Summary
מאמר זה מתאר את השימוש במצלמה אופטית חדשה ומהירה עבור הדמיה מקרוסקופית פוטולומינסנציה לכל החיים של דגימות פולטות דעיכה ארוכה. מתוארים תהליכי האינטגרציה, רכישת התמונה והניתוח, לצד הכנה ואפיון של חומרי החיישן להדמיה ויישום ההדמיה בחקר דגימות ביולוגיות.
Abstract
מאמר זה מציג מצלמת פוטולומינסנציה חדשה שנועדה למפות את ריכוז החמצן המולקולרי (O 2) בדגימות זרחן שונות, החל מציפויים רגישים ל-O 2 במצב מוצק ועד לדגימות רקמות חיות של בעלי חיים המוכתמות בבדיקות מסיסות רגישות ל-O2. בפרט, נעשה שימוש בגשושית ננו-חלקיקית המבוססת על אינפרא-אדום קרוב NanO2-IR, הניתנת לגירוי באמצעות דיודה פולטת אור (LED) של 625 ננומטר ופולטת ב-760 ננומטר. מערכת ההדמיה מבוססת על מצלמת Timepix3 (Tpx3Cam) ועל מתאם אופטו-מכני, הכולל גם מאיץ תמונה. O2 phosphorescence lifetime imaging microscopy (PLIM) נדרש בדרך כלל עבור מחקרים שונים, אך לפלטפורמות הנוכחיות יש מגבלות בדיוק שלהן, בגמישות הכללית ובשימושיות שלהן.
המערכת המוצגת כאן היא מצלמת תמונה מהירה ורגישה במיוחד, הבנויה על חיישן אופטי משולב ומודול שבב קריאה, Tpx3Cam. הוא הוכח כמפיק אותות זרחן בעוצמה גבוהה וערכי חיים יציבים מדגימות רקמת מעי מוכתמת על פני השטח או מקטעים מוכתמים תוך לומינלית של המעי הגס ומאפשר מיפוי מפורט של רמות O2 ברקמה בכ-20 שניות או פחות. כמו כן מוצגים ניסויים ראשוניים על הדמיה של היפוקסיה בגידולים מושתלים בבעלי חיים חסרי הכרה. אנו גם מתארים כיצד ניתן להגדיר מחדש את מכשיר ההדמיה לשימוש עם חומרים רגישים O2 המבוססים על צבעי Pt-פורפירין באמצעות נורית LED של 390 ננומטר לעירור ומסנן פס פס של 650 ננומטר לפליטה. בסך הכל, נמצא כי מכשיר ההדמיה PLIM מפיק מדידות כמותיות מדויקות של ערכי חיים עבור הגשושיות בהן נעשה שימוש ומפות דו-ממדיות בהתאמה של ריכוז O2 . זה גם שימושי עבור הדמיה מטבולית של מודלים רקמות ex vivo ובעלי חיים חיים.
Introduction
O 2 הוא אחד הפרמטרים הסביבתיים המרכזיים למערכות חיות, והידע על התפלגות O 2 והדינמיקה שלו חשוב למחקרים ביולוגיים רבים 1,2,3. הערכת חמצון רקמות באמצעות בדיקות זרחניות 4,5,6,7,8 ו- PLIM 9,10,11,12,13 צוברות פופולריות במחקר ביולוגי ורפואי 3,9,14,15,16, 17,18,19. הסיבה לכך היא ש- PLIM, בניגוד למדידות עוצמת פלואורסצנטיות או זרחן, אינו מושפע מגורמים חיצוניים כגון ריכוז הגשוש, הלבנה, עוצמת עירור, יישור אופטי, פיזור ואוטופלואורסצנציה.
עם זאת, פלטפורמות O2 PLIM הנוכחיות מוגבלות על ידי רגישותן, מהירות רכישת התמונה, דיוקן והשימושיות הכללית שלהן. ספירת פוטון בודד מתואמת זמן (TCSPC), בשילוב עם הליך סריקת רסטר, משמשת לעתים קרובות בהתקני PLIM ומיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי (FLIM)20,21,22. עם זאת, מכיוון ש- PLIM דורש זמן שהייה ארוך של פיקסלים (בטווח של אלפיות השנייה), זמן רכישת התמונה ארוך בהרבה ממה שנדרש עבור יישומי FLIM20,22,23. טכניקות אחרות, כגון מצלמות CCD/CMOS מגודרות, חסרות רגישות לפוטון יחיד ויש להן קצב פריימים נמוך20,24,25,26. יתר על כן, מערכות PLIM הקיימות משמשות בעיקר בפורמט מיקרוסקופי, בעוד מערכות מקרוסקופיות נפוצות פחות27.
מצלמת המאקרו PLIM28 מבוססת TCSPC הוקמה כדי להתגבר על רבות ממגבלות אלה. העיצוב של imager היה מאוד הקל על ידי השימוש של מתאם אופטו-מכני חדש, קריקט, אשר יש את הדברים הבאים: i) שני מתאמי C-mount, אשר מספקים צימוד קל של מודול המצלמה בצד האחורי עדשה אובייקטיבית בצד הקדמי; ii) בית פנימי עבור מזין תמונה ושקע חשמל עבור האחרון בצד החיצוני של הצרצר; iii) חלל פנימי מאחורי מתאם ההרכבה C הקדמי שבו ניתן לאחסן מסנן פליטה סטנדרטי של 25 מ"מ לפני המפעיל; ו-iv) אופטיקה מובנית המתנגשת באור עם וסתי טבעת, המאפשרים יישור/מיקוד אופטי בין העדשה למצלמה כדי להפיק תמונות חדות על שבב המצלמה.
במכונת ההדמיה המורכבת, מודול המצלמה מוצמד לצד האחורי של מתאם הקריקט, אשר מכיל גם מעצבן תמונה המורכב מפוטוקתודה ואחריה צלחת מיקרו-ערוצית (MCP), מגבר, ומנצנץ מהיר, זרחן P47. מסנן פליטה של 760 ננומטר ± 50 ננומטר מותקן בתוך הצרצר, ועדשת אובייקטיבית, NMV-50M11 אינץ', מחוברת למתאם ההרכבה C בצד הקדמי. לבסוף, העדשה והמצלמה מיושרות אופטית עם וסתי הטבעת.
תפקידו של האינטנסיפייר הוא לאתר פוטונים נכנסים ולהמיר אותם לפרצי אור מהירים על שבב המצלמה, הנרשמים ומשמשים ליצירת דעיכות פליטה ותמונות לכל החיים. מודול המצלמה כולל מערך חיישנים אופטי מתקדם מבוסס TCSPC (256 פיקסלים x 256 פיקסלים) ושבב קריאה מהדור החדש 29,30,31,32,33, המאפשרים הקלטה סימולטנית של זמן ההגעה (TOA) והזמן מעל סף (TOT) של התפרצויות פוטונים בכל פיקסל של שבב ההדמיה ברזולוציית זמן של 1.6 ns וקצב קריאה של 80 Mpixel/s.
בתצורה זו, למצלמה עם האינטנסיפייר יש רגישות לפוטון יחיד. הוא מונחה נתונים ומבוסס על מערכת הקריאה המהירה של גלאי פיקסלים (SPIDR)34. הרזולוציה המרחבית של ה- imager אופיינה בעבר בחיישני O2 זרחניים מישוריים ומסיכת צלחת רזולוציה. פונקציית תגובת המכשיר (IRF) נמדדה על ידי הדמיה של חיישן פלואורסצנטי מישורי תחת אותן הגדרות ששימשו בכל המדידות האחרות. אורך החיים של הצבע בסביבות 2.6 ns היה קצר מספיק כדי להשתמש בו למדידת IRF במצב PLIM. מכונת ההדמיה יכולה לצלם עצמים בגודל של עד 18 מ"מ x 18 מ"מ ברזולוציות מרחביות וזמניות של 39.4 מיקרומטר ו- 30.6 ננומטר (רוחב מלא בחצי מקסימום), בהתאמה28.
הפרוטוקולים הבאים מתארים את הרכבת מצלמת המאקרו ואת השימוש בה לאחר מכן למיפוי ריכוז O 2 בדגימות ביולוגיות המוכתמות בגשושית O2 שאופיינה קודם לכן, NanO2-IR35. הגשושית היא גשושית O 2-sensing בהירה, ניתנת לצילום וחדירה לתאים, המבוססת על צבע פלטינה (II) בנזופורפירין (PtBP). הוא מעורר ב-625 ננומטר, פולט ב-760 ננומטר, ומספק תגובה אופטית חזקה ל-O 2 בטווח הפיזיולוגי (0%-21% או 0-210 מיקרומטר של O2). ההדמיה מודגמת גם כדי לאפיין חומרי חיישנים שונים המבוססים על צבעי Pt(II)-פורפירין. בסך הכל, מכונת הצילום קומפקטית וגמישה, בדומה למצלמת צילום נפוצה. בהתקנה הנוכחית, מכונת ההדמיה מתאימה ליישומי PLIM שונים בשדה רחב. החלפת נורית ה-LED במקור לייזר מהיר תשפר עוד יותר את ביצועי מכונת ההדמיה ועשויה לאפשר יישומי FLIM של ננו-שניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים עם בעלי חיים בוצעו תחת אישורים שהונפקו על ידי הרשות הרגולטורית למוצרי בריאות (HPRA, אירלנד) בהתאם לדירקטיבה של מועצת הקהילות האירופית (2010/63/EU) ואושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת קולג 'קורק.
1. הכנת מדגם
- מכתים עם בדיקה של דגימות רקמות חיות ex vivo
- עבור יישומי ex vivo , השתמש בדגימות רקמה מבודדות טריות מעכברות Balb/c בנות 4 שבועות.
- ביום הניסוי, הרדימו עכבר על ידי עריפת ראש, ונתחו במהירות שברים של המעי הגס, בגודל של כ -10 מ"מ. שטפו אותם מיד עם חיץ PBS, הניחו בתווך DMEM בתוספת חיץ Hepes של 10 mM (pH 7.2), ודגרו בטמפרטורה של37°C 36.
- עבור צביעת פני השטח של הצד הסרוסלי של המעי, להעביר את דגימות הרקמה החיה לתוך צלחת מיני, להחיל 2 מ"ל של DMEM מלא המכיל 1 מ"ג / מ"ל NanO2-IR בדיקה כדי לכסות את דגימות הרקמה, לדגור במשך 30 דקות ב 37 ° C.
הערה: תאים ברקמה שלאחר המוות נשארים חיים במשך שעות רבות בתרבית. NaNO2-IR מראה ציטוטוקסיות מינורית, כך שכל הניסויים הושלמו תוך 4 שעות לאחר בידוד הרקמות. - עבור צביעת רקמות עמוקות intraluminal ex vivo , להעביר את חתיכות המעי לצלחת פטרי יבש, ולהסיר כל DMEM עודף עם נייר סינון.
- הזריקו 1 μL של DMEM המכיל 1 מ"ג/מ"ל NanO2-IR 35 לתוך לומן עם מזרק המילטון, ודגרו על הדגימות במשך15 דקות או עד 4 שעות.
הערה: NaNO2-IR מראה השפעות ציטוטוקסיות קלות לטווח ארוך; לכן, כל הניסויים צריכים להסתיים בתוך 4 שעות לאחר בידוד רקמות.
- הכנת רקמת גידול מוכתמת בבעלי חיים
- עבור יישומי in vivo , תאי CT26 טרום כתמים למשך 18 שעות בתווך ללא סרום המכיל בדיקת NaNO2-IR במינון 0.05 מ"ג/מ"ל.
- קח עכבר, לגלח את אזור ההזרקה באגף הימני, ולהזריק עם מזרק 200 μL של תערובת של 1 × 10 5 תאים לא מוכתמים ו 1 × 105 תאים מוכתמים מראש עם NanO2-IR .
- לאפשר גידולים לגדול בעכברים, ניטור גודל הגידול עם קליפר ואת משקל החיה מעת לעת37. בעלי החיים עם גידולים מושתלים מוכנים להדמיה ביום השביעי לצמיחת הגידול.
הערה: נפח הגידול חושב באמצעות משוואה (1):
V = (L × W 2)/2 (1)
כאשר L הוא קוטר הגידול, ו-W iהוא הקוטר בניצב לקוטר L. - להקריב את בעלי החיים על ידי נקע צוואר הרחם ממש לפני ההדמיה.
2. הגדרת הדמיה של PLIM
- קח את מתאם Cricket והסר את מתאם ההרכבה C בצד האחורי שלו כדי לקבל גישה לבית המניע שבתוכו. הכנס את משפר התמונה MCP-125 לתא זה, והחזיר את מתאם הרכבה C.
- הסר את מתאם הרכבה C בצד הקדמי של הצרצר, הכנס את מסנן הפליטה 760 ננומטר ± 50 ננומטר, ותקן אותו על-ידי החזרת תושבת C.
- חבר את מודול המצלמה Tpx3Cam לצד האחורי של מודול הקריקט באמצעות מתאם C-mount שלו
- חבר את העדשה לצד הקדמי של מודול הקריקט באמצעות מתאם הרכבה C.
- הרכיבו את כל מכלול המצלמה על גבי הקופסה השחורה האופטית, כשפניה כלפי מטה אל השלב שבו יצולמו הדגימות (איור 1).
- הרכיבו את נורית ה-LED הבהירה במיוחד בגודל 624 ננומטר על עמוד המחובר לקרש לחם בתוך הקופסה השחורה.
- חבר את נורית ה- LED לספק כוח וגנרטור פולסים. הפעל את נורית ה- LED, ומקד אותה כדי להבטיח עירור יעיל ואחיד של דגימות מצולמות.
- חברו את המצלמה למחולל פולסים אחר, וסנכרנו את הפולסים הנשלחים למצלמה ולנוריתה-LED 38.
- באמצעות הכבל והשקע המיוחדים ביחידת הקריקט, חבר את האינטנסיפייר לספק כוח סטנדרטי והגדר את הרווח ל- 2.7 V.
- באמצעות יכולות המיקוד של העדשה ומתאם הצרצרים, מקד את אופטיקת המצלמה על במת הדגימה כדי להפיק תמונות ברורות של דגימות עם ניגודיות ובהירות טובות.
- לשימוש במכונת הדמיה עם צבעי Pt-porphyrin, החלף את נורית ה-LED של 625 ננומטר בנורית LED של 390 ננומטר לעירור, והחלף את מסנן 760 ננומטר ± 50 ננומטר במסנן 650 ננומטר ± 50 ננומטר במודול Cricket.
3. רכישת תמונות
- הניחו את הדגימה מול עדשת המצלמה.
הערה: השתמש בשלב מתכוונן x-y-z כמחזיק הדגימה כדי להתאים את מיקום הדגימה למיקוד טוב. - כבו את כל האורות בחדר.
- הפעל את תוכנת Sophy לכוונון הפרמטרים התפעוליים, כגון מיקוד ויישור דגימה.
הערה: תוכנת Sophy מסופקת יחד עם המצלמה כדי להגדיר את פרמטרי ההדמיה ולהקליט את הנתונים. ודא שהתוכנה מחוברת למצלמה על-ידי בדיקת קוד המצלמה. עם זאת, השתמשנו בתוכנית אחרת לרכישת נתונים. - ב'מודולים', בחרו אינסוף מסגרות והגדירו את מצב הפעולה של הפיקסלים לזמן מעל הסף.
- במודולים, עבור אל תצוגה מקדימה ובחר מודול פעיל. פעולה זו פותחת את החלון Medpix/Timpix Frames.
- בחלון זה, שנו את סולם הצבעים וסובבו את התמונה לכיוון הרצוי.
- הפעל את האינטנסיפייר והתחל את ההקלטה.
הערה: השתמש במסך ההקלטה של תוכנת Sophy כדי לאשר חזותית את היישור והמיקוד של הדגימה ולמטב את פרמטרי העירור LED להקלטה. - עצור את ההקלטה וסגור את תוכנת Sophy.
- עבור אל המסוף והשתמש בתוכנה המותאמת אישית כדי לרכוש את הנתונים הגולמיים בפורמט הבינארי ולעבד אותם לאחר מכן (https://github.com/svihra/TimePix3).
- במסוף, הפעל את הפקודות הבאות כדי להקליט את הנתונים:
מסמך CD/SPIDR/תא מטען/שחרור/
LS
./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {שם הקובץ} - t {זמן רכישה}
הערה: בעת הקלדת "ls", בדוק את רשימת הקבצים בספריה הנוכחית; אשר כי Tpx3daq נראה. - המתן עד שכל המסגרות יוקלטו.
- כדי לעבד את הנתונים, הפעל את הפקודות הבאות במסוף:
תקליטור מסמכים/עיבוד נתונים/Timepix3/Timepix3/
שורש
. L dataprocess.cpp++
.x DRGUI. C - המתן לפתיחת חלון RRGui . בחר את כל המשתנים משמאל ואת All Data, Single File ו - Centroid מימין.
- בחר את הקובץ לעיבוד והפעלה של מפחית הנתונים.
הערה: כל הקבצים המעובדים יופיעו באותה תיקייה שבה נמצא הקובץ הגולמי.
- במסוף, הפעל את הפקודות הבאות כדי להקליט את הנתונים:
4. ניתוח נתונים
- נתח את הנתונים שלאחר עיבוד באמצעות תוכנה ייעודית הכתובה בשפת C שתכתוב את הנתונים לקובץ תמונה .ics (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).
- פתח את קובצי התמונה .ics באמצעות תוכנת Time Resolved Imaging הזמינה בחינם (ראה טבלת חומרים). השתמש בפונקציות דו-מעריכיות כדי להתאים לדעיכת הזרחן.
- פתח את .ics קובצי התמונה המותאמים באמצעות התוכנה הזמינה לניתוח תמונות (ראה טבלת חומרים).
- באמצעות טבלאות בדיקת מידע, צור תמונות לכל החיים של זרחן וקידוד שלהן בסקאלת פסאודו-צבעים (לדוגמה, צבע כחול לתקופות חיים קצרות ואדום לתקופות חיים ארוכות). השתמש בפונקציה Measure כדי לחשב את ערכי משך החיים הממוצע עבור התמונה כולה או אזורי עניין (ROI) ספציפיים.
- המרת ערכי החיים לריכוז החמצן באמצעות המשוואה המתקבלת מהתאמת כיול O2 של הגשושית36.
הערה: משוואה (2) שימשה לעבודה זו:
O 2 [μM] = −86.16 + 770.35 × e−0.049 × LT (2)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עבור יישומי הדמיה ex vivo , שברי רקמות מעיים הוכתמו על ידי יישום מקומי של בדיקת NanO2-IR בצד הסרוסלי של הרקמה. עבור צביעה עמוקה יותר, 1 μL של הבדיקה הוזרק לתוך לומן. במקרה האחרון, דופן המעי בעובי 0.2-0.25 מ"מ הגנה על הגשושית מפני המצלמה. שני תהליכי הצביעה מודגמים באיור 2A.
העוצמה המתקבלת ותמונות PLIM מוצגות באיור 2B-G. הצבעים משקפים בבירור את ההבדל בערכי החיים, ומכאן, את ההבדל בחמצון של הצדדים הסרוסליים והרירית של הרקמה. איור 2C ואיור 2D מתייחסים לקבוצות דומות של רקמות שהוכתמו באופן מקומי (איור 2C) ותוך לומינלית (איור 2D). כצפוי, הרקמות הראו דפוסי PLIM דומים. אולם הצביעה התוך-לומינלית של הצד הרירית של הרקמה (איור 2D) הראתה ערכי חיים גבוהים יותר, מה שמשקף חמצון נמוך יותר במשטח הפנימי של המעי, בהשוואה לצביעה מקומית של הצד הסרוסלי (איור 2C), שהראתה תקופות חיים נמוכות יותר. זה משקף חמצון גבוה יותר על פני השטח החיצוניים של המעי.
כדי לבחון את יציבות אותות החיים והפעילות הנשימתית של המעי, נערך ניתוח PLIM בהילוך מהיר על הדגימות המוכתמות תוך לומינלית במשך שעתיים (איור 2D-G). עלייה בערכי החיים נצפתה בין 15 דקות (54.4 μs ± 0.9 μs) ו 2 שעות (61.1 μs ± 0.8 μs ) של הדגירה, אשר משקף ירידה ברמות O2 בחלק הלומינלי של המעי. בנוסף, רמות O2 הנמוכות לאחר שעתיים של דגירה מוכיחות כי נשימת הרקמה נמשכה לאורך כל תקופת הדיסקציה, ההכנה, הצביעה, הדגירה ושלבי ההדמיה. נוסף על כך, ניתן לייחס את השינוי בצורת הלומן שנצפה באיור 2D-G להתפלגות הגשושית המוזרקת ללומן, כלומר אות LT משקף את האזור שבו הגשושית ממוקמת.
כדי להעריך את הביצועים העתידיים של מכשיר ההדמיה in vivo, מחקר ראשוני על הדמיה של היפוקסיה בגידולים תת-עוריים מושתלים שגדלו בעכברים בוצע מיד לאחר ההקרבה (איור 3). במקרה זה, עכברי Balb/c הוזרקו תת עורית באגף הימני עם 200 μL של תערובת של תאי CT26, שלא היו מוכתמים או מוכתמים בבדיקה NanO2-IR של 0.05 מ"ג/מ"ל. PLIM בוצע ביום השביעי לצמיחת הגידול, והעכברים הוקרבו ממש לפני ההדמיה (כלומר, לאחר המוות). תמונות של אזורי הגידול בעכברים ביום השביעי לגדילה מוצגות באיור 3A,B.
תמונות העוצמה (משמאל) וה-PLIM (מימין) של אזורי הגידול בעכברים ביום השביעי לצמיחת הגידול (איור 3B) מדגימות את הביצועים והרגישות הן של המדמה והן של הגשושית בניסויים כאלה (נתונים סטטיסטיים מפורטים יותר לא מוצגים). החיות צולמו במשך 20 שניות כל אחת. האגפים השמאליים של העכברים גולחו וצולמו כריקים. הם לא הפיקו אותות PLIM. לעומת זאת, אזורים עם הגידול והגשושית הפיקו אותות חיים יציבים של ~50 μs. מטרת ניסוי זה הייתה להעריך את השימושיות של מכשיר ההדמיה עבור מחקרי in vivo עם בעלי חיים ומודלים של מחלות אנושיות. בעוד חלק זה הראה תוצאות איכותניות ראשוניות, מאמר מקביל נמצא בהכנה, אשר מספק הערכה כמותית יסודית יותר.
לאחר מכן, ההדמיה הודגמה גם בהדמיית PLIM של חומרי חיישנים המבוססים על צבעי Pt(II)-פורפירין. המבנה הכימי של צבע Pt-octaethylporphine (PtOEP) ופרטים טכניים של הכנת חומרי החיישן המתאימים מתוארים במקום אחר 6,39. ציפויי חיישני מצב מוצק זרחניים מבוססי פוליסטירן PtOEP שהושקעו על סרט פוליאסטר שקוף (מיילר) ככתמים קטנים צולמו על ידי טבילת הסרט במאגר PBS (מצב מחומצן רווי אוויר) או ב- PBS המכיל גלוקוז וגלוקוז אוקסידאז, המספק מצב לא מחומצן לחלוטין. אותות החיים שהתקבלו בתנאים מחומצנים (25.6 μs ± 0.5 μs) ובתנאים לא מחומצנים (65.7 μs ± 1.5 μs) תאמו את התוצאות שדווחו קודם לכן6. תמונות העוצמה וה-PLIM של החיישנים המחומצנים והלא מחומצנים מוצגות באיור 4A, B.
איור 1: התקנה ניסיונית של מכשיר ההדמיה38. הודפס מחדש באישור Sen et al.38. זכויות יוצרים: האגודה האופטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: O2 PLIM של דגימות מעי עכבר מוכתמות מקומית ותוך-לומינלית. (A) המחשה של שתי שיטות הצביעה באמצעות (B) עוצמת זרחן ו-(C) תמונות PLIM של המעי המוכתמות באופן מקומי באמצעות בדיקת NanO2-IR. (ד-ג) Timelapse PLIM של המעי המוכתם intraluminally ב 15 דקות, 30 דקות, 1 שעה, ו 2 שעות לאחר הצביעה. תמונות PLIM מוצגות בסקאלת פסאודו-צבעים: הצבע הכחול מתאים לתקופת חיים נמוכה יותר, והצבע האדום מתאים לערכי חיים גבוהים יותר. מוטות קנה מידה = 5 מ"מ. קיצור: PLIM = מיקרוסקופ הדמיה לכל החיים זרחני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: O2 PLIM של גידולים מושתלים באגפים הימניים של העכברים . (A) המחשה גרפית של התפתחות גידולים בבעלי חיים חיים. עוצמת זרחן (משמאל) ותמונות PLIM (מימין) של אזורי הגידול ביום השביעי (B) לצמיחת הגידול. תמונת PLIM מוצגת בסולם פסאודו-צבעים: הצבע הכחול מתאים לתקופת חיים נמוכה יותר, והצבע האדום מתאים לערכי חיים גבוהים יותר. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. קיצור: PLIM = מיקרוסקופ הדמיה לכל החיים זרחני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: עוצמת הזרחן של נקודת חיישן מבוססת PtOEP. תמונות עוצמת זרחן (משמאל) ו-PLIM (מימין) של נקודת חיישן PtOEP במצבים (A) מחומצן ו-(B) לא מחומצן. תמונות PLIM מוצגות בסקאלת פסאודו-צבעים: הכחול מתאים לתקופת חיים נמוכה יותר, והצבע האדום מתאים לערכי חיים גבוהים יותר. קיצורים: PLIM = מיקרוסקופ הדמיה לכל החיים זרחן; PtOEP = אוקטאתילפורפירין פלטינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקולים לעיל נותנים תיאור מפורט של הרכבת ה- imager החדש ופעולתו במצב FLIM/PLIM של מיקרו-שנייה. מצלמת Tpx3Cam מהדור החדש מבוססת TCSPC, המשולבת באמצעות המתאם האופטו-מכני Cricket עם חיישן התמונה, מסנן הפליטה ועדשת המאקרו, מייצרת מודול אופטי יציב, קומפקטי וגמיש וקל לתפעול. ההדמיה הוכחה כבעלת ביצועים טובים עם מגוון דגימות שונות ומשימות אנליטיות, שכללו אפיון חומרים זרחניים והדמיית רקמות חיות O2 . בניסויי ההדמיה נעשה שימוש בבדיקה המסיסה המבוססת על אינפרא-אדום קרוב Pt(II)-benzoporphyrin, NanO2-IR, וחיישני מצב מוצק מבוססי Pt(II)-פורפירין הפולטים אדום. חיישנים אלה שימשו בהצלחה לזיהוי זרחן מרוהה של O2 בשל שינוי סטוקס הגדול שלהם, חיי פליטה ארוכים, רגישות גבוהה, תגובה מהירה ויציבות פוטוכימית טובה.
בדיקות רגישות O2 וציפויי מצב מוצק שונים, כאשר נבדקו על מצלמת המאקרו, הפיקו תוצאות התואמות את הנתונים שפורסמו בעבר40. החומרים הפגינו אחידות, ניגודיות טובה ותגובות לכל החיים לתנאי סביבה משתנים, במיוחד במונחים של טמפרטורה ומצב חמצון. ההשוואה של תוצאות אלה עם אלה שהופקו במיקרוסקופ TCSPC-PLIM קונפוקלי מראה כי ההדמיה החדשה מדויקת, יש קריאות חיים באיכות טובה יותר, ורוכש תמונות PLIM במהירות גבוהה ורגישות28,38,40.
ההדמיה גם הדגימה ביצועים מבטיחים עם דגימות ביולוגיות מוכתמות זרחניות מסוגים שונים. לפיכך, הופקו מפות ריכוז O2 מפורטות עבור הדגימות שהכילו תרחיפים של תאי נשימה מוכתמים, רקמת בעלי חיים חיים לאחר המוות, איברים שלמים וגידולים מושתלים. מכשיר ההדמיה סיפק מדידות של ערכי חיים מפני השטח ואפילו בעומקים של עד 0.5 מ"מ בתוך הרקמה28,36,38.
מכיוון שערכי החיים של הזרחן מושפעים מאוד מטמפרטורה41, יש צורך ליישם בקרת טמפרטורה הדוקה של הדגימות המצולמות, כגון באמצעות שלב דגימה מחומם ו / או תא אינקובטור. בעת השימוש בעירור UV, חשוב לבחור בקפידה את מחזיקי הדגימה, שכן חומרים רבים בעלי אוטופלואורסצנטיות באזור ספקטרלי זה, המשפיע על ערך החיים האמיתי של הדגימה. כל הדמיית PLIM במחקר זה בוצעה בהספק LED של 4 V וברוחב פולס של 50 ns לזמן אינטגרציה של 20 שניות; עם זאת, ניתן להתאים פרמטרים אלה לפי הצורך. כ-104,500 פריימים נרשמים במהלך 20 שניות של זמן רכישת תמונה. לבסוף, חשוב לבצע את המדידות בתא חשוך כדי למנוע הפרעות לאור הסביבה.
לפיכך, מצלמת PLIM יכולה לבצע מדידות מהירות וכמותיות לאורך החיים עם עצמים מקרוסקופיים בגודל משמעותי. בעוד סריקת לייזר PLIM-TCSPS אפשרית, היא תהיה איטית מדי בגלל זמני השהייה הארוכים הדרושים לצבעי חישת החמצן. תמונה זו, לעומת זאת, מהירה ויכולה להקליט את כל הפיקסלים בו זמנית. יתר על כן, מדידות מבוססות עוצמה יכולות להיות מושפעות מריכוז הצבע הפלואורסצנטי/זרחני, עוצמות LED או לייזר לא יציבות, הלבנה פוטו, יישור הרכיבים האופטיים ופיזור מהדגימות. לעומת זאת, מצלמת המאקרו מבוססת TCSPC אינה תלויה בגורמים אלה. לכן, הוא יכול לבצע מדידות מדויקות ונטולות כיול של O2. החסרונות של המצלמה כוללים עיבוד נתונים מורכב יחסית וגדלי נתונים גדולים (~ 2 Gb).
בעתיד, ההדמיה יכולה לשמש לא רק למיפוי ריכוזי O2 אלא גם פרמטרים כימיים וביוכימיים אחרים של דגימות שנבדקו, כגון דינמיקת pH וגלוקוז, באמצעות הגשושיות או החיישנים המתאימים. זה הופך אותו לכלי שימושי למחקרים פיזיולוגיים עם מודלים שונים של רקמות ומחלות. ניתן גם לשדרג את ה- imager כך שיפעל במצב FLIM ננו-שנייה. עם זאת, זה דורש החלפת נורות ה- LED הנוכחיות במקור עירור מהיר יותר (למשל, לייזר ps). פעולת המערכת במצב PLIM/FLIM כפול אפשרית גם היא בעיקר.
בסך הכל, ה- imager מדגים פשטות ורבגוניות, יחד עם פונקציונליות טובה וביצועים תפעוליים ביישומי TCSPC-PLIM בשדה רחב. מצלמות שדה רחב זמינות מסחרית מבצעות לרוב הדמיה מבוססת עוצמה, שבה העוצמות הזרחניות יכולות להיות מושפעות מגורמים כמו הלבנה, גיאומטריית מדידה, פיזור מדגימות וכו '. ההדמיה הנוכחית מבוססת על הדמיה לכל החיים, מה שהופך את המדידות לכמותיות יותר מאשר איכותיות. יתר על כן, השילוב של המצלמה האופטית Tpx3Cam עם מתאם קריקט ומשפר תמונה מספק רגישות פוטון יחיד, פשטות, גמישות ועמידות של המדידות. בניגוד למערכות אחרות, ניתן לשאת אותו לאתר הניסויים ולסובב אותו ב-360° בהתאם לדרישות משימת הדגימה והמדידה. עם המטרה הנוכחית שלה, אשר קל לשנות עבור עדשה אחרת, imager יכול למדוד דגימות עד 18 מ"מ x 18 מ"מ בגודל של כמה שניות עם רזולוציה מרחבית גבוהה של 256 פיקסלים x 256 פיקסלים. מאמר זה מתאר נהלים שלב אחר שלב כיצד להכין דוגמאות לבדיקה ולהשתמש במכונת ההדמיה ביישומי PLIM השונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
תמיכה כספית לעבודה זו מקרן המדע אירלנד, מענקי SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 ו-18/SP/3522, ומחקר סרטן פורץ דרך (אונקולוגיה מדויקת אירלנד) זוכה להכרת תודה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
References
- Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
- Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
- Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
- Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
- Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
- Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).
- Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
- Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
- Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
- Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
- Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
- Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
- Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).
- Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
- Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
- Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
- Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
- Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
- Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. Becker, W. , Springer. Cham, Switzerland. 225-247 (2015).
- Becker, W. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. König, K. , De Gruyter. Berlin, Germany. 23-52 (2018).
- Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800 (2017).
- Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).
- Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).
- Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).
- Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, Springer. Cham, Switzerland. (2017).
- Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).
- Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
- Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
- Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).
- Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).
- Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).
- Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).
- Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
- Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006 (2020).
- Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
- Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
- Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
- Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).
- Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M.
