Summary
Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines neuen, schnellen optischen Bildgebungsgeräts für die makroskopische Photolumineszenz-Lebensdauer-Bildgebung von Proben mit langem Zerfall. Die Integrations-, Bildaufnahme- und Analyseverfahren werden ebenso beschrieben wie die Präparation und Charakterisierung der Sensormaterialien für die Bildgebung und die Anwendung des Imagers bei der Untersuchung biologischer Proben.
Abstract
In diesem Artikel wird ein neuer Photolumineszenz-Lifetime-Imager vorgestellt, der entwickelt wurde, um die molekulare Sauerstoffkonzentration (O2) in verschiedenen phosphoreszierenden Proben abzubilden, die vonO2-empfindlichen Festkörperbeschichtungen bis hin zu lebenden tierischen Gewebeproben, die mit löslichenO2-empfindlichen Sonden gefärbt wurden, reichen. Insbesondere wurde die nanopartikelbasierte Nahinfrarotsonde NanO2-IR verwendet, die mit einer 625 nm Leuchtdiode (LED) anregbar ist und bei 760 nm emittiert. Das Bildgebungssystem basiert auf der Timepix3-Kamera (Tpx3Cam) und dem opto-mechanischen Adapter, der auch einen Bildverstärker beherbergt. Die Phosphoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (PLIM) wird häufig für verschiedene Studien benötigt, aber die aktuellen Plattformen haben Einschränkungen in ihrer Genauigkeit, allgemeinen Flexibilität und Benutzerfreundlichkeit.
Bei dem hier vorgestellten System handelt es sich um einen schnellen und hochempfindlichen Imager, der auf einem integrierten optischen Sensor und einem Auslesechip-Modul, Tpx3Cam, aufgebaut ist. Es wird gezeigt, dass es hochintensive Phosphoreszenzsignale und stabile Lebensdauerwerte aus oberflächengefärbten Darmgewebeproben oder intraluminal gefärbten Fragmenten des Dickdarms erzeugt und die detaillierte Kartierung desO2-Spiegels im Gewebe in etwa 20 s oder weniger ermöglicht. Erste Experimente zur Bildgebung von Hypoxie in transplantierten Tumoren bei bewusstlosen Tieren werden ebenfalls vorgestellt. Wir beschreiben auch, wie der Imager für die Verwendungmit O2-empfindlichen Materialien auf Basis von Pt-Porphyrin-Farbstoffen neu konfiguriert werden kann, wobei eine 390-nm-LED für die Anregung und ein 650-nm-Bandpassfilter für die Emission verwendet werden. Insgesamt konnte festgestellt werden, dass der PLIM-Imager genaue quantitative Messungen der Lebensdauerwerte für die verwendeten Sonden und entsprechende zweidimensionale Karten derO2-Konzentration liefert. Es ist auch nützlich für die metabolische Bildgebung von Ex-vivo-Gewebemodellen und lebenden Tieren.
Introduction
O2 ist einer der wichtigsten Umweltparameter für lebende Systeme, und die Kenntnis der Verteilung vonO2 und seiner Dynamik ist für viele biologische Studien wichtig 1,2,3. Die Bestimmung der Sauerstoffversorgung des Gewebes mit Hilfe der phosphoreszierenden Sonden 4,5,6,7,8 und PLIM 9,10,11,12,13 erfreut sich in der biologischen und medizinischen Forschung zunehmender Beliebtheit 3,9,14,15,16, 17,18,19. Dies liegt daran, dass PLIM im Gegensatz zu Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzintensitätsmessungen nicht von externen Faktoren wie Sondenkonzentration, Photobleichung, Anregungsintensität, optischer Ausrichtung, Streuung und Autofluoreszenz beeinflusst wird.
Aktuelle O2 PLIM-Plattformen sind jedoch durch ihre Empfindlichkeit, Bildaufnahmegeschwindigkeit, Genauigkeit und allgemeine Benutzerfreundlichkeit eingeschränkt. Die zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung (TCSPC) in Kombination mit einem Raster-Scanning-Verfahren wird häufig in PLIM- und FLIM-Geräten (Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie) verwendet20,21,22. Da PLIM jedoch eine lange Pixelverweilzeit (im Millisekundenbereich) erfordert, ist die Zeit der Bildaufnahme viel länger als für FLIM-Anwendungen erforderlich 20,22,23. Andere Techniken, wie z. B. geschlossene CCD/CMOS-Kameras, haben keine Einzelphotonenempfindlichkeit und niedrige Bildraten20,24,25,26. Darüber hinaus werden die bestehenden PLIM-Systeme meist im mikroskopischen Format verwendet, während makroskopische Systeme weniger verbreitet sind27.
Der TCSPC-basierte PLIM-Makro-Imager28 wurde eingerichtet, um viele dieser Einschränkungen zu überwinden. Das Design des Imagers wurde durch die Verwendung eines neuen opto-mechanischen Adapters, Cricket, erheblich erleichtert, der über Folgendes verfügt: i) zwei C-Mount-Adapter, die eine einfache Kopplung des Kameramoduls auf der Rückseite und des Objektivs auf der Vorderseite ermöglichen; ii) ein internes Gehäuse für einen Bildverstärker und eine Steckdose für letzteren an der Außenseite der Grille; iii) ein Innenraum hinter dem frontseitigen C-Mount-Adapter, in dem ein Standard-25-mm-Emissionsfilter vor dem Druckübersetzer untergebracht werden kann; und iv) eine eingebaute Lichtkollimationsoptik mit Ringregulatoren, die eine optische Ausrichtung/Fokussierung zwischen dem Objektiv und der Kamera ermöglichen, um gestochen scharfe Bilder auf dem Kamerachip zu erzeugen.
Im zusammengebauten Imager ist das Kameramodul mit der Rückseite des Cricket-Adapters gekoppelt, der auch einen Bildverstärker enthält, der aus einer Photokathode besteht, gefolgt von einer Mikrokanalplatte (MCP), einem Verstärker und einem schnellen Szintillator, P47-Phosphor. Im Inneren des Cricket ist ein 760-nm- ± 50-nm-Emissionsfilter angebracht, und ein Objektiv, NMV-50M11'', ist am vorderseitigen C-Mount-Adapter angebracht. Schließlich werden das Objektiv und die Kamera optisch mit Ringreglern ausgerichtet.
Die Aufgabe des Verstärkers besteht darin, einfallende Photonen zu detektieren und sie in schnelle Lichtblitze auf dem Kamerachip umzuwandeln, die registriert und zur Erzeugung von Emissionszerfällen und Lebensdauerbildern verwendet werden. Das Kameramodul besteht aus einem fortschrittlichen TCSPC-basierten optischen Sensorarray (256 Pixel x 256 Pixel) und einem Auslesechip der neuen Generation 29,30,31,32,33, die die gleichzeitige Aufzeichnung der Ankunftszeit (TOA) undder Zeit über dem Schwellenwert (TOT) von Photonenausbrüchen an jedem Pixel des Bildgebungschips mit einer Zeitauflösung von 1,6 ns und einer Ausleserate von 80 Mpixel/s ermöglichen.
In dieser Konfiguration hat die Kamera mit dem Verstärker eine Einzelphotonenempfindlichkeit. Es ist datengesteuert und basiert auf dem SPIDR-System (Speedy Pixel Detector Readout)34. Die räumliche Auflösung des Imagers wurde zuvor mit planaren phosphoreszierendenO2-Sensoren und einer Auflösungsplattenmaske charakterisiert. Die Instrumentenantwortfunktion (IRF) wurde durch die Abbildung eines planaren Fluoreszenzsensors unter den gleichen Einstellungen wie bei allen anderen Messungen gemessen. Die Lebensdauer des Farbstoffs von rund 2,6 ns war kurz genug, um ihn für die IRF-Messung im PLIM-Modus zu verwenden. Der Imager kann Objekte mit einer Größe von bis zu 18 mm x 18 mm mit räumlichen und zeitlichen Auflösungen von 39,4 μm bzw. 30,6 ns (volle Breite bei halbem Maximum) abbilden.
Die folgenden Protokolle beschreiben den Zusammenbau des Makro-Imagers und seine anschließende Verwendung zur Kartierung der O2-Konzentration in biologischen Proben, die mit der zuvor charakterisierten Nahinfrarot-O2-SondeNanO2-IR 35 gefärbt wurden. Bei der Sonde handelt es sich um eine helle, photostabile, zelldurchlässige O2-Sonde, die auf dem Farbstoff Platin(II)-benzoporphyrin (PtBP) basiert. Es ist bei 625 nm erregbar, emittiert bei 760 nm und bietet eine robuste optische Reaktion auf O2 im physiologischen Bereich (0%-21% oder 0-210 μM vonO2). Der Imager wird auch demonstriert, um verschiedene Sensormaterialien auf Basis von Pt(II)-Porphyrin-Farbstoffen zu charakterisieren. Insgesamt ist der Imager kompakt und flexibel, ähnlich wie eine herkömmliche Fotokamera. Im aktuellen Setup ist der Imager für verschiedene Weitfeld-PLIM-Anwendungen geeignet. Der Ersatz der LED durch eine schnelle Laserquelle wird die Leistung des Imagers weiter verbessern und könnte potenziell FLIM-Anwendungen im Nanosekundenbereich ermöglichen.
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Protocol
Alle Verfahren mit Tieren wurden im Rahmen von Zulassungen der Health Products Regulatory Authority (HPRA, Irland) gemäß der Richtlinie des Rates der Europäischen Gemeinschaften (2010/63/EU) durchgeführt und von der Ethikkommission für Tierversuche des University College Cork genehmigt.
1. Probenvorbereitung
- Färbung mit der Sonde von lebenden Gewebeproben ex vivo
- Für Ex-vivo-Anwendungen werden frisch isolierte Gewebeproben von 4 Wochen alten weiblichen Balb/c-Mäusen verwendet.
- Am Tag des Experiments wird eine Maus durch Enthauptung eingeschläfert und etwa 10 mm große Fragmente des Dickdarms (Dickdarm) schnell präpariert. Waschen Sie sie sofort mit PBS-Puffer, legen Sie sie in DMEM-Medium, das mit 10 mM Hepes-Puffer (pH 7,2) ergänzt ist, und inkubieren Sie sie bei 37 °C36.
- Für die Oberflächenfärbung der Serosalseite des Darms werden die lebenden Gewebeproben in eine Minischale überführt, 2 ml vollständige DMEM-Sonde mit 1 mg/ml NanO2-IR aufgetragen, um die Gewebeproben zu bedecken, und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert.
HINWEIS: Zellen im postmortalen Gewebe bleiben in Kultur viele Stunden am Leben. NaNO2-IR zeigt eine geringe Zytotoxizität, so dass alle Experimente innerhalb von 4 h nach der Gewebeisolierung abgeschlossen wurden. - Für eine intraluminale Ex-vivo-Färbung des Tiefengewebes werden die Darmstücke in eine trockene Petrischale gegeben und überschüssiges DMEM mit Filterpapier entfernt.
- Injizieren Sie 1 μl DMEM mit 1 mg/ml NanO2-IR 35 mit einer Hamilton-Spritze in das Lumen und inkubieren Sie die Proben15 Minuten oder bis zu 4 Stunden.
HINWEIS: NaNO2-IR zeigt geringfügige zytotoxische Langzeitwirkungen; Daher sollten alle Experimente innerhalb von 4 h nach der Gewebeisolierung abgeschlossen sein.
- Präparation von gefärbtem Tumorgewebe bei lebenden Tieren
- Für In-vivo-Anwendungen werden CT26-Zellen 18 h lang in einem serumfreien Medium mit NaNO2-IR-Sonde bei 0,05 mg/ml vorgefärbt.
- Nehmen Sie eine Maus, rasieren Sie den Injektionsbereich in der rechten Flanke und injizieren Sie mit einer Spritze 200 μl einer Mischung aus 1 × 105 nicht gefärbten Zellen und 1 × 105 Zellen, die mit NanO2-IR vorgefärbt sind.
- Lassen Sie die Tumore in den Mäusen wachsen, indem Sie die Tumorgröße mit einem Messschieber und das Tiergewicht regelmäßig überwachen37. Die Tiere mit transplantierten Tumoren sind am siebten Tag des Tumorwachstums bereit für die Bildgebung.
HINWEIS: Das Tumorvolumen wurde mit Gleichung (1) berechnet:
V = (L × W 2)/2 (1)
wobei L der Durchmesser des Tumors und W is der Durchmesser senkrecht zum Durchmesser L ist. - Opfern Sie die Tiere durch Zervixluxation kurz vor der Bildgebung.
2. Einrichtung der PLIM-Bildgebung
- Nehmen Sie den Cricket-Adapter und entfernen Sie den C-Mount-Adapter auf der Rückseite, um Zugang zum Verstärkergehäuse im Inneren zu erhalten. Setzen Sie den Bildverstärker MCP-125 in dieses Fach ein und setzen Sie den C-Mount-Adapter wieder ein.
- Entfernen Sie den vorderseitigen C-Mount-Adapter des Cricket, setzen Sie den 760-nm- ± 50-nm-Emissionsfilter ein und befestigen Sie ihn, indem Sie den C-Mount wieder einsetzen.
- Verbinden Sie das Tpx3Cam-Kameramodul über den C-Mount-Adapter mit der Rückseite des Cricket-Moduls
- Verbinden Sie das Objektiv über den C-Mount-Adapter mit der Vorderseite des Cricket-Moduls.
- Montieren Sie die gesamte Kamerabaugruppe auf der optischen Blackbox mit Blick nach unten auf den Tisch, auf dem die Proben abgebildet werden sollen (Abbildung 1).
- Montieren Sie die superhelle LED mit 624 nm an einem Pfosten, der mit einem Steckbrett in der Blackbox verbunden ist.
- Schließen Sie die LED an eine Stromversorgung und einen Impulsgeber an. Schalten Sie die LED ein und fokussieren Sie sie, um eine effektive und gleichmäßige Anregung der abgebildeten Proben zu gewährleisten.
- Schließen Sie die Kamera an einen anderen Impulsgeber an und synchronisieren Sie die an die Kamera gesendeten Impulse mit der LED38.
- Schließen Sie den Verstärker mit dem speziellen Kabel und der Buchse am Cricket-Gerät an ein Standardnetzteil an und stellen Sie die Verstärkung auf 2,7 V ein.
- Fokussieren Sie die Kameraoptik mit den Fokussierfunktionen des Objektivs und des Cricket-Adapters auf den Probentisch, um klare Bilder von Proben mit gutem Kontrast und guter Helligkeit zu erzeugen.
- Für die Verwendung von Imagern mit Pt-Porphyrin-Farbstoffen ersetzen Sie die 625-nm-LED durch eine 390-nm-LED zur Anregung und ersetzen Sie den 760-nm- ± 50-nm-Filter durch einen 650-nm- ± 50-nm-Filter im Cricket-Modul.
3. Bildaufnahme
- Platzieren Sie die Probe vor dem Kameraobjektiv.
Anmerkungen: Verwenden Sie einen X-Y-Z-verstellbaren Tisch als Probenhalter, um die Probenposition für eine gute Fokussierung einzustellen. - Schalten Sie alle Lichter im Raum aus.
- Schalten Sie die Sophy-Software ein, um die Betriebsparameter wie Fokussierung und Probenausrichtung einzustellen.
HINWEIS: Die Sophy-Software wird zusammen mit der Kamera bereitgestellt, um die Bildgebungsparameter einzustellen und die Daten aufzuzeichnen. Stellen Sie sicher, dass die Software mit der Kamera verbunden ist, indem Sie den Kameracode überprüfen. Für die Datenerfassung haben wir jedoch ein anderes Programm verwendet. - Wählen Sie unter Module die Option " Unendliche Frames" aus, und stellen Sie den Pixelbetriebsmodus auf " Zeit über Schwellenwert" ein.
- Wechseln Sie unter Module zu Vorschau, und wählen Sie Aktives Modul aus. Dadurch wird das Fenster Medpix/Timpix Frames geöffnet.
- Ändern Sie in diesem Fenster die Farbskala und drehen Sie das Bild in die gewünschte Ausrichtung.
- Schalten Sie den Verstärker ein und starten Sie die Aufnahme.
Anmerkungen: Verwenden Sie den Aufnahmebildschirm der Sophy-Software, um die Ausrichtung und den Fokus der Probe visuell zu bestätigen und die LED-Anregungsparameter für die Aufzeichnung zu optimieren. - Stoppen Sie die Aufnahme und schließen Sie die Sophy-Software.
- Gehen Sie zum Terminal und verwenden Sie die speziell entwickelte Software, um die Rohdaten im Binärformat zu erfassen und nachzubearbeiten (https://github.com/svihra/TimePix3).
- Führen Sie im Terminal die folgenden Befehle aus, um die Daten aufzuzeichnen:
CD-Dokument/SPIDR/trunk/Release/
Ls
./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Name der Datei} - t {Erfassungszeit}
HINWEIS: Überprüfen Sie nach der Eingabe von "ls" die Liste der Dateien im aktuellen Verzeichnis. Vergewissern Sie sich, dass Tpx3daq angezeigt wird. - Warten Sie, bis alle Frames aufgezeichnet wurden.
- Um die Daten zu verarbeiten, führen Sie die folgenden Befehle im Terminal aus:
cd Dokumente/Datenverarbeitung/Timepix3/Timepix3/
wurzel
. L Datenprozess.cpp++
.x DRGUI. C - Warten Sie, bis sich ein RRGui-Fenster öffnet. Wählen Sie alle Variablen auf der linken Seite und Alle Daten, Einzelne Datei und Schwerpunkt auf der rechten Seite aus.
- Wählen Sie die Datei aus, die verarbeitet werden soll, und führen Sie die Datenreduzierung aus.
HINWEIS: Alle verarbeiteten Dateien werden im selben Ordner wie die Rohdatei angezeigt.
- Führen Sie im Terminal die folgenden Befehle aus, um die Daten aufzuzeichnen:
4. Datenanalyse
- Analysieren Sie die nachbearbeiteten Daten mit einem speziellen Programm, das in C-Sprache geschrieben ist und die Daten in eine .ics Bilddatei (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam) schreibt.
- Öffnen Sie die .ics Bilddateien mit der frei verfügbaren Software Time Resolved Imaging (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie zwei Exponentialfunktionen , um die Phosphoreszenzzerfälle anzupassen.
- Öffnen Sie die passenden .ics Bilddateien mit der verfügbaren Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle).
- Generieren Sie mithilfe von Lookup-Tabellen Bilder mit Phosphoreszenzlebensdauer und kodieren Sie sie in einer Pseudofarbskala (z. B. blaue Farbe für kurze Lebensdauer und rot für lange Lebensdauern). Verwenden Sie die Funktion Messen , um die durchschnittlichen Lebensdauerwerte für das gesamte Bild oder bestimmte Interessenbereiche (ROIs) zu berechnen.
- Rechnen Sie die Lebensdauerwerte in die Sauerstoffkonzentration um, indem Sie die Gleichung verwenden, die sich aus der Anpassung derO2-Kalibrierung der Sonde36 ergibt.
HINWEIS: Für diese Arbeit wurde Gleichung (2) verwendet:
O2 [μM] = −86,16 + 770,35 × e−0,049 × LT (2)
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Representative Results
Für Ex-vivo-Bildgebungsanwendungen wurden Fragmente von Darmgewebe durch die topische Anwendung der NanO2-IR-Sonde auf der serosalen Seite des Gewebes gefärbt. Für eine tiefere Färbung wurde 1 μL der Sonde in das Lumen injiziert. In letzterem Fall schirmte die 0,2-0,25 mm dicke Darmwand die Sonde von der Kamera ab. Die beiden Färbeverfahren sind in Abbildung 2A dargestellt.
Die resultierenden Intensitäts- und PLIM-Bilder sind in Abbildung 2B-G dargestellt. Die Farben spiegeln deutlich den Unterschied in den Lebensdauerwerten und damit den Unterschied in der Sauerstoffversorgung der Serosal- und Schleimhautseite des Gewebes wider. Abbildung 2C und Abbildung 2D beziehen sich auf ähnliche Gewebegruppen, die topisch (Abbildung 2C) und intraluminal (Abbildung 2D) gefärbt wurden. Erwartungsgemäß zeigten die Gewebe ähnliche PLIM-Muster. Die intraluminale Färbung der Schleimhautseite des Gewebes (Abbildung 2D) zeigte jedoch höhere Lebensdauerwerte, die eine geringere Sauerstoffversorgung in der inneren Oberfläche des Darms widerspiegeln, als die topische Färbung der serosalen Seite (Abbildung 2C), die eine geringere Lebensdauer aufwies. Dies spiegelt eine höhere Sauerstoffversorgung in der äußeren Oberfläche des Darms wider.
Um die Stabilität der Lebenszeitsignale und der respiratorischen Aktivität des Darms zu untersuchen, wurde eine Zeitraffer-PLIM-Analyse an den intraluminal gefärbten Proben über 2 h durchgeführt (Abbildung 2D-G). Zwischen 15 min (54,4 μs ± 0,9 μs) und 2 h (61,1 μs ± 0,8 μs) der Inkubation wurde ein Anstieg der Lebensdauerwerte beobachtet, was eine Verringerung desO2-Spiegels im luminalen Teil des Darms widerspiegelt. Darüber hinaus beweisen die niedrigenO2-Spiegel nach 2 h Inkubation, dass die Gewebeatmung während des gesamten Zeitraums der Dissektion, Präparation, Färbung, Inkubation und Bildgebung fortgesetzt wurde. Darüber hinaus kann die in Abbildung 2D-G beobachtete Änderung der Lumenform auf die Verteilung der in das Lumen injizierten Sonde zurückgeführt werden, was bedeutet, dass das LT-Signal den Bereich widerspiegelt, in dem sich die Sonde befindet.
Um die zukünftige Leistung des Imagers in vivo zu beurteilen, wurde unmittelbar nach der Opferung eine erste Studie zur Bildgebung von Hypoxie in transplantierten subkutanen Tumoren durchgeführt, die in Mäusen gezüchtet wurden (Abbildung 3). In diesem Fall wurden Balb/c-Mäusen subkutan in die rechte Flanke 200 μL einer Mischung aus CT26-Zellen injiziert, die ungefärbt oder mit einer 0,05 mg/ml NanO2-IR-Sonde gefärbt waren. Die PLIM wurde am siebten Tag des Tumorwachstums durchgeführt, und die Mäuse wurden kurz vor der Bildgebung (d. h. post mortem) geopfert. Bilder der Tumorareale bei den Mäusen am siebten Tag des Wachstums sind in Abbildung 3A,B dargestellt.
Die Intensitäts- (links) und PLIM-Bilder (rechts) für die Tumorareale der Mäuse am siebten Tag des Tumorwachstums (Abbildung 3B) zeigen die Leistungsfähigkeit und Empfindlichkeit sowohl des Imagers als auch der Sonde in solchen Experimenten (detailliertere statistische Daten nicht gezeigt). Die Tiere wurden jeweils 20 s lang fotografiert. Die linken Flanken der Mäuse wurden rasiert und als Rohling dargestellt. Sie erzeugten keine PLIM-Signale. Im Gegensatz dazu produzierten Regionen mit dem Tumor und der Sonde stabile Lebensdauersignale von ~50 μs. Ziel dieses Experiments war es, die Verwendbarkeit des Imagers für In-vivo-Studien mit lebenden Tieren und Modellen menschlicher Krankheiten zu evaluieren. Während in diesem Teil vorläufige qualitative Ergebnisse gezeigt wurden, ist ein entsprechendes Papier in Vorbereitung, das eine gründlichere quantitative Bewertung bietet.
Als nächstes wurde der Imager auch in der PLIM-Bildgebung von Sensormaterialien auf Basis von Pt(II)-Porphyrin-Farbstoffen demonstriert. Die chemische Struktur des Pt-Octaethylporphin-Farbstoffs (PtOEP) und technische Details der Herstellung der entsprechenden Sensormaterialien sind an anderer Stelle beschrieben 6,39. Die phosphoreszierenden Festkörpersensorbeschichtungen auf PtOEP-Polystyrolbasis, die als kleine Flecken auf einer transparenten Polyesterfolie (Mylar) abgeschieden wurden, wurden durch Eintauchen der Folie in PBS-Puffer (luftgesättigter sauerstoffreicher Zustand) oder in PBS-haltige Glukose und Glukoseoxidase abgebildet, was einen vollständig sauerstoffarmen Zustand ermöglicht. Die Lebensdauersignale, die unter sauerstoffhaltigen (25,6 μs ± 0,5 μs) und sauerstoffarmen Bedingungen (65,7 μs ± 1,5 μs) erhalten wurden, stimmten mit den zuvor berichteten Ergebnissen überein6. Die Intensitäts- und PLIM-Bilder der sauerstoffhaltigen und sauerstoffarmen Sensoren sind in Abbildung 4A, B dargestellt.
Abbildung 1: Versuchsaufbau des Imagers38. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Sen et al.38. Urheberrecht: The Optical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: O2 PLIM der topisch und intraluminal gefärbten Mausdarmproben. (A) Illustration der beiden Färbemethoden unter Verwendung von (B) Phosphoreszenzintensität und (C) PLIM-Bildern des mit der NanO2-IR-Sonde topisch gefärbten Darms. (D-G) Zeitraffer-PLIM des intraluminal gefärbten Darms 15 min, 30 min, 1 h und 2 h nach der Färbung. Die PLIM-Bilder werden in einer Pseudofarbskala dargestellt: Die blaue Farbe entspricht einer geringeren Lebensdauer und die rote Farbe entspricht höheren Lebensdauerwerten. Maßstabsbalken = 5 mm. Abkürzung: PLIM = Phosphorescence Lifetime Imaging Microscopy. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: O2 PLIM von transplantierten Tumoren in den rechten Flanken der Mäuse . (A) Grafische Darstellung der Tumorentwicklung bei lebenden Tieren. Phosphoreszenzintensität (links) und PLIM-Bilder (rechts) von Tumorarealen am (B) siebten Tag des Tumorwachstums. Das PLIM-Bild wird in einer Pseudofarbskala dargestellt: Die blaue Farbe entspricht einer geringeren Lebensdauer und die rote Farbe entspricht höheren Lebensdauerwerten. Maßstabsleiste = 5 mm. Abkürzung: PLIM = Phosphorescence Lifetime Imaging Microscopy. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Phosphoreszenzintensität des PtOEP-basierten Sensorspots. Phosphoreszenzintensität (links) und PLIM-Bilder (rechts) des PtOEP-Sensorflecks im (A) sauerstoffhaltigen und (B) sauerstoffarmen Zustand. Die PLIM-Bilder werden in einer Pseudofarbskala dargestellt: Die blaue Farbe entspricht einer geringeren Lebensdauer und die rote Farbe entspricht höheren Lebensdauerwerten. Abkürzungen: PLIM = Phosphorescence Lifetime Imaging Microscopy; PtOEP = Platinoctaethylporphyrin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die obigen Protokolle geben eine detaillierte Beschreibung des Zusammenbaus des neuen Imagers und seines Betriebs im Mikrosekunden-FLIM/PLIM-Modus. Die TCSPC-basierte Tpx3Cam-Kamera der neuen Generation, die über den opto-mechanischen Adapter Cricket mit dem Bildverstärker, dem Emissionsfilter und dem Makroobjektiv gekoppelt ist, ergibt ein stabiles, kompaktes und flexibles optisches Modul, das einfach zu bedienen ist. Es wurde gezeigt, dass der Imager bei einer Reihe verschiedener Proben und analytischer Aufgaben gut funktioniert, darunter die Charakterisierung phosphoreszierender Materialien und dieO2-Bildgebung von lebendem Gewebe. In den bildgebenden Experimenten wurden die zelldurchlässige lösliche NanO2-IR-Sonde NanO2-IR und die rot emittierenden Pt(II)-Porphyrin-basierten Festkörpersensoren verwendet. Diese Sensoren wurden aufgrund ihrer großen Stokes-Verschiebung, ihrer langen Emissionslebensdauer, ihrer hohen Empfindlichkeit, ihrer schnellen Reaktion und ihrer guten photochemischen Stabilität erfolgreich für die Phosphoreszenzdetektion von O2 eingesetzt.
Diese verschiedenenO2-empfindlichen Sonden und Festkörperbeschichtungen lieferten beim Testen auf dem Makro-Imager Ergebnisse, die mit zuvor veröffentlichten Daten übereinstimmen40. Die Materialien zeigten eine gute Gleichmäßigkeit, einen guten Kontrast und eine gute Reaktion auf die Lebensdauer bei sich ändernden Umgebungsbedingungen, insbesondere in Bezug auf Temperatur und Sauerstoffversorgung. Der Vergleich dieser Ergebnisse mit denen des konfokalen TCSPC-PLIM-Mikroskops zeigt, dass der neue Imager genau ist, eine bessere Qualität der Lebensdauermessungen aufweist und PLIM-Bilder mit hoher Geschwindigkeit und Empfindlichkeit aufnimmt28,38,40.
Der Imager zeigte auch eine vielversprechende Leistung bei phosphoreszenzgefärbten biologischen Proben verschiedener Typen. Daher wurden detaillierteO2-Konzentrationskarten für die Proben erstellt, die Suspensionen von gefärbten Atemzellen, lebendem postmortalem tierischem Gewebe, ganzen Organen und transplantierten Tumoren enthielten. Der Imager hat Messungen der Lebensdauerwerte von der Oberfläche und sogar in Tiefen von bis zu 0,5 mm im Gewebe ermöglicht28,36,38.
Da die Phosphoreszenzlebensdauer stark von der Temperatur41 beeinflusst wird, ist es notwendig, eine strenge Temperaturkontrolle der abgebildeten Proben zu implementieren, z. B. durch die Verwendung eines beheizten Probentisches und/oder einer Inkubatorkammer. Bei der Verwendung von UV-Anregung ist es wichtig, die Probenhalter sorgfältig auszuwählen, da viele Materialien in diesem Spektralbereich eine Autofluoreszenz besitzen, die sich auf den tatsächlichen Lebensdauerwert der Probe auswirkt. Die gesamte PLIM-Bildgebung in dieser Studie wurde mit einer LED-Leistung von 4 V und einer Pulsbreite von 50 ns für eine Integrationszeit von 20 s durchgeführt. Diese Parameter können jedoch nach Bedarf angepasst werden. Während der Bildaufnahmezeit von 20 Sekunden werden ca. 104.500 Bilder aufgenommen. Schließlich ist es wichtig, die Messungen in einer dunklen Kammer durchzuführen, um Störungen durch Umgebungslicht zu vermeiden.
So kann der PLIM-Imager schnelle, quantitative Lebensdauermessungen mit makroskopischen Objekten signifikanter Größe durchführen. Laserscanning PLIM-TCSPS ist zwar möglich, wäre aber aufgrund der langen Verweilzeiten, die für die sauerstoffempfindlichen Farbstoffe erforderlich sind, zu langsam. Dieser Imager ist jedoch schnell und kann alle Pixel gleichzeitig aufnehmen. Darüber hinaus können intensitätsbasierte Messungen durch die Fluoreszenz-/Phosphoreszenzfarbstoffkonzentration, eine instabile LED- oder Laserintensität, Photobleaching, die Ausrichtung der optischen Komponenten und die Streuung der Proben beeinflusst werden. Im Gegensatz dazu ist der TCSPC-basierte Makro-Imager im Wesentlichen unabhängig von diesen Faktoren. Daher kann es genaue und kalibrierungsfreie Messungen von O2 durchführen. Zu den Nachteilen der Kamera gehören die relativ komplexe Datenverarbeitung und die großen Datenmengen (~2 GB).
Zukünftig können mit dem Imager nicht nurO2-Konzentrationen , sondern auch andere chemische und biochemische Parameter der getesteten Proben, wie z.B. der pH-Wert und die Glukosedynamik, mit den entsprechenden Sonden oder Sensoren abgebildet werden. Dies macht es zu einem nützlichen Werkzeug für physiologische Studien mit verschiedenen Gewebe- und Krankheitsmodellen. Der Imager kann auch für den Betrieb im Nanosekunden-FLIM-Modus aufgerüstet werden. Dies erfordert jedoch den Austausch der aktuellen LEDs durch eine schnellere Anregungsquelle (z. B. einen ps-Laser). Prinzipiell ist auch ein Systembetrieb im dualen PLIM/FLIM-Modus möglich.
Insgesamt demonstriert der Imager Einfachheit und Vielseitigkeit sowie gute Funktionalität und Betriebsleistung in Weitfeld-TCSPC-PLIM-Anwendungen. Kommerziell erhältliche Weitfeld-Imager führen meist intensitätsbasierte Bildgebung durch, bei der die phosphoreszierenden Intensitäten durch Faktoren wie Photobleaching, Messgeometrie, Streuung von Proben usw. beeinflusst werden können. Der aktuelle Imager basiert auf Lifetime Imaging, wodurch die Messungen eher quantitativ als qualitativ sind. Darüber hinaus bietet die Integration der optischen Kamera Tpx3Cam mit dem Cricket-Adapter und dem Bildverstärker Einzelphotonenempfindlichkeit, Einfachheit, Flexibilität und Robustheit der Messungen. Im Gegensatz zu anderen Systemen kann es an den Ort der Experimente getragen und je nach Anforderung der Probe und Messaufgabe um 360° gedreht werden. Mit seinem aktuellen Objektiv, das sich leicht gegen ein anderes Objektiv austauschen lässt, kann der Imager Proben bis zu einer Größe von 18 mm x 18 mm in wenigen Sekunden und mit einer hohen räumlichen Auflösung von 256 Pixeln x 256 Pixeln messen. In diesem Dokument werden Schritt-für-Schritt-Verfahren beschrieben, wie Sie Proben für Tests vorbereiten und den Imager in den verschiedenen PLIM-Anwendungen verwenden.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Die finanzielle Unterstützung für diese Arbeit durch die Science Foundation Ireland, die Zuschüsse SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 und 18/SP/3522 sowie Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) wird dankbar gewürdigt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
References
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