningen (POP, figur 6D) så att vävnaden är centrerad på navelbandet. Mät höjden och bredden på vävnaden där den skär navelbandet med hjälp av digitala bromsok. Dessa värden kommer att användas för att beräkna tvärsnittsarea.
- Fäst en stor kompressionsplatta (Table of Materials) via basadaptern och placera djuret ovanpå så att provet centreras under grepphållaren.
- Dragprovning
- Programmera dragprovningsregimen i programvaran: förladdning, förkondition, dra till fel. Detta följer tidigare protokoll för mekanisk testning av bäckenbotten29 och reproduktiv vävnad30 .
- Ställ in instrumentet som förberedelse för dragprovning. För den aktuella studien, använd en 10 N lastcell, ett 3D-tryckt grepp och en basadapter för att fästa en kompressionsplatta som visas i figur 7.
OBS: Alla basuppsättningar som kan stödja djurets fulla storlek är acceptabla. Använd alla grepp som säkert kan hålla navelbandet. En anpassad 3D-tryckt hållare och grepp från tidigare studier31,32 användes i denna testning. STL-filer inkluderades som kompletterande filer.- Placera djuret så att provexemplaret centreras under greppet (figur 8A). Immobilisera bäckenregionen som omger provet genom att fästa djuret vid plattan (figur 8B).
- Sänk lastcellen så att navelbandets svansar lätt når greppet. Fäst navelsträngstejpen i greppet och lämna tejpen slak för att undvika manipulation av prover.
- Öppna förkonditioneringstestet i programvarugränssnittet och märk testet med provnamnet. Se till att förkonditioneringsmetoden inkluderar förspänningssteget.
- Klicka för att starta förkonditioneringstestet, som förbelastar provet vid 0,015 N. När förbelastningskraften är stabil kommer provet att förkonditioneras med en töjningshastighet på 0,1 mm/s i 30 sekunder. Låt vävnaden vila i 1 min. Medan du väntar laddar du testregimen för att dra till fel.
OBS: Förbelastningskraften kan variera beroende på instrumentbegränsningarna och testförhållandena. Se tidigare studier där den rapporterade förbelastningen varierar från 0,015 N till 0,1 N 29,33,34,35,36. - Öppna testregimen som är programmerad att dra till misslyckande. Märk testet med provnamnet och klicka på Okej för att komma till nästa fönster. Ange provets mätarlängd och klicka sedan på Nästa för att övergå till testsidan.
- Balansera alla och klicka på Start. Låt testet köras med en töjningshastighet på 0,1 mm/s tills vävnaden har dragits till misslyckande. Testet kommer att producera belastningsförskjutningsdata.
- Beräkning av spänning, töjning och modul för dragprovning
- Med hjälp av belastningsförskjutningsdata, tvärsnittsarean och mätlängden från provet beräknas spänningen (MPa) och töjningen (%) som tidigare rapporterats 37,38,39,40,41. Använd ekvation 1 och ekvation 2 nedan. Observera att sträckning av tejpen under testning också bör beaktas i dessa beräkningar.
Ekvation 1
Ekvation 2- Från belastningskurvan (figur 9A,D) beräknas styvheten (linjär lutning, N/mm) och den slutliga belastningen. Från spänningstöjningskurvan beräknar du tangentmodulen (linjär lutning, MPa) och den ultimata spänningen. Det linjära området för spänningstöjningskurvan noteras i figur 9B,E med den beräknade tangentmodulen från detta område som visas i figur 9C,F för båda experimentgrupperna.
OBS: För både styvhets- och tangentmodulen, identifiera den linjära delen genom att välja ett fönster med punkter som maximerar R2-värdet för en linjär regression37,41.
- Från belastningskurvan (figur 9A,D) beräknas styvheten (linjär lutning, N/mm) och den slutliga belastningen. Från spänningstöjningskurvan beräknar du tangentmodulen (linjär lutning, MPa) och den ultimata spänningen. Det linjära området för spänningstöjningskurvan noteras i figur 9B,E med den beräknade tangentmodulen från detta område som visas i figur 9C,F för båda experimentgrupperna.
- Med hjälp av belastningsförskjutningsdata, tvärsnittsarean och mätlängden från provet beräknas spänningen (MPa) och töjningen (%) som tidigare rapporterats 37,38,39,40,41. Använd ekvation 1 och ekvation 2 nedan. Observera att sträckning av tejpen under testning också bör beaktas i dessa beräkningar.
Ekvation 1
Ekvation 2
Figur 6: Provberedning för enaxlig dragprovning. (A) Den exponerade kontroll-USL:n före (B) navelsträngstejpen träs bakom vävnaden. (C) USL-vaginal valvkorsning efter fullständig upplösning av suturerna med (B) naveltejpen gängad bakom vävnaden som förberedelse för dragprovning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Det mekaniska provningssystemet . (A) Provningssystemet i dragprovningsläge som används med (B) 3D-tryckt hållare och (C) 3D-tryckt provgrepp komplett med en texturerad remsa för att förbättra greppet. Konfiguration av de delar som visas i panelen (D). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Inställning av dragprovningen . (A) Provexemplaret är centrerat under greppet och hållaren. B) Djuret och vävnaden som omger provet hålls stillastående innan dragprovet påbörjas. Som framgår av den infällda bilden är det viktigt att säkra den omgivande vävnaden för att isolera vävnaden av intresse. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Exempel på utdata och analys av dragprovsdata. (A) Belastningskurvan för ett kontrollprov följt av (B) spänningstöjningsanalysen och (C) lutningen på linjekurvans passningsekvation som visar tangentmodulen i MPa. (D-F) visar samma process för ett USLS-prov. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Representative Results
Kirurgisk genomförbarhet och uterosacral suturplacering
Det fanns inga intraoperativa komplikationer relaterade till hysterektomi eller uterosacral ligamentsuspension hos något av djuren. Det var minimal blödning under avlägsnandet av livmoderhornen, förutsatt att den intilliggande vaskulaturen klämdes fast före avlägsnandet. Begränsad blödning möjliggjorde god visualisering av uterosacral ligament för suturplacering och förhindrade intraoperativ tarm-, rektum-, ureteral- eller blåsskada. Efter placering av suturerna förhindrade den nybildade USL-vaginala valvkorsningen rörelse av livmoderhals-/livmoderstubben som visas i figur 5C. Under de tre första postoperativa dagarna kontrollerades djuren dagligen och sedan varannan vecka fram till försökets slut. Med opioid- och NSAID-analgetika med förlängd frisättning administrerade vid operationen visade sig ytterligare smärtstillande medel vara onödiga. Baserat på vår erfarenhet av 16 djuroperationer (n = 8 för både kontroll- och USLS-grupper) bör en viktminskning förväntas under den första veckan efter operationen med en genomsnittlig förlust på 5,7 ± 1,4% från operationsdagens vikt. Som förväntat gick råttorna långsamt upp i vikt under de följande 23 veckorna, med en genomsnittlig viktökning på 15,1 ± 4,5% under experimentets gång.
Mekanisk testning av USLS-reparationen
För att demonstrera funktionaliteten hos USLS-reparationen utfördes enaxlig dragprovning. Efter avlivning av djuret vid den valda postoperativa tidpunkten, 24 veckor i denna studie, bör det kirurgiska området dissekeras noggrant för att visualisera USL-vaginalvalvkorsningen som visas i figur 6A. Jämfört med andra metoder för att testa USL hos råtta tillsammans med andra stödjande strukturer och bäckenorgan29,42, är metoden som beskrivs här den första som testar råtta USL på ett isolerat sätt. Naveltejpen som användes i denna studie valdes strategiskt för sin flexibilitet eftersom tejpens överensstämmelse möjliggjorde minimal störning av vävnaden under dragtestberedningen. Belastningsförskjutningsdata måste därför justeras för att ta hänsyn till den lilla mängd stretch som naveltejpen bidrar med. Figur 9 ger ett exempel på data som erhållits genom dragprovning med figur 9A som ett exempel på ett typiskt spännings-töjningsdiagram. Rapportering av spännings-töjningsdata rekommenderas eftersom denna information är normaliserad och oberoende av provernas storlek34 och bättre kan jämföras mellan studier. För det intakta uterosakrala ligamentet redovisar vi strukturella egenskaper som slutlast (2,9 ± 0,5 N) och styvhet (0,4 ± 0,1 N/mm) samt normaliserade materialegenskaper som slutspänning (2,1 ± 0,4 MPa), yttersta töjning (1,6 ± 0,5) och tangentmodul (4,0 ± 1,1 MPa). I de enaxliga tester som utfördes på råttans reproduktionsorgan och alla deras stödjande vävnadsanslutningar av Moalli et al., rapporterade de en ultimat belastning vid misslyckande (13,2 ± 1,1 N) och styvhet (2,9 ± 0,9 N / mm) högre än den isolerade USL29. Det arbete som utförts av Moalli et al. och annan litteratur34,35 nämner den höga variationen mellan testade prover som visas i de data som presenteras här. För reparationen av uterosacral ligamentupphängning fann vi att alla strukturella materialegenskaper (styvhet, 0,33 ± 0,13 N / mm; ultimat belastning, 2,6 ± 1,3 N) och normaliserade materialegenskaper (ultimat spänning, 1,8 ± 0,7 MPa; ultimat töjning 1,3 ± 0,3; tangentmodul, 3,0 ± 0,9 MPa) var lägre än den för den inhemska USL.
Discussion
Protokollet är anmärkningsvärt för flera fördelar. Såvitt vi vet är det den första publicerade beskrivningen av USLS i råttmodellen och kommer att ge framtida utredare reproducerbara steg för att utföra denna procedur i forskningsinställningen. För det andra inkluderar vi ett nytt protokoll för dragprovning av USL: s ursprungliga och kirurgiska gränssnitt. Dragtestprotokollet kan användas i liknande studier som undersöker nya vävnadstekniska metoder för att öka inhemska vävnadsreparationer som USLS. Dessutom är råttmodellen i sig användbar för studier av bäckenbottenstörningar på grund av enkel hantering / ombordstigning, kort livslängd och kostnadseffektivitet jämfört med större djurmodeller. Begränsningar av protokollet inkluderar en oförmåga att bedöma en av de viktigaste komplikationerna av USLS, ureteral kinking. Trots detta hade vi inga fall av förmodad ureteral skada i denna studie. Ett annat övervägande är att bäckenets horisontella orientering, litet förhållande mellan fostrets huvud och födelsekanal och brist på spontan prolaps i råttmodellen begränsar viss tillämplighet av resultaten för människor. Användningen av multiparösa råttor är dock en styrka i denna studie eftersom detta står för den ledande riskfaktorn i utvecklingen av POP3.
Upprättandet av ett framgångsrikt protokoll för hysterektomi och USLS i Lewis-råttan kommer att vara ett användbart verktyg för framtida forskare som undersöker kirurgiska komponenter i POP, samtidigt som variationen i testning av USL: s mekaniska beteende minimeras. Kirurgiska djurmodeller är fördelaktiga eftersom de tillåter forskare att utforma kliniskt relevanta experiment som kontrollerar för paritet, kroppsmassa, sjukdom och näring34 samtidigt som de mildrar den etiska risken för initial studie på människor. Vidare tillåter standardiserade modeller för POP forskare att kringgå begränsningarna för mänsklig vävnadssamling. I synnerhet kommer de dragprovningsmetoder som beskrivs i detta protokoll att möjliggöra överensstämmelse mellan studierna. Tidigare gnagarmodeller testade de mekaniska egenskaperna hos hela bäckenregionen, vilket inkluderar livmoderhalsen, vagina och de multipla bäckenstödbanden29,42. De metoder som beskrivs här möjliggör mätning av USL på ett sätt som upprätthåller de inhemska ryggrads- och livmoderhalsfästena. Det bör noteras att dragprovningsmetoderna inte bedömer USL ensam, utan snarare USL i kombination med dess införande vid korsbenet och livmoderhalsen. Detta är en styrka i studien eftersom den återspeglar de vanliga in situ-krafterna som ligamentet utsätts för. Vi erkänner att det isolerade ligamentets mekaniska beteende skulle vara annorlunda om det testades ex vivo utan dess ursprungliga fästen. Detta gäller särskilt eftersom råttstrukturerna är små och begränsar möjligheten att samla in ett prov som är lämpligt för ex vivo-testning. USL: erna upplever belastning i flera riktningar på plats, så testets uniaxiella karaktär är en begränsning, men med hjälp av denna metod möjliggör meningsfulla jämförelser mellan tidigare studier av råtta USL-mekanik29,42. Även om det för närvarande inte finns något allmänt accepterat standardprotokoll för mekanisk testning, kommer denna modell att vara ett användbart verktyg för framtida vävnadstekniska studier inom området.
Flera steg som beskrivs i detta protokoll är avgörande för djurens hälsa och välbefinnande samt reproducerbarheten av USLS-operationen och efterföljande dragprovning. För det första är det viktigt att erhålla både smärtstillande och antiinflammatoriska läkemedel som beskrivs som smärtstillande medel ensam visade sig vara otillräckliga för smärtlindring. Det profylaktiska antibiotikumet minskar risken för infektion i operationsområdet och är standard för vård vid mänsklig kirurgi. När det gäller USLS-kirurgiska ingrepp är det viktigt att undvika skador på äggstockarna och minimera blodförlusten för en lyckad operation. Steg 1.3.3 och 1.3.4 beskriver hur toppen av livmoderhornet separeras från den intilliggande äggstocken. Försiktighet bör vidtas för att upprätthålla denna dissektion på sidan av livmoderhornet för att förhindra störningar av känsliga kärl runt äggstocken, vilket kan leda till överdriven blödning. Observera att andra utredare har visat att äggstocksfunktionen bevaras efter avlägsnande av livmoderhornen43. Dessutom, om äggstockarna störs eller avlägsnas, kommer den övergripande kollagenfibrillarkitekturen att störas, vilket förändrar de mekaniska egenskaperna hos dess vävnader44,45. När livmoderhornet är säkert separerat från äggstocken finns det ett tydligt dissektionsplan som möjliggör isolering av livmoderhornet från de omgivande fettkuddarna och vaskulaturen. Trots det tydliga dissektionsplanet bör pediklarna längs livmoderhornet säkras med en klämma före transektion med mikrosax. I motsats till kirurgisk praxis hos människor har vi funnit att suturligering av hysterektomipediklarna är onödig, eftersom klämning av pedikeln före transektion säkerställer adekvat hemostas. Steg 1.3.6 i protokollet beskriver denna noggranna process för att minimera blodförlusten. När hysterektomi utförs bör stor försiktighet vidtas för att identifiera urinledarna som nämns i steg 1.3.6 och 1.3.8. Att förstå urinledarens anatomiska närhet är kritisk, eftersom en av de vanligaste komplikationerna i samband med USL hos människor är ureteral skada46.
Sammanfattningsvis presenterar vi ett nytt protokoll för att utföra hysterektomi, uterosacral ligamentsuspension och dragprovning av USL i en råttmodell. Vi förväntar oss att våra resultat kommer att hjälpa framtida grundvetenskapliga utredare genom att ge en tydlig, reproducerbar beskrivning av dessa procedurer och därigenom möjliggöra framsteg av bäckenorganprolapsforskning.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Prof. Silvia Blemker för användningen av hennes Instron och Prof. George Christ för användningen av hans kirurgiska utrymme samt den 3D-tryckta hållaren och greppet. Detta arbete stöddes av UVA-Coulter Translational Research Partnership och DoD (W81XWH-19-1-0157).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol prep pad | BD | 326895 | |
| Artificial Tear Ointment | American Health Service Sales Corp | PH-PARALUBE-O | |
| Bluehill software | Instron | Bluehill 3 | |
| Cavicide 1 disinfectant | Fisher Scientific | 22 998 800 | |
| Compression platean | Instron | 2501-163 | |
| Cotton swabs | Puritan Medical | 806-WC | |
| Gauze Sponge, 8-Ply | VWR | 95038-728 | |
| Mosquito Forceps | Medline Industries | MMDS1222115 | |
| Needle Holder | Medline Industries | DYND04045 | |
| Operating Scissors, 5½", Sharp | American Health Service Sales Corp | 4-222 | |
| Opioid Analgesic (Buprenorphine XR) | Fidelis Animal Health | Ethiqa XR | 0.65 mg/kg SC Q72 |
| NSAID Analgesic (Meloxicam SR) | Wildlife Pharmaceuticals, LLC | Meloxicam SR | 1 mg/kg SC q72 |
| PDS II, 3-0 Polydioxanone Suture, SH-1 | Ethicon | Z316H | |
| PDS II, 5-0 P olydioxanone Suture, RB-1 | Ethicon | Z303H | |
| Retractor | Medline Industries | MDS1862107 | |
| Scalpel Blade Stainless Surgical #10 | Miltex | 4-310 | |
| Scalpel Handle | Medline Industries | MDS15210 | |
| Scissor, Micro, Curved, 4.5" | Westcott | MDS0910311 | |
| Single Column Universal Testing System | Instron | 5943 S3873 | 1 kN force capacity, 10 N load cell |
| Sterile Natural Rubber Latex Gloves | Accutech | 91225075 | |
| Suture,Vicryl,6-0,P-3 | Ethicon | J492G | |
| Tape,Umbilical,Cotton,1/8X18" | Ethicon | U10T | |
| Tension and Compression Load Cell | Instron | 2530-10N | 10N load cell (1 kgf, 2 lbf) |
| Veterinary surgical adhesive (skin glue) | Covetrus | 31477 |
References
- Olsen, A. L., et al. Epidemiology of surgically managed pelvic organ prolapse and urinary incontinence. Obstetrics and Gynecology. 89 (4), 501-506 (1997).
- Wu, J. M., et al. Lifetime risk of stress urinary incontinence or pelvic organ prolapse surgery. Obstetrics and Gynecology. 123 (6), 1201-1206 (2014).
- Kenton, K., Mueller, E. R. The global burden of female pelvic floor disorders. BJU International. 98, 1-7 (2006).
- Herschorn, S. Female pelvic floor anatomy The pelvic floor, supporting structures, and pelvic organs. Reviews in Urology. 6, 2-10 (2004).
- Jelovsek, J. E., Maher, C., Barber, M. D.
- Campbell, R. M. The anatomy and histology of the sacrouterine ligaments. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 59 (1), 1-12 (1950).
- Reisenauer, C., et al. The role of smooth muscle in the pathogenesis of pelvic organ prolapse - An immunohistochemical and morphometric analysis of the cervical third of the uterosacral ligament. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 19 (3), 383-389 (2008).
- Lavelle, R. S., Christie, A. L., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. Risk of prolapse recurrence after native tissue anterior vaginal suspension procedure with intermediate to long-term followup. Journal of Urology. 195 (4), 1014-1020 (2016).
- Jelovsek, J. E., et al. Effect of uterosacral ligament suspension vs sacrospinous ligament fixation with or without perioperative behavioral therapy for pelvic organ vaginal prolapse on surgical outcomes and prolapse symptoms at 5 years in the OPTIMAL randomized clinical trial. JAMA - Journal of the American Medical Association. 319 (15), 1554-1565 (2018).
- Bradley, M. S., et al. Vaginal uterosacral ligament suspension: A retrospective cohort of absorbable and permanent suture groups. Female Pelvic Medicine & Reconstructive Surgery. 24 (3), 207-212 (2018).
- Cola, A., et al. Native-tissue prolapse repair: Efficacy and adverse effects of uterosacral ligaments suspension at 10-year follow up. International Journal of Gynecology and Obstetrics. , (2022).
- Sung, V. W., Washington, B., Raker, C. A. Costs of ambulatory care related to female pelvic floor disorders in the United States. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 202 (5), 1-4 (2010).
- Subak, L. L., et al. Cost of pelvic organ prolapse surgery in the United States. Obstetrics and Gynecology. 98 (4), 646-651 (2001).
- Siddiqui, N. Y., et al. Mesh sacrocolpopexy compared with native tissue vaginal repair: A systematic review and meta-analysis. Obstetrics & Gynecology. 125 (1), 44-55 (2015).
- FDA takes action to protect women's health, orders manufacturers of surgical mesh intended for transvaginal repair of pelvic organ prolapse to stop selling all devices. FDA News Release. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-takes-action-protect-womens-health-orders-manufacturers-surgical-mesh-intended-transvaginal (2019).
- Brincat, C. A. Pelvic organ prolapse reconsidering treatment, innovation, and failure. JAMA - Journal of the American Medical Association. 322 (11), 1047-1048 (2019).
- Cundiff, G. W. Surgical innovation and the US Food and Drug Administration. Female Pelvic Medicine & Reconstructive Surgery. 25 (4), 263-264 (2019).
- Luchristt, D., Weidner, A. C., Siddiqui, N. Y. Urinary basement membrane graft-augmented sacrospinous ligament suspension: a description of technique and short-term outcomes. International Urogynecology Journal. 33 (5), 1347-1350 (2022).
- Couri, B. M., et al. Animal models of female pelvic organ prolapse: Lessons learned. Expert Review of Obstetrics and Gynecology. 7 (3), 249-260 (2012).
- Mori da Cunha, M. G. M. C., et al. Animal models for pelvic organ prolapse: systematic review. International Urogynecology Journal. 32 (6), 1331-1344 (2021).
- Kasabwala, K., Goueli, R., Culligan, P. J. A live porcine model for robotic sacrocolpopexy training. International Urogynecology Journal. 30 (8), 1371-1375 (2019).
- Mansoor, A., et al. Development of an ovine model for training in vaginal surgery for pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal. 28 (10), 1595-1597 (2017).
- Liang, R., et al. Impact of prolapse meshes on the metabolism of vaginal extracellular matrix in rhesus macaque. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 212 (2), 1-7 (2015).
- Johannesson, L., et al. Preclinical report on allogeneic uterus transplantation in non-human primates. Human Reproduction. 28 (1), 189-198 (2013).
- Iwanaga, R., et al. Comparative histology of mouse, rat, and human pelvic ligaments. International Urogynecology Journal. 27 (11), 1697-1704 (2016).
- National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , National Academies Press. (2011).
- Federal Animal Welfare Regulations. National Archives. , Available from: https://www.ecfr.gov/current/title-9/chapter-l/subchapter-A/part-2/subpart-C/section-2.31 (2022).
- Ma, Y., et al. Knockdown of Hoxa11 in vivo in the uterosacral ligament and uterus of mice results in altered collagen and matrix metalloproteinase activity. Biology of Reproduction. 86 (4), 100 (2012).
- Moalli, P. A., et al. A rat model to study the structural properties of the vagina and its supportive tissues. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 192 (1), 80-88 (2005).
- Yoshida, K., et al. Mechanics of cervical remodelling: Insights from rodent models of pregnancy. Interface Focus. 9 (5), 20190026 (2019).
- Christ, G. J., Sharma, P., Hess, W., Bour, R. Modular biofabrication platform for diverse tissue engineering applications and related method thereof. , (2020).
- Smith, K., Christ, G. J. Incorporation of in vitro double seeding for enhanced development of tissue engineered skeletal muscle implants. , University of Virginia. (2019).
- Becker, W. R., De Vita, R. Biaxial mechanical properties of swine uterosacral and cardinal ligaments. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 14 (3), 549-560 (2015).
- Donaldson, K., Huntington, A., De Vita, R. Mechanics of uterosacral ligaments: Current knowledge, existing gaps, and future directions. Annals of Biomedical Engineering. 49 (8), 1788-1804 (2021).
- Baah-Dwomoh, A., McGuire, J., Tan, T., De Vita, R. Mechanical properties of female reproductive organs and supporting connective tissues: A review of the current state of knowledge. Applied Mechanics Reviews. 68 (6), 1-12 (2016).
- Tan, T., Cholewa, N. M., Case, S. W., De Vita, R. Micro-structural and biaxial creep properties of the swine uterosacral-cardinal ligament complex. Annals of Biomedical Engineering. 44 (11), 3225-3237 (2016).
- Kurtaliaj, I., Golman, M., Abraham, A. C., Thomopoulos, S.
- Griffin, M., et al. Biomechanical characterization of human soft tissues using indentation and tensile testing. Journal of Visualized Experiments. (118), e54872 (2016).
- Feola, A., et al. Parity negatively impacts vaginal mechanical properties and collagen structure in rhesus macaques. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 203 (6), 1-8 (2010).
- Tan, T., et al. Histo-mechanical properties of the swine cardinal and uterosacral ligaments. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 42, 129-137 (2015).
- Abramowitch, S. D., Feola, A., Jallah, Z., Moalli, P. A. Tissue mechanics, animal models, and pelvic organ prolapse: A review. European Journal of Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology. 144, Suppl 1 146-158 (2009).
- Lowder, J. L., et al. Adaptations of the rat vagina in pregnancy to accommodate delivery. Obstetrics and Gynecology. 109 (1), 128-135 (2007).
- Koebele, S. V., et al. Hysterectomy uniquely impacts spatial memory in a rat model: A role for the nonpregnant uterus in cognitive processes. Endocrinology. 160 (1), 1-19 (2019).
- Kafantari, H., et al. Structural alterations in rat skin and bone collagen fibrils induced by ovariectomy. Bone. 26 (4), 349-353 (2000).
- Daghma, D. E. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers in bone matrix indicates bone quality in ovariectomized rat spine. Journal of Bone and Mineral Metabolism. 36 (3), 297-306 (2018).
- Manodoro, S., Frigerio, M., Milani, R., Spelzini, F. Tips and tricks for uterosacral ligament suspension: how to avoid ureteral injury. International Urogynecology Journal. 29 (1), 161-163 (2018).
