Summary
Burada, miyokard B-lenfositlerinin intravasküler veya endotel boşluğundaki konumlarına göre akım sitometrisi kullanılarak nicelleştirilmesi ve farklılaştırılması için bir protokol sunulmuştur.
Abstract
Giderek artan sayıda kanıt, B-lenfositlerin miyokard fizyolojisi ve yaralanmaya miyokard adaptasyonu bağlamında önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bununla birlikte, literatür miyokard B hücrelerinin prevalansı hakkında zıt veriler bildirmektedir. B hücrelerinin hem kemirgen kalbindeki en yaygın bağışıklık hücreleri arasında olduğu hem de mevcut olduğu, ancak miyeloid hücrelerden belirgin şekilde daha düşük bir prevalansta olduğu veya oldukça nadir olduğu bildirilmiştir. Benzer şekilde, birkaç grup akut iskemik miyokard hasarından sonra miyokard B hücrelerinin sayısının arttığını tanımlamıştır, ancak bir grup yaralı miyokardın B hücrelerinin sayısında herhangi bir değişiklik bildirmemiştir. Miyokard B hücrelerinin prevalansını değerlendirmek için paylaşılan, tekrarlanabilir bir yöntemin uygulanması, farklı araştırma gruplarından gelen gözlemleri uyumlu hale getirmek ve böylece B hücresi miyokard etkileşimleri çalışmasının ilerlemesini teşvik etmek için kritik öneme sahiptir. Deneyimlerimize dayanarak, literatürde bildirilen görünüşte zıt gözlemler muhtemelen murin miyokard B hücrelerinin çoğunlukla intravasküler olması ve mikrovasküler endotele bağlı olması gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, bir murin kalbinden kurtarılan B hücrelerinin sayısı, organı temizlemek için kullanılan perfüzyon koşullarına ve kullanılan sindirim yöntemine karşı son derece hassastır. Burada, bu iki kritik değişkeni belirli bir şekilde açıklayan optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, murin miyokard B hücrelerinin sayısının tekrarlanabilir, akış sitometrisine dayalı analizini güçlendirir ve araştırmacıların ekstravasküler ve intravasküler miyokard B hücrelerini ayırt etmelerini sağlar.
Introduction
B-lenfositler, hem adaptif hem de doğuştan gelen immün yanıtlarda önemli bir rol oynayan oldukça uzmanlaşmış bağışıklık hücreleridir1. İki ana B hücresi popülasyonu vardır: çoğunlukla embriyonik yaşam sırasında üretilen daha küçük bir B1 hücresi popülasyonu ve yetişkin yaşamında kemik iliğinde üretilen baskın bir B2 hücresi popülasyonu1. Kemik iliğinde olgunlaştıktan sonra, B hücreleri birincil ve ikincil lenfoid organlara göç eder. Oradan, kan damarlarından ve lenfatik damarlardan geçen lenfoid organlar arasında sürekli olarak dolaşırlar2. B hücreleri, yüzeylerinde reseptör olarak işlev gören spesifik antikorları eksprese eder. B hücreleri reseptörlerine bağlanan bir antijenle karşılaştıklarında, aktive edici bir sinyal tetiklenebilir. Aktif B hücreleri ya antijenin bulunduğu dokuya göç eder ya da antikor üreten plazma hücrelerine olgunlaşabilecekleri kemik iliğine geri dönerler 3,4.
Son zamanlarda, kalbin büyük bir B hücresi popülasyonunu barındırdığı takdir edilmektedir. Kemirgenlerde yapılan çalışmalar, B hücrelerinin embriyonik gelişim5 sırasında kalbi erken kolonize ettiğini ve miyokardiyal ilişkili B hücrelerinin çoğunlukla endotel 6,7'ye yapışmış intravasküler, naif B2 hücreleri olduğunu ve küçük bir B1 hücresi yüzdesi 7 olduğunu göstermiştir. Hala birçok belirsizlik alanı vardır, ancak mevcut veriler B hücrelerinin hem naif kalpte hem de yaralanmaya miyokard adaptasyonu bağlamında önemli bir rol oynadığını göstermektedir.
Naif murin kalbindeki çalışmalar, başlangıçta miyokard B hücrelerinin çoğunlukla endotele yapışmış intravasküler boşlukta bulunduğunu göstermiştir (murin kardiyak B hücrelerinin %>95'inin intravasküler boşlukta yer aldığı bulunmuştur). Bu B hücrelerinin, periferik kandan izole edilen dolaşımdaki B hücrelerinden farklı gen ekspresyon paternlerine sahip olduğu bulunmuştur. B hücresi eksikliği olan hayvanlardan gelen naif kalplerin analizi ve sinjenik kontroller, B hücresi olmayan hayvanların daha küçük kalplere ve daha yüksek ejeksiyon fraksiyonuna sahip olduğunu bulmuştur6. Tüm bu kanıtlar, B hücrelerinin miyokard büyümesini ve / veya miyokard fonksiyonunu modüle edebileceğini ve sadece interstisyel değil, aynı zamanda intravasküler B hücrelerinin de bu tür gözlemlerden sorumlu olabileceğini düşündürmektedir. B hücrelerinin ayrıca miyokard yerleşik makrofajlarının fenotipini modüle ettiği bulunmuştur8.
Birçok çalışma, B hücrelerininyaralanmaya miyokard adaptasyonu bağlamında önemli bir rol oynadığını göstermiştir 8,9,10,11,12,13. B hücreleri, muhtemelen CXCL13-CXCR5'e bağımlıbir mekanizma 11,13 yoluyla yaralı kalpte geçici olarak birikir. Oradan, B hücreleri, sitokin aracılı monosit alımını içeren çeşitli mekanizmalar yoluyla olumsuz kardiyak yeniden yapılanmayı teşvik eder 9,12. Ek olarak, B hücreleri, çeşitli mekanizmalarla kardiyak hasarın genişlemesini ve olumsuz kardiyak yeniden şekillenmeyi teşvik edebilen kardiyak proteinlere karşı antikorlar üretebilir 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B hücreleri ayrıca IL-10 10'un salgılanması yoluyla yaralı kalp üzerinde koruyucu etkilergösterebilir.
B hücrelerinin naif ve yaralı kalpteki rolünü araştıran grupların sayısı arttıkça, miyokard B hücrelerini uygun şekilde ölçmek ve değerlendirmek ve böylece literatürde ortaya çıkmaya başlamış tutarsızlıklardan kaçınmak için paylaşılan protokolleri tanımlamak giderek daha önemli hale gelmektedir. Şimdiye kadar B hücrelerinin her ikisinin de kemirgen kalbindeki en yaygın bağışıklık hücrelerinden biri olduğu7 ve miyeloid hücrelerden 26,27 veya oldukça nadir28'den belirgin şekilde daha düşük bir prevalansta bulundukları bildirilmiştir. Benzer şekilde, birkaç grup akut iskemik miyokard hasarı 7,9,13'ten sonra miyokard B hücrelerinin sayısının arttığını tanımlamıştır, ancak bir grup yaralı miyokard29'un B hücrelerinin sayısında herhangi bir değişiklik olmadığını bildirmiştir. Kardiyak immün hücreler üzerinde yapılan çalışmalar nadiren perfüzyon koşulları hakkında ayrıntılı bilgi verir ve sindirim koşulları hakkında fikir birliği yoktur. Kemirgen kalbinde, B hücrelerinin büyük bir kısmı intravasküler olduğundan ve bağışıklık hücrelerinin miyokarddan ekstraksiyonu kullanılan sindirim yöntemine büyük ölçüde bağlı olduğundan, literatürde bildirilen farklılıklar organ perfüzyonu ve doku sindirimindeki farklılıkların bir sonucu olabilir.
Burada, perfüzyon ve sindirim koşullarını optimize ederek B hücresi geri kazanımının verimini en üst düzeye çıkaran ve intravasküler ve ekstravasküler miyokard B hücrelerinin ayrımına izin veren murin miyokard B hücrelerinin akış sitometrisine dayalı nicelleştirilmesi için ayrıntılı bir yöntem sunulmaktadır6. Bu protokol, intravasküler ve interstisyel immün hücreleri birbirinden ayıran diğer benzer protokollerin uyarlanması ve optimizasyonudur 28,30,31.
Bu protokolde, mikrovasküler endotele yapışmış biyolojik olarak ilgili B hücrelerini çıkarmadan intravasküler boşlukta yüzen B hücrelerini ortadan kaldırmak için miyokard perfüzyonunu standartlaştırıyoruz. Ayrıca, intravasküler ile interstisyel immün hücreleri32'yi ayırt etmek için intravenöz antikor enjeksiyonunun kullanımını tanımlayan önceki protokollere dayanarak ve B hücrelerinin yüzey belirteci B22033'ü eksprese etmesinden yararlanarak, hayvan kurban edilmeden ve kardiyak perfüzyondan hemen önce B220'ye özgü bir antikorun intravasküler enjeksiyonu yoluyla intravasküler ve ekstravasküler miyokard B hücrelerinin nasıl ayırt edileceğini gösteriyoruz. Bu protokol, naif ve yaralı kalpteki miyokard B hücrelerinin analizini de dahil etmek isteyen herhangi bir bilim adamının araştırmasıyla ilgilidir. Bu protokolün yaygın olarak uygulanması, araştırma grupları arasındaki tutarsızlıkları azaltacak, intravasküler ve ekstravasküler miyokard B hücre havuzlarındaki değişikliklerin analizine izin verecek ve böylece kardiyak immünoloji alanındaki keşiflerin ilerlemesini destekleyecektir.
Özetle, protokol, akış sitometrisi yoluyla miyokard B hücrelerini ölçmek ve analiz etmek için optimize edilmiş bir iş akışını temsil eder ve aynı zamanda ekstravasküler boşlukta ve intravasküler boşlukta bulunan hücreleri ayırt eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu makalede açıklanan tüm deneyler, Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki IACUC'nin onayı ile gerçekleştirilmiştir.
1. Hazırlıklar
- FACS Arabelleğini Tablo 1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
- Hayvanları ötenazi yapmak için yeterli CO2 olduğundan emin olun.
- Diseksiyon alanını hazırlayın (tezgah pedini yerleştirin ve bant ve diseksiyon aletlerini yakına yerleştirin).
- 15 mL tüpleri etiketleyin, her tüpe kalsiyum ve magnezyum içeren 3 mL HBSS koyun (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları buzun üzerine yerleştirin (kalp başına bir tüp ve Referans grup / akış sitometrisi kontrolleri için ekstra bir tüp). Ayrıca, küçük (35 mm) Petri kaplarını HBSS ile doldurun.
- Sıcaklık kontrollü çalkalayıcıyı açın, 37 °C'ye ayarlayın ve santrifüjü 4 °C sıcaklıkta önceden soğutun.
- Şırınga pompasını hazırlayın ve akış hızını 3 mL / dak'ya ayarlayın. 20 mL'lik bir şırıngayı HBSS ile doldurun, tüp hattını tamponla doldurun ve kabarcıkları çıkarın.
2. İntravasküler B hücresi boyama (in vivo)
- C57BL/6J suşunun 12 haftalık erkek faresini tartın. 100 μL B220 antikor seyreltmesi ile 3/10 cc'lik bir insülin şırıngası yükleyin (PBS'de 1:10). Işıktan korumak için şırıngayı alüminyum folyo ile örtün.
- Bir fareyi anestezi altına alın.
- 400 mg / kg'lık bir doz ile% 2,2,2-tribromoetanol intraperitoneal enjeksiyonu uygulayın ve 10-20 dakika bekleyin.
NOT: Farenin nefes alış verişini ve hareketini izleyin. Fare hareket etmeyi bıraktığında, ayak parmağını sıkıştırarak ağrıyı uyarın; yoksunluk refleksinin olmaması yeterli anesteziyi gösterir. - 20 dakika içinde yeterli anestezi sağlanamazsa, 100 mg / kg'da ek bir anestezi dozu uygulanabilir ve her 5 dakikada bir fare kinetiği, yoksunluk refleksi ve solunum değerlendirmesi yapılmalıdır.
- 400 mg / kg'lık bir doz ile% 2,2,2-tribromoetanol intraperitoneal enjeksiyonu uygulayın ve 10-20 dakika bekleyin.
- Fareyi laboratuvar tezgahının üzerine bir tarafa doğru eğimli bir tezgah pedine yerleştirin, sırtın derisini yavaşça aşağı çekin ve gözün çıkıntı yapmasını sağlamak için gövdeyi tezgaha hafifçe bastırın.
- Seyreltilmiş B220 antikorunu retroorbital enjeksiyonla adım 2.1'den enjekte edin.
- Şırıngayı farenin başının sagital düzleminden 45 ° C'de göze sokun. Çözeltiyi yavaşça enjekte edin. Direnç hissedilirse, şırıngayı çıkarın ve tekrar girin. 2 dakika bekleyin.
NOT: Uzun süreli inkübasyon süresi, intravasküler ve ekstravasküler B hücrelerini ayırt etme yeteneğini tehlikeye atacaktır, çünkü enjekte edilen antikorun vaskülatür dışına yayılması için zaman verecektir.
- Şırıngayı farenin başının sagital düzleminden 45 ° C'de göze sokun. Çözeltiyi yavaşça enjekte edin. Direnç hissedilirse, şırıngayı çıkarın ve tekrar girin. 2 dakika bekleyin.
- IACUC düzenlemelerine göre fareyi ötenazileştirin.
- CO2 akışını ötenazi odasına 0,5 L/dak hızında veya odanızın büyüklüğüne göre önerilen akış hızında açın.
- Fareyi önerilen süre boyunca odaya yerleştirin ve artık nefes almadığından emin olun. Onu çıkarın ve ikincil bir ötenazi yöntemi olarak servikal çıkık gerçekleştirin.
- Fare ötenazi yapıldıktan sonra, derhal organ toplama ve perfüzyona geçin.
3. Kalp koleksiyonu
- Göğüs açıklığı.
- Farenin derisini forseps ile epigastrik bölgede tutun. Makas kullanarak ciltte 2 mm'lik bir açıklık açın ve göğüs ve karnın parlak yarı saydam bir tabakası olan fasya tabakasını ortaya çıkarmak için cildi soymak için forsepsleri kullanın. Karın duvarını açmak ve ksifoid süreci ortaya çıkarmak için epigastriyumda fasya ve periton boyunca kesin. Hemostatik forseps kullanarak ksifoid işlemi kelepçeleyin.
- Makasla, göğüs duvarından her iki taraftaki orta klaviküler çizgi seviyesinde dikey bir kesim yapın ve açıklığı korumak için ağırlık olarak hemostatik forseps kullanarak mediasten içeriğini ortaya çıkarmak için ön göğüs duvarını kaldırın.
- Kalp perfüzyonu ve ekstraksiyonu.
- Forseps kullanarak, kalbi çevreleyen yağ veya timik dokuları çıkarın.
- Forseps kullanarak aortu arkadan güvenli bir şekilde tutun. Şırınga iğnesini (25 G) kalbin tepesine sokun. 3 mL/dak hızında 3 mL HBSS ile perfüze edin.
NOT: Perfüzyonu izleyin. Karaciğer dolmalı ve koroner damarlardaki kan tamamen çıkarılmalıdır. Sabit bir akışı korumak için 1 mL / dakikaya kalibre edilmiş bir şırınga pompasının kullanılması önerilir. - Aortu makas kullanarak kesin ve kalbi çıkarın. Kalan kanı çıkarmak için kalbi Petri kabında HBSS ile yıkayın. Makas ve forseps kullanarak yağ, bağ dokusu ve timüsü çıkarın ve kalbi kurutun. İzole edilmiş kalbi tartın ve ağırlığı miligram cinsinden not edin. Kalbi oda sıcaklığında bir bıçakla küçük parçalara (1-2 mm) doğrayın.
NOT: Yetişkin fare kalpleri 0,090-0,210 mg ağırlığında olabilir. - Kalp dokusunun kütlesini ölçün ve 3 mL HBSS içeren 15 mL'lik bir tüpe sindirilmek üzere 60 mg kıyılmış kalbi yerleştirin. Kalan kalp dokusunu koruyun ve "Referans kontrol dokusu" etiketli bir tüpe yerleştirin; bu, canlı-ölü sinyal ve otofloresan için kompanzasyon kontrolü için kullanılacaktır.
4. Kalp sindirimi ve hücre boyama
- Kıyılmış doku içeren her tüpe enzimler ekleyin (bakınız Tablo 1). Tüpe 0.5 μL / mg DNaz 1 (60 mg kalp dokusu için 300 Ünite), 0.5 μL / mg kollajenaz II (60 mg kalp dokusu için 625 Ünite) ve 0.2 μL / mg hyaluronidaz (60 mg kalp dokusu için 50 Ünite) ekleyin.
- Sindirim reaksiyonunu çalkalayıcıya 300 rpm'de 30 dakika boyunca yerleştirin. Çalkalayıcı rafını yaklaşık 25° eğime ayarlayın.
- 15 mL reaksiyon tüplerinin her birine 7 mL HBSS ekleyin ve hızlanma ve kırma orta veya yavaş olarak ayarlanarak 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı boşaltın ve kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için her peleti 5 mL ACK lizis tamponunda yeniden askıya alın. ACK lizis tamponunda oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
- Her tüpe 10 mL PBS ekleyin, karıştırın ve ardından 40 μm'lik bir süzgeçle 50 mL'lik bir tüpe filtreleyin. Tüm kalıntıların filtre odasının içinde olduğundan emin olun. Filtre üzerindeki kalıntıları, filtre haznesi içinde tamamen asılı kalana kadar bir şırınga pistonu ile parçalayın.
- Ses seviyesi kalp başına 25 mL'ye ulaşana kadar filtreden PBS ekleyin; bu, askıya alınmış hücrelerin filtreden geçmesine izin verecektir. Referans kontrol doku tüpüne ilave 25 mL PBS ekleyin ve hacmi farklı tüplere bölün (her biri 25 mL). Tüplerden birini "Lekesiz" ve diğerini "Canlı ölü" olarak etiketleyin. 4 °C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj.
NOT: Bu noktada, canlı-ölü lekesi için seyreltmeyi hazırlayın (seyreltme: 1x PBS'de 1:500). - Süpernatanı boşaltın, peleti 100 μL PBS'de lekesiz tüpte ve diğer peletlerin her birini canlı-ölü leke seyreltmesinin 100 μL'sinde yeniden askıya alın. Karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın, buz kovasını alüminyum folyo ile kaplayın.
- Her numuneye 500 μL FACS tamponu ekleyin ve 40 μm'lik bir filtreden etiketli bir FACS tüpüne aktarın. FACS tüplerini 4 °C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı atın. Peleti 500 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın.
- Lekesiz ve Canlı ölü tüpler hariç, her tüpe 50 μL Fc bloke edici çözelti ekleyin (bakınız Tablo 1). 5 dakika boyunca karıştırın ve kuluçkaya yatırın.
- Lekesiz ve Canlı ölü tüpler hariç her tüpe 50 μL antikor karışımı çözeltisi ekleyin ( Tablo 1'e bakınız) ve buz kovasını alüminyum folyo ile kaplayarak karanlıkta 30 dakika kuluçkaya yatırın.
- Her boruya 2 mL FACS tamponu ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve 300-500 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın.
5. Akış sitometrisi
- Cihaz kontrol ayarlarını yapın.
NOT: Bu protokolde numune 4 lazerli Cytek Aurora akış sitometresi ile analiz edilir. İlgilenilen belirteçleri tespit etmek için başka bir uygun akış sitometresi kullanılabilir.- Cihaz kontrol yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu). Pencerenin üst kısmında, Edinme sekmesini seçin ve Yeni + 'ya tıklayın. Yeni Deneme Oluştur adlı bir pencere görüntülenir.
- Kitaplık bölümünde, Filtre uygulanacak tür alanına PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 ve Zombie Aqua yazın ve her birini yazdıktan sonra Ekle'yi tıklatın. Florofor isimleri sağda görülmelidir. Ardından, Grup sekmesine devam etmek için İleri'yi tıklatın.
- Grup sekmesinde, analiz için kalbi eklemek üzere tüplü sembolü tıklatın.
- + Referans grubuna tıklayın ve bir pencere açılacaktır. Floresan etiket sütununda Zombie Aqua'yı seçin ve kontrol türü sütununda Hücreler'i seçin, ardından Kaydet'i tıklayın.
- İleri > İşaretçiler sekmesini tıklatın; floroforların adlarını içeren bir tablo görüntülenecektir. Her florofor sütununun ilk satırına karşılık gelen hücre işaretleyicisini yazın ve PerCP-Cy5.5 için Enter: CD45 yazın; BV421 için CD19; Alexa Fluor 700 için CD11b; PE için B220; ve Zombie Aqua için canlı-ölü.
- Edinme sekmesine gitmek için İleri'yi iki kez tıklatın. Deney grubunun Kaydedilecek Olaylar'da 10.000.000 ve referans grubu satırı için aynı alana 200.000 yazın. Kaydet ve Aç'ı tıklayın. Diğer ayarlar varsayılan olarak kalmalıdır: Durma Süresi 10.000 ve Durdurma Düzeyi 3.000 olmalıdır.
- Sol altta Enstrüman kontrolü'ne tıklayın. Voltajı FSC-50, SSC-175, SSC-B-175 olarak ayarlayın. Ardından, Edinme Denetimi'ni seçin. Akış hızı seçeneği için açılır menüden Yüksek'i seçin.
- Bir sitometre ile referans örnekleri alın ve yazılımda karışımını çözün.
- Lekesiz kalp tüpünü vorteksleyin ve numune enjeksiyon portuna (SIP) güvenli bir şekilde yerleştirin. Yeşil gösterge okunun doğru numuneyi işaret ettiğinden emin olun, ardından sitometre yazılımının Edinme Kontrol panelinde Başlat'ı tıklayın ve olaylar kaydedilene kadar bekleyin. Aynı şeyi Live-dead-stained kalp dokusu için de yapın.
- Mix Çıkar menüsünü seçin ve aşağıdaki kontrolleri ayarlayın:
- Kitaplıktaki sütunda PE, PerCP-Cy5.5, BV421 ve Alexa Fluor 700 onay kutularını seçin. Zombie Aqua'nın aynı sütunda işaretli olmadığından emin olun. Alt kısımda, Floresan Etiketi olarak Otofloresan seçeneğini işaretleyin.
- Pozitif/Negatif Popülasyonları Tanımla sekmesine gitmek için İleri'yi tıklatın. Bu sekmede, FSC-A ve SSC-B-A arasındaki bir çizim görüntülenir. FSC-A ekseninde 1,0 M ile 4,0 M arasında ve SSC-B-A ekseninde 0,2 M ile 3,0 M arasında bir alan seçmek için çokgenin noktalarını tıklatıp sürükleyin.
- Sağdaki bir sonraki grafikte, V5-A X ekseninde görüntülenecektir. En sağdaki zirvenin yarısını pozitif ve grafiğin sol tarafındaki bir bölgeyi negatif olarak seçmek için kapıları hareket ettirin. Referans Grubu - Lekesiz başlıklı grafikte, benzer bir aralıkta bir popülasyon seçin. Bunun için lekesiz pozitif-negatif ayarlanmak zorunda değildir.
- Deneysel örnekler edinin.
- Tek bir fare için bir örnek içeren her tüp için, tüpü vortekse edin ve güvenli bir şekilde SIP üzerine yerleştirin. Yeşil gösterge okunun doğru numuneyi işaret ettiğinden emin olun, ardından sitometre yazılımının Edinme Kontrol panelinde Başlat'ı tıklayın ve olaylar kaydedilene kadar bekleyin.
- Geçit stratejisi.
- Varsayılan Karıştırılmamış Çalışma Sayfası sekmesini seçin. Üstteki Nokta çizimi aracını kullanarak FSC-A ve SSC-A grafiği oluşturun. Poligon seçim aracını kullanarak FSC-A ekseninde 0,4 M'den yüksek ve SSC-A ekseninde 0,8 M'den yüksek olayları seçin. Bu seçime çift tıkladığınızda yeni bir grafik görüntülenecektir.
- Yeni oluşturulan grafikten, X ekseni etiketine sağ tıklayın ve AF-A'yı seçin; Y ekseni etiketine sağ tıklayın ve Canlı ölü lekesi'ni seçin. Üstteki Dikdörtgen seçim aracına tıklayın ve alt canlı-ölü sinyaline karşılık gelen canlı-ölü ekseninde 105'in altındaki tüm olayları seçin. Bu seçime çift tıkladığınızda yeni bir grafik görüntülenecektir.
- Yeni grafikte, X ekseni için PerCP-Cy5.5-A'yı ve Y ekseni için SSC-A'yı seçmek için sağ tıklayın. Dikdörtgen seçim aracını kullanarak,CD45 pozitif hücrelerine karşılık gelen PerCP-Cy5.5-A ekseninde 10 4'ten yüksek olayları seçin. Seçime çift tıklayın ve yeni bir grafik görüntülenecektir.
- Yeni grafikte, X ekseni için FSC-A'yı ve Y ekseni için FSC-H'yi seçmek üzere sağ tıklatın. Poligon seçim aracını kullanarak, FSC-A değeri ile SSC-A değerinin aynı olduğu bir eğilimi izleyen olayları seçin; bununla hücre çiftleri çıkarılacak ve seçimdeki popülasyon CD45+ popülasyonu olarak adlandırılacaktır. CD45+ popülasyonuyla yeni bir grafik görüntülemek için seçime çift tıklayın.
- CD45+ popülasyon grafiğinden, X ekseninde BV421 ve Y ekseninde SSC-A'yı seçmek için sağ tıklayın. Poligon seçim aracını kullanarak BV421 ekseninde sağdaki popülasyonu seçin. Bu B hücresi popülasyonudur. B hücresi popülasyonuyla iki yeni arsa oluşturmak için bu popülasyonda iki kez çift tıklayın.
- X ekseninde PE-A ve Y ekseninde BV421-A ile ilk B hücresi grafiğini ayarlamak için sağ tıklatın. Sağdaki popülasyon intravasküler B hücrelerine karşılık gelir ve soldaki popülasyon interstisyel B hücrelerini temsil eder. Her ikisinden de seçim yapmak için Poligon seçim aracını kullanın.
- X ekseninde Alexa Fluor 700-A ve Y ekseninde SSC-A ile ikinci B hücresi grafiğini kurmak için sağ tıklayın. Soldaki popülasyon CD11b hücrelerine karşılık gelir ve sağdaki olaylar (varsa) CD11b + hücrelerine karşılık gelir.
- Her seçime sağ tıklayın ve ardından Kapı Özellikleri'ne tıklayın. Boyutları ve yüzdeleri görüntülemek için Count ve % Parent (Ebeveyn Sayısı) ve % Parent (Ebeveyn Yüzdesi ) öğelerine tıklayın. Daha fazla veri analizi için olay sayısını ve yüzdeleri kaydedin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Edinme tamamlandıktan ve tüm olaylar toplandıktan sonra, veriler standart akış sitometrisi uygulamasına göre analiz edilmelidir. Analizin odağı, her deneyin bireysel amacına bağlı olarak değişecektir. Bu durumda, intravasküler ve ekstravasküler B hücrelerinin nicelleştirilmesi takip edildi ve mg doku başına düşen hücre sayısı olarak ifade edildi.
Bir spektral sitometre kullanırken, analize, bağışıklık hücrelerine karşılık gelen bir aralıkta olmayan boyutlardaki kalıntıları çıkarmak için bir başlangıç kapısı ile başlanması ve ardından canlı-ölü leke + sinyalinin çıkarılması önerilir. Bu, lökositlere karşılık gelen CD45 pozitif hücrelerin temiz bir popülasyonunun tespit edilmesini sağlar (Şekil 1). Çiftlerin çıkarılmasından sonra, naif yaralanmamış bir kalpte, CD45 + hücrelerinin yaklaşık% 20'sinin CD19 + B hücreleri olması beklenmektedir (Şekil 2A, bu temsili deneyde% 18.1 B hücreleri). Bu hücrelerin ortalama %5,5'i interstisyel boşlukta, %94,5'i ise damar içi boşlukta yer almaktadır (Şekil 2B). Kalpte bulunan tüm B hücresi popülasyonundan sadece% 1.6'sı, CD11b yüzey belirtecine dayanan B1 hücrelerine karşılık gelir (tipik olarak bir murin CD19 + hücresini yüksek derecede güven 1,34,35 olan birB1 hücresi olarak sınıflandırmak için yeterli kabul edilir) ve diğer% 98,4'ü B2 hücrelerine karşılık gelir (Şekil 2C).
Şekil 1: Miyokardiyal ilişkili B hücrelerini tespit etmek ve karakterize etmek için kullanılan akış sitometrisi geçiş stratejisi. (A) FSC-A vs SSC-A: Grafik, toplanan tüm olayları gösterir ve seçilen alan, analizi lökositlerin boyut aralığındaki olaylarla zenginleştirmek için çizilir. (B) Otofloresan ve canlı-ölü boyama: Seçilen alan daha düşük canlı-ölü sinyaline karşılık gelir. Çizilen kapı, ölü hücreleri ve canlı-ölü lekelenmesine bağlanan diğer bazı hücre kalıntılarını ortadan kaldırır. (C) CD45 sinyaline karşı SSC-A: Seçilen alan CD45+ hücrelerine (yani miyokard lökositlerine) karşılık gelir. (D) FSC-A ve FSC-H: Bu kapı, hücre çiftlerini (seçilmemiş olaylar) kaldırmak için çizilmiştir. (E) CD19 sinyaline karşı SSC-A: Seçilen alan miyokard B hücrelerine karşılık gelir. (F) B220 vs. CD19: Siyah karenin içindeki alan intramiyokardiyal B hücrelerine (CD19+, B220-) karşılık gelir ve kırmızı karenin içindeki alan intravasküler B hücresi popülasyonuna karşılık gelir. (G) CD11b vs. SSC-A: Siyah dairenin içindeki alan CD11b+'ya (B1 hücreleri) karşılık gelir ve kırmızı dairenin içindeki alan CD11b- (B2 hücreleri) değerine karşılık gelir. Her panelde görüntülenen yüzdeler, görüntülenen nüfusun ebeveyn popülasyonundan temsil ettiği ortalama yüzdeyi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Miyokard dokusunun miligramı başına ortalama B hücresi sayısını bildiren temsili grafikler . (A) Ortalama CD45+ ve CD19+ hücreleri/mg murin miyokard dokusu sayısı. Görüntülenen yüzde, ebeveyn popülasyonundan (CD45+) hücrelerin yüzdesine karşılık gelir. (B) CD19+ hücrelerinin ortalama sayısı ve intravasküler boşlukların interstisyel (ekstravasküler) boşluğunda bulunan B hücrelerinin yüzdesi. (C) B1 veya B2 hücrelerinin belirteçlerini eksprese eden miyokard B hücrelerinin mutlak sayısı ve yüzdesi. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasına karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Bu tablo, yordam için gereken çözümleri ve reaktifleri içerir. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Giderek artan sayıda kanıt, B hücrelerinin miyokard fizyolojisi ve miyokard yeniden şekillenmesi / yaralanmaya adaptasyonu bağlamında önemli bir rol oynadığını göstermektedir 7,8,9,10,11,12,13,36. Akış sitometrisi, herhangi bir dokudaki bağışıklık hücresi popülasyonlarını incelemek için mükemmel bir araçtır ve kalpteki B hücrelerine odaklanan herhangi bir çalışma için neredeyse zorunlu bir araçtır.
B hücreleri ve kalp hakkında ortaya çıkan literatür, kalpteki B hücrelerinin sayısı ve yaralanma ile miyokard B hücresi sayısındaki değişiklikler gibi çok temel yönlerle ilgili zıt bulgular bildirmektedir. B hücreleri, kemirgen kalplerinde en yaygın bağışıklık hücresi olarak bildirilmiştir7. Bununla birlikte, diğer çalışmalar diğer miyeloid hücrelere kıyasla göreceli prevalansını değerlendirdi ve belirgin şekilde daha düşük sayılar26,27 gösterdi. Pinto ve ark.26, B hücrelerinin toplam lökositlerin yaklaşık% 9'unu oluşturduğunu, Yu ve ark.27'nin% 10'unu bildirdiğini bulmuşlardır. Adamo ve ark.7, lökosit sayılarına göre B hücrelerinin ortalama yüzdesinin% 20 civarında olduğunu ve bunun bu makalede bildirilen % 18.1'e çok yakın olduğunu bildirmiştir. Diğer çalışmalar, B hücrelerinin miyokard28'de çok düşük bir prevalansa sahip olduğunu bildirmiştir.
Birkaç kritik deneysel adım, literatürde bildirilen B hücresi sayılarındaki değişkenlikleri açıklayabilir. Yani, kalbin perfüzyonundaki, doku kıymasındaki ve sindirimdeki farklılıklar, mg kalp dokusu başına geri kazanılan B hücrelerinin sayısını önemli ölçüde etkileyebilir. Kalsiyum şelatlama ajanları içeren ve kalsiyum içermeyen tamponlarla perfüzyon veya daha yüksek hacimli veya perfüzyon hızına sahip perfüzyon, endotele bağlı B hücrelerini ayırabilir ve iyileşme verimini azaltabilir. Aşırı ince doku kıyma, dokunun aşırı sindirimine ve hücre canlılığının kaybına neden olabilir. Hücre canlılığındaki bir azalma, uzun süre veya daha yüksek enzim konsantrasyonlarıyla sindirimin bir sonucu olabilir.
B hücrelerine karşılık gelen CD45+ hücrelerinin yüzdesi, vahşi tip bir farede% 15 -% 30 arasında bir aralıkta olabilir. Kullanılan fare suşuna, yaşa ve genetik arka plana bağlı olarak, bu değer değişebilir. Bununla birlikte, yüzde çalışılan grupta benzer kalmalıdır. Aynı gruba ait fareler arasındaki B hücrelerinin sayısı ve yüzdesindeki büyük değişkenlik, deneysel bir hatanın meydana gelebileceğini düşündürmektedir. Düşük yüzdeler, perfüzyon gücü ve süresinde bir fazlalık olduğunu gösterebilir. CD45 + hücrelerindeki küresel azalma, dokunun aşırı sindirildiğini gösterebilir.
Burada açıklanan protokol, sindirilmiş murin kalbinden tutarlı bir B hücresi verimi sağlamak ve intravasküler ve ekstravaskülerB hücrelerinin 6 ayrımına izin vermek için optimize edilmiştir. İntravasküler ve ekstravasküler B hücrelerinin ayrımı, kurban edilmeden hemen önce bir antikorun intravasküler enjeksiyonu ile sağlanır. İntravasküler olarak enjekte edilen antikor, vaskülatür boyunca kolayca yayılır ve tüm intravasküler B hücreleriyle karşılaşır. Hayvan yeterince yakında kurban edilirse ve kalp derhal hasat edilirse, antikorun ekstravasküler boşlukta dağılması ve ekstravasküler B hücrelerini boyaması için zamanı yoktur. Antikorun intravasküler enjeksiyonu ile organ hasadı arasındaki süre kritik olduğundan, antikor ile aşılamanız ve bir seferde bir bireysel fare kalbi toplamanız önerilir. İntravasküler ve ekstravasküler B hücrelerinin ayrımı ilgi çekici değilse, antikorların intravasküler enjeksiyonu ihmal edilebilir. Şekil 1'de görüntülenen geçit stratejisi, B220 etiketlemesinin olmaması nedeniyle mümkün olmayacak olan son adım dışında aynı kalacaktır. Deneysel tasarıma bağlı olarak, gösterilen paneldeki herhangi bir florofor, kullanılan panele uyan bir renge değiştirilebilir. Ayrıca, yüzey işaretleyicilerinin seçiminin, bunu yapan grubun ihtiyaçlarına göre değiştirilebileceğini düşünmek önemlidir; Örneğin, deneysel tasarımda B1 hücreleri üzerindeki CD11b ekspresyonunun azaltılabileceğine inanılıyorsa, IgM, IgD ve CD537 gibi farklı belirteçlerin eklenmesi önerilir.
Sadece akış sitometrisi için kompanzasyon kontrollerini çalıştırmak için bir kalbin işlenmesinin gerekli olabileceğini lütfen unutmayın. Bu, deneme ilk kez optimize edildiğinde önerilir. Aşağıdaki deneylerde, kalp toplama anında bazı dokuların kurtarılması yeterli olabilir, çünkü negatif bir "lekesiz" kontrol ve pozitif bir "canlı-ölü" leke kontrolü yapmak için yeterli hücre sağlayacaktır. Diğer renkler için tek tek kontroller önceki denemelerden içe aktarılabilir veya boncuklar kullanılarak oluşturulabilir.
Protokolün bazı adımları, deneyin sonuçlarını değiştirmeden değiştirilebilir. Örneğin, anestezi yöntemi, araştırmacının deneyimine bağlı olarak tercih edilen bir yöntem için değiştirilebilir; 2,2,2-tribromoetanol yerine izofluran kullanımı, anestezi uygulaması ile kalp toplanması arasında harcanan süreyi azaltabilir. Ayrıca, kalbin perfüzyonu, yavaş, nazik ve tutarlı bir şekilde yapıldığı sürece bir şırınga pompası kullanılmadan manuel olarak yapılabilir.
Protokolün doğru bir şekilde uygulanmasına rağmen, deneyimsiz operatörler aynı deneysel oturumdaki örnekler arasında veya farklı deneysel oturumlar arasında yüksek değişkenlikle karşılaşabilirler. Deneyime dayanarak, bu değişkenlik, bilim adamı iş akışına tam olarak aşina olma fırsatına sahip olduktan sonra ortadan kalkar. Bu nedenle, bu protokolü uygulamak isteyen herkesin, araştırma projeleri hakkında önemli veriler toplamadan önce iki ila üç deneme çalışmasında tekrarlanabilirliğini değerlendirmesi önerilir.
Özetle, bağışıklık hücrelerini kalpten izole etmek ve bunları akış sitometrisi yoluyla analiz etmek için mevcut yöntemler tipik olarak bağışıklık hücrelerinin endotele bağlanma yeteneğini göz önünde bulundurmaz ve intravasküler boşluktaki herhangi bir bağışıklık hücresinin temizlenmesi gereken bir kirletici olduğu varsayımıyla perfüzyonu standartlaştırmaz veya kapsamlı perfüzyon uygulamaz. Bu, endotele yapışan intravasküler immün hücrelerin biyolojik olarak ilgisi olduğu fikrini göz ardı etmektedir. Burada sunulan protokol, miyokard B hücrelerine, intravasküler ve ekstravasküler hücrelere özel dikkat göstererek miyokard immün hücrelerinin iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiştir. Bu protokolün, kardiyak immünoloji alanında çalışan ve B hücrelerinin sağlıklı ve yaralı kalplerde oynayabileceği işlevi araştırmakla ilgilenen tüm bilim adamlarının ilgisini çekeceğini umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Luigi Adamo, kalp yetmezliğinin tedavisi için immünomodülatör moleküllerin geliştirilmesine odaklanmış bir şirket olan i-Cordis, LLC'nin kurucu ortağıdır ve B hücresi modüle edici ilaç pirfenidonun türevlerine özel bir ilgi duymaktadır. Geri kalan yazarların beyan edecek herhangi bir çelişkisi yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Luigi Adamo'ya verilen NHLBI hibeleri 5K08HLO145108-03 ve 1R01HL160716-01 tarafından finanse edilmiştir.
Bu çalışmayı geliştirmek için kullanılan Aurora Akış Sitometresi, NIH Grant S10OD026859 tarafından finanse edildi. JHU Ross Flow Cytometry Core'un desteğini kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
| (CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
| 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
| 10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
| 1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
| 15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
| 1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
| 3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
| Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
| Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
| Anesthesia Induction Chamber - Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
| CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
| Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
| Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
| Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
| Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
| Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
| DNase I - 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Easypet 3 - Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
| Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
| FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
| GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
| HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
| Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
| Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
| Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
| Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
| R 4.1.1 | The R Foundation | ||
| Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
| Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
| Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
| Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
| SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
| Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
| Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
| Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
| Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
| Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
References
- Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease. Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).
- Gowans, J. L., Knight, E. J. The route of re-circulation of lymphocytes in the rat. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).
- Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes. Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).
- Tanaka, T., et al. Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).
- Rocha-Resende, C., et al. Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs. JCI Insight. 5 (16), (2020).
- Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).
- Adamo, L., et al. Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury. JCI Insight. 3 (11), (2018).
- Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).
- Zouggari, Y., et al. B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction. Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).
- Wu, L., et al. IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).
- Heinrichs, M., et al. The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).
- Sun, Y., et al. Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice. Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).
- Yan, X., et al. Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).
- Iwata, M., et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo. Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).
- Jahns, R., et al. Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy. The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).
- Christ, T., et al. Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).
- Jane-wit, D., et al. Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis. Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).
- Ludwig, R. J., et al.
- Haudek, S. B., et al. Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).
- Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).
- Zhang, M., et al. The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).
- Zhang, M., et al. Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).
- Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function. Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).
- Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy. The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).
- Caforio, A. L. P., et al. Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).
- Pinto, A. R., et al.
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Horckmans, M., et al. Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction. Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens. Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
- Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. B-1 B cell development in the fetus and adult. Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).
- Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure. Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).
- Zhao, T. X., et al. Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study. Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).
- Kushnir, N., et al. B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice. Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).
