Summary
Detta dokument beskriver användningen av en ny, snabb optisk kamera för makroskopisk fotoluminiscenslivstidsavbildning av långa sönderfallsemitterande prover. Integrations-, bildförvärvs- och analysprocedurerna beskrivs, tillsammans med förberedelse och karakterisering av sensormaterialen för avbildning och tillämpning av kameran vid studier av biologiska prover.
Abstract
Denna artikel presenterar en ny fotoluminiscensavlivningskamera utformad för att kartlägga koncentrationen av molekylärt syre (O2) i olika fosforescerande prover, allt från fasta tillståndet, O2-känsliga beläggningar till levande djurvävnadsprover färgade med lösligaO2-känsliga sonder. I synnerhet användes den nanopartikelbaserade nära infraröda sonden NanO2-IR, som är exciterbar med en 625 nm ljusemitterande diod (LED) och avger vid 760 nm. Bildsystemet är baserat på Timepix3-kameran (Tpx3Cam) och den optomekaniska adaptern, som också rymmer en bildförstärkare. O2-fosforescenslivstidsavbildningsmikroskopi (PLIM) krävs vanligtvis för olika studier, men nuvarande plattformar har begränsningar i deras noggrannhet, allmänna flexibilitet och användbarhet.
Systemet som presenteras här är en snabb och mycket känslig kamera, som bygger på en integrerad optisk sensor och avläsningschipmodul, Tpx3Cam. Det har visat sig producera högintensiva fosforescenssignaler och stabila livstidsvärden från ytfärgade tarmvävnadsprover eller intraluminalt färgade fragment av tjocktarmen och möjliggör detaljerad kartläggning av vävnad O2-nivåer på cirka 20 s eller mindre. Inledande experiment på avbildning av hypoxi i ympade tumörer hos medvetslösa djur presenteras också. Vi beskriver också hur kameran kan konfigureras om för användning med O2-känsliga material baserat på Pt-porfyrinfärgämnen med hjälp av en 390 nm LED för excitationen och ett bandpass 650 nm filter för emission. Sammantaget visade sig PLIM-kameran producera exakta kvantitativa mätningar av livstidsvärden för de använda sonderna och respektive tvådimensionella kartoröver O2-koncentrationen. Det är också användbart för metabolisk avbildning av ex vivo-vävnadsmodeller och levande djur.
Introduction
O 2 är en av de viktigaste miljöparametrarna för levande system, och kunskap om fördelningen av O 2 och dess dynamik är viktig för många biologiska studier 1,2,3. Bedömningen av vävnadens syresättning med hjälp av fosforescerande sonder 4,5,6,7,8 och PLIM 9,10,11,12,13 blir allt populärare inom biologisk och medicinsk forskning 3,9,14,15,16, 17,18,19. Detta beror på att PLIM, till skillnad från fluorescens- eller fosforescensintensitetsmätningar, inte påverkas av yttre faktorer som sondkoncentration, fotoblekning, excitationsintensitet, optisk inriktning, spridning och autofluorescens.
Nuvarande O2 PLIM-plattformar begränsas dock av deras känslighet, bildinsamlingshastighet, noggrannhet och allmänna användbarhet. Tidskorrelerad single photon counting (TCSPC), i kombination med en rasterskanningsprocedur, används ofta i PLIM- och fluorescenslivstidsbildmikroskopi (FLIM) enheter20,21,22. Men eftersom PLIM kräver en lång pixeluppehållstid (i millisekundområdet) är tiden för bildförvärv mycket längre än vad som krävs för FLIM-applikationer20,22,23. Andra tekniker, såsom gated CCD / CMOS-kameror, saknar enkel fotonkänslighet och har låga bildhastigheter20,24,25,26. Dessutom används de befintliga PLIM-systemen oftast i mikroskopiskt format, medan makroskopiska system är mindre vanliga27.
Den TCSPC-baserade PLIM-makrokameran28 inrättades för att övervinna många av dessa begränsningar. Utformningen av kameran underlättades kraftigt av användningen av en ny optomekanisk adapter, Cricket, som har följande: i) två C-monterade adaptrar, som ger enkel koppling av kameramodulen på baksidan och objektivlinsen på framsidan; ii) ett inre hölje för en bildförstärkare och ett eluttag för den senare på Crickets utsida; iii) Ett inre utrymme bakom adaptern på framsidan av C-fattningen där ett standardfilter för 25 mm utsläpp kan placeras framför förstärkaren. och iv) en inbyggd ljuskollimeringsoptik med ringregulatorer, som möjliggör optisk inriktning / fokusering mellan linsen och kameran för att producera skarpa bilder på kamerachipet.
I den monterade kameran är kameramodulen kopplad till baksidan av Cricket-adaptern, som också rymmer en bildförstärkare bestående av en fotokatod följt av en mikrokanalplatta (MCP), en förstärkare och en snabb scintillator, P47-fosfor. Ett 760 nm ± 50 nm emissionsfilter är monterat inuti Cricket, och en objektivlins, NMV-50M11'', är fäst på framsidan C-mount adapter. Slutligen är linsen och kameran optiskt inriktade mot ringregulatorer.
Förstärkarens roll är att upptäcka inkommande fotoner och omvandla dem till snabba ljusutbrott på kamerachipet, som registreras och används för att generera emissionsförfall och livstidsbilder. Kameramodulen består av en avancerad TCSPC-baserad optisk sensoruppsättning (256 pixlar x 256 pixlar) och en ny generation avläsningschip 29,30,31,32,33, som möjliggör samtidig inspelning av ankomsttid (TOA) och tid över tröskel (TOT) för fotonskurar vid varje pixel i bildchipet med en tidsupplösning på 1,6 ns och en avläsningshastighet på 80 Mpixel/s.
I denna konfiguration har kameran med förstärkaren enfotonkänslighet. Den är datadriven och baserad på SPIDR-systemet (speedy pixel detector readout)34. Kamerans rumsliga upplösning karakteriserades tidigare med plana fosforescerande O2-sensorer och en upplösningsplattmask. Instrumentets responsfunktion (IRF) mättes genom avbildning av en plan fluorescerande sensor under samma inställningar som används för alla andra mätningar. Färgämnets livslängd på cirka 2,6 ns var tillräckligt kort för att det skulle kunna användas för IRF-mätning i PLIM-läge. Kameran kan avbilda objekt upp till 18 mm x 18 mm i storlek med rumsliga och tidsmässiga upplösningar på 39,4 μm och 30,6 ns (full bredd vid halvmaximalt), respektive28.
Följande protokoll beskriver sammansättningen av makrokameran och dess efterföljande användning för kartläggning avO2-koncentrationen i biologiska prover färgade med den tidigare karakteriserade nära infraröda O2-sonden, NanO2-IR 35. Sonden är en ljusstark, fotostabil, cellgenomsläpplig O2-avkännande sond baserad på platina (II) bensoporfyrin (PtBP) färgämne. Det är retbart vid 625 nm, avger vid 760 nm och ger ett robust optiskt svar påO2 i det fysiologiska området (0% -21% eller 0-210 μM avO2). Kameran demonstreras också karakterisera olika sensormaterial baserat på Pt(II)-porfyrinfärgämnen. Sammantaget är kameran kompakt och flexibel, liknar en vanlig fotografisk kamera. I den aktuella inställningen är kameran lämplig för olika widefield PLIM-applikationer. Att ersätta lysdioden med en snabb laserkälla kommer att ytterligare förbättra kamerans prestanda och kan potentiellt möjliggöra nanosekund FLIM-applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök med djur utfördes enligt tillstånd utfärdade av Health Products Regulatory Authority (HPRA, Irland) i enlighet med Europeiska gemenskapernas rådsdirektiv (2010/63 / EU) och godkändes av Animal Experimentation Ethics Committee vid University College Cork.
1. Beredning av prov
- Färgning med sond av levande vävnadsprover ex vivo
- För ex vivo-applikationer , använd nyligen isolerade vävnadsprover från 4 veckor gamla kvinnliga Balb / c-möss.
- På dagen för experimentet, avliva en mus genom halshuggning och dissekera snabbt fragment av tjocktarmen (tjocktarmen), ca 10 mm i storlek. Tvätta dem omedelbart med PBS-buffert, placera dem i DMEM-medium kompletterat med 10 mM Hepes-buffert (pH 7,2) och inkubera vid 37 °C36.
- För ytfärgning av tarmens serösa sida, överför de levande vävnadsproverna till en miniskål, applicera 2 ml komplett DMEM innehållande 1 mg/ml NanO2-IR-sond för att täcka vävnadsproverna och inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
OBS: Celler i postmortemvävnad förblir levande i många timmar i odling. NaNO2-IR visar mindre cytotoxicitet, så alla experiment slutfördes inom 4 timmar efter vävnadsisolering. - För intraluminal ex vivo-färgning av djup vävnad, överför tarmbitarna till en torr petriskål och ta bort eventuellt överskott av DMEM med filterpapper.
- Injicera 1 μl DMEM innehållande 1 mg/ml NanO2-IR 35 i lumen med en Hamilton-spruta och inkubera proverna i15 minuter eller upp till 4 timmar.
OBS: NaNO2-IR visar mindre långsiktiga cytotoxiska effekter; Därför bör alla experiment slutföras inom 4 timmar efter vävnadsisolering.
- Beredning av färgad tumörvävnad hos levande djur
- För in vivo-applikationer , förfärga CT26-celler i 18 timmar i serumfritt medium innehållande NaNO2-IR-sond vid 0,05 mg/ml.
- Ta en mus, raka injektionsområdet i höger flank och injicera med en spruta 200 μL av en blandning av 1 × 10 5 icke-färgade celler och 1 × 105 celler förfärgade med NanO2-IR .
- Låt tumörer växa i mössen, övervaka tumörstorleken med en bromsok och djurvikten regelbundet37. Djuren med ympade tumörer blir redo för avbildning på den sjunde dagen av tumörtillväxt.
OBS: Tumörvolymen beräknades med ekvation (1):
V = (L × W 2)/2 (1)
där L är tumörens diameter och W is diametern vinkelrätt mot diametern L. - Offra djuren genom cervikal dislokation strax före avbildningen.
2. Inställning av PLIM-avbildning
- Ta Cricket-adaptern och ta bort dess baksida C-mount-adaptern för att få tillgång till förstärkarhuset inuti. Sätt i MCP-125-bildförstärkaren i det här facket och sätt tillbaka C-fattningsadaptern.
- Ta bort Crickets främre adapter för C-fattning, sätt i emissionsfiltret på 760 nm ± 50 nm och åtgärda det genom att sätta tillbaka C-fästet.
- Anslut Tpx3Cam-kameramodulen till baksidan av Cricket-modulen via dess C-fattningsadapter
- Anslut objektivet till framsidan av Cricket-modulen via C-fattningsadaptern.
- Montera hela kameraenheten ovanpå den optiska svarta lådan, vänd nedåt mot scenen där proverna kommer att avbildas (figur 1).
- Montera den 624 nm superljusa lysdioden på en stolpe ansluten till en brödbräda inuti den svarta lådan.
- Anslut lysdioden till en strömförsörjning och en pulsgenerator. Slå på lysdioden och fokusera den för att säkerställa effektiv och enhetlig excitation av avbildade prover.
- Anslut kameran till en annan pulsgenerator och synkronisera pulserna som skickas till kameran och LED38.
- Anslut förstärkaren till en vanlig strömförsörjning med den speciella kabeln och uttaget på Cricket-enheten och ställ in förstärkningen på 2,7 V.
- Använd linsens och cricketadapterns fokuseringsfunktioner och fokusera kameraoptiken på provsteget för att generera tydliga bilder av prover med god kontrast och ljusstyrka.
- För användning av kameran med Pt-porfyrinfärger, byt ut 625 nm LED med en 390 nm LED för excitation och ersätt 760 nm ± 50 nm-filtret med ett 650 nm ± 50 nm-filter i Cricket-modulen.
3. Bildinsamling
- Placera provet framför kameralinsen.
OBS: Använd ett x-y-z justerbart steg som provhållare för att justera provpositionen för bra fokus. - Stäng av alla lampor i rummet.
- Slå på Sophy-programvaran för att ställa in driftsparametrarna, såsom fokusering och provjustering.
OBS: Sophy-programvaran tillhandahålls tillsammans med kameran för att ställa in bildparametrarna och spela in data. Se till att programvaran är ansluten till kameran genom att kontrollera kamerakoden. Vi använde dock ett annat program för datainsamling. - I Moduler väljer du oändliga bildrutor och ställer in pixeloperationsläget på tid över tröskelvärdet.
- I Moduler går du till Förhandsgranskning och väljer Aktiv modul. Detta öppnar fönstret Medpix / Timpix Frames .
- I det här fönstret ändrar du färgskalan och roterar bilden till önskad orientering.
- Slå på förstärkaren och starta inspelningen.
OBS: Använd inspelningsskärmen i Sophy-programvaran för att visuellt bekräfta provets inriktning och fokus och för att optimera LED-excitationsparametrarna för inspelning. - Stoppa inspelningen och stäng Sophy-programvaran.
- Gå till terminalen och använd den specialdesignade programvaran för att hämta rådata i binärt format och efterbehandla det (https://github.com/svihra/TimePix3).
- Kör följande kommandon i terminalen för att registrera data:
cd-dokument/spidr/trunk/release/
Ls
./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Filens namn} - t {förvärvstid}
OBS: När du skriver "ls", kontrollera listan över filer i den aktuella katalogen; bekräfta att Tpx3daq visas. - Vänta tills alla bildrutor har spelats in.
- För att bearbeta data, kör följande kommandon i terminalen:
cd-dokument/DataProcessing/Timepix3/Timepix3/
rot
. L dataprocess.cpp++
.x DRGUI. C - Vänta tills ett RRGui-fönster öppnas. Markera alla variabler till vänster och Alla data, En fil och Centroid till höger.
- Välj filen som ska bearbetas och kör datareduceraren.
Alla bearbetade filer visas i samma mapp som den råa filen.
- Kör följande kommandon i terminalen för att registrera data:
4. Analys av data
- Analysera efterbehandlade data med ett dedikerat program skrivet i C-språk som skriver data till en .ics bildfil (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).
- Öppna .ics bildfilerna med hjälp av det fritt tillgängliga programmet Time Resolved Imaging (se Materialförteckning). Använd tvåexponentiella funktioner för att passa fosforescenssönderfallen.
- Öppna de anpassade .ics bildfilerna med det tillgängliga bildanalysprogrammet (se Materialförteckning).
- Använd uppslagstabeller, generera fosforescenslivstidsbilder och koda dem i pseudofärgskala (t.ex. blå färg för korta livslängder och röd för långa livslängder). Använd funktionen Mät för att beräkna de genomsnittliga livslängdsvärdena för hela bilden eller specifika intressanta regioner (ROI).
- Konvertera livslängdsvärdena till syrekoncentrationen med hjälp av ekvationen som erhålls vid montering avO2-kalibreringen av sonden36.
OBS: Ekvation (2) användes för detta arbete:
O2 [μM] = −86,16 + 770,35 × e−0,049 × LT (2)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För ex vivo-avbildningsapplikationer färgades fragment av tarmvävnader genom topikal applicering av NanO2-IR-sonden på vävnadens serösa sida. För djupare färgning injicerades 1 μL av sonden i lumen. I det senare fallet skyddade den 0,2-0,25 mm tjocka tarmväggen sonden från kameran. De två färgningsprocesserna visas i figur 2A.
Den resulterande intensiteten och PLIM-bilderna presenteras i figur 2B-G. Färgerna återspeglar tydligt skillnaden i livstidsvärden och därmed skillnaden i syresättning av vävnadens serösa och slemhinnesidor. Figur 2C och figur 2D avser liknande uppsättningar vävnader som färgats lokalt (figur 2C) och intraluminalt (figur 2D). Som förväntat visade vävnaderna liknande PLIM-mönster. Den intraluminala färgningen av vävnadens slemhinnesida (figur 2D) visade emellertid högre livstidsvärden, vilket återspeglar lägre syresättning i tarmens inre yta, jämfört med den topiska färgningen av serosalsidan (figur 2C), som visade lägre livslängder. Detta återspeglar högre syresättning i tarmens yttre yta.
För att undersöka stabiliteten hos livstidssignalerna och andningsaktiviteten i tarmen utfördes en time-lapse PLIM-analys på de intraluminalt färgade proverna över 2 timmar (figur 2D-G). En ökning av livstidsvärdena observerades mellan 15 min (54,4 μs ± 0,9 μs) och 2 h (61,1 μs ± 0,8 μs ) av inkubationen, vilket återspeglar en minskning avO2-nivåerna i tarmens luminala del. Dessutom visar de lågaO2-nivåerna efter 2 timmars inkubation att vävnadspirationen fortsatte under hela perioden av dissektion, beredning, färgning, inkubation och bildsteg. Dessutom kan förändringen i formen på lumen som observerats i figur 2D-G hänföras till fördelningen av sonden som injiceras i lumen, vilket innebär att LT-signalen återspeglar området där sonden är belägen.
För att bedöma kamerans framtida prestanda in vivo genomfördes en inledande studie om avbildning av hypoxi i ympade subkutana tumörer odlade i möss omedelbart efter avlivning (figur 3). I detta fall injicerades Balb/c-möss subkutant i den högra flanken med 200 μL av en blandning av CT26-celler, som var ofärgade eller färgade med en 0,05 mg/ml NanO2-IR-sond. PLIM utfördes på den sjunde dagen av tumörtillväxten, och mössen offrades strax före avbildningen (dvs obduktion). Bilder av tumörområdena hos mössen på den sjunde tillväxtdagen visas i figur 3A,B.
Intensitetsbilderna (vänster) och PLIM (höger) för tumörområdena hos mössen på den sjunde dagen av tumörtillväxt (figur 3B) visar prestanda och känslighet hos både kameran och sonden i sådana experiment (mer detaljerade statistiska data visas inte). Djuren avbildades i 20 s vardera. Mössens vänstra sidor rakades och avbildades som ett ämne. De producerade inga PLIM-signaler. Däremot producerade regioner med tumören och sonden stabila livstidssignaler på ~ 50 μs. Syftet med detta experiment var att utvärdera användbarheten av kameran för in vivo-studier med levande djur och modeller av mänsklig sjukdom. Medan denna del visade preliminära kvalitativa resultat, håller ett motsvarande dokument på att utarbetas, vilket ger en mer grundlig kvantitativ bedömning.
Därefter demonstrerades kameran också i PLIM-avbildning av sensormaterial baserat på Pt (II) -porfyrinfärgämnen. Den kemiska strukturen hos Pt-oktaetylporfinfärgämne (PtOEP) och tekniska detaljer för beredningen av motsvarande sensormaterial beskrivs på annan plats 6,39. De PtOEP-polystyrenbaserade fosforescerande solid state-sensorbeläggningarna avsattes på en transparent polyesterfilm (Mylar) som små fläckar avbildades genom att sänka filmen i PBS-buffert (luftmättat syresatt tillstånd) eller i PBS innehållande glukos och glukosoxidas, vilket ger ett fullständigt deoxygenerat tillstånd. Livstidssignalerna erhållna under syresatta (25,6 μs ± 0,5 μs) och deoxygenerade förhållanden (65,7 μs ± 1,5 μs) matchade de resultat som rapporterats tidigare6. Intensitets- och PLIM-bilderna av de syresatta och syrefria sensorerna ges i figur 4A, B.
Figur 1: Experimentell installation av kameran38. Omtryckt med tillstånd från Sen et al.38. Upphovsrätt: The Optical Society. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: O2 PLIM för de topiskt och intraluminalt färgade mustarmproverna. (A) Illustration av de två färgningsmetoderna med användning av (B) fosforescensintensitet och (C) PLIM-bilder av tarmen lokalt färgad med NanO2-IR-sonden. (D-G) Timelapse PLIM i den intraluminalt färgade tarmen vid 15 min, 30 min, 1 h och 2 h efter färgning. PLIM-bilderna presenteras i en pseudofärgskala: den blå färgen motsvarar en lägre livslängd och den röda färgen motsvarar högre livstidsvärden. Skalstänger = 5 mm. Förkortning: PLIM = fosforescens livstidsavbildningsmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: O2 PLIM av ympade tumörer i mössens högra sidor . (A) Grafisk illustration av tumörutveckling hos levande djur. Fosforescensintensitet (vänster) och PLIM (höger) bilder av tumörområden på (B) sjunde dagen av tumörtillväxt. PLIM-bilden presenteras i en pseudofärgskala: den blå färgen motsvarar en lägre livslängd och den röda färgen motsvarar högre livstidsvärden. Skalstång = 5 mm. Förkortning: PLIM = fosforescens livstidsavbildningsmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Fosforescensintensitet för den PtOEP-baserade sensorpunkten. Fosforescensintensitet (vänster) och PLIM (höger) bilder av PtOEP-sensorns punkt i (A) syresatt och (B) syresatt tillstånd. PLIM-bilderna presenteras i en pseudofärgskala: den blå motsvarar en lägre livslängd och den röda färgen motsvarar högre livstidsvärden. Förkortningar: PLIM = fosforescens livstidsavbildningsmikroskopi; PtOEP = platinaoktaetylporfyrin. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ovanstående protokoll ger en detaljerad beskrivning av sammansättningen av den nya kameran och dess funktion i mikrosekund FLIM / PLIM-läge. Den TCSPC-baserade nya generationens Tpx3Cam-kamera, kopplad med hjälp av den optomekaniska adaptern Cricket med bildförstärkare, emissionsfilter och makrolins, ger en stabil, kompakt och flexibel optisk modul som är enkel att använda. Avbildaren visade sig fungera bra med en rad olika prover och analytiska uppgifter, som inkluderade karakterisering av fosforescerande material och levande vävnadO2-avbildning . Den nära infraröda Pt(II)-bensoporfyrinbaserade cellpermeabla lösliga sonden NanO2-IR och de rödemitterande Pt(II)-porfyrinbaserade halvledarsensorerna användes i avbildningsexperimenten. Dessa sensorer har framgångsrikt använts för släckt fosforescensdetektering avO2 på grund av deras stora Stokes skift, långa utsläppslivslängd, hög känslighet, snabb respons och god fotokemisk stabilitet.
Dessa olikaO2-känsliga prober och solid state-beläggningar, när de testades på makrokameran, gav resultat som överensstämmer med tidigare publicerade data40. Materialen visade god enhetlighet, kontrast och livslängdsrespons på förändrade miljöförhållanden, särskilt när det gäller temperatur och syresättningstillstånd. Jämförelsen av dessa resultat med de som produceras på det konfokala TCSPC-PLIM-mikroskopet visar att den nya kameran är korrekt, har livstidsavläsningar av bättre kvalitet och förvärvar PLIM-bilder med hög hastighet och känslighet28,38,40.
Kameran visade också lovande prestanda med fosforescerande färgade biologiska prover av olika slag. Således producerades detaljeradeO2-koncentrationskartor för proverna innehållande suspensioner av färgade andningsceller, levande postmortem djurvävnad, hela organ och ympade tumörer. Kameran har gett mätningar av livstidsvärden från ytan och även på djup upp till 0,5 mm inuti vävnaden28,36,38.
Eftersom livslängdsvärden för fosforescens påverkas starkt av temperaturen41 är det nödvändigt att genomföra noggrann temperaturkontroll av de avbildade proverna, t.ex. genom att använda ett uppvärmt provsteg och/eller en inkubatorkammare. När du använder UV-excitation är det viktigt att noggrant välja provhållare, eftersom många material har autofluorescens i detta spektralområde, vilket påverkar provets verkliga livstidsvärde. All PLIM-avbildning i denna studie utfördes vid en LED-effekt på 4 V och en pulsbredd på 50 ns för en integrationstid på 20 s; Dessa parametrar kan dock justeras efter behov. Cirka 104 500 bilder spelas in under 20 s bildinsamlingstid. Slutligen är det viktigt att utföra mätningarna i en mörk kammare för att undvika störningar i omgivande ljus.
Således kan PLIM-kameran utföra snabba, kvantitativa livstidsmätningar med makroskopiska objekt av betydande storlek. Medan laserskanning PLIM-TCSPS är möjlig, skulle det vara för långsamt på grund av de långa uppehållstiderna som krävs för de syreavkännande färgämnena. Denna avbildning är dock snabb och kan spela in alla pixlar samtidigt. Vidare, intensitetsbaserade mätningar kan påverkas av den fluorescerande / fosforescerande färgkoncentrationen, en instabil LED eller laserintensiteter, fotoblekning, inriktningen av de optiska komponenterna, och spridning från proverna. Däremot är den TCSPC-baserade makrokameran väsentligen oberoende av dessa faktorer. Därför kan den utföra noggranna och kalibreringsfria mätningar avO2. Nackdelarna med kameran inkluderar dess relativt komplexa databehandling och stora datastorlekar (~ 2 Gb).
I framtiden kan kameran också användas inte bara för att kartläggaO2-koncentrationer utan även andra kemiska och biokemiska parametrar för testade prover, såsom pH och glukosdynamik, med hjälp av motsvarande sonder eller sensorer. Detta gör det till ett användbart verktyg för fysiologiska studier med olika vävnads- och sjukdomsmodeller. Kameran kan också uppgraderas för att fungera i nanosekunds FLIM-läge. Detta kräver dock att de nuvarande lysdioderna ersätts med en snabbare excitationskälla (t.ex. en ps-laser). Systemdrift i dubbelt PLIM/FLIM-läge är också i princip möjlig.
Sammantaget visar kameran enkelhet och mångsidighet, tillsammans med god funktionalitet och driftsprestanda i widefield TCSPC-PLIM-applikationer. Kommersiellt tillgängliga bredfältskameror utför mestadels intensitetsbaserad avbildning, där fosforescerande intensiteter kan påverkas av faktorer som fotoblekning, mätgeometri, spridning från prover etc. Den nuvarande avbildaren är baserad på livstidsavbildning, vilket gör mätningarna mer kvantitativa än kvalitativa. Dessutom ger integrationen av den optiska Tpx3Cam-kameran med Cricket-adaptern och bildförstärkaren enfotonkänslighet, enkelhet, flexibilitet och robusthet i mätningarna. Till skillnad från andra system kan den transporteras till platsen för experimenten och roteras 360 ° baserat på kraven i provet och mätuppgiften. Med sitt nuvarande objektiv, som är lätt att ändra för ett annat objektiv, kan kameran mäta prover upp till 18 mm x 18 mm i storlek på några sekunder och med en hög rumslig upplösning på 256 pixlar x 256 pixlar. Detta dokument beskriver steg för steg procedurer för hur man förbereder prover för testning och använder kameran i de olika PLIM-applikationerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Ekonomiskt stöd för detta arbete från Science Foundation Ireland, bidrag SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 och 18/SP/3522, och Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) tas tacksamt emot.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
References
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
- Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
- Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
- Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
- Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
- Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
- Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
- Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
- Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
- Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
- Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).
- Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
- Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
- Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
- Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. Becker, W. , Springer. Cham, Switzerland. 225-247 (2015).
- Becker, W. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. König, K. , De Gruyter. Berlin, Germany. 23-52 (2018).
- Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800 (2017).
- Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).
- Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).
- Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).
- Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, Springer. Cham, Switzerland. (2017).
- Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).
- Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
- Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
- Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).
- Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).
- Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).
- Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006 (2020).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
- Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
- Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
- Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).
- Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M.
