Summary
Qui riportiamo un protocollo per la quantificazione e la differenziazione dei linfociti B miocardici in base alla loro posizione nello spazio intravascolare o endoteliale utilizzando la citometria a flusso.
Abstract
Un numero crescente di prove dimostra che i linfociti B svolgono un ruolo importante nel contesto della fisiologia miocardica e dell'adattamento miocardico alle lesioni. Tuttavia, la letteratura riporta dati contrastanti sulla prevalenza delle cellule B del miocardio. È stato riportato che le cellule B sono tra le cellule immunitarie più diffuse nel cuore dei roditori o per essere presenti, ma con una prevalenza marcatamente inferiore rispetto alle cellule mieloidi, o per essere piuttosto rare. Allo stesso modo, diversi gruppi hanno descritto che il numero di cellule B miocardiche aumenta dopo il danno miocardico ischemico acuto, ma un gruppo non ha riportato cambiamenti nel numero di cellule B del miocardio danneggiato. L'implementazione di un metodo condiviso e riproducibile per valutare la prevalenza delle cellule B miocardiche è fondamentale per armonizzare le osservazioni di diversi gruppi di ricerca e quindi promuovere l'avanzamento dello studio delle interazioni miocardiche a cellule B. Sulla base della nostra esperienza, le osservazioni apparentemente contrastanti riportate in letteratura derivano probabilmente dal fatto che le cellule B miocardiche murine sono per lo più intravascolari e collegate all'endotelio microvascolare. Pertanto, il numero di cellule B recuperate da un cuore murino è squisitamente sensibile alle condizioni di perfusione utilizzate per pulire l'organo e al metodo di digestione utilizzato. Qui riportiamo un protocollo ottimizzato che tiene conto di queste due variabili critiche in modo specifico. Questo protocollo consente l'analisi riproducibile basata sulla citometria a flusso del numero di cellule B miocardiche murine e consente ai ricercatori di distinguere le cellule B miocardiche extravascolari da quelle intravascolari.
Introduction
I linfociti B sono cellule immunitarie altamente specializzate che svolgono un ruolo importante nelle risposte immunitarie adattative e innate1. Ci sono due popolazioni principali di cellule B: una popolazione più piccola di cellule B1 che sono per lo più prodotte durante la vita embrionale e una popolazione preponderante di cellule B2 che vengono prodotte nella vita adulta nel midollo osseo1. Dopo la maturazione nel midollo osseo, le cellule B migrano verso gli organi linfoidi primari e secondari. Da lì ricircolano continuamente tra gli organi linfoidi che viaggiano attraverso i vasi sanguigni e i vasi linfatici2. Le cellule B esprimono anticorpi specifici sulla loro superficie, che funzionano come recettori. Quando le cellule B incontrano un antigene che si lega al loro recettore, può essere attivato un segnale di attivazione. Le cellule B attivate migrano verso il tessuto in cui è stato trovato l'antigene o tornano al midollo osseo dove possono maturare in plasmacellule produttrici di anticorpi 3,4.
Recentemente, è stato apprezzato che il cuore ospita una considerevole popolazione di cellule B. Studi su roditori hanno dimostrato che le cellule B colonizzano il cuore precocemente durante lo sviluppo embrionale5 e che le cellule B associate al miocardio sono per lo più cellule B2 intravascolari e naïve che aderiscono all'endotelio6,7, con una piccola percentuale di cellule B17. Ci sono ancora molte aree di incertezza, ma i dati disponibili indicano che le cellule B svolgono un ruolo importante sia nel cuore naïve che nel contesto dell'adattamento miocardico alle lesioni.
Studi sul cuore murino naïve hanno dimostrato che al basale le cellule B miocardiche si trovano principalmente nello spazio intravascolare, aderenti all'endotelio (>95% delle cellule B cardiache murine sono risultate localizzate nello spazio intravascolare). Queste cellule B sono risultate avere modelli di espressione genica diversi da quelli delle cellule B circolanti isolate dal sangue periferico. L'analisi dei cuori naïve di animali carenti di cellule B e i controlli singeneici hanno rilevato che gli animali privi di cellule B avevano cuori più piccoli e una frazione di eiezione più elevata6. Tutte queste evidenze suggeriscono che le cellule B potrebbero modulare la crescita miocardica e/o la funzione miocardica e che non solo le cellule B interstiziali ma anche intravascolari potrebbero essere responsabili di tali osservazioni. È stato anche scoperto che le cellule B modulano il fenotipo dei macrofagi residenti nel miocardio8.
Diversi studi hanno dimostrato che le cellule B svolgono un ruolo importante nel contesto dell'adattamento miocardico alle lesioni 8,9,10,11,12,13. Le cellule B si accumulano transitoriamente nel cuore danneggiato, probabilmente attraverso un meccanismo CXCL13-CXCR5 dipendente11,13. Da lì, le cellule B promuovono il rimodellamento cardiaco avverso attraverso diversi meccanismi che includono il reclutamento di monociti mediati da citochine 9,12. Inoltre, le cellule B possono produrre anticorpi contro le proteine cardiache che possono promuovere l'estensione del danno cardiaco e il rimodellamento cardiaco avverso attraverso diversi meccanismi 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . Le cellule B possono anche esercitare effetti protettivi sul cuore ferito attraverso la secrezione di IL-1010.
Man mano che cresce il numero di gruppi che studiano il ruolo delle cellule B nel cuore naïve e ferito, sta diventando sempre più importante definire protocolli condivisi per quantificare e valutare correttamente le cellule B del miocardio ed evitare così incongruenze che hanno già iniziato a comparire in letteratura. Finora le cellule B sono state infatti entrambe riportate come una delle cellule immunitarie più diffuse nel cuore dei roditori7 e per essere presenti con una prevalenza marcatamente inferiore rispetto alle cellule mieloidi26,27, o per essere piuttosto rare 28. Allo stesso modo, diversi gruppi hanno descritto che il numero di cellule B miocardiche aumenta dopo danno miocardico ischemico acuto 7,9,13, ma un gruppo non ha riportato cambiamenti nel numero di cellule B del miocardio danneggiato29. Gli studi sulle cellule immunitarie cardiache raramente forniscono dettagli sulle condizioni di perfusione e non vi è consenso sulle condizioni di digestione. Poiché nel cuore dei roditori una grande percentuale di cellule B sono intravascolari e l'estrazione delle cellule immunitarie dal miocardio dipende fortemente dal metodo di digestione utilizzato, le differenze riportate in letteratura potrebbero essere il risultato di differenze nella perfusione d'organo e nella digestione dei tessuti.
Presentato qui è un metodo dettagliato per la quantificazione basata sulla citometria a flusso delle cellule B miocardiche murine che massimizza la resa del recupero delle cellule B ottimizzando le condizioni di perfusione e digestione e consente la discriminazionedelle cellule B miocardiche intravascolari rispetto a quelle extravascolari 6. Questo protocollo è un adattamento e un'ottimizzazione di altri protocolli simili che distinguono tra cellule immunitarie intravascolari e interstiziali 28,30,31.
In questo protocollo, standardizziamo la perfusione miocardica per eliminare le cellule B che galleggiano nello spazio intravascolare senza rimuovere le cellule B biologicamente rilevanti che aderiscono all'endotelio microvascolare. Inoltre, basandosi su protocolli precedenti che hanno descritto l'uso dell'iniezione endovenosa di anticorpi per distinguere le cellule immunitarie intravascolari da quelle interstiziali32, e sfruttando il fatto che le cellule B esprimono il marcatore di superficie B22033, dimostriamo come distinguere le cellule B miocardiche intravascolari da quelle extravascolari attraverso l'iniezione intravascolare di un anticorpo specifico B220 immediatamente prima del sacrificio animale e della perfusione cardiaca. Questo protocollo è rilevante per la ricerca di qualsiasi scienziato interessato a includere l'analisi delle cellule B miocardiche nel cuore naïve e ferito. L'implementazione diffusa di questo protocollo ridurrà le incongruenze tra i gruppi di ricerca, consentirà l'analisi dei cambiamenti nei pool di cellule B miocardiche intravascolari ed extravascolari e quindi rafforzerà il progresso delle scoperte nel campo dell'immunologia cardiaca.
In sintesi, il protocollo rappresenta un flusso di lavoro ottimizzato per quantificare e analizzare le cellule B del miocardio tramite citometria a flusso e allo stesso tempo distinguere tra cellule situate nello spazio extravascolare e nello spazio intravascolare.
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Protocol
Tutti gli esperimenti descritti in questo manoscritto sono stati eseguiti con l'approvazione della IACUC presso la Johns Hopkins University School of Medicine.
1. Preparativi
- Preparare il buffer FACS, come descritto nella tabella 1.
- Assicurati che ci sia abbastanza CO2 per l'eutanasia degli animali.
- Preparare lo spazio di dissezione (posizionare il cuscinetto da banco e posizionare il nastro e gli strumenti di dissezione nelle vicinanze).
- Etichettare i tubi da 15 ml, mettere 3 ml di HBSS con calcio e magnesio in ogni provetta (vedere Tabella dei materiali) e posizionarli su ghiaccio (un tubo per cuore e uno extra per il gruppo di riferimento / controlli di citometria a flusso). Inoltre, riempire le piccole piastre di Petri (35 mm) con HBSS.
- Accendere lo shaker a temperatura controllata, impostarlo a 37 °C e preraffreddare la centrifuga a una temperatura di 4 °C.
- Preparare la pompa a siringa e impostare la portata a 3 ml/min. Riempire una siringa da 20 mL con HBSS, adescare la tuberia con tampone e rimuovere eventuali bolle.
2. Colorazione intravascolare delle cellule B (in vivo)
- Pesare un topo maschio di 12 settimane del ceppo C57BL/6J. Caricare una siringa da insulina da 3/10 cc con 100 μL di diluizione anticorpale B220 (1:10, in PBS). Coprire la siringa con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce.
- Anestetizzare un mouse.
- Applicare un'iniezione intraperitoneale del 2% di 2,2,2-tribromoetanolo con una dose di 400 mg/kg e attendere 10-20 min.
NOTA: monitorare la respirazione e il movimento del mouse. Una volta che il topo smette di muoversi, stimolare il dolore pizzicando la punta; L'assenza di un riflesso di sospensione indica un'anestesia adeguata. - Se non si ottiene un'anestesia adeguata nel corso di 20 minuti, può essere somministrata una dose aggiuntiva di anestetico a 100 mg/kg e ogni 5 minuti deve essere effettuata una valutazione della cinetica del topo, del riflesso di ritiro e della respirazione.
- Applicare un'iniezione intraperitoneale del 2% di 2,2,2-tribromoetanolo con una dose di 400 mg/kg e attendere 10-20 min.
- Posizionare il mouse sul banco da laboratorio su un tappetino inclinato verso un lato, tirare delicatamente verso il basso la pelle della schiena e premere leggermente il corpo contro la panca per far sporgere l'occhio.
- Iniettare l'anticorpo B220 diluito dal punto 2.1 mediante iniezione retroorbitale.
- Introdurre la siringa nell'occhio a 45° dal piano sagittale della testa del topo. Iniettare lentamente la soluzione. Se si avverte resistenza, rimuovere la siringa ed entrare di nuovo. Attendere 2 min.
NOTA: Il tempo di incubazione prolungato metterebbe a repentaglio la capacità di discriminare le cellule B intra-vascolari rispetto a quelle extra-vascolari in quanto darebbe il tempo all'anticorpo iniettato di diffondersi al di fuori della vascolarizzazione.
- Introdurre la siringa nell'occhio a 45° dal piano sagittale della testa del topo. Iniettare lentamente la soluzione. Se si avverte resistenza, rimuovere la siringa ed entrare di nuovo. Attendere 2 min.
- Eutanasia del mouse secondo i regolamenti IACUC.
- Aprire il flusso di CO2 nella camera di eutanasia a una velocità di 0,5 L / min, o la portata consigliata in base alle dimensioni della camera.
- Posizionare il mouse nella camera per il tempo consigliato, assicurandosi che non respiri più. Rimuoverlo ed eseguire la dislocazione cervicale come metodo secondario di eutanasia.
- Una volta che il topo è stato eutanasiato, procedere prontamente al prelievo di organi e alla perfusione.
3. Raccolta del cuore
- Apertura del torace.
- Tenere la pelle del topo con una pinza nella zona epigastrica. Fai un'apertura di 2 mm nella pelle usando le forbici e usa la pinza per staccare la pelle per rivelare lo strato di fascia, uno strato traslucido lucido, del torace e dell'addome. Tagliare all'epigastrio attraverso la fascia e il peritoneo per aprire la parete addominale e rivelare il processo xifoideo. Bloccare il processo xifoideo usando una pinza emostatica.
- Con le forbici, effettuare un taglio verticale attraverso la parete toracica a livello della linea medio-clavicolare su ciascun lato e sollevare la parete toracica anteriore per rivelare il contenuto di mediastino, usando una pinza emostatica come peso per mantenere l'apertura.
- Perfusione ed estrazione cardiaca.
- Usando una pinza, rimuovere qualsiasi tessuto grasso o timico che circonda il cuore.
- Tenere saldamente l'aorta da dietro usando una pinza. Introdurre l'ago della siringa (25 G) nell'apice del cuore. Perfondere con 3 mL di HBSS alla velocità di 3 mL/min.
NOTA: monitorare la perfusione. Il fegato dovrebbe riempirsi e il sangue nei vasi coronarici dovrebbe essere completamente rimosso. Si consiglia l'uso di una pompa a siringa calibrata a 1 mL/minuto per mantenere un flusso costante. - Tagliare l'aorta usando le forbici e togliere il cuore. Lavare il cuore nella capsula di Petri con HBSS per rimuovere il sangue residuo. Usando forbici e pinze, rimuovere il grasso, il tessuto connettivo e il timo e asciugare il cuore. Pesare il cuore isolato e annotare il peso in milligrammi. Tritare il cuore a temperatura ambiente in piccoli pezzi (1-2 mm) con una lama.
NOTA: I cuori di topo adulti possono pesare tra 0,090-0,210 mg. - Misurare la massa del tessuto cardiaco e posizionare 60 mg di cuore tritato da digerire in un tubo da 15 ml con 3 ml di HBSS. Conservare il tessuto cardiaco rimanente e metterlo in un tubo etichettato "Tessuto di controllo di riferimento"; Questo sarà utilizzato per il controllo della compensazione per il segnale vivo-morto e l'autofluorescenza.
4. Digestione del cuore e colorazione cellulare
- Aggiungere enzimi a ciascuna provetta contenente tessuto tritato (vedere Tabella 1). Aggiungere 0,5 μL/mg di DNasi 1 (300 Unità per 60 mg di tessuto cardiaco), 0,5 μL/mg di collagenasi II (625 Unità per 60 mg di tessuto cardiaco) e 0,2 μL/mg di ialuronidasi (50 Unità per 60 mg di tessuto cardiaco) al tubo.
- Posizionare la reazione di digestione nello shaker per 30 minuti a 300 giri/min. Regolare la cremagliera dell'agitatore a circa 25° di inclinazione.
- Aggiungere 7 mL di HBSS a ciascuna delle provette di reazione da 15 mL e centrifugare a 250 x g per 5 minuti a 4 °C con accelerazione e rottura impostate su moderate o lente. Decantare il surnatante e risospendere ogni pellet in 5 ml di tampone di lisi ACK per rimuovere i globuli rossi. Incubare nel tampone di lisi ACK per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 10 ml di PBS a ciascun tubo, miscelare e quindi filtrare in un tubo da 50 ml con un filtro da 40 μm. Assicurarsi che tutti i detriti siano all'interno della camera del filtro. Rompere eventuali detriti sul filtro con uno stantuffo della siringa fino a quando non è completamente sospeso all'interno della camera del filtro.
- Aggiungere PBS attraverso il filtro fino a quando il volume raggiunge 25 ml per cuore; Ciò consentirà alle celle sospese di passare attraverso il filtro. Aggiungere altri 25 ml di PBS al tubo tissutale di controllo di riferimento e dividere il volume in diversi tubi (25 ml ciascuno). Etichetta uno dei tubi "Non macchiato" e l'altro come "Morto vivo". Centrifugare a 250 x g per 5 minuti a 4 °C.
NOTA: A questo punto, preparare la diluizione per la colorazione viva morta (diluizione: 1:500 in 1x PBS). - Decantare il surnatante, risospendere il pellet nel tubo non colorato in 100 μL di PBS e ciascuno degli altri pellet in 100 μL della diluizione della macchia morta viva. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti al buio, coprendo il secchiello del ghiaccio con un foglio di alluminio.
- Aggiungere 500 μL di tampone FACS a ciascun campione e trasferirlo in una provetta FACS marcata attraverso un filtro da 40 μm. Centrifugare le provette FACS a 250 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 500 μL di tampone FACS.
- Aggiungere 50 μL di soluzione bloccante Fc (vedere Tabella 1) a ciascun tubo, ad eccezione dei tubi non colorati e vivi. Mescolare e incubare per 5 min.
- Aggiungere 50 μL di soluzione di miscela anticorpale (vedere Tabella 1) a ciascuna provetta, ad eccezione delle provette non colorate e morte vive, e incubare per 30 minuti al buio, coprendo il secchiello del ghiaccio con un foglio di alluminio.
- Aggiungere 2 mL di tampone FACS a ciascuna provetta e centrifugare a 250 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risospendere in 300-500 μL di tampone FACS.
5. Citometria a flusso
- Impostare le impostazioni di controllo dello strumento.
NOTA: In questo protocollo il campione viene analizzato con un citometro a flusso Cytek Aurora a 4 laser. Un altro citometro a flusso appropriato potrebbe essere utilizzato per rilevare i marcatori di interesse.- Aprire il software di controllo dello strumento (vedere Tabella dei materiali). Nella parte superiore della finestra, seleziona la scheda Acquisizione e fai clic su Nuovo +. Verrà visualizzata una finestra chiamata Crea nuovo esperimento .
- Nella sezione Libreria, nel campo Tipo da filtrare, digitare PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 e Zombie Aqua, facendo clic su Aggiungi dopo aver digitato ciascuno di essi. I nomi dei fluorofori dovrebbero essere visti a destra. Quindi fare clic su Avanti per passare alla scheda Gruppo .
- Nella scheda Raggruppa , fate clic sul simbolo con un tubo per aggiungere il cuore per l'analisi.
- Fare clic sul gruppo + Riferimento e verrà visualizzata una finestra. Nella colonna dei tag fluorescenti selezionare Zombie Aqua, quindi nella colonna Tipo di controllo selezionare Celle, quindi fare clic su Salva.
- Fare clic sulla scheda Marcatori > successivo ; Verrà visualizzata una tabella con i nomi dei fluorofori. Digitare il marcatore di cella corrispondente nella prima riga di ogni colonna di fluoroforo e digitare Enter: CD45 per PerCP-Cy5.5; CD19 per BV421; CD11b per Alexa Fluor 700; B220 per PE; e morti vivi per Zombie Aqua.
- Fare clic su Avanti due volte per passare alla scheda Acquisizione . In Eventi da registrare del gruppo di esperimenti digitare 10.000.000 e nello stesso campo per la riga del gruppo di riferimento digitare 200.000. Fai clic su Salva e apri. Le altre impostazioni devono rimanere invariate, Tempo di arresto a 10.000 e Volume di arresto a 3.000.
- In basso a sinistra fare clic su Controllo strumento. Impostare la tensione su FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. Quindi, selezionare Controllo acquisizione. Per l'opzione Portata , selezionare Alta dal menu a discesa.
- Acquisire campioni di riferimento con un citometro e rimuovere il software.
- Vortice il tubo cardiaco non colorato e posizionarlo saldamente sulla porta di iniezione del campione (SIP). Assicurarsi che la freccia dell'indicatore verde punti al campione corretto, quindi fare clic su Avvia nel pannello Controllo acquisizione del software del citometro e attendere che gli eventi vengano registrati. Fai lo stesso per il tessuto cardiaco macchiato di morti vivi.
- Selezionare il menu Unmix e impostare i seguenti controlli:
- Seleziona le caselle di controllo PE, PerCP-Cy5.5, BV421 e Alexa Fluor 700 nella colonna della libreria. Assicurati che Zombie Aqua sia deselezionato nella stessa colonna. In basso, seleziona l'opzione di Autofluorescenza come tag fluorescente.
- Fare clic su Avanti per passare alla scheda Identifica popolazioni positive/negative . In questa scheda verrà visualizzato un grafico di FSC-A e SSC-B-A. Fare clic e trascinare i punti del poligono per selezionare un'area compresa tra 1,0 M e 4,0 M sull'asse FSC-A e tra 0,2 M e 3,0 M sull'asse SSC-B-A.
- Nel grafico successivo a destra, V5-A verrà visualizzato sull'asse X. Sposta le porte per selezionare metà del picco all'estrema destra come positivo e una regione sul lato sinistro del grafico come negativo. Nel grafico intitolato Gruppo di riferimento - Non macchiato, selezionare una popolazione in un intervallo simile. Per questo non macchiato non deve essere impostato alcun positivo-negativo.
- Acquisire campioni sperimentali.
- Per ogni provetta contenente un campione per un singolo topo, vortice la provetta e posizionarla saldamente sul SIP. Assicurarsi che la freccia dell'indicatore verde punti al campione corretto, quindi fare clic su Avvia nel pannello Controllo acquisizione del software del citometro e attendere che gli eventi vengano registrati.
- Strategia di gateing.
- Selezionare la scheda Foglio di lavoro non misto predefinito . Creare un grafico FSC-A rispetto a SSC-A utilizzando lo strumento Dot plot in alto. Selezionare eventi superiori a 0,4 M sull'asse FSC-A e superiori a 0,8 M sull'asse SSC-A utilizzando lo strumento di selezione Poligono. Fare doppio clic in questa selezione e verrà visualizzato un nuovo grafico.
- Dal grafico appena creato, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'etichetta dell'asse X e selezionare AF-A; fare clic con il pulsante destro del mouse sull'etichetta dell'asse Y e selezionare Colorazione morta in tempo reale. Fare clic sullo strumento di selezione del rettangolo in alto e selezionare tutti gli eventi inferiori a 105 sull'asse vivi-morti che corrispondono al segnale inferiore vivo-morto. Fare doppio clic in questa selezione e verrà visualizzato un nuovo grafico.
- Nel nuovo plottaggio, fate clic con il pulsante destro del mouse per selezionare PerCP-Cy5.5-A per l'asse X e SSC-A per l'asse Y. Utilizzando lo strumento di selezione Rettangolo, selezionate gli eventi superiori a 104 sull'asse PerCP-Cy5.5-A che corrispondono alle celle CD45 positive. Fare doppio clic sulla selezione e verrà visualizzato un nuovo grafico.
- Nel nuovo plottaggio, fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare FSC-A per l'asse X e FSC-H per l'asse Y. Utilizzando lo strumento di selezione poligono selezionare gli eventi che seguono una tendenza in cui il valore FSC-A e il valore SSC-A sono uguali; con questo i doppietti cellulari verranno rimossi e la popolazione nella selezione sarà indicata come popolazione CD45+. Fare doppio clic sulla selezione per visualizzare un nuovo grafico con la popolazione CD45+.
- Dal grafico della popolazione CD45+, fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare BV421 sull'asse X rispetto a SSC-A sull'asse Y. Utilizzando lo strumento di selezione poligono, selezionate la popolazione a destra sull'asse BV421 . Questa è la popolazione di cellule B. Fare doppio clic due volte in questa popolazione per creare due nuovi grafici con la popolazione di cellule B.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse per impostare il primo plottaggio a celle B con PE-A sull'asse X e BV421-A sull'asse Y. La popolazione a destra corrisponde alle cellule B intravascolari e la popolazione a sinistra rappresenta le cellule B interstiziali. Utilizzare lo strumento di selezione poligono per selezionare entrambi.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse per impostare il secondo plottaggio delle celle B con Alexa Fluor 700-A sull'asse X e SSC-A sull'asse Y. La popolazione a sinistra corrisponde alle cellule CD11b- e gli eventi a destra (se presenti) corrispondono alle cellule CD11b+.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse su ciascuna selezione, quindi fare clic su Proprietà gate. Fare clic su Conteggio e % genitore per visualizzare le dimensioni e le percentuali. Registrare il numero di eventi e le percentuali per ulteriori analisi dei dati.
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Representative Results
Una volta completata l'acquisizione e raccolti tutti gli eventi, i dati devono essere analizzati secondo la pratica standard della citometria a flusso. Il focus dell'analisi varierà a seconda dell'obiettivo individuale di ciascun esperimento. In questo caso, è stata perseguita la quantificazione delle cellule B intravascolari ed extravascolari ed è stata espressa come numero di cellule per mg di tessuto.
Quando si utilizza un citometro spettrale, si consiglia di iniziare l'analisi con un gating iniziale per rimuovere detriti con dimensioni che non sono in un intervallo corrispondente alle cellule immunitarie, seguito dalla rimozione del segnale macchia + vivo-morto. Ciò consente di rilevare una popolazione pulita di cellule CD45 positive corrispondenti ai leucociti (Figura 1). Dopo la rimozione dei doppietti, in un cuore ingenuo non ferito, si prevede che circa il 20% delle cellule CD45+ saranno cellule B CD19+ (Figura 2A, 18,1% di cellule B in questo esperimento rappresentativo). Di queste cellule, in media il 5,5% si trova nello spazio interstiziale, mentre il 94,5% si trova nello spazio intravascolare (Figura 2B). Dell'intera popolazione di cellule B presente nel cuore, solo circa l'1,6% corrisponde alle cellule B1 in base al marcatore di superficie CD11b (che è tipicamente considerato sufficiente per classificare una cellula CD19+ murina come cellula B1 con un alto grado di confidenza 1,34,35), e l'altro 98,4% corrisponde alle cellule B2 (Figura 2C).
Figura 1: Strategia di gating della citometria a flusso utilizzata per rilevare e caratterizzare le cellule B associate al miocardio. (A) FSC-A vs. SSC-A: Il grafico mostra tutti gli eventi raccolti e l'area selezionata viene disegnata per arricchire l'analisi con eventi che si trovano nell'intervallo di dimensioni dei leucociti. (B) Autofluorescenza vs. colorazione vivi-morti: l'area selezionata corrisponde al segnale inferiore vivo-morto. Il cancello disegnato rimuove le cellule morte e alcuni altri detriti cellulari che si legano alla colorazione dei morti vivi. (C) Segnale CD45 vs. SSC-A: l'area selezionata corrisponde alle cellule CD45+ (cioè ai leucociti miocardici). (D) FSC-A vs. FSC-H: questa porta viene disegnata per rimuovere i doppietti delle celle (eventi non selezionati). (E) Segnale CD19 vs. SSC-A: l'area selezionata corrisponde alle cellule B del miocardio. (F) B220 vs. CD19: L'area all'interno del quadrato nero corrisponde alle cellule B intramiocardiche (CD19+, B220-), e l'area all'interno del quadrato rosso corrisponde alla popolazione intravascolare di cellule B. (G) CD11b vs. SSC-A: l'area all'interno del cerchio nero corrisponde al CD11b+ (cellule B1) e l'area all'interno del cerchio rosso corrisponde alle cellule CD11b- (B2). Le percentuali visualizzate su ciascun pannello rappresentano la percentuale media rappresentata dalla popolazione visualizzata rispetto alla popolazione parentale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Grafici rappresentativi che riportano il numero medio di cellule B per milligrammo di tessuto miocardico . (A) Numero medio di cellule CD45+ e CD19+/mg di tessuto miocardico murino. La percentuale visualizzata corrisponde alla percentuale di cellule della popolazione parentale (CD45+). (B) Numero medio di cellule CD19+ e percentuale di cellule B che si trovano nello spazio interstiziale (extravascolare) degli spazi intravascolari. (C) Numero assoluto e percentuale di cellule B miocardiche che esprimono marcatori di cellule B1 o B2. Le barre di errore corrispondono all'errore standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella 1: Questa tabella contiene le soluzioni e i reagenti necessari per la procedura. Clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Un numero crescente di evidenze indica che le cellule B svolgono un ruolo importante nel contesto della fisiologia miocardica e del rimodellamento/adattamento miocardico alle lesioni 7,8,9,10,11,12,13,36. La citometria a flusso è uno strumento eccellente per studiare le popolazioni di cellule immunitarie in qualsiasi tessuto e quasi uno strumento obbligatorio per qualsiasi studio che si concentra sulle cellule B nel cuore.
La letteratura emergente sulle cellule B e sul cuore riporta già risultati contrastanti su aspetti molto basilari, come il numero di cellule B nel cuore e i cambiamenti nel numero di cellule B miocardiche con lesioni. Le cellule B sono state segnalate come la cellula immunitaria più diffusa nei cuori dei roditori7. Tuttavia, altri studi hanno valutato la loro prevalenza relativa rispetto ad altre cellule mieloidi e hanno mostrato numeri marcatamente inferiori26,27. Pinto et al.26 hanno scoperto che le cellule B comprendevano circa il 9% dei leucociti totali, mentre Yu et al.27 hanno riportato il 10%. Adamo et al.7 hanno riferito che la percentuale media di cellule B rispetto al numero di leucociti era di circa il 20%, che è molto vicino al 18,1% riportato in questo manoscritto. Altri studi hanno riportato che le cellule B hanno una prevalenza molto bassa nel miocardio28.
Diversi passaggi sperimentali critici potrebbero spiegare le variabilità nel numero di cellule B riportate in letteratura. Vale a dire, le differenze nella perfusione del cuore, nella macinazione dei tessuti e nella digestione possono influenzare significativamente il numero di cellule B recuperate per mg di tessuto cardiaco. La perfusione con tamponi contenenti agenti chelanti del calcio e senza calcio, o la perfusione con un volume o un tasso di perfusione più elevato, potrebbe staccare le cellule B attaccate all'endotelio e ridurre la resa di recupero. Una macinazione eccessiva dei tessuti potrebbe portare a un'eccessiva digestione del tessuto e alla perdita di vitalità cellulare. Una riduzione della vitalità cellulare potrebbe anche essere il risultato della digestione per un tempo prolungato o con concentrazioni enzimatiche più elevate.
La percentuale di cellule CD45+ che corrispondono alle cellule B potrebbe essere compresa tra il 15% e il 30% in un topo wild-type. A seconda del ceppo di topo utilizzato, dell'età e del background genetico, questo valore può variare. Tuttavia, la percentuale dovrebbe rimanere simile nel gruppo studiato. Una grande variabilità nel numero e nella percentuale di cellule B tra topi appartenenti allo stesso gruppo suggerisce che potrebbe verificarsi un errore sperimentale. Basse percentuali potrebbero indicare un eccesso nella forza di perfusione e nel tempo. La riduzione globale delle cellule CD45+ potrebbe indicare che il tessuto viene sovra-digerito.
Il protocollo qui descritto è stato ottimizzato per fornire una resa costante di cellule B dal cuore murino digerito e per consentire la discriminazione delle cellule B intravascolari rispetto a quelle extravascolari6. La discriminazione delle cellule B intravascolari rispetto a quelle extravascolari si ottiene tramite iniezione intravascolare di un anticorpo immediatamente prima del sacrificio. L'anticorpo iniettato per via intravascolare si diffonde facilmente in tutta la vascolarizzazione e incontra tutte le cellule B intravascolari. Se l'animale viene sacrificato abbastanza presto e il cuore viene prontamente raccolto, l'anticorpo non ha il tempo di diffondersi nello spazio extravascolare e colorare le cellule B extravascolari. Poiché il tempo tra l'iniezione intravascolare dell'anticorpo e il prelievo di organi è critico, si raccomanda di inoculare con l'anticorpo e raccogliere un singolo cuore di topo alla volta. L'iniezione intravascolare di anticorpi può essere omessa se la discriminazione delle cellule B intravascolari rispetto a quelle extravascolari non è di interesse. La strategia di gating mostrata nella Figura 1 rimarrebbe la stessa ad eccezione dell'ultimo passaggio, che non sarebbe possibile a causa della mancanza di etichettatura B220. A seconda del design sperimentale, qualsiasi fluoroforo dal pannello mostrato può essere modificato in un colore che si adatta al pannello utilizzato. Inoltre, è importante considerare che la selezione dei marcatori di superficie potrebbe essere modificata in base alle esigenze del gruppo che la esegue; ad esempio, se nel disegno sperimentale si ritiene che l'espressione di CD11b sulle cellule B1 possa essere ridotta, si raccomanda l'aggiunta di diversi marcatori, come IgM, IgD e CD537.
Si prega di notare che potrebbe essere necessario elaborare un cuore solo per eseguire controlli di compensazione per la citometria a flusso. Questa operazione è consigliata la prima volta che l'esperimento viene ottimizzato. Nei seguenti esperimenti, il salvataggio di alcuni tessuti al momento della raccolta del cuore potrebbe essere sufficiente, in quanto fornirebbe cellule sufficienti per eseguire un controllo negativo "non macchiato" e un controllo positivo della macchia "vivo-morto". I singoli controlli per gli altri colori potevano essere importati da esperimenti precedenti o generati utilizzando perline.
Alcuni passaggi del protocollo possono essere modificati senza alterare i risultati dell'esperimento. Ad esempio, il metodo di anestesia potrebbe essere cambiato per uno preferito a seconda dell'esperienza del ricercatore; L'uso di isoflurano invece di 2,2,2-tribromoetanolo potrebbe ridurre il tempo trascorso tra la somministrazione dell'anestesia e la raccolta cardiaca. Inoltre, la perfusione del cuore potrebbe essere eseguita manualmente senza l'uso di una pompa a siringa purché venga eseguita lentamente, delicatamente e costantemente.
Nonostante l'accurata esecuzione del protocollo, operatori inesperti potrebbero riscontrare un'elevata variabilità tra campioni all'interno della stessa sessione sperimentale o tra diverse sessioni sperimentali. Sulla base dell'esperienza, questa variabilità scompare una volta che lo scienziato ha avuto l'opportunità di acquisire piena familiarità con il flusso di lavoro. Si raccomanda pertanto a chiunque voglia implementare questo protocollo di valutarne la riproducibilità in due o tre prove prima di raccogliere dati cruciali sui propri progetti di ricerca.
In sintesi, i metodi esistenti per isolare le cellule immunitarie dal cuore e analizzarle tramite citometria a flusso in genere non considerano la capacità delle cellule immunitarie di attaccarsi all'endotelio e non standardizzano la perfusione o implementano una perfusione estesa, con il presupposto che qualsiasi cellula immunitaria nello spazio intravascolare sia un contaminante che deve essere eliminato. Ciò ignora l'idea che le cellule immunitarie intravascolari aderenti all'endotelio abbiano rilevanza biologica. Il protocollo qui presentato è stato ottimizzato per massimizzare il recupero delle cellule immunitarie miocardiche con particolare attenzione alle cellule B miocardiche, intravascolari ed extravascolari. Ci aspettiamo che questo protocollo sia di interesse per tutti quegli scienziati che lavorano nel campo dell'immunologia cardiaca e sono interessati ad esplorare la funzione che le cellule B potrebbero svolgere nei cuori sani e feriti.
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Disclosures
Luigi Adamo è co-fondatore di i-Cordis, LLC, una società focalizzata sullo sviluppo di molecole immunomodulatorie per il trattamento dello scompenso cardiaco, con un interesse specifico per i derivati del farmaco modulante delle cellule B pirfenidone. Gli altri autori non hanno conflitti da dichiarare.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato dalle sovvenzioni NHLBI 5K08HLO145108-03 e 1R01HL160716-01 assegnate a Luigi Adamo.
Il citometro a flusso Aurora utilizzato per sviluppare questo studio è stato finanziato dal NIH Grant S10OD026859. Riconosciamo il supporto del JHU Ross Flow Cytometry Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
| (CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
| 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
| 10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
| 1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
| 15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
| 1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
| 3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
| Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
| Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
| Anesthesia Induction Chamber - Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
| CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
| Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
| Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
| Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
| Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
| Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
| DNase I - 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Easypet 3 - Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
| Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
| FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
| GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
| HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
| Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
| Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
| Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
| Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
| R 4.1.1 | The R Foundation | ||
| Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
| Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
| Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
| Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
| SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
| Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
| Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
| Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
| Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
| Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
References
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