Summary
この論文では、長い崩壊発光サンプルの巨視的なフォトルミネッセンスライフタイムイメージングのための新しい高速光学イメージャーの使用について説明します。統合、画像取得、および分析手順、およびイメージング用のセンサー材料の準備と特性評価、および生物学的サンプルの研究におけるイメージャーの適用について説明します。
Abstract
この論文では、固体のO 2感受性コーティングから可溶性O2感受性プローブで染色された生きた動物組織サンプルまで、さまざまなリン光サンプル中の分子状酸素(O2)濃度をマッピングするように設計された新しいフォトルミネッセンスライフタイムイメージャーを紹介します。特に、625nmの発光ダイオード(LED)で励起可能で760nmで発光するナノ粒子ベースの近赤外プローブNanO2-IRを用いた。イメージングシステムは、Timepix3カメラ(Tpx3Cam)と、イメージインテンシファイアも収容するオプトメカニカルアダプターに基づいています。O2リン光寿命イメージング顕微鏡(PLIM)は、様々な研究に一般的に必要とされるが、現在のプラットフォームは、その精度、一般的な柔軟性、およびユーザビリティにおいて限界を有する。
ここで紹介するシステムは、統合された光学センサーと読み出しチップモジュールであるTpx3Cam上に構築された、高速で高感度のイメージャーです。表面染色された腸組織サンプルまたは大腸の管腔内染色断片から高強度のリン光シグナルおよび安定した寿命値を生成することが示され、約20秒以下で組織O2 レベルの詳細なマッピングを可能にする。無意識の動物の移植腫瘍における低酸素症のイメージングに関する最初の実験も提示されています。また、励起用の390 nm LEDと発光用のバンドパス650 nmフィルターを使用して、Pt-ポルフィリン色素に基づくO2感応材料で使用するためにイメージャを再構成する方法についても説明します。全体として、PLIMイメージャは、使用されたプローブの寿命値およびO2 濃度のそれぞれの2次元マップの正確な定量的測定値を生成することが見出された。また、 ex vivo 組織モデルや生きた動物の代謝イメージングにも有用です。
Introduction
O 2は生命システムにとって重要な環境パラメータの1つであり、O 2の分布とそのダイナミクスに関する知識は多くの生物学的研究にとって重要です1,2,3。リン光プローブ4,5,6,7,8およびPLIM9,10,11,12,13による組織酸素化の評価は、生物学的および医学的研究3,9,14,15,16において人気を集めている。 17、18、19。これは、PLIMが蛍光や燐光強度の測定とは異なり、プローブ濃度、光退色、励起強度、光学アライメント、散乱、自家蛍光などの外的要因の影響を受けないためです。
しかしながら、現在のO2 PLIMプラットフォームは、それらの感度、画像取得速度、精度、および一般的なユーザビリティによって制限される。ラスタースキャン手順と組み合わせた時間相関単一光子計数(TCSPC)は、PLIMおよび蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)デバイス20、21、22で頻繁に使用されます。しかしながら、PLIMは長いピクセル滞留時間(ミリ秒の範囲)を必要とするので、画像取得の時間は、FLIMアプリケーション20、22、23に必要とされる時間よりもはるかに長い。ゲート付きCCD / CMOSカメラなどの他の技術は、単一光子感度に欠け、フレームレートが低い20,24,25,26です。さらに、既存のPLIMシステムは主に微視的フォーマットで使用されていますが、巨視的システムはあまり一般的ではありません27。
TCSPCベースのPLIMマクロイメージャ28 は、これらの制限の多くを克服するためにセットアップされた。イメージャーの設計は、次の新しいオプトメカニカルアダプターCricketを使用することで大幅に容易になりました:i)背面のカメラモジュールと前面の対物レンズを簡単に結合できる2つのCマウントアダプター。ii)イメージインテンシファイア用の内部ハウジングと、クリケットの外側にある後者用の電源ソケット。iii)前面Cマウントアダプターの後ろの内部スペースで、標準の25mmエミッションフィルターをインテンシファイアの前に収納できます。iv)リングレギュレーターを備えた内蔵の光コリメート光学系により、レンズとカメラ間の光学的位置合わせ/焦点合わせが可能になり、カメラチップ上に鮮明な画像が生成されます。
組み立てられたイメージャーでは、カメラモジュールはクリケットアダプターの裏側に結合され、光電陰極とそれに続くマイクロチャネルプレート(MCP)、増幅器、および高速シンチレーターであるP47蛍光体で構成されるイメージインテンシファイアも収容されています。クリケットの内部には760nm±50nmの発光フィルターが取り付けられ、前面のCマウントアダプターには対物レンズNMV-50M11''が取り付けられています。最後に、レンズとカメラはリングレギュレーターと光学的に位置合わせされます。
インテンシファイアの役割は、入射する光子を検出し、それらをカメラチップ上で高速の光バーストに変換することであり、それらは登録され、発光減衰と生涯画像を生成するために使用されます。カメラモジュールは、高度なTCSPCベースの光学センサーアレイ(256ピクセルx 256ピクセル)と新世代の読み出しチップ29,30,31,32,33で構成されており、1.6nsの時間分解能と80Mpixel/sの読み出し速度で、イメージングチップの各ピクセルでのフォトンバーストの到着時間(TOA)と時間超過しきい値(TOT)の同時記録を可能にします。
この構成では、インテンシファイアを備えたカメラは単一光子感度を有する。これは、データ駆動型であり、高速ピクセル検出器読み出し(SPIDR)システム34に基づいている。イメージャの空間分解能は、平面燐光O2 センサおよび分解能プレートマスクを用いて予め特徴付けられた。機器の応答関数(IRF)は、他のすべての測定に使用したのと同じ設定で平面蛍光センサーのイメージングによって測定されました。約2.6nsの色素の寿命は、PLIMモードでのIRF測定に使用するのに十分短かった。イメージャは、最大18 mm x 18 mmのサイズのオブジェクトを、それぞれ39.4 μmおよび30.6 ns(半値で全幅)の空間分解能と時間分解能でイメージングできます28。
以下のプロトコルは、マクロイメージャの組み立て、および以前に特徴付けられた近赤外O2プローブ、NanO2−IR35で染色された生物学的試料中のO2濃度をマッピングするためのその後の使用について記載している。このプローブは、白金(II)ベンゾポルフィリン(PtBP)色素をベースにした、明るく光安定性のある細胞透過性のO2センシングプローブです。それは625nmで励起性であり、760nmで放出し、生理学的範囲(0%〜21%または0〜210μMのO2)のO2に対して堅牢な光学応答を提供する。イメージャーは、Pt(II)-ポルフィリン色素に基づくさまざまなセンサー材料の特性評価も実証されています。全体として、イメージャーはコンパクトで柔軟性があり、一般的な写真カメラに似ています。現在のセットアップでは、イメージャはさまざまな広視野PLIMアプリケーションに適しています。LEDを高速レーザー光源に置き換えると、イメージャの性能がさらに向上し、ナノ秒のFLIMアプリケーションが可能になる可能性があります。
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Protocol
動物を使ったすべての手順は、欧州共同体理事会指令(2010/63 / EU)に従って健康製品規制当局(HPRA、アイルランド)によって発行された承認の下で実行され、ユニバーシティカレッジコークの動物実験倫理委員会によって承認されました。
1. サンプル調製
- 生体外での生体外組織サンプルのプローブによる染色
- ex vivoアプリケーションの場合は、4週齢の雌Balb/cマウスから新たに単離された組織サンプルを使用します。
- 実験当日、マウスを断頭で安楽死させ、大きさ約10mmの結腸(大腸)の断片を素早く解剖する。直ちにPBS緩衝液で洗浄し、10 mM Hepes緩衝液(pH 7.2)を添加したDMEM培地に入れ、37°Cでインキュベートします36。
- 腸の漿膜側の表面染色では、生きた組織サンプルをミニディッシュに移し、1 mg/mL NanO2-IRプローブを含む2 mLの完全DMEMを塗布して組織サンプルを覆い、37°Cで30分間インキュベートします。
注:死後組織の細胞は、培養中で何時間も生き続けます。NaNO2-IRは軽度の細胞毒性を示すため、すべての実験は組織単離後4時間以内に完了しました。 - 深部組織管腔 内ex vivo 染色の場合は、腸の小片を乾燥したペトリ皿に移し、余分なDMEMをろ紙で取り除きます。
- 1 mg/mL NanO2-IR 35を含むDMEMを1 μLハミルトンシリンジで内腔に注入し、サンプルを15 分間または最大4時間インキュベートします。
注:NaNO2-IRは、軽微な長期細胞毒性作用を示します。したがって、すべての実験は組織単離後4時間以内に完了する必要があります。
- 生きた動物における染色腫瘍組織の調製
- in vivoアプリケーションでは、0.05 mg/mLのNaNO2-IRプローブを含む無血清培地でCT26細胞を18時間プレ染色します。
- マウスを取り、右脇腹の注射領域を剃毛し、NanO2-IRで予め染色された1 × 10 5個の非染色細胞と1 × 105個の細胞の混合物をシリンジ200μLで注射する。
- マウス内で腫瘍を増殖させ、ノギスで腫瘍の大きさと動物の体重を定期的に監視します37。移植された腫瘍を有する動物は、腫瘍増殖の7日目にイメージングの準備が整う。
注:腫瘍体積は、式(1)を使用して計算されました。
V = (L × W 2)/2 (1)
ここで、Lは腫瘍の直径であり、Wisは直径Lに垂直な直径である。 - イメージングの直前に頸部脱臼によって動物を犠牲にします。
2. PLIMイメージングのセットアップ
- クリケットアダプターを取り、裏側のCマウントアダプターを取り外して、内部のインテンシファイアハウジングにアクセスできるようにします。MCP-125イメージインテンシファイアをこのコンパートメントに挿入し、Cマウントアダプターを元に戻します。
- クリケットの前面Cマウントアダプターを取り外し、760nm±50nmの発光フィルターを挿入し、Cマウントを元に戻して固定します。
- Tpx3CamカメラモジュールをCマウントアダプター を介して クリケットモジュールの背面に接続します
- Cマウントアダプター を介して レンズをクリケットモジュールの前面に接続します。
- カメラアセンブリ全体を光学ブラックボックスの上に取り付け、サンプルを画像化するステージに下を向かせます(図1)。
- 624nmの超高輝度LEDを、ブラックボックス内のブレッドボードに接続されたポストに取り付けます。
- LEDを電源とパルス発生器に接続します。LEDのスイッチを入れ、焦点を合わせて、画像化されたサンプルの効果的かつ均一な励起を確保します。
- カメラを別のパルス発生器に接続し、カメラに送られるパルスとLED38とを同期させる。
- クリケットユニットの専用ケーブルとソケットを使用して、インテンシファイアを標準電源に接続し、 ゲイン を 2.7Vに設定します。
- レンズとクリケットアダプターのフォーカシング機能を使用して、カメラの光学系をサンプルステージに集束させ、コントラストと明るさの良いサンプルの鮮明な画像を生成します。
- Pt-ポルフィリン色素を使用したイメージャーの使用には、励起用の 625 nm LED を 390 nm LED に交換し、クリケットモジュールでは 760 nm ± 50 nm フィルターを 650 nm ± 50 nm フィルターに交換します。
3. 画像取得
- サンプルをカメラレンズの前に置きます。
注意: サンプルの位置を調整して焦点を合わせるために、サンプルホルダーとしてx-y-z調整可能なステージを使用してください。 - 部屋のすべての照明を消します。
- Sophyソフトウェアの電源を入れて、フォーカシングやサンプルアライメントなどの操作パラメータを調整します。
注意: Sophyソフトウェアは、イメージングパラメータを設定し、データを記録するためのカメラと一緒に提供されます。カメラのコードを確認して、ソフトウェアがカメラに接続されていることを確認してください。ただし、データ収集には別のプログラムを使用しました。 - [モジュール] で、無限フレームを選択し、ピクセル操作モードをしきい値を超える時間に設定します。
- [モジュール] で [プレビュー] に移動し、[アクティブなモジュール] を選択します。これにより、Medpix/Timpixフレームウィンドウが開きます。
- このウィンドウで、 カラースケールを変更し、イメージを目的の方向に 回転 します。
- インテンシファイアのスイッチを入れて、録音を開始します。
注意: Sophyソフトウェアの記録画面を使用して、サンプルの位置合わせと焦点を視覚的に確認し、記録用のLED励起パラメーターを最適化します。 - 録音を停止し、Sophyソフトウェアを閉じます。
- ターミナルに移動し、カスタム設計されたソフトウェアを使用して、バイナリ形式で生データを取得し、後処理(https://github.com/svihra/TimePix3)します。
- ターミナルで、次のコマンドを実行してデータを記録します。
CD ドキュメント/スピドル/トランク/リリース/
です。
./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {ファイルの名前} - t {取得時間}
注: 「ls」と入力したら、現在のディレクトリ内のファイルの一覧を確認します。Tpx3daq が表示されていることを確認します。 - すべてのフレームが記録されるまで待ちます。
- データを処理するには、ターミナルで次のコマンドを実行します 。
cd ドキュメント/データ処理/タイムピックス3/タイムピックス3/
根
.L データプロセス.cpp++
.x DRGUI.C - RRGui ウィンドウが開くのを待ちます。左側ですべての変数を選択し、右側で [すべてのデータ]、[単一ファイル]、および [重心] を選択します。
- 処理するファイルを選択し、データレデューサーを実行します。
注:処理されたすべてのファイルは、RAWファイルと同じフォルダーに表示されます。
- ターミナルで、次のコマンドを実行してデータを記録します。
4.データ分析
- C言語で記述された専用プログラムで後処理データを解析し、データを.ics画像ファイル(https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam)に書き込みます。
- 無料で入手できる時間分解イメージングソフトウェアを使用して、.ics画像ファイルを開きます( 材料表を参照)。 2指数関数 を使用して、燐光減衰に適合させます。
- 利用可能な画像解析ソフトウェアでフィット.ics画像ファイルを開きます( 材料表を参照)。
- ルックアップテーブルを使用して、燐光寿命画像を生成し、それらを疑似カラースケールでエンコードします(たとえば、短い寿命の場合は青色、長い寿命の場合は赤色)。測定機能を使用して、画像全体または特定の関心領域(ROI)の平均寿命値を計算します。
- 寿命値をプローブ36のO2校正のフィッティングから得られた式を用いて酸素濃度に変換する。
注:この作業には式(2)が使用されました。
O 2 [μM] = −86.16 + 770.35 × e−0.049 × LT (2)
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Representative Results
ex vivoイメージングアプリケーションの場合、腸組織の断片は、組織の漿膜側にNanO2-IRプローブの局所適用によって染色されました。より深い染色のために、1μLのプローブを内腔に注入した。後者の場合、厚さ0.2〜0.25 mmの腸壁がプローブをカメラから遮蔽しました。2つの染色プロセスを図2Aに示します。
得られた強度とPLIM画像を図2B-Gに示します。色は、寿命値の違い、したがって、組織の漿膜側と粘膜側の酸素化の違いを明確に反映しています。図2Cおよび図2Dは、局所的(図2C)および管腔内(図2D)に染色された類似の組織セットを指す。予想通り、組織は同様のPLIMパターンを示しました。しかし、組織の粘膜側の管腔内染色(図2D)は、より低い寿命を示した漿膜側の局所染色(図2C)と比較して、腸の内面の酸素化が低いことを反映して、より高い寿命値を示しました。これは、腸の外表面におけるより高い酸素化を反映しています。
生涯シグナルと腸の呼吸活動の安定性を調べるために、管腔内染色されたサンプルに対して2時間にわたってタイムラプスPLIM分析を実施しました(図2D-G)。インキュベーションの15分(54.4μs±0.9μs)から2時間(61.1μs±0.8μs)の間に寿命値の増加が観察され、これは腸の管腔部分におけるO2レベルの低下を反映している。さらに、2時間のインキュベーション後の低O2レベルは、組織呼吸が解剖、調製、染色、インキュベーション、およびイメージングステップの全期間にわたって継続したことを証明しています。さらに、図2D-Gで観察された内腔の形状の変化は、管腔に注入されたプローブの分布に起因する可能性があり、LT信号はプローブが配置されている領域を反映しています。
in vivoでのイメージャの将来の性能を評価するために、マウスで増殖した移植皮下腫瘍における低酸素のイメージングに関する最初の研究が、屠殺直後に実施されました(図3)。この場合、Balb/cマウスにCT26細胞の混合物200 μLを右脇腹の皮下注射し、無染色または0.05 mg/mL NanO2-IRプローブで染色しました。PLIMは腫瘍増殖の7日目に実施され、マウスはイメージングの直前(すなわち死後)に屠殺された。成長の7日目のマウスにおける腫瘍領域の画像を図3A、Bに示す。
腫瘍増殖7日目のマウスの腫瘍領域の強度(左)およびPLIM(右)画像(図3B)は、このような実験におけるイメージャーとプローブの両方の性能と感度を示しています(より詳細な統計データは示されていません)。動物をそれぞれ20秒間画像化した。マウスの左脇腹を剃毛し、ブランクとして画像化した。それらはPLIM信号を生成しませんでした。対照的に、腫瘍とプローブのある領域は、~50μsの安定した寿命シグナルを生成しました。この実験の目的は、生きた動物と人間の病気のモデルを用いた in vivo 研究のためのイメージャーの使いやすさを評価することでした。この部分は予備的な定性的結果を示しましたが、対応する論文は準備中であり、より徹底的な定量的評価を提供します。
次に、イメージャーは、Pt(II)-ポルフィリン色素に基づくセンサー材料のPLIMイメージングでも実証されました。Pt-オクタエチルポルフィン色素(PtOEP)の化学構造および対応するセンサー材料の調製の技術的詳細は、他の場所に記載されている6,39。透明なポリエステルフィルム(マイラー)上に小さなスポットとして堆積されたPtOEPポリスチレンベースのリン光固体センサーコーティングを、フィルムをPBSバッファー(空気飽和酸素化状態)またはグルコースとグルコースオキシダーゼを含むPBSに浸すことによって画像化されました。酸素化(25.6 μs ± 0.5 μs)および脱酸素条件(65.7 μs ± 1.5 μs)で得られた寿命信号は、以前に報告された結果と一致しました6。酸素化センサーと脱酸素化センサーの強度とPLIM画像を図4A、Bに示します。
図1:撮像装置38の実験セットアップ。 Sen et al.38の許可を得て転載。著作権:光学協会。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:局所および管腔内で染色されたマウス腸サンプルのO2PLIM。 (A)NanO2-IRプローブで局所染色した腸の(B)燐光強度および(C)PLIM画像を用いた2つの染色方法の説明図。(D-G)染色後15分、30分、1時間、および2時間における管腔内染色された腸のタイムラプスPLIM。PLIM画像は擬似カラースケールで表示されます:青色はより低い寿命に対応し、赤色はより高い寿命値に対応します。スケールバー= 5 mm。略称:PLIM =燐光寿命イメージング顕微鏡。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウスの右脇腹に移植された腫瘍のO2PLIM。 (A)生きた動物における腫瘍発生の図。(B)腫瘍増殖7日目の腫瘍領域の燐光強度(左)とPLIM(右)画像。PLIM画像は擬似カラースケールで表示され、青色は寿命の短縮に対応し、赤色は寿命の値が高いことに対応します。スケールバー= 5 mm。略称:PLIM =燐光寿命イメージング顕微鏡。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:PtOEPベースのセンサースポットの燐光強度。 (A)酸素化状態および(B)脱酸素状態におけるPtOEPセンサースポットの燐光強度(左)およびPLIM(右)画像。PLIM画像は擬似カラースケールで表示されます:青は短い寿命に対応し、赤色はより高い寿命値に対応します。略語:PLIM =燐光寿命イメージング顕微鏡;PtOEP = プラチナオクタエチルポルフィリン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
上記のプロトコルは、新しいイメージャのアセンブリとマイクロ秒FLIM/PLIMモードでの動作の詳細な説明を提供します。TCSPCベースの新世代Tpx3Camカメラは、イメージインテンシファイア、発光フィルター、マクロレンズを備えたオプトメカニカルアダプターCricketによって組み合わされ、操作が容易な安定したコンパクトで柔軟な光学モジュールを生成します。イメージャーは、燐光発光材料の特性評価および生きた組織O2 イメージングを含む、さまざまなサンプルおよび分析タスクで良好に機能することが示された。近赤外Pt(II)-ベンゾポルフィリンベースの細胞透過性可溶性プローブNanO2-IRと赤色発光Pt(II)-ポルフィリンベースの固体センサーをイメージング実験に使用しました。これらのセンサは、その大きなストークスシフト、長い発光寿命、高感度、高速応答、および良好な光化学的安定性により、O2 の消光リン光検出に首尾よく使用されている。
これらの異なるO2感受性プローブおよび固体コーティングを、マクロイメージャ上で試験した場合、以前に公開されたデータ40と一致する結果を生成した。これらの材料は、特に温度と酸素化状態に関して、変化する環境条件に対して良好な均一性、コントラスト、および寿命応答を示しました。これらの結果を共焦点TCSPC-PLIM顕微鏡で得られた結果と比較すると、新しいイメージャは正確で、より高品質の寿命測定値を持ち、高速かつ高感度でPLIM画像を取得していることがわかります28、38、40。
イメージャーはまた、さまざまな種類の燐光染色された生物学的サンプルで有望な性能を示しました。したがって、染色された呼吸細胞、生死後の動物組織、臓器全体、および移植された腫瘍の懸濁液を含むサンプルについて、詳細なO2濃度マップが作成されました。イメージャは、表面から、さらには組織内の最大0.5mmの深さでも寿命値の測定値を提供しています28,36,38。
燐光寿命値は温度41の影響を強く受けるため、加熱した試料ステージやインキュベーターチャンバーを使用するなど、イメージングされた試料の温度制御を厳密に実施する必要があります。UV励起を使用する場合、多くの材料がこのスペクトル領域で自家蛍光を持ち、サンプルの真の寿命値に影響を与えるため、サンプルホルダーを慎重に選択することが重要です。この研究のすべてのPLIMイメージングは、20秒の積分時間で、4VのLED電力と50nsのパルス幅で実行されました。ただし、これらのパラメータは必要に応じて調整できます。20秒の画像取得時間で約104,500フレームが記録されます。最後に、周囲光の干渉を避けるために、暗いチャンバーで測定を実行することが重要です。
したがって、PLIMイメージャは、かなりの大きさの巨視的な物体に対して、高速で定量的な寿命測定を実行できます。レーザースキャニングPLIM-TCSPSは可能ですが、酸素感知色素に必要な滞留時間が長いため、遅すぎます。ただし、このイメージャーは高速で、すべてのピクセルを同時に記録できます。さらに、強度ベースの測定は、蛍光/燐光色素の濃度、不安定なLEDまたはレーザー強度、光退色、光学部品の整列、およびサンプルからの散乱によって影響を受ける可能性があります。対照的に、TCSPCベースのマクロイメージャは、本質的にこれらの要因から独立しています。したがって、O2の正確かつ校正不要の測定を行うことができる。カメラの欠点には、比較的複雑なデータ処理と大きなデータサイズ(~2 Gb)が含まれます。
将来的には、イメージャは、O2 濃度だけでなく、対応するプローブまたはセンサーを使用して、pHおよびグルコース動態などの試験サンプルの他の化学的および生化学的パラメータをマッピングするためにも使用することができる。これにより、さまざまな組織モデルや疾患モデルを用いた生理学的研究に有用なツールになります。イメージャは、ナノ秒のFLIMモードで動作するようにアップグレードすることもできます。ただし、これには、現在のLEDをより高速な励起源(psレーザーなど)に置き換える必要があります。デュアルPLIM/FLIMモードでのシステム動作も主に可能です。
全体として、このイメージャは、広視野TCSPC-PLIMアプリケーションで優れた機能と動作性能に加えて、シンプルさと汎用性を示しています。市販の広視野イメージャーは、主に強度ベースのイメージングを実行し、燐光強度は、光退色、測定形状、サンプルからの散乱などの要因によって影響を受ける可能性があります。現在のイメージャは寿命イメージングに基づいているため、測定は定性的ではなく定量的になります。さらに、Tpx3Cam光学カメラとクリケットアダプターおよびイメージインテンシファイアの統合により、単一光子感度、シンプルさ、柔軟性、および測定の堅牢性が提供されます。他のシステムとは異なり、実験現場に運び、サンプルと測定タスクの要件に基づいて360°回転させることができます。別のレンズに簡単に交換できる現在の対物レンズにより、イメージャーは最大18 mm x 18 mmのサイズのサンプルを数秒で測定でき、256 x 256ピクセルの高い空間分解能で測定できます。このホワイトペーパーでは、テスト用のサンプルを準備し、さまざまなPLIMアプリケーションでイメージャを使用する方法について、手順を順を追って説明します。
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Disclosures
著者には、宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
アイルランド科学財団からのこの研究への財政的支援、SFI/12/RC/2276_P2、SFI/17/RC-PhD/3484および18/SP/3522、およびBreakthrough Cancer Research(Precision Oncology Ireland)は感謝の意を表します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 627 nm LED | Parts Express | Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes. | |
| 760 ± 50 nm emission filter | Edmund Optics | 84-788 | Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes. |
| Balb/c mice | Envigo, UK | Balb/c | |
| Black box | Thorlabs | XE25C9/M | |
| Cricket Adapter | Photonis | Cricket-2 | |
| CT26 cells | ATCC | CT26.WT | https://www.atcc.org/products/crl-2638 |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D0697 | Other media can also be used |
| ImageJ Software | ImageJ | Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen | Photonis | PP0360EF | |
| Mini dishes | Sarstedt | 83.3900.300 | 35 mm diameter |
| Mylar plastic film, 75 micron | RS Ireland | 785-0795 | Othe plastic substrates can also be used |
| NanO2-IR | home-made | n/a | The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. |
| NMV-50M11” 50 mm lens | Navitar | Other lenses compatibel with C-mount adators can be used | |
| Optical breadboard | Thorlabs | MB1836 | |
| Petri Dishes | Sarstedt | 82.1472.001 | 92 mm diameter |
| Power Supply | Tenma | 72-10495 | |
| Pulse Generator | Tenma | TGP110 | |
| Sophy | Amsterdam Scientific Instruments | n/z | Provided by ASI together with the Tpx3Cam |
| Tpx3Cam | Amsterdam Scientific Instruments | TPXCAM | |
| Tri2 Software | University of Oxford | n/a | Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml |
| XYZ Translation Stage | Thorlabs | LT3 |
References
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