Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Biyomedikal Uygulamalar için Floresan Ömür Boyu Makro Görüntüleyici

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64321
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 3, 4, 1
1School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork, 2Cancer Research@UCC, University College Cork, 3Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis (CMCA), The University of Western Australia, 4Physics Department, Brookhaven National Laboratory

Summary

Bu yazıda, uzun bozunma yayan numunelerin makroskopik fotolüminesans ömür boyu görüntülenmesi için yeni, hızlı bir optik görüntüleyicinin kullanımı açıklanmaktadır. Entegrasyon, görüntü toplama ve analiz prosedürleri, görüntüleme için sensör malzemelerinin hazırlanması ve karakterizasyonu ve görüntüleyicinin biyolojik numunelerin incelenmesinde uygulanması ile birlikte açıklanmaktadır.

Abstract

Bu makalede, katı hal, O2'ye duyarlı kaplamalardan çözünür O2'ye duyarlı problarla boyanmış canlı hayvan dokusu örneklerine kadar farklı fosforesan numunelerdeki moleküler oksijen (O2) konsantrasyonunu haritalamak için tasarlanmış yeni bir fotolüminesans ömür boyu görüntüleyici sunulmaktadır. Özellikle, 625 nm ışık yayan diyot (LED) ile uyarılabilen ve 760 nm'de yayılan nanopartikül tabanlı yakın kızılötesi prob NanO2-IR kullanıldı. Görüntüleme sistemi, Timepix3 kameraya (Tpx3Cam) ve aynı zamanda bir görüntü yoğunlaştırıcı barındıran opto-mekanik adaptöre dayanmaktadır. O2 fosforesans ömür boyu görüntüleme mikroskobu (PLIM) çeşitli çalışmalar için yaygın olarak gereklidir, ancak mevcut platformların doğrulukları, genel esneklikleri ve kullanılabilirlikleri konusunda sınırlamaları vardır.

Burada sunulan sistem, entegre bir optik sensör ve okuma çipi modülü olan Tpx3Cam üzerine inşa edilmiş hızlı ve son derece hassas bir görüntüleyicidir. Yüzey lekeli bağırsak dokusu örneklerinden veya kalın bağırsağın intraluminal olarak boyanmış parçalarından yüksek yoğunluklu fosforesans sinyalleri ve stabil ömür değerleri ürettiği gösterilmiştir ve dokuO2 seviyelerinin yaklaşık 20 s veya daha kısa sürede ayrıntılı haritalanmasını sağlar. Bilinçsiz hayvanlarda aşılanmış tümörlerde hipoksi görüntülemeye yönelik ilk deneyler de sunulmuştur. Ayrıca, görüntüleyicinin, uyarma için 390 nm LED ve emisyon için 650 nm bandpass filtre kullanılarak Pt-porfirin boyalarınadayanan O2'ye duyarlı malzemelerle kullanım için nasıl yeniden yapılandırılabileceğini de açıklıyoruz. Genel olarak, PLIM görüntüleyicinin, kullanılan problar veO2 konsantrasyonunun ilgili iki boyutlu haritaları için yaşam boyu değerlerin doğru nicel ölçümlerini ürettiği bulunmuştur. Ayrıca ex vivo doku modellerinin ve canlı hayvanların metabolik görüntülemesi için de yararlıdır.

Introduction

O2, canlı sistemler için anahtar çevresel parametrelerden biridir veO2'nin dağılımı ve dinamikleri hakkında bilgi sahibi olmak birçok biyolojik çalışma için önemlidir 1,2,3. Doku oksijenasyonununfosforlu problar 4,5,6,7,8 ve PLIM 9,10,11,12,13 ile değerlendirilmesi biyolojik ve tıbbi araştırmalarda popülerlik kazanmaktadır 3,9,14,15,16, 17,18,19. Bunun nedeni, PLIM'in, floresan veya fosforesans yoğunluğu ölçümlerinin aksine, prob konsantrasyonu, fotobeyazlatma, uyarma yoğunluğu, optik hizalama, saçılma ve otofloresan gibi dış faktörlerden etkilenmemesidir.

Bununla birlikte, mevcut O2 PLIM platformları hassasiyetleri, görüntü yakalama hızları, doğrulukları ve genel kullanılabilirlikleri ile sınırlıdır. Zaman korelasyonlu tek foton sayımı (TCSPC), raster tarama prosedürü ile birlikte, PLIM ve floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) cihazlarında sıklıkla kullanılır20,21,22. Bununla birlikte, PLIM uzun bir piksel bekleme süresi gerektirdiğinden (milisaniye aralığında), görüntü alma süresi FLIM uygulamaları için gerekenden çok daha uzundur20,22,23. Kapılı CCD / CMOS kameralar gibi diğer teknikler, tek foton hassasiyetinden yoksundur ve düşük kare hızlarına sahiptir20,24,25,26. Ayrıca, mevcut PLIM sistemleri çoğunlukla mikroskobik formatta kullanılırken, makroskobik sistemler daha az yaygındır27.

TCSPC tabanlı PLIM makro görüntüleyici28 , bu sınırlamaların çoğunun üstesinden gelmek için kurulmuştur. Görüntüleyicinin tasarımı, aşağıdakilere sahip yeni bir opto-mekanik adaptör olan Cricket'in kullanılmasıyla büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır: i) arka taraftaki kamera modülünün ve ön taraftaki objektif lensin kolay bağlanmasını sağlayan iki C montaj adaptörü; ii) Kriketin dış tarafında bir görüntü yoğunlaştırıcı için bir iç mahfaza ve ikincisi için bir elektrik prizi; iii) yoğunlaştırıcının önüne standart bir 25 mm emisyon filtresinin yerleştirilebileceği ön taraftaki C-mount adaptörünün arkasındaki bir iç alan; ve iv) kamera çipinde net görüntüler üretmek için lens ve kamera arasında optik hizalama/odaklama sağlayan halka regülatörleri ile optikleri harmanlayan dahili bir ışık.

Birleştirilmiş görüntüleyicide, kamera modülü, bir fotokatottan oluşan bir görüntü yoğunlaştırıcıyı ve ardından bir mikrokanal plakasını (MCP), bir amplifikatör ve hızlı bir sintilatör, P47 fosforu barındıran Kriket adaptörünün arka tarafına bağlanır. Cricket'in içine 760 nm ± 50 nm emisyon filtresi takılmıştır ve ön taraftaki C-mount adaptörüne NMV-50M11 '' objektif bir lens takılmıştır. Son olarak, lens ve kamera halka regülatörleri ile optik olarak hizalanmıştır.

Yoğunlaştırıcının rolü, gelen fotonları tespit etmek ve bunları kamera çipinde emisyon bozunumları ve ömür boyu görüntüler üretmek için kaydedilen ve kullanılan hızlı ışık patlamalarına dönüştürmektir. Kamera modülü, gelişmiş bir TCSPC tabanlı optik sensör dizisi (256 piksel x 256 piksel) veyeni nesil bir okuma çipi 29,30,31,32,33'ten oluşur ve görüntüleme yongasının her pikselinde 1,6 ns zaman çözünürlüğü ve 80 Mpixel/s okuma hızı ile foton patlamalarının varış zamanının (TOA) ve eşik aşımı süresinin (TOT) eşzamanlı olarak kaydedilmesini sağlar.

Bu konfigürasyonda, yoğunlaştırıcılı kamera tek foton hassasiyetine sahiptir. Veriye dayalıdır ve hızlı piksel dedektörü okuma (SPIDR) sistemi34'e dayanır. Görüntüleyicinin uzamsal çözünürlüğü daha önce düzlemsel fosforesanO2 sensörleri ve bir çözünürlük plakası maskesi ile karakterize edildi. Cihaz tepki fonksiyonu (IRF), diğer tüm ölçümlerde kullanılanla aynı ayarlarda düzlemsel bir floresan sensörün görüntülenmesiyle ölçülmüştür. Yaklaşık 2,6 ns'lik boyanın ömrü, PLIM modunda IRF ölçümü için kullanılabilecek kadar kısaydı. Görüntüleyici, sırasıyla 39,4 μm ve 30,6 ns (yarı maksimumda tam genişlik) uzamsal ve zamansal çözünürlüklerle 18 mm x 18 mm boyutlarına kadar nesneleri görüntüleyebilir28.

Aşağıdaki protokoller, makro görüntüleyicinin montajını ve daha önce karakterize edilen yakın kızılötesi O2 probuNanO2-IR 35 ile boyanmış biyolojik numunelerdeO2 konsantrasyonunun haritalanması için daha sonraki kullanımını açıklamaktadır. Prob, platin (II) benzoporfirin (PtBP) boyasına dayanan parlak, fotostabil, hücre geçirgen birO2 algılama probudur. 625 nm'de uyarılabilir, 760 nm'de yayılır ve fizyolojik aralıktaO2'ye sağlam bir optik yanıt sağlar (% 0 -% 21 veya 0-210 μMO2). Görüntüleyicinin ayrıca Pt(II)-porfirin boyalarına dayalı farklı sensör malzemelerini karakterize ettiği gösterilmiştir. Genel olarak, görüntüleyici yaygın bir fotoğraf makinesine benzer şekilde kompakt ve esnektir. Mevcut kurulumda, görüntüleyici farklı geniş alan PLIM uygulamaları için uygundur. LED'in hızlı bir lazer kaynağı ile değiştirilmesi, görüntüleyicinin performansını daha da artıracak ve potansiyel olarak nanosaniye FLIM uygulamalarını etkinleştirebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi (2010/63/EU) uyarınca Sağlık Ürünleri Düzenleme Kurumu (HPRA, İrlanda) tarafından verilen izinler altında gerçekleştirilmiş ve University College Cork Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Numune hazırlama

  1. Canlı doku örneklerinin ex vivo probu ile boyanması
    1. Ex vivo uygulamalar için, 4 haftalık dişi Balb / c farelerinden taze izole edilmiş doku örnekleri kullanın.
    2. Deney gününde, bir fareyi kafa keserek ötenazi yapın ve yaklaşık 10 mm büyüklüğündeki kolon parçalarını (kalın bağırsak) hızla disseke edin. Hemen PBS tamponu ile yıkayın, 10 mM Hepes tamponu (pH 7.2) ile takviye edilmiş DMEM ortamına yerleştirin ve 37 ° C'de inkübe edin36.
    3. Bağırsağın serozal tarafının yüzey boyaması için, canlı doku örneklerini bir mini kaba aktarın, doku örneklerini örtmek için 1 mg / mL NanO2-IR probu içeren 2 mL tam DMEM uygulayın ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Post-mortem dokudaki hücreler kültürde saatlerce canlı kalır. NaNO2-IR küçük sitotoksisite gösterir, bu nedenle tüm deneyler doku izolasyonundan sonra 4 saat içinde tamamlanmıştır.
    4. Derin doku intraluminal ex vivo boyama için, bağırsak parçalarını kuru bir Petri kabına aktarın ve fazla DLEM'yi filtre kağıdı ile çıkarın.
    5. Bir Hamilton şırıngası ile lümene 1 mg / mL NanO2-IR 35 içeren 1 μL DMEM enjekte edin ve numuneleri15 dakika veya 4 saate kadar inkübe edin.
      NOT: NaNO2-IR küçük uzun süreli sitotoksik etkiler gösterir; Bu nedenle tüm deneyler doku izolasyonundan sonra 4 saat içinde tamamlanmalıdır.
  2. Canlı hayvanlarda lekeli tümör dokusunun hazırlanması
    1. İn vivo uygulamalar için, CT26 hücrelerini 0.05 mg / mL'de NaNO2-IR probu içeren serumsuz ortamda 18 saat boyunca önceden boyayın.
    2. Bir fare alın, enjeksiyon alanını sağ kanattan tıraş edin ve NanO2-IR ile önceden boyanmış 1 × 10 5 lekesiz hücre ve 1 × 105 hücreden oluşan bir şırınga 200 μL karışımı enjekte edin.
    3. Tümörlerin farelerde büyümesine izin verin, tümör boyutunu bir kumpas ile ve hayvan ağırlığını periyodik olarak izleyin37. Aşılanmış tümörleri olan hayvanlar, tümör büyümesinin yedinci gününde görüntüleme için hazır hale gelir.
      NOT: Tümör hacmi denklem (1) kullanılarak hesaplanmıştır:
      V = (L × G 2)/2 (1)
      burada L , tümörün çapıdır ve Wis, L çapına dik çaptır.
    4. Görüntülemeden hemen önce servikal çıkıkla hayvanları kurban edin.

2. PLIM görüntüleme kurulumu

  1. Kriket adaptörünü alın ve içindeki yoğunlaştırıcı muhafazaya erişmek için arka taraftaki C-mount adaptörünü çıkarın. MCP-125 görüntü yoğunlaştırıcıyı bu bölmeye takın ve C yuvalı adaptörü geri takın.
  2. Cricket'in ön taraftaki C-mount adaptörünü çıkarın, 760 nm ± 50 nm emisyon filtresini takın ve C-mount'u geri takarak sabitleyin.
  3. Tpx3Cam kamera modülünü, C-mount adaptörü aracılığıyla Kriket modülünün arka tarafına bağlayın
  4. Lensi, C-mount adaptörü aracılığıyla Kriket modülünün ön tarafına bağlayın.
  5. Tüm kamera düzeneğini optik kara kutunun üzerine, örneklerin görüntüleneceği aşamaya bakacak şekilde monte edin (Şekil 1).
  6. 624 nm süper parlak LED'i kara kutunun içindeki bir breadboard'a bağlı bir direğe monte edin.
  7. LED'i bir güç kaynağına ve bir darbe jeneratörüne bağlayın. LED'i açın ve görüntülenen numunelerin etkili ve homojen bir şekilde uyarılmasını sağlamak için LED'e odaklanın.
  8. Fotoğraf makinesini başka bir darbe üretecine bağlayın ve kameraya ve LED38'e gönderilen darbeleri senkronize edin.
  9. Kriket ünitesindeki özel kabloyu ve soketi kullanarak, yoğunlaştırıcıyı standart bir güç kaynağına bağlayın ve kazancı 2,7 V'a ayarlayın.
  10. Lensin ve Kriket adaptörünün odaklama özelliklerini kullanarak, iyi kontrast ve parlaklığa sahip örneklerin net görüntülerini oluşturmak için kamera optiklerini örnek aşamasına odaklayın.
  11. Pt-porfirin boyalarla görüntüleyici kullanımı için, 625 nm LED'i uyarma için 390 nm LED ile değiştirin ve 760 nm ± 50 nm filtreyi Kriket modülünde 650 nm ± 50 nm filtreyle değiştirin.

3. Görüntü alma

  1. Örneği kamera lensinin önüne yerleştirin.
    NOT: İyi bir odaklanma için numune konumunu ayarlamak üzere numune tutucu olarak x-y-z ayarlanabilir bir sahne alanı kullanın.
  2. Odadaki tüm ışıkları kapatın.
  3. Odaklama ve numune hizalaması gibi operasyonel parametreleri ayarlamak için Sophy yazılımını açın.
    NOT: Sophy yazılımı, görüntüleme parametrelerini ayarlamak ve verileri kaydetmek için kamera ile birlikte sağlanır. Fotoğraf makinesi kodunu kontrol ederek yazılımın fotoğraf makinesine bağlı olduğundan emin olun. Ancak veri toplama için farklı bir program kullandık.
  4. Modüller'de sonsuz kareler seçin ve piksel çalışma modunu eşik üzerinde zamana ayarlayın.
  5. Modüller'de Önizleme'ye gidin ve Etkin modül'ü seçin. Bu, Medpix/Timpix Frames penceresini açar.
  6. Bu pencerede, renk ölçeğini değiştirin ve görüntüyü istediğiniz yöne döndürün .
  7. Yoğunlaştırıcıyı açın ve kaydı başlatın.
    NOT: Numunenin hizalamasını ve odağını görsel olarak onaylamak ve kayıt için LED uyarma parametrelerini optimize etmek için Sophy yazılımının kayıt ekranını kullanın.
  8. Kaydı durdurun ve Sophy yazılımını kapatın.
  9. Terminale gidin ve ham verileri ikili biçimde almak ve işlem sonrası işlemek için özel olarak tasarlanmış yazılımı kullanın (https://github.com/svihra/TimePix3).
    1. Terminalde, verileri kaydetmek için aşağıdaki komutları çalıştırın:
      Cd Belgesi/SPIDR/trunk/Release/
       Ls
      ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Dosyanın adı} - t {edinme süresi}
      NOT: "ls" yazdıktan sonra, geçerli dizindeki dosyaların listesini kontrol edin; Tpx3daq'ın görüldüğünü onaylayın.
    2. Tüm kareler kaydedilene kadar bekleyin.
    3. Verileri işlemek için terminalde aşağıdaki komutları çalıştırın:
      cd Belgeleri/Veri İşleme/Timepix3/Timepix3/
      kök
      . L dataprocess.cpp++
      .x DRGUI. C
    4. Bir RRGui penceresinin açılmasını bekleyin. Soldaki tüm değişkenleri ve sağdaki Tüm Veriler, Tek Dosya ve Centroid'i seçin.
    5. İşlenecek dosyayı seçin ve veri düşürücüyü çalıştırın.
      Not: işlenen tüm dosyalar ham dosya ile aynı klasörde görünür.

4. Veri analizi

  1. Sonradan işlenen verileri, verileri bir .ics görüntü dosyasına (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam) yazacak olan C dilinde yazılmış özel bir programla analiz edin.
  2. Ücretsiz olarak sunulan Time Resolved Imaging yazılımını kullanarak .ics görüntü dosyalarını açın (bkz. Fosforesans bozunumlarına uymak için iki üstel fonksiyon kullanın.
  3. Takılı .ics görüntü dosyalarını mevcut görüntü analiz yazılımıyla açın (bkz.
  4. Arama Tabloları'nı kullanarak fosforesans ömrü görüntüleri oluşturun ve bunları sahte renk ölçeğinde kodlayın (ör. kısa ömürler için mavi renk ve uzun ömürler için kırmızı). Görüntünün tamamı veya belirli ilgi alanları (YG) için ortalama yaşam boyu değerlerini hesaplamak üzere Ölçüm işlevini kullanın.
  5. Prob36'nın O2 kalibrasyonunun takılmasından elde edilen denklemi kullanarak ömür boyu değerleri oksijen konsantrasyonuna dönüştürün.
    NOT: Bu çalışma için (2) numaralı denklem kullanılmıştır:
    O 2 [μM] = −86,16 + 770,35 × e−0,049 × LT (2)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ex vivo görüntüleme uygulamaları için, dokunun serozal tarafına NanO2-IR probunun topikal uygulaması ile bağırsak dokusunun parçaları boyandı. Daha derin boyama için, probun 1 μL'si lümene enjekte edildi. İkinci durumda, 0.2-0.25 mm kalınlığındaki bağırsak duvarı, probu kameradan korudu. İki boyama işlemi Şekil 2A'da gösterilmiştir.

Elde edilen yoğunluk ve PLIM görüntüleri Şekil 2B-G'de sunulmuştur. Renkler, yaşam boyu değerlerdeki farkı ve dolayısıyla dokunun serozal ve mukozal taraflarının oksijenlenmesindeki farkı açıkça yansıtır. Şekil 2C ve Şekil 2D, topikal olarak (Şekil 2C) ve intraluminal olarak (Şekil 2D) boyanmış benzer doku kümelerini ifade eder. Beklendiği gibi, dokular benzer PLIM paternleri gösterdi. Bununla birlikte, dokunun mukozal tarafının intraluminal boyanması (Şekil 2D), daha düşük yaşam süreleri gösteren serozal tarafın topikal boyanmasına (Şekil 2C) kıyasla, bağırsağın iç yüzeyinde daha düşük oksijenasyonu yansıtan daha yüksek yaşam değerleri göstermiştir. Bu, bağırsağın dış yüzeyinde daha yüksek oksijenlenmeyi yansıtır.

Yaşam boyu sinyallerin stabilitesini ve bağırsağın solunum aktivitesini incelemek için, intraluminal olarak boyanmış numuneler üzerinde 2 saat boyunca hızlandırılmış bir PLIM analizi yapılmıştır (Şekil 2D-G). İnkübasyonun 15 dakikası (54.4 μs ± 0.9 μs) ile 2 saat (61.1 μs ± 0.8 μs) arasında yaşam boyu değerlerinde bir artış gözlendi, bu da bağırsağın luminal kısmındakiO2 seviyelerinde bir azalmayı yansıtıyor. Ek olarak, 2 saatlik inkübasyondan sonra düşükO2 seviyeleri, doku solunumunun tüm diseksiyon, hazırlık, boyama, inkübasyon ve görüntüleme adımları boyunca devam ettiğini kanıtlamaktadır. Ek olarak, Şekil 2D-G'de gözlenen lümen şeklindeki değişiklik, lümen içine enjekte edilen probun dağılımına bağlanabilir, yani LT sinyali, probun bulunduğu alanı yansıtır.

Görüntüleyicinin gelecekteki performansını in vivo olarak değerlendirmek için, farelerde yetiştirilen aşılanmış deri altı tümörlerde hipoksinin görüntülenmesi üzerine ilk çalışma, kurbandan hemen sonra gerçekleştirilmiştir (Şekil 3). Bu durumda, Balb / c fareleri, 0.05 mg / mL NanO2-IR probu ile lekelenmemiş veya boyanmış 200 μL'lik bir CT26 hücresi karışımı ile sağ tarafa deri altından enjekte edildi. PLIM, tümör büyümesinin yedinci gününde gerçekleştirildi ve fareler görüntülemeden hemen önce (yani ölüm sonrası) kurban edildi. Büyümenin yedinci gününde farelerdeki tümör bölgelerinin görüntüleri Şekil 3A,B'de gösterilmiştir.

Tümör büyümesinin yedinci gününde farelerdeki tümör alanları için yoğunluk (sol) ve PLIM (sağ) görüntüleri (Şekil 3B), bu tür deneylerde hem görüntüleyicinin hem de probun performansını ve hassasiyetini göstermektedir (daha ayrıntılı istatistiksel veriler gösterilmemiştir). Hayvanların her biri 20 saniye boyunca görüntülendi. Farelerin sol kanatları tıraş edildi ve boş olarak görüntülendi. PLIM sinyalleri üretmediler. Buna karşılık, tümör ve prob içeren bölgeler ~ 50 μs'lik kararlı ömür boyu sinyaller üretti. Bu deneyin amacı, görüntüleyicinin canlı hayvanlarla ve insan hastalığı modelleriyle in vivo çalışmalar için kullanılabilirliğini değerlendirmektir. Bu bölüm ön nitel sonuçları gösterirken, daha kapsamlı bir nicel değerlendirme sağlayan ilgili bir makale hazırlanmaktadır.

Daha sonra, görüntüleyici ayrıca Pt(II)-porfirin boyalarına dayalı sensör malzemelerinin PLIM görüntülemesinde de gösterildi. Pt-oktaetilporfin boyasının (PtOEP) kimyasal yapısı ve ilgili sensör malzemelerinin hazırlanmasının teknik detaylarıbaşka bir yerde açıklanmıştır 6,39. Şeffaf bir polyester film (Mylar) üzerinde küçük lekeler olarak biriktirilen PtOEP-polistiren bazlı fosforlu katı hal sensörü kaplamaları, filmi PBS tamponuna (havaya doymuş oksijenli durum) veya tamamen oksijensiz bir durum sağlayan glikoz ve glikoz oksidaz içeren PBS'ye batırarak görüntülendi. Oksijenli (25.6 μs ± 0.5 μs) ve oksijensiz koşullarda (65.7 μs ± 1.5 μs) elde edilen yaşam boyu sinyalleri, daha önce bildirilen sonuçlarla eşleşti6. Oksijenli ve oksijensiz sensörlerin yoğunluk ve PLIM görüntüleri Şekil 4A, B'de verilmiştir.

Figure 1
Resim 1: Görüntüleyici38'in deneysel kurulumu. Sen ve ark.38'in izniyle yeniden basılmıştır. Telif Hakkı: The Optical Society. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Topikal ve intraluminal olarak boyanmış fare bağırsak örneklerinin O2 PLIM'i. (A) NanO2-IR probu ile topikal olarak boyanmış bağırsağın (B) fosforesans yoğunluğu ve (C) PLIM görüntüleri kullanılarak iki boyama yönteminin gösterilmesi. (D-G) İntraluminal olarak boyanmış bağırsağın timelapse PLIM'i boyamadan sonra 15 dakika, 30 dakika, 1 saat ve 2 saat içinde. PLIM görüntüleri sahte renk ölçeğinde sunulur: mavi renk daha düşük bir ömre karşılık gelir ve kırmızı renk daha yüksek yaşam boyu değerlerine karşılık gelir. Ölçek çubukları = 5 mm. Kısaltma: PLIM = fosforesans ömür boyu görüntüleme mikroskobu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Farelerin sağ kanadındaki aşılanmış tümörlerin O2 PLIM'i . (A) Canlı hayvanlarda tümör gelişiminin grafiksel gösterimi. Tümör büyümesinin (B) yedinci gününde tümör alanlarının fosforesans yoğunluğu (solda) ve PLIM (sağda) görüntüleri. PLIM görüntüsü sahte renk ölçeğinde sunulur: mavi renk daha düşük bir ömre karşılık gelir ve kırmızı renk daha yüksek yaşam boyu değerlerine karşılık gelir. Ölçek çubuğu = 5 mm. Kısaltma: PLIM = fosforesans ömür boyu görüntüleme mikroskobu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: PtOEP tabanlı sensör noktasının fosforesans yoğunluğu. PtOEP sensörünün fosforesans yoğunluğu (solda) ve PLIM (sağda) görüntüleri, (A) oksijenli ve (B) oksijensiz durumlarda noktalanır. PLIM görüntüleri sahte renk ölçeğinde sunulur: mavi daha düşük bir ömre karşılık gelir ve kırmızı renk daha yüksek yaşam boyu değerlerine karşılık gelir. Kısaltmalar: PLIM = fosforesans ömür boyu görüntüleme mikroskobu; PtOEP = platin oktaetilporfirin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yukarıdaki protokoller, yeni görüntüleyicinin montajının ve mikrosaniye FLIM/PLIM modunda çalışmasının ayrıntılı bir açıklamasını verir. TCSPC tabanlı yeni nesil Tpx3Cam kamera, görüntü yoğunlaştırıcı, emisyon filtresi ve makro lens ile opto-mekanik adaptör Cricket ile birleştiğinde, kullanımı kolay, kararlı, kompakt ve esnek bir optik modül üretir. Görüntüleyicinin, fosforlu malzemelerin karakterizasyonu ve canlı dokuO2 görüntülemeyi içeren bir dizi farklı numune ve analitik görevle iyi performans gösterdiği gösterilmiştir. Görüntüleme deneylerinde yakın kızılötesi Pt(II)-benzoporfirin bazlı hücre geçirgen çözünür prob NanO2-IR ve kırmızı yayan Pt(II)-porfirin bazlı katı hal sensörleri kullanılmıştır. Bu sensörler, büyük Stokes değişimi, uzun emisyon ömrü, yüksek hassasiyet, hızlı tepki ve iyi fotokimyasal stabilite nedeniyleO2'nin söndürülmüş fosforesans tespiti için başarıyla kullanılmıştır.

Bu farklıO2 hassas problar ve katı hal kaplamaları, makro görüntüleyici üzerinde test edildiğinde, daha önce yayınlanan verilerle uyumlu sonuçlar üretti40. Malzemeler, özellikle sıcaklık ve oksijenlenme durumu açısından değişen çevresel koşullara karşı iyi bir homojenlik, kontrast ve ömür boyu tepkiler göstermiştir. Bu sonuçların konfokal TCSPC-PLIM mikroskobunda üretilenlerle karşılaştırılması, yeni görüntüleyicinin doğru olduğunu, daha kaliteli ömür boyu okumalara sahip olduğunu ve yüksek hız ve hassasiyete sahip PLIM görüntüleri elde ettiğinigöstermektedir 28,38,40.

Görüntüleyici ayrıca farklı tiplerde fosforlu olarak boyanmış biyolojik örneklerle umut verici bir performans sergiledi. Böylece, boyalı solunum hücrelerinin, canlı postmortem hayvan dokusunun, tüm organların ve aşılanmış tümörlerin süspansiyonlarını içeren numuneler için ayrıntılıO2 konsantrasyon haritaları üretildi. Görüntüleyici, yüzeyden ve hatta doku içinde 0,5 mm'ye kadar derinliklerde bileömür boyu değerlerin ölçümlerini sağlamıştır 28,36,38.

Fosforesans yaşam süresi değerleri sıcaklık41'den güçlü bir şekilde etkilendiğinden, ısıtılmış bir numune aşaması ve/veya bir inkübatör odası kullanmak gibi yollarla görüntülenen numunelerin sıkı sıcaklık kontrolünün uygulanması gerekir. UV uyarımı kullanılırken, numune tutucuların dikkatli bir şekilde seçilmesi önemlidir, çünkü birçok malzeme bu spektral bölgede otofloresana sahiptir ve bu da numunenin gerçek yaşam boyu değerini etkiler. Bu çalışmadaki tüm PLIM görüntüleme, 20 s'lik bir entegrasyon süresi için 4 V'luk bir LED gücünde ve 50 ns'lik bir darbe genişliğinde gerçekleştirilmiştir; ancak, bu parametreler gerektiği gibi ayarlanabilir. 20 saniyelik görüntü yakalama süresi boyunca yaklaşık 104.500 kare kaydedilir. Son olarak, ortam ışığı parazitini önlemek için ölçümleri karanlık bir odada yapmak önemlidir.

Böylece, PLIM görüntüleyici önemli boyuttaki makroskopik nesnelerle hızlı, nicel ömür ölçümleri yapabilir. Lazer taramalı PLIM-TCSPS mümkün olsa da, oksijen algılayan boyalar için gereken uzun bekleme süreleri nedeniyle çok yavaş olacaktır. Ancak bu görüntüleyici hızlıdır ve tüm pikselleri aynı anda kaydedebilir. Ayrıca, yoğunluğa dayalı ölçümler floresan/fosforlu boya konsantrasyonu, kararsız LED veya lazer yoğunlukları, fotobeyazlatma, optik bileşenlerin hizalanması ve numunelerden saçılma gibi faktörlerden etkilenebilir. Buna karşılık, TCSPC tabanlı makro görüntüleyici temel olarak bu faktörlerden bağımsızdır. Bu nedenle,O2'nin doğru ve kalibrasyonsuz ölçümlerini yapabilir. Kameranın dezavantajları arasında nispeten karmaşık veri işleme ve büyük veri boyutları (~ 2 Gb) bulunmaktadır.

Gelecekte, görüntüleyici sadeceO2 konsantrasyonlarını haritalamak için değil, aynı zamanda ilgili probları veya sensörleri kullanarak pH ve glikoz dinamikleri gibi test edilen numunelerin diğer kimyasal ve biyokimyasal parametrelerini de haritalamak için kullanılabilir. Bu, onu çeşitli doku ve hastalık modelleriyle fizyolojik çalışmalar için yararlı bir araç haline getirir. Görüntüleyici ayrıca nanosaniye FLIM modunda çalışacak şekilde yükseltilebilir. Ancak bu, mevcut LED'lerin daha hızlı bir uyarma kaynağı (örneğin, bir ps lazer) ile değiştirilmesini gerektirir. Çift PLIM/FLIM modunda sistemin çalışması da temel olarak mümkündür.

Görüntüleyici, basitlik ve çok yönlülüğün yanı sıra geniş alan TCSPC-PLIM uygulamalarında iyi işlevsellik ve operasyonel performans gösterir. Ticari olarak temin edilebilen geniş alan görüntüleyiciler çoğunlukla, fosforlu yoğunlukların fotobeyazlatma, ölçüm geometrisi, numunelerden saçılma gibi faktörlerden etkilenebildiği yoğunluğa dayalı görüntüleme gerçekleştirir. Mevcut görüntüleyici, ölçümleri nitel olmaktan ziyade nicel hale getiren ömür boyu görüntülemeye dayanmaktadır. Ayrıca, Tpx3Cam optik kameranın Kriket adaptörü ve görüntü yoğunlaştırıcı ile entegrasyonu, ölçümlerin tek foton hassasiyeti, basitliği, esnekliği ve sağlamlığını sağlar. Diğer sistemlerden farklı olarak, deneylerin yapıldığı yere taşınabilir ve numunenin ve ölçüm görevinin gereksinimlerine göre 360 ° döndürülebilir. Başka bir lens için değiştirilmesi kolay olan mevcut hedefi ile görüntüleyici, 18 mm x 18 mm boyutlarına kadar olan örnekleri birkaç saniye içinde ve 256 piksel x 256 piksel yüksek uzamsal çözünürlükle ölçebilir. Bu makalede, test için numunelerin nasıl hazırlanacağı ve görüntüleyicinin farklı PLIM uygulamalarında nasıl kullanılacağı ile ilgili adım adım prosedürler açıklanmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgments

İrlanda Bilim Vakfı'ndan bu çalışma için mali destek, SFI / 12 / RC / 2276_P2, SFI / 17 / RC-PhD / 3484 ve 18 / SP / 3522 ve Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland) için minnetle kabul edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
627 nm LED Parts Express Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.
760 ± 50 nm emission filter Edmund Optics 84-788 Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.
Balb/c mice Envigo, UK Balb/c
Black box Thorlabs XE25C9/M
Cricket Adapter Photonis Cricket-2
CT26 cells  ATCC CT26.WT https://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEM Sigma-Aldrich D0697 Other media can also be used
ImageJ Software ImageJ Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen Photonis PP0360EF
Mini dishes Sarstedt 83.3900.300 35 mm diameter 
Mylar plastic film, 75 micron  RS Ireland 785-0795 Othe plastic substrates can also be used
NanO2-IR home-made n/a The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. 
NMV-50M11” 50 mm lens Navitar Other lenses compatibel with C-mount adators can be used
Optical breadboard Thorlabs MB1836
Petri Dishes Sarstedt 82.1472.001 92 mm diameter
Power Supply Tenma 72-10495
Pulse Generator Tenma TGP110
Sophy Amsterdam Scientific Instruments n/z Provided by ASI together with the Tpx3Cam
Tpx3Cam Amsterdam Scientific Instruments TPXCAM
Tri2 Software University of Oxford n/a Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ Translation Stage Thorlabs LT3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
  2. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
  3. Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
  4. Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).
  5. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  6. O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
  7. Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
  8. Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).
  9. Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
  10. Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
  11. Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
  12. Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
  13. Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
  14. Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
  15. Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).
  16. Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
  17. Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
  18. Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
  19. Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
  20. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
  21. Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. Becker, W. , Springer. Cham, Switzerland. 225-247 (2015).
  22. Becker, W. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. König, K. , De Gruyter. Berlin, Germany. 23-52 (2018).
  23. Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800 (2017).
  24. Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).
  25. Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).
  26. Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).
  27. Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, Springer. Cham, Switzerland. (2017).
  28. Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).
  29. Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
  30. Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
  31. Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).
  32. Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).
  33. Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).
  34. Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).
  35. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  36. Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006 (2020).
  37. Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
  38. Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
  39. Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
  40. Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).
  41. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. Fluorescence lifetime imaging. Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).

Tags

Biyoloji Sayı 194
Biyomedikal Uygulamalar için Floresan Ömür Boyu Makro Görüntüleyici
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sen, R., Zhdanov, A. V., Devoy, C.,… More

Sen, R., Zhdanov, A. V., Devoy, C., Tangney, M., Hirvonen, L. M., Nomerotski, A., Papkovsky, D. B. Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (194), e64321, doi:10.3791/64321 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter