Summary
Dette papir beskriver brugen af et nyt, hurtigt optisk kamera til makroskopisk fotoluminescens levetidsbilleddannelse af prøver med lang henfaldsemission. Integrations-, billedoptagelses- og analyseprocedurerne beskrives sammen med forberedelsen og karakteriseringen af sensormaterialerne til billeddannelse og anvendelse af billeddanneren til undersøgelse af biologiske prøver.
Abstract
Dette papir præsenterer et nyt fotoluminescenslevetidskamera designet til at kortlægge koncentrationen af molekylært ilt (O2) i forskellige fosforescerende prøver, der spænder fra faststof, O2-følsomme belægninger til levende animalske vævsprøver farvet med opløseligeO2-følsomme sonder. Især blev den nanopartikelbaserede nær-infrarøde sonde NanO2-IR, som er spændende med en 625 nm lysemitterende diode (LED) og udsender ved 760 nm, brugt. Billedbehandlingssystemet er baseret på Timepix3-kameraet (Tpx3Cam) og den optomekaniske adapter, som også huser en billedforstærker. O2 phosphorescens levetid billeddannelse mikroskopi (PLIM) er almindeligt påkrævet for forskellige undersøgelser, men nuværende platforme har begrænsninger i deres nøjagtighed, generelle fleksibilitet og brugervenlighed.
Systemet, der præsenteres her, er et hurtigt og meget følsomt kamera, der er bygget på en integreret optisk sensor og udlæsningschipmodul, Tpx3Cam. Det er vist at producere højintensive phosphorescenssignaler og stabile levetidsværdier fra overfladefarvede tarmvævsprøver eller intraluminalt farvede fragmenter af tyktarmen og muliggør detaljeret kortlægning af vævO2-niveauer i ca. 20 s eller mindre. Indledende forsøg på billeddannelse af hypoxi i podede tumorer hos bevidstløse dyr præsenteres også. Vi beskriver også, hvordan kameraet kan omkonfigureres til brugmed O2-følsomme materialer baseret på Pt-porfyrinfarvestoffer ved hjælp af en 390 nm LED til excitation og et båndpas 650 nm filter til emission. Samlet set viste PLIM-kameraet sig at producere nøjagtige kvantitative målinger af levetidsværdier for de anvendte sonder og respektive todimensionelle kort overO2-koncentrationen . Det er også nyttigt til metabolisk billeddannelse af ex vivo vævsmodeller og levende dyr.
Introduction
O 2 er et af de vigtigste miljøparametre for levende systemer, og viden om fordelingen af O 2 og dens dynamik er vigtig for mange biologiske undersøgelser 1,2,3. Vurderingen af vævets iltning ved hjælp af fosforescerende sonder 4,5,6,7,8 og PLIM 9,10,11,12,13 vinder popularitet inden for biologisk og medicinsk forskning 3,9,14,15,16, 17,18,19. Dette skyldes, at PLIM, i modsætning til fluorescens- eller phosphorescensintensitetsmålinger, ikke påvirkes af eksterne faktorer såsom sondekoncentration, fotoblegning, excitationsintensitet, optisk justering, spredning og autofluorescens.
Imidlertid er nuværende O2 PLIM-platforme begrænset af deres følsomhed, billedoptagelseshastighed, nøjagtighed og generelle brugervenlighed. Tidskorreleret enkeltfotontælling (TCSPC) kombineret med en rasterscanningsprocedure bruges ofte i PLIM- og FLIM-enheder (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) 20,21,22. Men da PLIM kræver en lang pixelopholdstid (i millisekundområdet), er tiden for billedoptagelse meget længere end hvad der kræves til FLIM-applikationer20,22,23. Andre teknikker, såsom gated CCD / CMOS-kameraer, mangler enkelt fotonfølsomhed og har lave billedhastigheder20,24,25,26. Desuden anvendes de eksisterende PLIM-systemer mest i mikroskopisk format, mens makroskopiske systemer er mindre almindelige27.
Det TCSPC-baserede PLIM macro imager28 blev oprettet for at overvinde mange af disse begrænsninger. Kameraets design blev i høj grad lettet ved brug af en ny optomekanisk adapter, Cricket, som har følgende: i) to C-mount-adaptere, som giver nem kobling af kameramodulet på bagsiden og objektivobjektiv på forsiden; ii) et indvendigt hus til en billedforstærker og en stikkontakt til sidstnævnte på ydersiden af cricket; iii) et indvendigt rum bag C-monteringsadapteren på forsiden, hvor et standard 25 mm emissionsfilter kan anbringes foran forstærkeren og iv) en indbygget lyskolliderende optik med ringregulatorer, som tillader optisk justering / fokusering mellem linsen og kameraet for at producere skarpe billeder på kamerachippen.
I det samlede kamera er kameramodulet koblet til bagsiden af Cricket-adapteren, som også huser en billedforstærker bestående af en fotokatode efterfulgt af en mikrokanalplade (MCP), en forstærker og en hurtig scintillator, P47-fosfor. Et 760 nm ± 50 nm emissionsfilter er monteret inde i Cricket, og en objektivlinse, NMV-50M11'', er fastgjort til C-mount-adapteren på forsiden. Endelig er linsen og kameraet justeret optisk med ringregulatorer.
Forstærkerens rolle er at detektere indkommende fotoner og omdanne dem til hurtige lysudbrud på kamerachippen, som registreres og bruges til at generere emissionshenfald og levetidsbilleder. Kameramodulet består af et avanceret TCSPC-baseret optisk sensorarray (256 pixels x 256 pixels) og en ny generation af udlæsningschip 29,30,31,32,33, som muliggør samtidig registrering af ankomsttidspunktet (TOA) og tiden over tærsklen (TOT) for fotonudbrud ved hver pixel i billedchippen med en tidsopløsning på 1,6 ns og en udlæsningshastighed på 80 Mpixel/s.
I denne konfiguration har kameraet med forstærkeren enkeltfotonfølsomhed. Det er datadrevet og baseret på SPIDR-systemet (Speedy Pixel Detector Readout)34. Den rumlige opløsning af billeddanneren var tidligere karakteriseret med plane fosforescerendeO2-sensorer og en opløsningsplademaske. Instrumentresponsfunktionen (IRF) blev målt ved billeddannelse af en plan fluorescerende sensor under de samme indstillinger, som blev brugt til alle de andre målinger. Farvestoffets levetid på omkring 2,6 ns var kort nok til, at det kunne bruges til IRF-måling i PLIM-tilstand. Kameraet kan afbilde objekter på op til 18 mm x 18 mm i størrelse med rumlige og tidsmæssige opløsninger på henholdsvis 39,4 μm og 30,6 ns (fuld bredde ved halv maksimum)28.
Følgende protokoller beskriver samlingen af makrokameraet og dets efterfølgende anvendelse til kortlægning af O2-koncentrationen i biologiske prøver farvet med den tidligere karakteriserede nær-infrarødeO2-sonde, NanO2-IR35. Sonden er en lys, fotobar, cellegennemtrængelig O2-sensing sonde baseret på platin (II) benzoporphyrin (PtBP) farvestof. Det er spændende ved 625 nm, udsender ved 760 nm og giver et robust optisk respons på O2 i det fysiologiske område (0% -21% eller 0-210 μMO2). Billeddanneren er også demonstreret for at karakterisere forskellige sensormaterialer baseret på Pt(II)-porfyrinfarvestoffer. Samlet set er kameraet kompakt og fleksibelt, svarende til et almindeligt fotografisk kamera. I den nuværende opsætning er imageren velegnet til forskellige widefield PLIM-applikationer. Udskiftning af LED'en med en hurtig laserkilde vil yderligere forbedre billeddannerens ydeevne og kan potentielt muliggøre nanosekund FLIM-applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg med dyr blev udført i henhold til tilladelser udstedt af Health Products Regulatory Authority (HPRA, Irland) i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskabs rådsdirektiv (2010/63/EU) og blev godkendt af Animal Experimentation Ethics Committee ved University College Cork.
1. Forberedelse af prøver
- Farvning med sonde af levende vævsprøver ex vivo
- Til ex vivo-applikationer skal du bruge frisk isolerede vævsprøver fra 4 uger gamle kvindelige Balb/c-mus.
- På forsøgsdagen aflives en mus ved halshugning og dissekerer hurtigt fragmenter af tyktarmen (tyktarmen), ca. 10 mm i størrelse. De vaskes straks med PBS-buffer, anbringes i DMEM-medium suppleret med 10 mM Hepes-buffer (pH 7,2) og inkuberes ved 37 °C36.
- Til overfladefarvning af den serosale side af tarmen overføres de levende vævsprøver til en miniskål, påføres 2 ml komplet DMEM indeholdende 1 mg/ml NanO2-IR-sonde til at dække vævsprøverne, og de inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.
BEMÆRK: Celler i post mortem-væv forbliver levende i mange timer i kultur. NaNO2-IR viser mindre cytotoksicitet, så alle eksperimenterne blev afsluttet inden for 4 timer efter vævsisolering. - Ved intraluminal ex vivo-farvning af dybt væv overføres tarmstykkerne til en tør petriskål, og overskydende DMEM fjernes med filterpapir.
- Injicer 1 μL DMEM indeholdende 1 mg/ml NanO2-IR 35 i lumen med en Hamilton sprøjte, og inkuber prøverne i15 minutter eller i op til 4 timer.
BEMÆRK: NaNO2-IR viser mindre langsigtede cytotoksiske virkninger; Derfor bør alle forsøg afsluttes inden for 4 timer efter vævsisolering.
- Fremstilling af farvet tumorvæv hos levende dyr
- Til in vivo-applikationer forpletter CT26-celler i 18 timer i serumfrit medium indeholdende NaNO2-IR-sonde ved 0,05 mg/ml.
- Tag en mus, barber injektionsområdet i højre flanke og injicer med en sprøjte 200 μL af en blanding af 1 × 10 5 ikke-farvede celler og 1 × 105 celler forfarvet med NanO2-IR .
- Lad tumorer vokse i musene, overvåge tumorstørrelsen med en tykkelse og dyrets vægt periodisk37. Dyrene med podede tumorer bliver klar til billeddannelse på den syvende dag af tumorvækst.
BEMÆRK: Tumorvolumenet blev beregnet ved hjælp af ligning (1):
V = (L × W 2)/2 (1)
hvor L er tumorens diameter, og W is diameteren vinkelret på diameteren L. - Ofre dyrene ved cervikal dislokation lige før billeddannelsen.
2. Opsætning af PLIM-billedbehandling
- Tag Cricket-adapteren, og fjern dens C-monteringsadapter på bagsiden for at få adgang til forstærkerhuset indeni. Indsæt MCP-125-billedforstærkeren i dette rum, og sæt C-mount-adapteren tilbage.
- Fjern Crickets C-mount-adapter på forsiden, indsæt 760 nm ± 50 nm emissionsfilteret, og fastgør det ved at sætte C-mounten tilbage.
- Tilslut Tpx3Cam-kameramodulet til bagsiden af Cricket-modulet via dets C-mount-adapter
- Tilslut objektivet til forsiden af Cricket-modulet via dets C-mount-adapter.
- Monter hele kameraenheden oven på den optiske sorte boks med forsiden nedad til det trin, hvor prøverne skal afbildes (figur 1).
- Monter den 624 nm superlyse LED på en stolpe, der er forbundet til et brødbræt inde i den sorte boks.
- Tilslut LED'en til en strømforsyning og en pulsgenerator. Tænd LED'en, og fokuser den for at sikre effektiv og ensartet excitation af afbildede prøver.
- Tilslut kameraet til en anden pulsgenerator, og synkroniser de impulser, der sendes til kameraet og LED38.
- Brug det specielle kabel og stikket på Cricket-enheden til at slutte forstærkeren til en standard strømforsyning og indstil forstærkningen til 2,7 V.
- Brug objektivets og Cricket-adapterens fokuseringsfunktioner til at fokusere kameraoptikken på prøvetrinnet for at generere klare billeder af prøver med god kontrast og lysstyrke.
- Til billedbrug med Pt-porfyrinfarvestoffer skal du udskifte 625 nm LED med en 390 nm LED til excitation og udskifte 760 nm ± 50 nm filteret med et 650 nm ± 50 nm filter i Cricket-modulet.
3. Optagelse af billeder
- Placer prøven foran kameralinsen.
BEMÆRK: Brug et x-y-z justerbart trin som prøveholder for at justere prøvepositionen for god fokus. - Sluk for alle lysene i rummet.
- Tænd for Sophy-softwaren til indstilling af driftsparametrene, såsom fokusering og prøvejustering.
BEMÆRK: Sophy-software leveres sammen med kameraet for at indstille billedparametrene og registrere dataene. Sørg for, at softwaren er tilsluttet kameraet ved at kontrollere kamerakoden. Vi brugte dog et andet program til dataindsamling. - Vælg uendelige billeder i Moduler, og indstil pixeldriftstilstanden til tid over tærsklen.
- I Moduler skal du gå til Eksempel og vælge Aktivt modul. Dette åbner vinduet Medpix/Timpix Frames .
- I dette vindue skal du ændre farveskalaen og rotere billedet til den ønskede retning.
- Tænd for forstærkeren, og start optagelsen.
BEMÆRK: Brug optagelsesskærmen i Sophy-softwaren til visuelt at bekræfte prøvens justering og fokus og til at optimere LED-excitationsparametrene til optagelse. - Stop optagelsen, og luk Sophy-softwaren.
- Gå til terminalen, og brug den specialdesignede software til at erhverve rådataene i det binære format og efterbehandle dem (https://github.com/svihra/TimePix3).
- Kør følgende kommandoer i terminalen for at registrere dataene:
Cd-dokument/SPIDR/trunk/Release/
Ls
./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Filens navn} - t {anskaffelsestid}
BEMÆRK: Når du skriver "ls", skal du kontrollere listen over filer i den aktuelle mappe; bekræfte, at Tpx3daq ses. - Vent, indtil alle rammerne er optaget.
- For at behandle dataene skal du køre følgende kommandoer i terminalen:
cd-dokumenter/databehandling/timepix3/timepix3/
rod
. L dataproces.cpp++
.x DRGUI. C - Vent på, at et RRGui-vindue åbnes. Vælg alle variablerne til venstre og Alle data, Enkelt fil og Centroid til højre.
- Vælg den fil, der skal behandles, og kør datareduktionen.
BEMÆRK: Alle de behandlede filer vises i samme mappe som raw-filen.
- Kør følgende kommandoer i terminalen for at registrere dataene:
4. Analyse af data
- Analyser de efterbehandlede data med et dedikeret program skrevet på C-sprog, der skriver dataene i en .ics billedfil (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).
- Åbn de .ics billedfiler ved hjælp af den frit tilgængelige Time Resolved Imaging-software (se Materialetabel). Brug to eksponentielle funktioner til at tilpasse fosforescenshenfaldene.
- Åbn de tilpassede .ics billedfiler med den tilgængelige billedanalysesoftware (se materialetabel).
- Brug opslagstabeller til at generere billeder af phosphorescenslevetid, og kod dem i pseudofarveskala (f.eks. blå farve for korte levetider og rød for lange levetider). Brug funktionen Måling til at beregne de gennemsnitlige levetidsværdier for hele billedet eller bestemte interesseområder.
- Omregning af levetidsværdierne til oxygenkoncentrationen ved hjælp af ligningen opnået ved montering afO2-kalibreringen af sonden36.
BEMÆRK: Ligning (2) blev brugt til dette arbejde:
O2 [μM] = -86,16 + 770,35 × e-0,049 × LT (2)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Til ex vivo-billeddannelsesapplikationer blev fragmenter af tarmvæv farvet ved topisk anvendelse af NanO2-IR-sonden på den serosale side af vævet. For dybere farvning blev 1 μL af sonden injiceret i lumen. I sidstnævnte tilfælde skærmede den 0,2-0,25 mm tykke tarmvæg sonden fra kameraet. De to farvningsprocesser er vist i figur 2A.
Den resulterende intensitet og PLIM-billeder er vist i figur 2B-G. Farverne afspejler tydeligt forskellen i levetidsværdier og dermed forskellen i iltning af vævets serosale og slimhindesider. Figur 2C og figur 2D henviser til lignende sæt væv, der blev farvet topisk (figur 2C) og intraluminalt (figur 2D). Som forventet viste vævene lignende PLIM-mønstre. Imidlertid viste den intraluminale farvning af slimhindesiden af vævet (figur 2D) højere levetidsværdier, hvilket afspejler lavere iltning i tarmens indre overflade sammenlignet med den aktuelle farvning af den serosale side (figur 2C), som viste lavere levetider. Dette afspejler højere iltning i tarmens ydre overflade.
For at undersøge stabiliteten af livstidssignalerne og tarmens åndedrætsaktivitet blev der udført en time-lapse PLIM-analyse på de intraluminalt farvede prøver over 2 timer (figur 2D-G). Der blev observeret en stigning i levetidsværdierne mellem 15 minutter (54,4 μs ± 0,9 μs) og 2 timer (61,1 μs ± 0,8 μs) af inkubationen, hvilket afspejler en reduktion iO2-niveauerne i tarmens luminale del. Derudover viser de laveO2-niveauer efter 2 timers inkubation, at vævsrespiration fortsatte i hele perioden med dissektion, forberedelse, farvning, inkubation og billeddannelse. Derudover kan ændringen i formen af lumen observeret i figur 2D-G tilskrives fordelingen af sonden injiceret i lumen, hvilket betyder, at LT-signalet afspejler det område, hvor sonden er placeret.
For at vurdere billeddannerens fremtidige ydeevne in vivo blev der udført en indledende undersøgelse af billeddannelse af hypoxi i podede subkutane tumorer dyrket hos mus umiddelbart efter ofring (figur 3). I dette tilfælde blev Balb/c-mus injiceret subkutant i højre flanke med 200 μL af en blanding af CT26-celler, som var ufarvede eller farvede med en 0,05 mg/ml NanO2-IR-sonde. PLIM blev udført på den syvende dag af tumorvæksten, og musene blev ofret lige før billeddannelsen (dvs. post mortem). Billeder af tumorområderne i musene på den syvende vækstdag er vist i figur 3A, B.
Intensitetsbillederne (venstre) og PLIM (højre) for tumorområderne i musene på den syvende dag med tumorvækst (figur 3B) viser ydeevnen og følsomheden af både billeddanneren og sonden i sådanne eksperimenter (mere detaljerede statistiske data ikke vist). Dyrene blev afbildet i 20 s hver. Musenes venstre flanker blev barberet og afbildet som et tomt. De producerede ingen PLIM-signaler. I modsætning hertil producerede regioner med tumoren og sonden stabile levetidssignaler på ~ 50 μs. Formålet med dette forsøg var at evaluere billeddannerens anvendelighed til in vivo-undersøgelser med levende dyr og modeller af sygdomme hos mennesker. Mens denne del viste foreløbige kvalitative resultater, er et tilsvarende papir under udarbejdelse, som giver en mere grundig kvantitativ vurdering.
Dernæst blev billeddanneren også demonstreret i PLIM-billeddannelse af sensormaterialer baseret på Pt(II)-porfyrinfarvestoffer. Den kemiske struktur af Pt-octaethylporphinfarvestof (PtOEP) og tekniske detaljer for fremstillingen af de tilsvarende sensormaterialer er beskrevet andetsteds 6,39. De PtOEP-polystyrenbaserede phosphorescent faststofsensorbelægninger deponeret på en gennemsigtig polyesterfilm (Mylar) som små pletter blev afbildet ved at nedsænke filmen i PBS-buffer (luftmættet iltet tilstand) eller i PBS indeholdende glucose og glucoseoxidase, hvilket giver en fuldt deoxygeneret tilstand. Levetidssignalerne opnået under iltede (25,6 μs ± 0,5 μs) og deoxygenerede betingelser (65,7 μs ± 1,5 μs) svarede til de tidligere rapporterede resultater6. Intensiteten og PLIM-billederne af de iltede og deoxygenerede sensorer er vist i figur 4A, B.
Figur 1: Eksperimentel opsætning af imager38. Genoptrykt med tilladelse fra Sen et al.38. Copyright: Det optiske samfund. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: O 2 PLIM af de topisk og intraluminalt farvede tarmprøver fra mus. (A) Illustration af de to farvningsmetoder ved hjælp af (B) phosphorescensintensitet og (C) PLIM-billeder af tarmen topisk farvet med NanO2-IR-sonden. (D-G) Timelapse PLIM i den intraluminalt farvede tarm 15 min, 30 min, 1 time og 2 timer efter farvning. PLIM-billederne præsenteres i en pseudofarveskala: den blå farve svarer til en lavere levetid, og den røde farve svarer til højere levetidsværdier. Skalastænger = 5 mm. Forkortelse: PLIM = phosphorescens levetid billeddannelse mikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: O2 PLIM af podede tumorer i musenes højre flanker . (A) Grafisk illustration af tumorudvikling hos levende dyr. Phosphorescensintensitet (venstre) og PLIM (højre) billeder af tumorområder på (B) syvende dag af tumorvækst. PLIM-billedet præsenteres i en pseudofarveskala: den blå farve svarer til en lavere levetid, og den røde farve svarer til højere levetidsværdier. Skalabjælke = 5 mm. Forkortelse: PLIM = phosphorescens levetid billeddannelse mikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Phosphorescensintensitet af det PtOEP-baserede sensorpunkt. Fosforescensintensitet (venstre) og PLIM (højre) billeder af PtOEP-sensorpunktet i (A) iltede og (B) deoxygenerede tilstande. PLIM-billederne præsenteres i en pseudofarveskala: den blå svarer til en lavere levetid, og den røde farve svarer til højere levetidsværdier. Forkortelser: PLIM = phosphorescens-livstidsbilledmikroskopi; PtOEP = platinoctaethylporfyrin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovenstående protokoller giver en detaljeret beskrivelse af samlingen af det nye kamera og dets funktion i mikrosekund FLIM/PLIM-tilstand. Det TCSPC-baserede nye generation Tpx3Cam-kamera, kombineret med den optomekaniske adapter Cricket med billedforstærkeren, emissionsfilteret og makroobjektivet, producerer et stabilt, kompakt og fleksibelt optisk modul, der er let at betjene. Billeddanneren viste sig at fungere godt med en række forskellige prøver og analytiske opgaver, som omfattede karakterisering af fosforescerende materialer og levende vævO2-billeddannelse . Den nær-infrarøde Pt (II) -benzoporfyrinbaserede cellegennemtrængelige opløselige sonde NanO2-IR og de rødemitterende Pt (II) -porfyrinbaserede faststofsensorer blev brugt i billeddannelseseksperimenterne. Disse sensorer er med succes blevet brugt til slukket fosforescensdetektion afO2 på grund af deres store Stokes 'skift, lang emissionslevetid, høj følsomhed, hurtig respons og god fotokemisk stabilitet.
Disseforskellige O2-følsomme sonder og faststofbelægninger gav resultater, der var i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte data40, når de blev testet på makrobilledet. Materialerne viste god ensartethed, kontrast og levetidsreaktioner på skiftende miljøforhold, især med hensyn til temperatur og iltningstilstand. Sammenligningen af disse resultater med dem, der produceres på det konfokale TCSPC-PLIM-mikroskop, viser, at det nye kamera er nøjagtigt, har levetidsaflæsninger af bedre kvalitet og erhverver PLIM-billeder med høj hastighed og følsomhed28,38,40.
Billeddanneren viste også lovende ydeevne med fosforescerende farvede biologiske prøver af forskellige typer. Således blev der produceret detaljeredeO2-koncentrationskort for prøverne indeholdende suspensioner af farvede respirationsceller, levende postmortem dyrevæv, hele organer og podede tumorer. Billeddanneren har leveret målinger af levetidsværdier fra overfladen og endda i dybder på op til 0,5 mm inde i vævet28,36,38.
Da phosphorescenslevetidsværdierne påvirkes stærkt af temperatur41, er det nødvendigt at gennemføre stram temperaturkontrol af prøverne, f.eks. ved anvendelse af et opvarmet prøvetrin og/eller et inkubatorkammer. Når du bruger UV-excitation, er det vigtigt omhyggeligt at vælge prøveholderne, da mange materialer besidder autofluorescens i dette spektralområde, hvilket påvirker prøvens sande levetidsværdi. Al PLIM-billeddannelse i denne undersøgelse blev udført ved en LED-effekt på 4 V og en pulsbredde på 50 ns for en integrationstid på 20 s; Disse parametre kan dog justeres efter behov. Cirka 104.500 billeder optages i løbet af 20 s billedoptagelsestid. Endelig er det vigtigt at udføre målingerne i et mørkt kammer for at undgå interferens i det omgivende lys.
PLIM-kameraet kan således udføre hurtige, kvantitative levetidsmålinger med makroskopiske objekter af betydelig størrelse. Mens laserscanning af PLIM-TCSPS er mulig, ville det være for langsomt på grund af de lange opholdstider, der kræves for de iltfølende farvestoffer. Dette kamera er dog hurtigt og kan optage alle pixels samtidigt. Yderligere, intensitetsbaserede målinger kan påvirkes af fluorescerende / fosforescerende farvestofkoncentration, en ustabil LED eller laserintensiteter, fotoblegning, justering af de optiske komponenter, og spredning fra prøverne. I modsætning hertil er det TCSPC-baserede makrokamera i det væsentlige uafhængigt af disse faktorer. Derfor kan den udføre nøjagtige og kalibreringsfrie målinger afO2. Ulemperne ved kameraet inkluderer dets relativt komplekse databehandling og store datastørrelser (~ 2 Gb).
I fremtiden kan kameraet også bruges ikke kun til at kortlæggeO2-koncentrationer , men også andre kemiske og biokemiske parametre for testede prøver, såsom pH- og glukosedynamikken, ved hjælp af de tilsvarende sonder eller sensorer. Dette gør det til et nyttigt værktøj til fysiologiske undersøgelser med forskellige vævs- og sygdomsmodeller. Imageren kan også opgraderes til at fungere i nanosekund FLIM-tilstand. Dette kræver dog, at de nuværende lysdioder udskiftes med en hurtigere excitationskilde (f.eks. En ps-laser). Systemdrift i dobbelt PLIM/FLIM-tilstand er også principielt mulig.
Alt i alt demonstrerer imageren enkelhed og alsidighed sammen med god funktionalitet og operationel ydeevne i widefield TCSPC-PLIM-applikationer. Kommercielt tilgængelige vidvinkelbilleddannere udfører for det meste intensitetsbaseret billeddannelse, hvor fosforescerende intensiteter kan påvirkes af faktorer som fotoblegning, målegeometri, spredning fra prøver osv. Det nuværende billedapparat er baseret på livstidsbilleddannelse, hvilket gør målingerne noget mere kvantitative end kvalitative. Desuden giver integrationen af det optiske Tpx3Cam-kamera med Cricket-adapteren og billedforstærkeren enkeltfotonfølsomhed, enkelhed, fleksibilitet og robusthed af målingerne. I modsætning til andre systemer kan den transporteres til forsøgsstedet og drejes 360° baseret på kravene til prøven og måleopgaven. Med sit nuværende mål, som er let at ændre til et andet objektiv, kan kameraet måle prøver op til 18 mm x 18 mm i størrelse på få sekunder og med en høj rumlig opløsning på 256 pixels x 256 pixels. Dette papir beskriver trin for trin procedurer for, hvordan man forbereder prøver til test og bruger imageren i de forskellige PLIM-applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Økonomisk støtte til dette arbejde fra Science Foundation Ireland, tilskud SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 og 18/SP/3522 og Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) anerkendes med taknemmelighed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
References
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
- Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
- Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
- Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
- Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
- Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
- Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
- Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
- Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
- Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
- Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).
- Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
- Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
- Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
- Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. Becker, W. , Springer. Cham, Switzerland. 225-247 (2015).
- Becker, W. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. König, K. , De Gruyter. Berlin, Germany. 23-52 (2018).
- Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800 (2017).
- Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).
- Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).
- Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).
- Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, Springer. Cham, Switzerland. (2017).
- Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).
- Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
- Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
- Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).
- Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).
- Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).
- Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006 (2020).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
- Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
- Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
- Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).
- Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M.
