Summary
כאן אנו מדווחים על פרוטוקול לכימות והתמיינות של לימפוציטים B שריר הלב בהתבסס על מיקומם בחלל התוך-וסקולרי או האנדותל באמצעות ציטומטריה של זרימה.
Abstract
גוף הולך וגדל של ראיות מראה כי לימפוציטים מסוג B ממלאים תפקיד חשוב בהקשר של פיזיולוגיה של שריר הלב והסתגלות שריר הלב לפציעה. עם זאת, הספרות מדווחת על נתונים מנוגדים על שכיחות תאי B שריר הלב. דווח כי תאי B הם גם בין תאי החיסון השכיחים ביותר בלב המכרסם או שהם נוכחים, אך בשכיחות נמוכה משמעותית מתאי מיאלואידים, או שהם נדירים למדי. באופן דומה, מספר קבוצות תיארו כי מספר תאי B שריר הלב עולה לאחר פגיעה איסכמית חריפה בשריר הלב, אך קבוצה אחת לא דיווחה על שינויים במספר תאי B של שריר הלב הפגוע. יישום שיטה משותפת הניתנת לשחזור כדי להעריך את השכיחות של תאי B שריר הלב הוא קריטי כדי ליצור הרמוניה בין תצפיות מקבוצות מחקר שונות ובכך לקדם את קידום המחקר של אינטראקציות שריר הלב של תאי B. בהתבסס על הניסיון שלנו, התצפיות המנוגדות לכאורה המדווחות בספרות נובעות ככל הנראה מהעובדה שתאי B של שריר הלב הם ברובם תוך-וסקולריים ומחוברים לאנדותל המיקרו-וסקולרי. לכן, מספר תאי B שהתאוששו מלב מורין רגיש להפליא לתנאי הזלוף המשמשים לניקוי האיבר ולשיטת העיכול המשמשת. כאן אנו מדווחים על פרוטוקול אופטימלי המביא בחשבון את שני המשתנים הקריטיים הללו באופן ספציפי. פרוטוקול זה מעצים ניתוח מבוסס ציטומטריה של זרימה הניתנת לשחזור של מספר תאי B שריר הלב ומאפשר לחוקרים להבחין בין תאי B מיו-וסקולריים חוץ-וסקולריים לעומת תאי B תוך-וסקולריים.
Introduction
לימפוציטים מסוג B הם תאים חיסוניים מיוחדים מאוד הממלאים תפקיד חשוב הן בתגובה החיסונית הנרכשת והן בתגובה החיסונית המולדת1. ישנן שתי אוכלוסיות עיקריות של תאי B: אוכלוסייה קטנה יותר של תאי B1 המיוצרים בעיקר במהלך החיים העובריים, ואוכלוסייה מוקדמת של תאי B2 המיוצרים בחיים הבוגרים במח העצם1. לאחר ההתבגרות במח העצם, תאי B נודדים לאיברי לימפה ראשוניים ומשניים. משם הם חוזרים ללא הרף בין איברי הלימפה העוברים דרך כלי הדם וכלי הלימפה2. תאי B מבטאים נוגדנים ספציפיים על פני השטח שלהם, המתפקדים כקולטנים. כאשר תאי B נתקלים באנטיגן שנקשר לקולטן שלהם, ניתן להפעיל אות מפעיל. תאי B פעילים נודדים לרקמה שבה נמצא האנטיגן או חוזרים למח העצם, שם הם יכולים להבשיל לתאי פלזמה המייצרים נוגדנים 3,4.
לאחרונה, זה כבר מוערך כי הלב מכיל אוכלוסייה גדולה של תאי B. מחקרים במכרסמים הראו כי תאי B מאכלסים את הלב בשלב מוקדם במהלך ההתפתחות העוברית5, וכי תאי B הקשורים לשריר הלב הם בעיקר תאי B2 תוך-וסקולריים, נאיביים, הנצמדים לאנדותל6,7, עם אחוז קטן של תאי B1 7. ישנם עדיין תחומים רבים של אי ודאות, אך הנתונים הזמינים מצביעים על כך שתאי B ממלאים תפקיד חשוב הן בלב התמים והן בהקשר של הסתגלות שריר הלב לפציעה.
מחקרים בלב המורין התמים הראו כי בנקודת ההתחלה תאי B של שריר הלב ממוקמים בעיקר בחלל התוך-וסקולרי, דבוקים לאנדותל (>95% מתאי ה-B הלבביים של מורין נמצאו ממוקמים בחלל התוך-וסקולרי). נמצא כי לתאי B אלה יש דפוסי ביטוי גנים שונים מאלה של תאי B במחזור הדם שבודדו מהדם ההיקפי. ניתוח של לבבות תמימים מבעלי חיים עם מחסור בתאי B ובקרות סינגניות מצאו שלבעלי חיים חסרי תאי B היו לבבות קטנים יותר ולחלקפליטה גבוה יותר 6. כל הראיות הללו מצביעות על כך שתאי B עשויים לווסת את גדילת שריר הלב ו/או את תפקוד שריר הלב, וכי לא רק תאי B אינטרסטיציאליים אלא גם תוך-וסקולריים יכולים להיות אחראים לתצפיות כאלה. כמו כן, נמצאו תאי B המווסתים את הפנוטיפ של מקרופאגים המתגוררים בשריר הלב8.
מספר מחקרים הראו כי תאי B ממלאים תפקיד חשוב בהקשר של הסתגלות שריר הלב לפציעה 8,9,10,11,12,13. תאי B מצטברים באופן חולף בלב הפגוע, ככל הנראה באמצעות מנגנון תלוי CXCL13-CXCR511,13. משם, תאי B מקדמים שיפוץ לב שלילי באמצעות מספר מנגנונים הכוללים גיוסמונוציטים בתיווך ציטוקינים 9,12. בנוסף, תאי B יכולים לייצר נוגדנים נגד חלבוני לב שיכולים לקדם את הרחבת הנזק הלבבי ושיפוץ לב שלילי באמצעות מספר מנגנונים 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . תאי B יכולים גם להפעיל השפעה מגנה על הלב הפגוע באמצעות הפרשת IL-1010.
ככל שמספר הקבוצות החוקרות את תפקידם של תאי B בלב התמים והפצוע גדל, חשוב יותר ויותר להגדיר פרוטוקולים משותפים כדי לכמת ולהעריך כראוי תאי B שריר הלב ובכך למנוע חוסר עקביות שכבר החלו להופיע בספרות. עד כה דווח כי תאי B הם כאחד מתאי החיסון השכיחים ביותר בלב המכרסם7 ונמצאים בשכיחות נמוכה משמעותית מאשר תאים מיאלואידים 26,27, או נדירים למדי28. באופן דומה, מספר קבוצות תיארו כי מספר תאי B שריר הלב עולה לאחר פגיעה איסכמית חריפה בשריר הלב 7,9,13, אך קבוצה אחת לא דיווחה על שינויים במספר תאי B של שריר הלבהפגוע 29. מחקרים על תאי חיסון לבביים כמעט ולא נותנים פרטים על תנאי פרפוזיה ואין הסכמה על תנאי העיכול. מכיוון שבלב מכרסם חלק גדול מתאי B הם תוך-וסקולריים ומיצוי תאי מערכת החיסון משריר הלב תלוי מאוד בשיטת העיכול שבה נעשה שימוש, ההבדלים המדווחים בספרות עשויים להיות תוצאה של הבדלים בזליגת איברים ובעיכול רקמות.
מוצגת כאן שיטה מפורטת לכימות מבוסס ציטומטריה של זרימה של תאי B שריר הלב של מורין, אשר ממקסמת את התשואה של התאוששות תאי B על ידי אופטימיזציה של תנאי הזלוף והעיכול ומאפשרת הבחנה של תאי B תוך-וסקולרייםלעומת תאי B חוץ-וסקולריים 6. פרוטוקול זה הוא התאמה ואופטימיזציה של פרוטוקולים דומים אחרים המבחינים בין תאי חיסון תוך-וסקולריים ואינטרסטיציאליים 28,30,31.
בפרוטוקול זה, אנו מבצעים סטנדרטיזציה של פרפוזיה שריר הלב כדי לחסל תאי B שצפים בחלל התוך-וסקולרי מבלי להסיר תאי B רלוונטיים ביולוגית שנדבקו לאנדותל המיקרו-וסקולרי. יתר על כן, בהתבסס על פרוטוקולים קודמים שתיארו את השימוש בהזרקה תוך ורידית של נוגדנים כדי להבחין בין תאי חיסון תוך-ורידיים לתאי חיסון אינטרסטיציאליים32, ותוך ניצול העובדה שתאי B מבטאים את סמן פני השטח B22033, אנו מדגימים כיצד להבחין בין תאי B תוך-וסקולריים לעומת תאי B חוץ-וסקולריים באמצעות הזרקה תוך-וסקולרית של נוגדן ספציפי ל-B220 מיד לפני הקרבת בעלי החיים וזליגת הלב. פרוטוקול זה רלוונטי למחקרו של כל מדען המעוניין לכלול ניתוח של תאי B שריר הלב בלב התמים והפצוע. יישום נרחב של פרוטוקול זה יפחית את חוסר העקביות בין קבוצות המחקר, יאפשר ניתוח של שינויים בבריכות תאי B תוך-וסקולריים וחוץ-וסקולריים, ובכך יחזק את קידום התגליות בתחום האימונולוגיה של הלב.
לסיכום, הפרוטוקול מייצג זרימת עבודה אופטימלית לכימות וניתוח תאי B שריר הלב באמצעות ציטומטריית זרימה, ובמקביל להבחין בין תאים הממוקמים בחלל החוץ-וסקולרי לבין החלל התוך-וסקולרי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים המתוארים בכתב יד זה בוצעו באישור IACUC בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס.
1. הכנות
- הכן את מאגר FACS, כמתואר בטבלה 1.
- ודא שיש מספיק CO2 כדי להרדים את בעלי החיים.
- הכינו את חלל הנתיחה (הניחו את משטח הספסל והניחו את כלי הקלטת והדיסקציה בקרבת מקום).
- תייג את הצינורות של 15 מ"ל, שים 3 מ"ל של HBSS עם סידן ומגנזיום בכל צינור (ראה טבלת חומרים) והנח אותם על קרח (צינור אחד לכל לב וצינור נוסף לקבוצת הפניה/בקרת ציטומטריה של זרימה). כמו כן, מלאו את צלחות הפטרי הקטנות (35 מ"מ) ב-HBSS.
- הפעל את השייקר מבוקר הטמפרטורה, הגדר אותו ל -37 מעלות צלזיוס, וצנן מראש את הצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- הכינו את משאבת המזרק והגדירו את קצב הזרימה ל-3 מ"ל/דקה. מלאו מזרק של 20 מ"ל ב-HBSS, הגדילו את קו הצינור במאגר והסירו את כל הבועות.
2. מכתים תוך-וסקולריים של תאי B (in vivo)
- שקלו עכבר זכר בן 12 שבועות מזן C57BL/6J. העמיסו מזרק אינסולין בנפח 3/10 סמ"ק עם 100 מיקרון של דילול הנוגדן B220 (1:10, ב-PBS). מכסים את המזרק ברדיד אלומיניום להגנה מפני אור.
- הרדמה של עכבר אחד.
- החל הזרקה intraperitoneal של 2% 2,2,2-tribromoethanol עם מינון של 400 מ"ג / ק"ג ולחכות 10-20 דקות.
הערה: עקוב אחר הנשימה והתנועה של העכבר. ברגע שהעכבר מפסיק לזוז, לעורר כאב על ידי צביטה של הבוהן; היעדר רפלקס נסיגה מצביע על הרדמה נאותה. - אם לא הושגה הרדמה מספקת במהלך 20 דקות, ניתן לתת מנה נוספת של חומר הרדמה במינון של 100 מ"ג/ק"ג, ויש לבצע הערכה של קינטיקה של עכברים, רפלקס גמילה ונשימה כל 5 דקות.
- החל הזרקה intraperitoneal של 2% 2,2,2-tribromoethanol עם מינון של 400 מ"ג / ק"ג ולחכות 10-20 דקות.
- הניחו את העכבר על ספסל המעבדה על משטח ספסל המוטה לכיוון צד אחד, משכו בעדינות את עור הגב, ולחצו מעט את הגוף על הספסל כדי לגרום לעין לבלוט.
- הזריקו את הנוגדן המדולל B220 משלב 2.1 על ידי הזרקה רטרואורביטלית.
- הכניסו את המזרק לעין בזווית של 45° מהמישור הסגיטלי של ראש העכבר. לאט לאט להזריק את הפתרון. אם מורגשת התנגדות, הסר את המזרק והזן שוב. המתן 2 דקות.
הערה: זמן הדגירה הממושך יסכן את היכולת להבחין בין תאי B תוך-וסקולריים לעומת חוץ-וסקולריים, שכן הוא ייתן זמן לנוגדן המוזרק להתפזר מחוץ לכלי הדם.
- הכניסו את המזרק לעין בזווית של 45° מהמישור הסגיטלי של ראש העכבר. לאט לאט להזריק את הפתרון. אם מורגשת התנגדות, הסר את המזרק והזן שוב. המתן 2 דקות.
- להרדים את העכבר בהתאם לתקנות IACUC.
- פתח את זרימת CO2 לתא המתת החסד בקצב של 0.5 ליטר לדקה, או את קצב הזרימה המומלץ בהתבסס על גודל התא שלך.
- הניחו את העכבר בתא לזמן המומלץ, וודאו שהוא כבר לא נושם. הסר אותו ולבצע פריקת צוואר הרחם כשיטה משנית של המתת חסד.
- לאחר שהעכבר מורדם, המשך מיד לקצירת איברים וזליפה.
3. אוסף לב
- פתח חזה.
- החזק את העור של העכבר עם מלקחיים באזור epigastric. צרו פתח בקוטר 2 מ"מ בעור באמצעות מספריים והשתמשו במלקחיים כדי לקלף את העור ולחשוף את שכבת החיתולית, שכבה שקופה ומבריקה, של החזה והבטן. חותכים באפיגסטריום דרך החיתולית והצפק כדי לפתוח את דופן הבטן ולחשוף את התהליך הקסיפואידי. מהדק את תהליך xiphoid באמצעות מלקחיים hemostatic.
- בעזרת המספריים, בצעו חתך אנכי דרך דופן בית החזה בגובה קו אמצע העצם בכל צד והרימו את דופן בית החזה הקדמית כדי לחשוף את תכולת המדיאסטינום, תוך שימוש במלקחיים המוסטטיים כמשקולת לשמירה על הפתח.
- זילוף לב ומיצוי.
- באמצעות מלקחיים, להסיר כל רקמת שומן או thymic סביב הלב.
- החזיקו את אבי העורקים היטב מאחור באמצעות מלקחיים. מכניסים את מחט המזרק (25 גרם) לתוך קצה הלב. עם 3 מ"ל של HBSS בקצב של 3 מ"ל לדקה.
הערה: עקוב אחר ההזלפה. הכבד צריך למלא, ודם בכלי הדם הכליליים צריך להיות מוסר לחלוטין. מומלץ להשתמש במשאבת מזרק מכוילת ל-1 מ"ל/דקה כדי לשמור על זרימה יציבה. - חותכים את אבי העורקים באמצעות מספריים ומוציאים את הלב. לשטוף את הלב בצלחת פטרי עם HBSS כדי להסיר את כל הדם שנותר. באמצעות מספריים ומלקחיים, להסיר את השומן, רקמת החיבור ואת בלוטת התימוס, ולייבש את הלב. שקלו את הלב המבודד ושימו לב למשקל במיליגרמים. טחנו את הלב בטמפרטורת החדר לחתיכות קטנות (1-2 מ"מ) בעזרת להב.
הערה: לבבות עכברים בוגרים עשויים לשקול בין 0.090-0.210 מ"ג. - מדוד את המסה של רקמת הלב והניח 60 מ"ג של הלב הטחון כדי להתעכל בצינור 15 מ"ל עם 3 מ"ל של HBSS. שמור על רקמת הלב הנותרת והניח בצינור שכותרתו "רקמת בקרת ייחוס"; זה ישמש לבקרת פיצויים עבור אות מת-חי ו- autofluorescence.
4. עיכול לב וכתמי תאים
- הוסיפו אנזימים לכל צינור המכיל רקמה טחונה (ראו טבלה 1). הוסיפו 0.5 μL/מ"ג של DNase 1 (300 יחידות עבור 60 מ"ג של רקמת לב), 0.5 μL/מ"ג של קולגןאז II (625 יחידות עבור 60 מ"ג של רקמת לב), ו-0.2 μL/mg של היאלורונידאז (50 יחידות עבור 60 מ"ג של רקמת לב) לצינור.
- מניחים את תגובת העיכול בשייקר למשך 30 דקות ב-300 סל"ד. כוונן את מתלה השייקר לכ-25° של שיפוע.
- הוסף 7 מ"ל של HBSS לכל אחד מצינורות התגובה של 15 מ"ל וצנטריפוגה בגודל 250 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס עם תאוצה ושבירה מוגדרות למתון או איטי. יש לנטרל את ה-supernatant ולהשהות כל כדור ב-5 מ"ל של חיץ ליזיס ACK כדי להסיר תאי דם אדומים. דגירה בחיץ תזה ACK במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסיפו 10 מ"ל של PBS לכל צינור, ערבבו ולאחר מכן סננו לצינור של 50 מ"ל עם מסננת של 40 מיקרומטר. ודא שכל הלכלוך נמצא בתוך תא המסנן. יש לרסק כל פסולת על המסנן באמצעות בוכנה של מזרק עד שהוא תלוי לחלוטין בתוך תא המסנן.
- הוסף PBS דרך המסנן עד נפח מגיע 25 מ"ל לכל לב; פעולה זו תאפשר לתאים המושעים לעבור דרך המסנן. הוסף 25 מ"ל נוספים של PBS לצינור רקמת בקרת הייחוס וחלק את הנפח לצינורות שונים (25 מ"ל כל אחד). תייג את אחד הצינורות "Unstained" ואת השני כמו "לחיות מת". צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: בשלב זה, הכינו את הדילול לכתם החי-מת (דילול: 1:500 ב-PBS אחד). - דקאנט את הסופר-נטנט, השהה את הכדור בצינור Unstained ב-100 μL של PBS וכל אחד מהכדורים האחרים ב-100 μL של דילול הכתם החי-מת. דגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך, מכסה את דלי הקרח עם רדיד אלומיניום.
- הוסף 500 μL של מאגר FACS לכל דגימה והעבר אותו לצינור FACS עם תווית דרך מסנן של 40 מיקרומטר. צנטריפוגה צינורות FACS ב 250 x g במשך 5 דקות ב 4 °C. השליכו את הסופר-נטנט. השהה את הכדור ב-500 μL של מאגר FACS.
- הוסף 50 μL של תמיסת חסימת Fc (ראה טבלה 1) לכל צינור, למעט צינורות לא מוכתמים ומתים חיים. מערבבים ודוגרים במשך 5 דקות.
- הוסיפו תמיסת תערובת נוגדנים של 50 μL (ראו טבלה 1) לכל צינור, למעט הצינורות Unstained ו-Live-dead, ודגרו במשך 30 דקות בחושך, תוך כיסוי דלי הקרח ברדיד אלומיניום.
- הוסף 2 מ"ל של חיץ FACS לכל צינור וצנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C. הסר את ה-supernatant והשעה מחדש ב-300-500 μL של מאגר FACS.
5. ציטומטריה של זרימה
- הגדרות בקרת מכשירים.
הערה: בפרוטוקול זה הדגימה מנותחת באמצעות ציטומטר זרימה של 4 לייזרים Cytek Aurora. עוד ציטומטר זרימה מתאים יכול לשמש כדי לזהות את סמני העניין.- פתח את תוכנת בקרת המכשירים (ראה טבלת חומרים). בחלק העליון של החלון, בחר את הכרטיסייה רכישה ולחץ על חדש +. יוצג חלון בשם ' צור ניסוי חדש' .
- במקטע ספריה, בשדה סוג לסינון, הקלד PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 ו- Zombie Aqua, לחיצה על הוסף לאחר הקלדת כל אחד מהם. יש לראות את שמות הפלואורופור מימין. לאחר מכן לחץ על הבא כדי להמשיך לכרטיסיה קבוצה .
- בכרטיסיה קבוצה , לחץ על הסמל עם צינור כדי להוסיף את הלב לניתוח.
- לחץ על הקבוצה + הפניה וחלון יוצג. בעמודת התג הפלואורסצנטי בחר Zombie Aqua, ובעמודת סוג הבקרה בחר תאים ולאחר מכן לחץ על שמור.
- לחץ על הכרטיסייה הבא > סמנים ; תוצג טבלה עם שמות הפלואורופורים. הקלד את סמן התא המתאים בשורה הראשונה של כל עמודת פלואורופור והקלד Enter: CD45 עבור PerCP-Cy5.5; CD19 עבור BV421; CD11b עבור אלקסה פלואור 700; B220 עבור PE; וחיים מתים עבור זומבי אקווה.
- לחץ על הבא פעמיים כדי לעבור לכרטיסיה רכישה . ב'אירועים לתיעוד' של קבוצת הניסוי, הקלד 10,000,000, ובאותו שדה עבור קבוצת הייחוס סוג שורה 200,000. לחץ על שמור ופתח. ההגדרות האחרות צריכות להישאר כברירת מחדל, זמן עצירה ל- 10,000 והפסקת עוצמת קול ל- 3,000.
- בפינה השמאלית התחתונה לחץ על בקרת מכשירים. הגדר מתח ל- FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. לאחר מכן, בחר את פקד הרכישה. עבור האפשרות קצב זרימה , בחר גבוה מהתפריט הנפתח.
- רכוש דוגמאות ייחוס עם ציטומטר ובטל את המיקס בתוכנה.
- מערבבים את צינור הלב הלא מוכתם ומניחים אותו בבטחה על יציאת הזרקת הדגימה (SIP). ודא שחץ המחוון הירוק מצביע על הדוגמה הנכונה ולאחר מכן לחץ על התחל בחלונית בקרת רכישה של תוכנת הציטומטר והמתן עד שהאירועים יתועדו. עשו את אותו הדבר עבור רקמת הלב המוכתמת ב-Live-dead.
- בחר בתפריט Unmix והגדר את הפקדים הבאים:
- בחר את תיבות הסימון עבור PE, PerCP-Cy5.5, BV421 ו- Alexa Fluor 700 בעמודה מהספרייה. ודא ש-Zombie Aqua אינו מסומן באותה עמודה. בחלק התחתון, בדוק את האפשרות של Autofluorescence כתג פלואורסצנטי.
- לחץ על הבא כדי להמשיך לכרטיסייה זיהוי אוכלוסיות חיוביות/שליליות . בכרטיסייה זו תוצג עלילה של FSC-A לעומת SSC-B-A. לחץ וגרור את נקודות המצולע כדי לבחור אזור בין 1.0 M ל- 4.0 M בציר FSC-A, ובין 0.2 M ל- 3.0 M בציר SSC-B-A.
- בחלקה הבאה מימין, V5-A יוצג על ציר X. הזז את השערים כדי לבחור מחצית מהפסגה בקצה הימני כחיובי ואזור בצד שמאל של העלילה כשלילי. בעלילה שכותרתה קבוצת ייחוס - לא מוכתמת, בחר אוכלוסייה בטווח דומה. לשם כך אין צורך להגדיר את השלילי החיובי-שלילי.
- לרכוש דגימות ניסיוניות.
- עבור כל צינור המכיל דגימה לעכבר בודד, מערבלים את הצינור ומניחים אותו בבטחה על ה- SIP. ודא שחץ החיווי הירוק מצביע על הדגימה הנכונה, ולאחר מכן לחץ על התחל בחלונית בקרת רכישה של תוכנת הציטומטר והמתן עד שהאירועים יתועדו.
- אסטרטגיית גיטינג.
- בחר את הכרטיסיה ברירת מחדל לגליון עבודה לא מעורבב . צור מתווה FSC-A לעומת SSC-A באמצעות הכלי 'התוויית נקודה' למעלה. בחר אירועים גבוהים מ- 0.4 M בציר FSC-A וגבוהים מ- 0.8 M בציר SSC-A באמצעות כלי הבחירה מצולע. לחץ פעמיים בבחירה זו ותוצג עלילה חדשה.
- מתוך העלילה החדשה שנוצרה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תווית ציר X ובחר AF-A; לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על תווית ציר Y ובחר כתם חי מת. לחץ על כלי בחירת המלבן למעלה ובחר את כל האירועים מתחת ל-105 על ציר החי-מת המתאים לאות החי-מת התחתון. לחץ פעמיים בבחירה זו ותוצג עלילה חדשה.
- בחלקה החדשה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור PerCP-Cy5.5-A עבור ציר X ו- SSC-A עבור ציר Y. בעזרת הכלי בחירת מלבן, בחר באירועים הגבוהים מ- 104 בציר PerCP-Cy5.5-A המתאימים לתאים החיוביים של CD45. לחץ פעמיים על הבחירה ותוצג עלילה חדשה.
- בהתווייה החדשה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור FSC-A עבור ציר X ו- FSC-H עבור ציר Y. באמצעות כלי הבחירה מצולע בחר את האירועים הבאים אחרי מגמה שבה ערך FSC-A וערך SSC-A זהים; בכך יוסרו כפילי התאים והאוכלוסייה בבחירה תיקרא אוכלוסיית CD45+. לחץ פעמיים על הבחירה כדי להציג מגרש חדש עם אוכלוסיית CD45+.
- מתוך עלילת האוכלוסייה CD45+, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לבחור BV421 בציר X לעומת SSC-A בציר Y. בעזרת הכלי בחירת מצולע, בחר באוכלוסייה מימין לציר BV421 . זוהי אוכלוסיית תאי B. לחץ פעמיים באוכלוסייה זו כדי ליצור שתי חלקות חדשות עם אוכלוסיית תאי B.
- לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להגדיר את עלילת תאי B הראשונה עם PE-A בציר X ו- BV421-A בציר Y. האוכלוסייה מימין מתאימה לתאי B התוך-וסקולריים, והאוכלוסייה משמאל מייצגת את תאי ה- B הבין-ביתיים. השתמשו בכלי בחירת מצולע כדי לבחור בשניהם.
- לחץ לחיצה ימנית כדי להגדיר את עלילת תאי B השנייה עם Alexa Fluor 700-A על ציר X ו - SSC-A על ציר Y. האוכלוסייה משמאל מתאימה לתאי CD11b, והאירועים מימין (אם בכלל) תואמים לתאי CD11b+.
- לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כל בחירה ולאחר מכן לחץ על מאפייני שער. לחץ על ספירה ועל % הורה כדי להציג את הגדלים והאחוזים. תעד את מספר האירועים והאחוזים לניתוח נתונים נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר השלמת הרכישה ואיסוף כל האירועים, יש לנתח את הנתונים על פי תרגול ציטומטריה של זרימה סטנדרטית. מוקד הניתוח ישתנה בהתאם למטרה האישית של כל ניסוי. במקרה זה, כימות של תאי B תוך-וסקולריים וחוץ-וסקולריים נרדף, והוא בא לידי ביטוי כמספר התאים למ"ג רקמה.
בעת שימוש בציטומטר ספקטרלי, מומלץ להתחיל את הניתוח עם gating ראשוני כדי להסיר פסולת בגדלים שאינם בטווח המתאים לתאי החיסון, ולאחר מכן להסיר את האות כתם חי מת+. זה מאפשר לזהות אוכלוסייה נקייה של תאים חיוביים מסוג CD45 המתאימים ללויקוציטים (איור 1). לאחר הסרת הכפילים, בלב נאיבי שאינו נגוע, צפוי שכ-20% מתאי CD45+ יהיו תאי CD19+ B (איור 2A, 18.1% תאי B בניסוי מייצג זה). מתוך התאים האלה, 5.5% בממוצע ממוקמים בחלל הבין-וסטיציאלי, בעוד ש-94.5% ממוקמים בחלל התוך-וסקולרי (איור 2B). מתוך כל אוכלוסיית תאי B שנמצאת בלב, רק כ-1.6% מתאימים לתאי B1 בהתבסס על סמן פני השטח CD11b (שבדרך כלל נחשב מספיק כדי לסווג תא מורין CD19+ כתא B1 עם רמה גבוהה של ביטחון 1,34,35), ו-98.4% האחרים מתאימים לתאי B2 (איור 2C).
איור 1: אסטרטגיית חיזוי ציטומטריה של זרימה המשמשת לזיהוי ואפיון תאי B הקשורים לשריר הלב. (A) FSC-A לעומת SSC-A: העלילה מציגה את כל האירועים שנאספו, והשטח שנבחר נמשך כדי להעשיר את הניתוח באירועים שנמצאים בטווח הגודל של לויקוציטים. (B) פלואורסצנציה אוטומטית לעומת כתם חי-מת: האזור שנבחר מתאים לאות החי-מת הנמוך יותר. השער המשורטט מסיר תאים מתים וכמה פסולת תאים אחרים שנקשרים לכתמים של מתים חיים. (C) אות CD45 לעומת SSC-A: האזור שנבחר מתאים לתאי CD45+ (כלומר, לויקוציטים שריר הלב). (D) FSC-A לעומת FSC-H: שער זה משורטט כדי להסיר כפילי תאים (אירועים שלא נבחרו). (E) אות CD19 לעומת SSC-A: האזור שנבחר מתאים לתאי B שריר הלב. (F) B220 לעומת CD19: השטח בתוך הריבוע השחור מתאים לתאי B התוך-עצביים (CD19+, B220-), והשטח בתוך הריבוע האדום מתאים לאוכלוסיית תאי B התוך-וסקולריים. (G) CD11b לעומת SSC-A: האזור בתוך העיגול השחור מתאים לתאי CD11b+ (B1), והאזור בתוך העיגול האדום מתאים לתאי CD11b- (B2). האחוזים המוצגים בכל חלונית מייצגים את האחוז הממוצע שהאוכלוסייה המוצגת מייצגת מאוכלוסיית ההורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: עלילות מייצגות המדווחות על המספר הממוצע של תאי B למיליגרם של רקמת שריר הלב. (A) מספר ממוצע של תאי CD45+ ו-CD19+ למ"ג של רקמת שריר הלב של מורין. האחוז המוצג מתאים לאחוז התאים מאוכלוסיית ההורים (CD45+). (B) המספר הממוצע של תאי CD19+ ואחוז תאי B הנמצאים במרחב הבין-תאי (חוץ-וסקולרי) של חללים תוך-וסקולריים. (C) מספר מוחלט ואחוז של תאי B שריר הלב המבטאים סמנים של תאי B1 או B2. קווי שגיאה תואמים לשגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 1: טבלה זו מכילה את הפתרונות והריאגנטים הדרושים להליך. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
גוף הולך וגדל של ראיות מצביע על כך שתאי B ממלאים תפקיד חשוב בהקשר של פיזיולוגיה של שריר הלב ושיפוץ/הסתגלות שריר הלב לפציעה 7,8,9,10,11,12,13,36. ציטומטריה של זרימה היא כלי מצוין לחקר אוכלוסיות תאי חיסון בכל רקמה וכמעט כלי חובה לכל מחקר המתמקד בתאי B בלב.
הספרות המתהווה על תאי B והלב כבר מדווחת על ממצאים מנוגדים בהיבטים בסיסיים ביותר, כגון מספר תאי B בלב ושינויים במספר תאי B בשריר הלב עם פציעה. תאי B דווחו כתא החיסוני הנפוץ ביותר בלבבות מכרסמים7. עם זאת, מחקרים אחרים העריכו את שכיחותם היחסית בהשוואה לתאים מיאלואידים אחרים והראו מספרים נמוכים משמעותיתשל 26,27. Pinto et al.26 מצאו כי תאי B היוו כ-9% מכלל הלויקוציטים, בעוד ש-Yu et al.27 דיווחו על 10%. Adamo et al.7 דיווחו כי האחוז הממוצע של תאי B ביחס למספרי לויקוציטים היה סביב 20%, שזה קרוב מאוד ל-18.1% שדווחו בכתב יד זה. מחקרים אחרים דיווחו כי לתאי B יש שכיחות נמוכה מאוד בשריר הלב28.
מספר שלבים ניסיוניים קריטיים יכולים להסביר את השונות במספרי תאי B המדווחים בספרות. כלומר, הבדלים בזילוף הלב, טחינת רקמות ועיכול יכולים להשפיע באופן משמעותי על מספר תאי B המחלימים לכל מ"ג רקמת לב. פרפוזיה עם מאגרים המכילים חומרי כלאט סידן וללא סידן, או פרפוזיה עם נפח או קצב זלוף גבוהים יותר, עלולה לנתק את תאי B המחוברים לאנדותל ולהפחית את תנובת ההתאוששות. טחינת רקמות עדינה מדי עלולה להוביל לעיכול יתר של הרקמה ולאובדן כדאיות התאים. ירידה בחיוניות התאים יכולה להיות גם תוצאה של עיכול לזמן ממושך או עם ריכוזי אנזימים גבוהים יותר.
אחוז תאי CD45+ המתאימים לתאי B יכול להיות בטווח שבין 15%-30% בעכבר מסוג פרא. בהתאם לזן העכבר שבו נעשה שימוש, לגיל ולרקע הגנטי, ערך זה יכול להשתנות. עם זאת, האחוז צריך להישאר דומה בקבוצה הנחקרת. שונות גדולה במספר ובאחוז תאי B בין עכברים השייכים לאותה קבוצה מצביעה על כך שייתכן שמתרחשת טעות ניסויית. אחוזים נמוכים יכולים להצביע על עודף בחוזק הזליפה ובזמן. הפחתה גלובלית בתאי CD45+ יכולה להצביע על כך שהרקמה מתעכלת יתר על המידה.
הפרוטוקול המתואר כאן עבר אופטימיזציה כדי לספק תשואה עקבית של תאי B מהלב המורין המעוכל ולאפשר הבחנה של תאי B תוך-וסקולריים לעומת תאי B חוץ-וסקולריים6. הבחנה בין תאי B תוך-וסקולריים לעומת תאי B חוץ-וסקולריים מושגת באמצעות הזרקה תוך-וסקולרית של נוגדן מיד לפני ההקרבה. הנוגדן המוזרק באופן תוך-וסקולרי מתפזר בקלות לאורך כלי הדם ופוגש את כל תאי ה-B התוך-וסקולריים. אם החיה מוקרבת די מהר והלב נקטף מיד, לנוגדן אין זמן להתפזר בחלל החוץ-וסקולרי ולהכתים תאי B חוץ-וסקולריים. מכיוון שהזמן שבין ההזרקה התוך-וסקולרית של הנוגדן לקצירת האיברים הוא קריטי, מומלץ לחסן בנוגדן ולאסוף לב עכבר בודד אחד בכל פעם. הזרקה תוך-וסקולרית של נוגדנים יכולה להיות מושמטת אם ההבחנה בין תאי B תוך-וסקולריים לעומת תאי B חוץ-וסקולריים אינה מעניינת. אסטרטגיית ה-gating המוצגת באיור 1 תישאר זהה למעט השלב האחרון, שלא היה אפשרי בשל היעדר תיוג B220. בהתאם לתכנון הניסוי, ניתן לשנות כל פלואורופור מהפאנל המוצג לצבע שמתאים לפאנל שבו נעשה שימוש. כמו כן, חשוב לקחת בחשבון כי הבחירה של סמני פני השטח יכול להיות שונה בהתאם לצרכים של הקבוצה המבצעת אותו; לדוגמה, אם בתכנון הניסוי מאמינים שניתן להפחית את ביטוי CD11b על תאי B1, מומלץ להוסיף סמנים שונים, כגון IgM, IgD ו- CD537.
שים לב שייתכן שיהיה צורך לעבד לב רק כדי להפעיל בקרות פיצוי עבור ציטומטריה של זרימה. זה מומלץ בפעם הראשונה שהניסוי ממוטב. בניסויים הבאים, שמירת רקמה מסוימת ברגע איסוף הלב יכולה להספיק, מכיוון שהיא תספק מספיק תאים כדי להפעיל בקרה שלילית "לא מוכתמת" ובקרת כתמים חיובית "חיים-מתים". ניתן לייבא פקדים בודדים עבור הצבעים האחרים מניסויים קודמים או ליצור באמצעות חרוזים.
ניתן לשנות כמה שלבים בפרוטוקול מבלי לשנות את תוצאות הניסוי. לדוגמה, ניתן לשנות את שיטת ההרדמה לשיטת ההרדמה המועדפת בהתאם לניסיונו של החוקר; השימוש באיזופלוראן במקום 2,2,2-טריברומואתנול יכול להפחית את הזמן המושקע בין מתן הרדמה לאיסוף הלב. כמו כן, הזלפת הלב יכולה להיעשות באופן ידני ללא שימוש במשאבת מזרק כל עוד היא מבוצעת לאט, בעדינות ובעקביות.
למרות הביצוע המדויק של הפרוטוקול, מפעילים לא מנוסים עלולים להיתקל בשונות גבוהה בין דגימות בתוך אותה ישיבה ניסיונית או בין מפגשים ניסיוניים שונים. בהתבסס על ניסיון, השתנות זו נעלמת ברגע שלמדען הייתה הזדמנות להכיר היטב את זרימת העבודה. לפיכך, מומלץ לכל מי שרוצה ליישם פרוטוקול זה להעריך את יכולת השחזור שלו בשתיים עד שלוש ריצות ניסוי לפני שהוא אוסף נתונים חיוניים על פרויקטי המחקר שלו.
לסיכום, השיטות הקיימות לבידוד תאי מערכת החיסון מהלב וניתוחם באמצעות ציטומטריה של זרימה בדרך כלל אינן מתחשבות ביכולתם של תאי מערכת החיסון להיצמד לאנדותל, ואינן מתקננות את הזלוף או מיישמות פרפוזיה נרחבת, מתוך הנחה שכל תא חיסוני במרחב התוך-וסקולרי הוא מזהם שיש לטהר. זה מתעלם מהרעיון שלתאי מערכת החיסון התוך-וסקולרית שנדבקו לאנדותל יש רלוונטיות ביולוגית. הפרוטוקול המוצג כאן עבר אופטימיזציה כדי למקסם את ההתאוששות של תאי מערכת החיסון שריר הלב עם תשומת לב ספציפית לתאי B שריר הלב, תוך-כלי דם וחוץ-וסקולריים. אנו מצפים שפרוטוקול זה יעניין את כל אותם מדענים שעובדים בתחום האימונולוגיה של הלב ומעוניינים לחקור את הפונקציה שתאי B עשויים למלא בלבבות בריאים ופצועים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לואיג'י אדמו הוא מייסד שותף של i-Cordis, LLC, חברה המתמקדת בפיתוח מולקולות אימונומודולטוריות לטיפול באי ספיקת לב, עם עניין ספציפי בנגזרות של התרופה המווסתת תאי B pirfenidone. לשאר המחברים אין קונפליקטים להצהיר.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי מענקי NHLBI 5K08HLO145108-03 ו- 1R01HL160716-01 שהוענקו ללואיג'י אדמו.
ציטומטר זרימת אורורה ששימש לפיתוח מחקר זה מומן על ידי NIH Grant S10OD026859. אנו מכירים בתמיכתה של ליבת הציטומטריה של זרימת JHU Ross.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
| (CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
| 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
| 10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
| 1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
| 15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
| 1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
| 3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
| Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
| Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
| Anesthesia Induction Chamber - Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
| CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
| Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
| Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
| Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
| Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
| Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
| DNase I - 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Easypet 3 - Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
| Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
| FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
| GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
| HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
| Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
| Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
| Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
| Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
| R 4.1.1 | The R Foundation | ||
| Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
| Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
| Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
| Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
| SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
| Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
| Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
| Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
| Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
| Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
References
- Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease. Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).
- Gowans, J. L., Knight, E. J. The route of re-circulation of lymphocytes in the rat. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).
- Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes. Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).
- Tanaka, T., et al. Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).
- Rocha-Resende, C., et al. Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs. JCI Insight. 5 (16), (2020).
- Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).
- Adamo, L., et al. Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury. JCI Insight. 3 (11), (2018).
- Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).
- Zouggari, Y., et al. B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction. Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).
- Wu, L., et al. IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).
- Heinrichs, M., et al. The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).
- Sun, Y., et al. Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice. Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).
- Yan, X., et al. Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).
- Iwata, M., et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo. Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).
- Jahns, R., et al. Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy. The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).
- Christ, T., et al. Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).
- Jane-wit, D., et al. Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis. Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).
- Ludwig, R. J., et al. Mechanisms of autoantibody-induced pathology. Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).
- Haudek, S. B., et al. Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).
- Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).
- Zhang, M., et al. The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).
- Zhang, M., et al. Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).
- Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function. Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).
- Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy. The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).
- Caforio, A. L. P., et al. Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Horckmans, M., et al. Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction. Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens. Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
- Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. B-1 B cell development in the fetus and adult. Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).
- Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure. Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).
- Zhao, T. X., et al. Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study. Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).
- Kushnir, N., et al. B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice. Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).
