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Biology

Fluorescence Lifetime Macro Imager para aplicações biomédicas

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64321
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 3, 4, 1
1School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork, 2Cancer Research@UCC, University College Cork, 3Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis (CMCA), The University of Western Australia, 4Physics Department, Brookhaven National Laboratory

Summary

Este artigo descreve o uso de um novo imageador óptico rápido para a imagem macroscópica da vida útil da fotoluminescência de amostras emissoras de decaimento longo. Os procedimentos de integração, aquisição e análise das imagens são descritos, juntamente com a preparação e caracterização dos materiais sensores para a aquisição de imagens e a aplicação do imageador no estudo de amostras biológicas.

Abstract

Este trabalho apresenta um novo imageador de vida útil de fotoluminescência projetado para mapear a concentração de oxigênio molecular (O 2) em diferentes amostras fosforescentes, desde revestimentos sensíveis ao estado sólido do tipo O 2 até amostras de tecido animal vivo coradas com sondas solúveis sensíveis ao O2. Em particular, a sonda de infravermelho próximo NanO2-IR, baseada em nanopartículas, que é excitável com um diodo emissor de luz (LED) de 625 nm e emite a 760 nm, foi usada. O sistema de imagem é baseado na câmera Timepix3 (Tpx3Cam) e no adaptador optomecânico, que também abriga um intensificador de imagem. A microscopia de imagem ao longo da vida da fosforescência (PLIM) do O2 é comumente necessária para vários estudos, mas as plataformas atuais têm limitações em sua precisão, flexibilidade geral e usabilidade.

O sistema apresentado aqui é um imager rápido e altamente sensível, que é construído sobre um sensor óptico integrado e módulo de chip de leitura, Tpx3Cam. É mostrado para produzir sinais de fosforescência de alta intensidade e valores estáveis de vida a partir de amostras de tecido intestinal corados superficialmente ou fragmentos intraluminalmente corados do intestino grosso e permite o mapeamento detalhado dos níveis de tecido O2 em cerca de 20 s ou menos. Experimentos iniciais sobre a imagem de hipóxia em tumores enxertados em animais inconscientes também são apresentados. Também descrevemos como o imageador pode ser reconfigurado para uso com materiais sensíveis ao O2 baseados em corantes Pt-porfirina usando um LED de 390 nm para a excitação e um filtro passa-banda de 650 nm para emissão. Em geral, o imageador PLIM produziu medidas quantitativas precisas dos valores de vida útil das sondas usadas e respectivos mapas bidimensionais da concentração de O2 . Também é útil para a obtenção de imagens metabólicas de modelos teciduais ex vivo e animais vivos.

Introduction

O 2 é um dos principais parâmetros ambientais para sistemas vivos, e o conhecimento da distribuição do O 2 e sua dinâmica é importante para muitos estudos biológicos 1,2,3. A avaliação da oxigenação tecidual por meio de sondas fosforescentes 4,5,6,7,8 e PLIM 9,10,11,12,13 vem ganhando popularidade nas pesquisas biológicas e médicas 3,9,14,15,16, 17,18,19. Isso ocorre porque o PLIM, ao contrário das medidas de fluorescência ou intensidade de fosforescência, não é afetado por fatores externos, como concentração de sonda, fotobranqueamento, intensidade de excitação, alinhamento óptico, espalhamento e autofluorescência.

No entanto, as plataformas PLIM O2 atuais são limitadas por sua sensibilidade, velocidade de aquisição de imagem, precisão e usabilidade geral. A contagem de fótons únicos correlacionada ao tempo (TCSPC), combinada com um procedimento de varredura raster, é frequentemente usada em dispositivos de PLIM e fluorescência de microscopia de imagem de tempo de vida (FLIM)20,21,22. No entanto, como o PLIM requer um longo tempo de permanência de pixels (na faixa de milissegundos), o tempo de aquisição da imagem é muito maior do que o necessário para aplicações FLIM20,22,23. Outras técnicas, como câmeras CCD/CMOS fechadas, não possuem sensibilidade a fótons únicos e apresentam baixas taxas de quadros20,24,25,26. Além disso, os sistemas PLIM existentes são mais utilizados no formato microscópico, enquanto os sistemas macroscópicos são menos comuns27.

O imageador de macro PLIM28 baseado em TCSPC foi configurado para superar muitas dessas limitações. O design do imageador foi muito facilitado pelo uso de um novo adaptador optomecânico, Cricket, que tem o seguinte: i) dois adaptadores C-mount, que fornecem fácil acoplamento do módulo da câmera no lado traseiro e lente objetiva no lado frontal; ii) uma carcaça interna para um intensificador de imagem e uma tomada para este último no lado externo do Grilo; iii) um espaço interno atrás do adaptador de montagem em C frontal, onde um filtro de emissão padrão de 25 mm pode ser alojado na frente do intensificador; e iv) uma óptica de colima de luz integrada com reguladores de anel, que permitem o alinhamento/focalização óptico entre a lente e a câmera para produzir imagens nítidas no chip da câmera.

No imageador montado, o módulo da câmera é acoplado à parte traseira do adaptador Cricket, que também abriga um intensificador de imagem composto por um fotocátodo seguido por uma placa de microcanal (MCP), um amplificador e um cintilador rápido, fósforo P47. Um filtro de emissão de 760 nm ± 50 nm é instalado dentro do Cricket, e uma lente objetiva, NMV-50M11'', é conectada ao adaptador de montagem C frontal lateral. Finalmente, a lente e a câmera estão alinhadas opticamente com reguladores de anel.

O papel do intensificador é detectar fótons de entrada e convertê-los em rajadas rápidas de luz no chip da câmera, que são registradas e usadas para gerar decaimentos de emissão e imagens vitalícias. O módulo da câmera é composto por um avançado conjunto de sensores ópticos baseados em TCSPC (256 pixels x 256 pixels) e um chip de leitura de nova geração 29,30,31,32,33, que permitem a gravação simultânea do tempo de chegada (TOA) e do tempo sobre o limiar (TOT) de rajadas de fótons em cada pixel do chip de imagem com uma resolução de tempo de 1,6 ns e uma taxa de leitura de 80 Mpixel/s.

Nessa configuração, a câmera com o intensificador tem sensibilidade de fóton único. É orientado por dados e baseado no sistema de leitura rápida do detector de pixels (SPIDR)34. A resolução espacial do imageador foi previamente caracterizada com sensores planares fosforescentes O2 e uma máscara de placa de resolução. A função de resposta do instrumento (IRF) foi medida pela imagem de um sensor fluorescente planar sob as mesmas configurações usadas para todas as outras medidas. A vida útil do corante de cerca de 2,6 ns foi curta o suficiente para que ele fosse usado para a medição de IRF no modo PLIM. O imageador pode obter imagens de objetos de até 18 mm x 18 mm de tamanho com resoluções espaciais e temporais de 39,4 μm e 30,6 ns (largura total na metade do máximo), respectivamente28.

Os protocolos a seguir descrevem a montagem do macroimageador e seu posterior uso para mapeamento da concentração de O 2 em amostras biológicas coradas com a sonda de infravermelho próximo O2 previamente caracterizada, NanO2-IR35. A sonda é uma sonda de detecção de O2 brilhante, fotoestável, permeável a células, baseada no corante de platina (II) benzoporfirina (PtBP). É excitável a 625 nm, emite a 760 nm e fornece uma resposta óptica robusta ao O 2 na faixa fisiológica (0%-21% ou 0-210 μM de O2). O imageador também demonstrou caracterizar diferentes materiais sensores baseados em corantes Pt(II)-porfirina. No geral, o imageador é compacto e flexível, semelhante a uma câmera fotográfica comum. Na configuração atual, o imageador é apropriado para diferentes aplicações PLIM de campo amplo. A substituição do LED por uma fonte de laser rápida melhorará ainda mais o desempenho do imageador e poderá potencialmente permitir aplicações FLIM de nanossegundos.

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Protocol

Todos os procedimentos com animais foram realizados sob autorizações emitidas pela Health Products Regulatory Authority (HPRA, Irlanda) de acordo com a Diretiva do Conselho das Comunidades Europeias (2010/63/EU) e foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da University College Cork.

1. Preparação da amostra

  1. Coloração com sonda de amostras de tecidos vivos ex vivo
    1. Para aplicações ex vivo , use amostras de tecido recém-isoladas de camundongos Balb/c fêmeas com 4 semanas de idade.
    2. No dia do experimento, eutanasiar um camundongo por decapitação e dissecar rapidamente fragmentos do cólon (intestino grosso), com aproximadamente 10 mm de tamanho. Lavá-los imediatamente com tampão PBS, colocar em meio DMEM suplementado com tampão Hepes 10 mM (pH 7,2) e incubar a 37 °C36.
    3. Para coloração superficial do lado seroso do intestino, transferir as amostras de tecido vivo para um mini-prato, aplicar 2 mL de DMEM completo contendo 1 mg/mL de sonda NanO2-IR para cobrir as amostras de tecido e incubar por 30 min a 37 °C.
      NOTA: As células no tecido post-mortem permanecem vivas por muitas horas em cultura. NaNO2-IR apresenta pequena citotoxicidade, de modo que todos os experimentos foram concluídos dentro de 4 h após o isolamento tecidual.
    4. Para coloração ex vivo intraluminal de tecidos profundos, transfira os pedaços do intestino para uma placa de Petri seca e remova qualquer excesso de DMEM com papel de filtro.
    5. Injetar 1 μL de DMEM contendo 1 mg/mL de NanO2-IR 35 no lúmen com uma seringa de Hamilton e incubar as amostras por15 min ou por até 4 h.
      NOTA: NaNO2-IR mostra efeitos citotóxicos menores a longo prazo; portanto, todos os experimentos devem ser concluídos dentro de 4 h após o isolamento tecidual.
  2. Preparo de tecido tumoral corado em animais vivos
    1. Para aplicações in vivo , pré-corar células CT26 por 18 h em meio sem soro contendo sonda NaNO2-IR a 0,05 mg/mL.
    2. Pegue um rato, raspe a área de injeção no flanco direito e injete com uma seringa 200 μL de uma mistura de 1 × 10 5 células não coradas e 1 × 105 células pré-coradas com NanO2-IR .
    3. Permitir o crescimento dos tumores nos camundongos, monitorando periodicamente o tamanho do tumor com paquímetro e o peso do animal37. Os animais com tumores enxertados ficam prontos para exames de imagem no sétimo dia de crescimento tumoral.
      LEGENDA: O volume tumoral foi calculado pela equação (1):
      V = (L × W 2)/2 (1)
      onde L é o diâmetro do tumor e W is o diâmetro perpendicular ao diâmetro L.
    4. Sacrificar os animais por deslocamento cervical imediatamente antes da realização do exame.

2. Configuração de imagens PLIM

  1. Pegue o adaptador Cricket e remova seu adaptador de montagem em C na parte traseira para ter acesso à caixa do intensificador no interior. Insira o intensificador de imagem MCP-125 neste compartimento e coloque o adaptador C-mount de volta.
  2. Remova o adaptador C-mount frontal do Cricket, insira o filtro de emissões de 760 nm ± 50 nm e corrija-o colocando de volta o C-mount.
  3. Conecte o módulo da câmera Tpx3Cam à parte traseira do módulo Cricket através de seu adaptador C-mount
  4. Conecte a lente à parte frontal do módulo Cricket através de seu adaptador C-mount.
  5. Monte todo o conjunto da câmera em cima da caixa preta óptica, voltada para baixo até o palco em que as amostras serão fotografadas (Figura 1).
  6. Monte o LED super brilhante de 624 nm em um poste conectado a uma protoboard dentro da caixa preta.
  7. Conecte o LED a uma fonte de alimentação e a um gerador de pulsos. Ligue o LED e concentre-o para garantir a excitação eficaz e uniforme das amostras fotografadas.
  8. Conecte a câmera a outro gerador de pulsos e sincronize os pulsos enviados para a câmera e o LED38.
  9. Usando o cabo e a tomada especiais na unidade Cricket, conecte o intensificador a uma fonte de alimentação padrão e defina o ganho para 2,7 V.
  10. Usando os recursos de foco da lente e do adaptador Cricket, foque a ótica da câmera no estágio de amostra para gerar imagens claras de amostras com bom contraste e brilho.
  11. Para uso do imageador com corantes Pt-porfirina, substitua o LED de 625 nm por um LED de 390 nm para excitação e substitua o filtro de 760 nm ± 50 nm por um filtro de 650 nm ± 50 nm no módulo Cricket.

3. Aquisição de imagens

  1. Coloque a amostra na frente da lente da câmera.
    NOTA: Use um estágio ajustável x-y-z como suporte da amostra para ajustar a posição da amostra para um bom foco.
  2. Desligue todas as luzes da sala.
  3. Ligue o software Sophy para ajustar os parâmetros operacionais, como o foco e o alinhamento da amostra.
    NOTA: O software Sophy é fornecido juntamente com a câmera para configurar os parâmetros de imagem e gravar os dados. Verifique se o software está conectado à câmera verificando o código da câmera. No entanto, foi utilizado outro programa para aquisição de dados.
  4. Em Módulos, selecione quadros infinitos e defina o modo de operação de pixel como tempo acima do limite.
  5. Em Módulos, vá para Visualizar e selecione Módulo ativo. Isso abre a janela Medpix/Timpix Frames .
  6. Nesta janela, altere a escala de cores e gire a imagem para a orientação desejada.
  7. Ligue o intensificador e inicie a gravação.
    NOTA: Use a tela de gravação do software Sophy para confirmar visualmente o alinhamento e o foco da amostra e otimizar os parâmetros de excitação do LED para gravação.
  8. Pare a gravação e feche o software Sophy.
  9. Vá para o terminal e use o software personalizado para adquirir os dados brutos no formato binário e pós-processá-los (https://github.com/svihra/TimePix3).
    1. No terminal, execute os seguintes comandos para registrar os dados:
      Documento Cd/SPIDR/tronco/Lançamento/
       É
      ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Nome do arquivo} - t {tempo de aquisição}
      Observação : ao digitar "ls", verifique a lista de arquivos no diretório atual; confirme se Tpx3daq é visto.
    2. Aguarde até que todos os quadros sejam gravados.
    3. Para processar os dados, execute os seguintes comandos no terminal:
      cd Documentos/DataProcessing/Timepix3/Timepix3/
      raiz
      . L dataprocess.cpp++
      .x DRGUI. C
    4. Aguarde até que uma janela RRGui seja aberta. Selecione todas as variáveis à esquerda e Todos os Dados, Arquivo Único e Centroide à direita.
    5. Selecione o arquivo a ser processado e execute o redutor de dados.
      Observação : todos os arquivos processados aparecerão na mesma pasta que o arquivo bruto.

4. Análise dos dados

  1. Analise os dados pós-processados com um programa dedicado escrito em linguagem C que gravará os dados em um arquivo de imagem .ics (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).
  2. Abra os arquivos de imagem .ics usando o software Time Resolved Imaging disponível gratuitamente (consulte a Tabela de Materiais). Use duas funções exponenciais para ajustar os decaimentos de fosforescência.
  3. Abra os arquivos de imagem .ics ajustados com o software de análise de imagem disponível (consulte a Tabela de Materiais).
  4. Usando tabelas de pesquisa, gere imagens de vida útil de fosforescência e codifique-as em escala de pseudocores (por exemplo, cor azul para vidas curtas e vermelho para vidas longas). Use a função Medir para calcular os valores médios de tempo de vida útil para toda a imagem ou regiões de interesse específicas (ROIs).
  5. Converter os valores de vida em concentração de oxigênio usando a equação obtida a partir do ajuste da calibração do O2 da sonda36.
    OBS: A equação (2) foi utilizada para este trabalho:
    O 2 [μM] = −86,16 + 770,35 × e−0,049 × LT (2)

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Representative Results

Para aplicações de imagem ex vivo , fragmentos de tecido intestinal foram corados pela aplicação tópica da sonda NanO2-IR no lado seroso do tecido. Para uma coloração mais profunda, 1 μL da sonda foi injetado no lúmen. Neste último caso, a parede intestinal de 0,2-0,25 mm de espessura protegeu a sonda da câmera. Os dois processos de coloração estão demonstrados na Figura 2A.

As imagens resultantes de intensidade e PLIM estão apresentadas na Figura 2B-G. As cores refletem claramente a diferença nos valores de tempo de vida e, portanto, a diferença na oxigenação dos lados seroso e mucoso do tecido. As figuras 2C e 2D referem-se a conjuntos semelhantes de tecidos que foram corados topicamente (Figura 2C) e intraluminalmente (Figura 2D). Como esperado, os tecidos apresentaram padrões semelhantes de PLIM. Entretanto, a coloração intraluminal da face mucosa do tecido (Figura 2D) apresentou maiores valores de tempo de vida, refletindo menor oxigenação na superfície interna do intestino, comparada à coloração tópica do lado seroso (Figura 2C), que apresentou menor tempo de vida. Isso reflete maior oxigenação na superfície externa do intestino.

Para examinar a estabilidade dos sinais de vida e da atividade respiratória do intestino, uma análise PLIM de lapso de tempo foi conduzida nas amostras coradas intraluminalmente ao longo de 2 h (Figura 2D-G). Um aumento nos valores de tempo de vida foi observado entre 15 min (54,4 μs ± 0,9 μs) e 2 h (61,1 μs ± 0,8 μs) da incubação, o que reflete uma redução nos níveis de O2 na parte luminal do intestino. Além disso, os baixos níveis de O 2 após2 h de incubação comprovam que a respiração tecidual continuou durante todo o período de dissecção, preparação, coloração, incubação e etapas de imagem. Além disso, a mudança na forma do lúmen observada na Figura 2D-G pode ser atribuída à distribuição da sonda injetada no lúmen, ou seja, o sinal do LL reflete a área onde a sonda está localizada.

Para avaliar o desempenho futuro do imageador in vivo, um estudo inicial sobre a imagem de hipóxia em tumores subcutâneos enxertados crescidos em camundongos foi realizado imediatamente após o sacrifício (Figura 3). Neste caso, camundongos Balb/c foram injetados subcutaneamente no flanco direito com 200 μL de uma mistura de células CT26, as quais não foram coradas ou coradas com sonda NanO2-IR 0,05 mg/mL. A PLIM foi realizada no sétimo dia de crescimento do tumor, e os camundongos foram sacrificados imediatamente antes da aquisição de imagens (ou seja, post-mortem). Imagens das áreas tumorais nos camundongos no sétimo dia de crescimento são mostradas na Figura 3A,B.

As imagens de intensidade (esquerda) e PLIM (direita) para as áreas tumorais nos camundongos no sétimo dia de crescimento tumoral (Figura 3B) demonstram o desempenho e a sensibilidade tanto do imageador quanto da sonda em tais experimentos (dados estatísticos mais detalhados não mostrados). Os animais foram fotografados por 20 s cada. Os flancos esquerdos dos ratos foram raspados e fotografados como um branco. Eles não produziram sinais PLIM. Em contraste, regiões com o tumor e a sonda produziram sinais estáveis de vida útil de ~50 μs. O objetivo deste experimento foi avaliar a usabilidade do imageador para estudos in vivo com animais vivos e modelos de doença humana. Embora esta parte tenha apresentado resultados qualitativos preliminares, um artigo correspondente está em preparação, o que fornece uma avaliação quantitativa mais completa.

Em seguida, o imageador também foi demonstrado na imagem PLIM de materiais sensores baseados em corantes Pt(II)-porfirina. A estrutura química do corante Pt-octaetilporfina (PtOEP) e os detalhes técnicos da preparação dos materiais sensores correspondentes são descritos em outra publicação 6,39. Os revestimentos de sensores de estado sólido fosforescentes à base de PtOEP-poliestireno depositados sobre um filme transparente de poliéster (Mylar) como pequenos pontos foram fotografados submergindo o filme em tampão PBS (estado oxigenado saturado pelo ar) ou em PBS contendo glicose e glicose oxidase, o que fornece uma condição totalmente desoxigenada. Os sinais de tempo de vida obtidos nas condições oxigenada (25,6 μs ± 0,5 μs) e desoxigenada (65,7 μs ± 1,5 μs) coincidiram com os resultados relatados anteriormente6. As imagens de intensidade e PLIM dos sensores oxigenados e desoxigenados são apresentadas na Figura 4A, B.

Figure 1
Figura 1: Configuração experimental do imageador38. Reproduzido com permissão de Sen et al.38. Direitos Autorais: The Optical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: PLIM O 2 das amostras de intestino de camundongos coradas tópica e intraluminalmente. (A) Ilustração dos dois métodos de coloração usando (B) intensidade de fosforescência e (C) imagens PLIM do intestino coradas topicamente com a sonda NanO2-IR. (D-G) Timelapse PLIM do intestino corado intraluminalmente em 15 min, 30 min, 1 h e 2 h após a coloração. As imagens PLIM são apresentadas em uma escala de pseudocores: a cor azul corresponde a um menor tempo de vida e a cor vermelha corresponde a maiores valores de tempo de vida. Barras de escala = 5 mm. Abreviação: PLIM = phosphorescence lifetime imaging microscopy. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: O2 PLIM dos tumores enxertados nos flancos direitos dos camundongos . (A) Ilustração gráfica do desenvolvimento tumoral em animais vivos. Imagens de intensidade de fosforescência (esquerda) e PLIM (direita) de áreas tumorais no (B) sétimo dia de crescimento tumoral. A imagem PLIM é apresentada em uma escala de pseudocores: a cor azul corresponde a um menor tempo de vida e a cor vermelha corresponde a maiores valores de tempo de vida. Barra de escala = 5 mm. Abreviação: PLIM = phosphorescence lifetime imaging microscopy. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Intensidade de fosforescência do ponto do sensor baseado em PtOEP. Imagens de intensidade de fosforescência (esquerda) e PLIM (direita) do ponto do sensor PtOEP nos estados (A) oxigenado e (B) desoxigenado. As imagens PLIM são apresentadas em uma escala de pseudocores: o azul corresponde a um menor tempo de vida e a cor vermelha corresponde a maiores valores de tempo de vida. Abreviações: PLIM = phosphorescence lifetime imaging microscopy; PtOEP = octaetilporfirina de platina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Os protocolos acima fornecem uma descrição detalhada da montagem do novo imageador e seu funcionamento no modo FLIM/PLIM de microssegundos. A câmera Tpx3Cam de nova geração baseada em TCSPC, acoplada por meio do adaptador optomecânico Cricket com o intensificador de imagem, filtro de emissão e macrolente, produz um módulo óptico estável, compacto e flexível que é fácil de operar. O imageador mostrou um bom desempenho com uma variedade de diferentes amostras e tarefas analíticas, que incluíram a caracterização de materiais fosforescentes e imagens de tecido vivo O2 . A sonda solúvel NanO2-IR permeável a células à base de Pt(II)-benzoporfirina no infravermelho próximo e os sensores de estado sólido à base de Pt(II)-porfirina emissores de vermelho foram usados nos experimentos de imagem. Esses sensores têm sido usados com sucesso para a detecção de fosforescência apagada de O2 devido ao seu grande deslocamento de Stokes, longa vida útil da emissão, alta sensibilidade, resposta rápida e boa estabilidade fotoquímica.

Essas diferentes sondas sensíveis ao O2 e revestimentos de estado sólido, quando testados no macroimageador, produziram resultados concordantes com dados publicados anteriormente40. Os materiais demonstraram boa uniformidade, contraste e respostas de vida útil às mudanças nas condições ambientais, particularmente em termos de temperatura e estado de oxigenação. A comparação desses resultados com os produzidos no microscópio confocal TCSPC-PLIM mostra que o novo imageador é preciso, tem leituras de melhor qualidade ao longo da vida e adquire imagens PLIM com alta velocidade e sensibilidade28,38,40.

O imageador também demonstrou desempenho promissor com amostras biológicas coradas com fosforescência de diferentes tipos. Assim, mapas detalhados de concentração de O2 foram produzidos para as amostras contendo suspensões de células respiratórias coradas, tecido animal vivo post-mortem, órgãos inteiros e tumores enxertados. O imageador forneceu medidas de valores de tempo de vida a partir da superfície e mesmo em profundidades de até 0,5 mm no interior do tecido28,36,38.

Como os valores de vida útil da fosforescência são fortemente influenciados pela temperatura41, é necessário implementar um controle rigoroso da temperatura das amostras fotografadas, como usando um estágio de amostra aquecido e/ou uma câmara de incubadora. Ao usar a excitação UV, é importante escolher cuidadosamente os suportes da amostra, pois muitos materiais possuem autofluorescência nessa região espectral, o que afeta o verdadeiro valor de vida útil da amostra. Todas as imagens de PLIM neste estudo foram realizadas com uma potência de LED de 4 V e uma largura de pulso de 50 ns para um tempo de integração de 20 s; no entanto, esses parâmetros podem ser ajustados conforme necessário. Aproximadamente 104.500 quadros são registrados durante os 20 s de tempo de aquisição das imagens. Por fim, é importante realizar as medições em câmara escura para evitar interferência da luz ambiente.

Assim, o imageador PLIM pode realizar medições rápidas e quantitativas do tempo de vida com objetos macroscópicos de tamanho significativo. Embora PLIM-TCSPS de varredura a laser seja possível, seria muito lento devido aos longos tempos de permanência necessários para os corantes sensíveis ao oxigênio. Este imageador, no entanto, é rápido e pode gravar todos os pixels simultaneamente. Além disso, as medições baseadas em intensidade podem ser influenciadas pela concentração de corante fluorescente/fosforescente, intensidades instáveis de LED ou laser, fotoclareamento, alinhamento dos componentes ópticos e espalhamento das amostras. Em contraste, o imageador de macro baseado em TCSPC é essencialmente independente desses fatores. Portanto, ele pode realizar medições precisas e sem calibração de O2. As desvantagens da câmera incluem seu processamento de dados relativamente complexo e grandes tamanhos de dados (~2 Gb).

No futuro, o imageador também pode ser usado não apenas para mapear as concentrações de O2 , mas também outros parâmetros químicos e bioquímicos das amostras testadas, como a dinâmica do pH e da glicose, usando as sondas ou sensores correspondentes. Isso o torna uma ferramenta útil para estudos fisiológicos com vários modelos de tecidos e doenças. O imageador também pode ser atualizado para operar no modo FLIM de nanossegundos. No entanto, isso requer a substituição dos LEDs atuais por uma fonte de excitação mais rápida (por exemplo, um laser ps). A operação do sistema no modo duplo PLIM/FLIM também é principalmente possível.

Em conjunto, o imageador demonstra simplicidade e versatilidade, juntamente com boa funcionalidade e desempenho operacional em aplicações TCSPC-PLIM de campo amplo. Os imageadores de campo largo disponíveis comercialmente realizam principalmente imagens baseadas em intensidade, nas quais as intensidades fosforescentes podem ser influenciadas por fatores como fotobranqueamento, geometria de medição, espalhamento de amostras, etc. O imageador atual é baseado em imagens vitalícias, o que torna as medições mais quantitativas do que qualitativas. Além disso, a integração da câmera óptica Tpx3Cam com o adaptador Cricket e intensificador de imagem fornece sensibilidade de fóton único, simplicidade, flexibilidade e robustez das medições. Ao contrário de outros sistemas, ele pode ser levado para o local dos experimentos e girado 360° com base nos requisitos da amostra e da tarefa de medição. Com sua objetiva atual, que é fácil de trocar por outra lente, o imageador pode medir amostras de até 18 mm x 18 mm de tamanho em questão de poucos segundos e com uma alta resolução espacial de 256 pixels x 256 pixels. Este artigo descreve procedimentos passo a passo de como preparar amostras para teste e usar o imageador nas diferentes aplicações PLIM.

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Disclosures

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgments

O apoio financeiro para este trabalho da Science Foundation Ireland, subsídios SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 e 18/SP/3522, e Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) é reconhecido com gratidão.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
627 nm LED Parts Express Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.
760 ± 50 nm emission filter Edmund Optics 84-788 Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.
Balb/c mice Envigo, UK Balb/c
Black box Thorlabs XE25C9/M
Cricket Adapter Photonis Cricket-2
CT26 cells  ATCC CT26.WT https://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEM Sigma-Aldrich D0697 Other media can also be used
ImageJ Software ImageJ Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen Photonis PP0360EF
Mini dishes Sarstedt 83.3900.300 35 mm diameter 
Mylar plastic film, 75 micron  RS Ireland 785-0795 Othe plastic substrates can also be used
NanO2-IR home-made n/a The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. 
NMV-50M11” 50 mm lens Navitar Other lenses compatibel with C-mount adators can be used
Optical breadboard Thorlabs MB1836
Petri Dishes Sarstedt 82.1472.001 92 mm diameter
Power Supply Tenma 72-10495
Pulse Generator Tenma TGP110
Sophy Amsterdam Scientific Instruments n/z Provided by ASI together with the Tpx3Cam
Tpx3Cam Amsterdam Scientific Instruments TPXCAM
Tri2 Software University of Oxford n/a Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ Translation Stage Thorlabs LT3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologia Edição 194
Fluorescence Lifetime Macro Imager para aplicações biomédicas
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Sen, R., Zhdanov, A. V., Devoy, C., Tangney, M., Hirvonen, L. M., Nomerotski, A., Papkovsky, D. B. Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (194), e64321, doi:10.3791/64321 (2023).

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