Summary
Här rapporterar vi ett protokoll för kvantifiering och differentiering av myokardiella B-lymfocyter baserat på deras placering i det intravaskulära eller endoteliala utrymmet med hjälp av flödescytometri.
Abstract
En växande mängd bevis visar att B-lymfocyter spelar en viktig roll i samband med myokardiell fysiologi och myokardiell anpassning till skada. Litteraturen rapporterar dock kontrasterande data om förekomsten av myokardiella B-celler. B-celler har rapporterats vara både bland de vanligaste immuncellerna i gnagarhjärtat eller vara närvarande, men med en markant lägre prevalens än myeloida celler, eller för att vara ganska sällsynta. På samma sätt har flera grupper beskrivit att antalet myokardiella B-celler ökar efter akut ischemisk hjärtskada, men en grupp rapporterade inga förändringar i antalet B-celler i det skadade myokardiet. Implementering av en delad, reproducerbar metod för att bedöma förekomsten av myokardiella B-celler är avgörande för att harmonisera observationer från olika forskargrupper och därmed främja utvecklingen av studien av B-cells myokardiella interaktioner. Baserat på vår erfarenhet härrör de till synes kontrasterande observationerna som rapporterats i litteraturen sannolikt från det faktum att murina myokardiella B-celler mestadels är intravaskulära och kopplade till det mikrovaskulära endotelet. Därför är antalet B-celler som återvinns från ett murint hjärta utsökt känsligt för de perfusionsförhållanden som används för att rengöra organet och för den metod för matsmältning som används. Här rapporterar vi ett optimerat protokoll som redovisar dessa två kritiska variabler på ett specifikt sätt. Detta protokoll möjliggör reproducerbar, flödescytometribaserad analys av antalet murina myokardiella B-celler och gör det möjligt för forskare att skilja extravaskulära kontra intravaskulära myokardiella B-celler.
Introduction
B-lymfocyter är högspecialiserade immunceller som spelar en viktig roll i både adaptiva och medfödda immunsvar1. Det finns två huvudpopulationer av B-celler: en mindre population av B1-celler som mestadels produceras under embryonalt liv och en övervägande population av B2-celler som produceras i vuxenlivet i benmärgen1. Efter mognad i benmärgen migrerar B-celler till primära och sekundära lymfoida organ. Därifrån återcirkulerar de kontinuerligt mellan lymfoida organ som färdas genom blodkärl och lymfkärl2. B-celler uttrycker specifika antikroppar på deras yta, som fungerar som receptorer. När B-celler stöter på ett antigen som binder till deras receptor kan en aktiverande signal utlösas. Aktiverade B-celler migrerar antingen till vävnaden där antigenet hittades eller går tillbaka till benmärgen där de kan mogna till antikroppsproducerande plasmaceller 3,4.
Nyligen har det uppskattats att hjärtat har en stor population av B-celler. Studier på gnagare har visat att B-celler koloniserar hjärtat tidigt under embryonal utveckling5, och att myokardassocierade B-celler mestadels är intravaskulära, naiva B2-celler vidhäftade till endotelet6,7, med en liten andel B1-celler 7. Det finns fortfarande många osäkerhetsområden, men tillgängliga data indikerar att B-celler spelar en viktig roll både i det naiva hjärtat och i samband med myokardiell anpassning till skada.
Studier i det naiva murina hjärtat har visat att vid baslinjen är myokardiella B-celler mestadels belägna i det intravaskulära utrymmet, vidhäftade till endotelet (>95% av murina hjärt-B-celler befanns vara belägna i det intravaskulära utrymmet). Dessa B-celler visade sig ha genuttrycksmönster som skiljer sig från de hos cirkulerande B-celler isolerade från det perifera blodet. Analys av naiva hjärtan från B-cellsbristdjur och syngena kontroller visade att djur som saknade B-celler hade mindre hjärtan och högre utkastningsfraktion6. Alla dessa bevis tyder på att B-celler kan modulera myokardiell tillväxt och / eller myokardiell funktion, och att inte bara interstitiella utan också intravaskulära B-celler kan vara ansvariga för sådana observationer. B-celler visade sig också modulera fenotypen för myokardiella makrofager8.
Flera studier har visat att B-celler spelar en viktig roll i samband med myokardiell anpassning till skada 8,9,10,11,12,13. B-celler ackumuleras övergående i det skadade hjärtat, sannolikt genom en CXCL13-CXCR5-beroende mekanism11,13. Därifrån främjar B-celler negativ hjärtombyggnad genom flera mekanismer som inkluderar cytokinmedierad monocytrekrytering 9,12. Dessutom kan B-celler producera antikroppar mot hjärtproteiner som kan främja förlängningen av hjärtskador och negativ hjärtombyggnad genom flera mekanismer 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-celler kan också utöva skyddande effekter på det skadade hjärtat genom utsöndring av IL-1010.
I takt med att antalet grupper som undersöker B-cellernas roll i det naiva och skadade hjärtat växer blir det allt viktigare att definiera gemensamma protokoll för att korrekt kvantifiera och bedöma myokardiella B-celler och därmed undvika inkonsekvenser som redan har börjat dyka upp i litteraturen. Hittills har B-celler faktiskt både rapporterats vara en av de vanligaste immuncellerna i gnagarhjärtat7 och vara närvarande vid en markant lägre prevalens än myeloida celler26,27, eller vara ganska sällsynta 28. På samma sätt har flera grupper beskrivit att antalet myokardiella B-celler ökar efter akut ischemisk hjärtskada 7,9,13, men en grupp rapporterade inga förändringar i antalet B-celler i det skadade myokardiet29. Studier på hjärtimmunceller ger sällan detaljer om perfusionsförhållanden och det finns ingen överenskommelse om matsmältningsförhållandena. Eftersom en stor andel av B-cellerna i gnagarhjärtat är intravaskulära och extraktionen av immunceller från hjärtmuskeln är starkt beroende av den matsmältningsmetod som används, kan skillnaderna som rapporteras i litteraturen vara resultatet av skillnader i organperfusion och vävnadssmältning.
Här presenteras en detaljerad metod för flödescytometribaserad kvantifiering av murina myokardiella B-celler som maximerar utbytet av B-cellåtervinning genom att optimera perfusions- och matsmältningsförhållandena och möjliggör diskriminering av intravaskulära kontra extravaskulära myokardiella B-celler6. Detta protokoll är en anpassning och optimering av andra liknande protokoll som skiljer mellan intravaskulära och interstitiella immunceller 28,30,31.
I detta protokoll standardiserar vi myokardiell perfusion för att eliminera B-celler som flyter i det intravaskulära utrymmet utan att ta bort biologiskt relevanta B-celler som följs till det mikrovaskulära endotelet. Dessutom, med utgångspunkt i tidigare protokoll som har beskrivit användningen av intravenös injektion av antikroppar för att skilja intravaskulära från interstitiella immunceller32, och dra nytta av det faktum att B-celler uttrycker ytmarkören B22033, visar vi hur man skiljer intravaskulära kontra extravaskulära myokardiella B-celler genom intravaskulär injektion av en B220-specifik antikropp omedelbart före djuroffret och hjärtperfusionen. Detta protokoll är relevant för forskningen från alla forskare som är intresserade av att inkludera analysen av myokardiella B-celler i det naiva och skadade hjärtat. Den utbredda implementeringen av detta protokoll kommer att minska inkonsekvenser mellan forskargrupper, möjliggöra analys av förändringar i de intravaskulära och extravaskulära myokardiella B-cellpoolerna och därmed stärka utvecklingen av upptäckter inom hjärtimmunologi.
Sammanfattningsvis representerar protokollet ett optimerat arbetsflöde för att kvantifiera och analysera myokardiella B-celler via flödescytometri och samtidigt skilja mellan celler som ligger i det extravaskulära utrymmet och det intravaskulära utrymmet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment som beskrivs i detta manuskript utfördes med godkännande av IACUC vid Johns Hopkins University School of Medicine.
1. Förberedelser
- Förbered FACS-bufferten enligt beskrivningen i tabell 1.
- Se till att det finns tillräckligt med CO2 för att avliva djuren.
- Förbered dissektionsutrymmet (placera bänkdynan och placera tejpen och dissektionsverktygen i närheten).
- Märk 15 ml rören, lägg 3 ml HBSS med kalcium och magnesium i varje rör (se materialtabell) och lägg dem på is (ett rör per hjärta och ett extra för referensgruppen / flödescytometrikontrollerna). Fyll också de små (35 mm) petriskålarna med HBSS.
- Slå på den temperaturstyrda skakapparaten, ställ in den på 37 °C och förkyl centrifugen vid en temperatur på 4 °C.
- Förbered sprutpumpen och ställ in flödeshastigheten på 3 ml/min. Fyll en 20 ml spruta med HBSS, fyll rörledningen med buffert och ta bort eventuella bubblor.
2. Intravaskulär B-cellfärgning (in vivo)
- Väg en 12 veckor gammal hanmus av C57BL/6J-stammen. Ladda en 3/10 cc insulinspruta med 100 μL av B220-antikroppsutspädningen (1:10, i PBS). Täck sprutan med aluminiumfolie för att skydda mot ljus.
- Bedöva en mus.
- Applicera en intraperitoneal injektion av 2% 2,2,2-tribrometanol med en dos på 400 mg/kg och vänta 10-20 min.
OBS: Övervaka musens andning och rörelse. När musen slutar röra sig, stimulera smärta genom att klämma på tån; frånvaron av en abstinensreflex indikerar adekvat anestesi. - Om adekvat anestesi inte uppnås inom loppet av 20 minuter kan en ytterligare dos bedövningsmedel på 100 mg/kg administreras, och en bedömning av muskinetik, abstinensreflex och andning bör göras var 5:e minut.
- Applicera en intraperitoneal injektion av 2% 2,2,2-tribrometanol med en dos på 400 mg/kg och vänta 10-20 min.
- Placera musen på labbbänken på en bänkdyna lutad mot ena sidan, dra försiktigt ner huden på ryggen och tryck kroppen något mot bänken för att få ögat att sticka ut.
- Injicera den utspädda B220-antikroppen från steg 2.1 genom retroorbital injektion.
- För in sprutan i ögat vid 45° från mushuvudets sagittala plan. Injicera långsamt lösningen. Om motstånd känns, ta bort sprutan och gå in igen. Vänta i 2 min.
OBS: Förlängd inkubationstid skulle äventyra förmågan att diskriminera intravaskulära vs extravaskulära B-celler eftersom det skulle ge tid för den injicerade antikroppen att diffundera utanför vaskulaturen.
- För in sprutan i ögat vid 45° från mushuvudets sagittala plan. Injicera långsamt lösningen. Om motstånd känns, ta bort sprutan och gå in igen. Vänta i 2 min.
- Avliva musen enligt IACUC-reglerna.
- Öppna CO2-flödet till eutanasikammaren med en hastighet av 0,5 l / min, eller den rekommenderade flödeshastigheten baserat på storleken på din kammare.
- Placera musen i kammaren under den rekommenderade tiden och se till att den inte längre andas. Ta bort det och utför cervikal dislokation som en sekundär metod för eutanasi.
- När musen har avlivats, fortsätt omedelbart till organskörd och perfusion.
3. Hjärtsamling
- Bröstöppning.
- Håll musens hud med pincett vid det epigastriska området. Gör en 2 mm öppning i huden med sax och använd tången för att skala bort huden för att avslöja fasciaskiktet, ett glänsande genomskinligt lager, i bröstet och buken. Skär vid epigastrium genom fascia och bukhinna för att öppna bukväggen och avslöja xiphoidprocessen. Kläm fast xiphoidprocessen med hemostatiska pincett.
- Med saxen gör du ett vertikalt snitt genom bröstväggen i nivå med den mittklavikulära linjen på varje sida och lyfter den främre bröstväggen för att avslöja mediastinuminnehållet, med hjälp av hemostatiska pincett som en vikt för att bibehålla öppningen.
- Hjärtperfusion och extraktion.
- Använd pincett, ta bort fett eller tymisk vävnad som omger hjärtat.
- Håll aortan ordentligt bakifrån med pincett. Inför sprutnålen (25 G) i hjärtats topp. Fyll på med 3 ml HBSS med en hastighet av 3 ml/min.
OBS: Övervaka perfusionen. Levern ska fyllas och blod i kranskärlen. Användning av en sprutpump kalibrerad till 1 ml/ minut rekommenderas för att upprätthålla ett jämnt flöde. - Skär aortan med sax och ta ut hjärtat. Tvätta hjärtat i petriskålen med HBSS för att ta bort eventuellt kvarvarande blod. Ta bort fett, bindväv och tymus med sax och pincett och torka hjärtat. Väg det isolerade hjärtat och notera vikten i milligram. Hacka hjärtat vid rumstemperatur i små bitar (1-2 mm) med ett blad.
OBS: Vuxna mushjärtan kan väga mellan 0,090-0,210 mg. - Mät massan av hjärtvävnad och placera 60 mg av det finhackade hjärtat som ska smälta i ett 15 ml rör med 3 ml HBSS. Behåll den återstående hjärtvävnaden och placera i ett rör märkt "Referenskontrollvävnad"; Detta kommer att användas för kompensationskontroll för levande död signal och autofluorescens.
4. Hjärtsmältning och cellfärgning
- Tillsätt enzymer till varje rör som innehåller malet vävnad (se tabell 1). Tillsätt 0,5 μl/mg DNas 1 (300 enheter för 60 mg hjärtvävnad), 0,5 μl/mg kollagenas II (625 enheter för 60 mg hjärtvävnad) och 0,2 μl/mg hyaluronidas (50 enheter för 60 mg hjärtvävnad) till röret.
- Placera matsmältningsreaktionen i skakapparaten i 30 minuter vid 300 rpm. Justera skakstället till ca 25° lutning.
- Tillsätt 7 ml HBSS till vart och ett av 15 ml reaktionsrör och centrifugera vid 250 x g i 5 minuter vid 4 °C med acceleration och brytning inställd på måttlig eller långsam. Dekantera supernatanten och återsuspendera varje pellet i 5 ml ACK-lysbuffert för att ta bort röda blodkroppar. Inkubera i ACK-lysbufferten i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt 10 ml PBS till varje rör, blanda och filtrera sedan i ett 50 ml rör med en 40 μm sil. Se till att allt skräp finns inuti filterkammaren. Krossa eventuellt skräp på filtret med en sprutkolv tills det är helt upphängt i filterkammaren.
- Tillsätt PBS genom filtret tills volymen når 25 ml per hjärta; Detta gör att de suspenderade cellerna kan passera genom filtret. Lägg till ytterligare 25 ml PBS till referenskontrollvävnadsröret och dela volymen i olika rör (25 ml vardera). Märk ett av rören "Unstained" och det andra som "Live-dead". Centrifugera vid 250 x g i 5 minuter vid 4 °C.
OBS: Förbered nu utspädningen för den levande döda fläcken (utspädning: 1:500 i 1x PBS). - Dekantera supernatanten, återsuspendera pelleten i det ofärgade röret i 100 μL PBS och var och en av de andra pelletsen i 100 μl av den levande döda fläckutspädningen. Inkubera på is i 30 minuter i mörkret och täck ishinken med aluminiumfolie.
- Tillsätt 500 μL FACS-buffert till varje prov och överför det till ett märkt FACS-rör genom ett 40 μm-filter. Centrifugera FACS-rören vid 250 x g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten. Återsuspendera pelleten i 500 μL FACS-buffert.
- Tillsätt 50 μl Fc-blockeringslösning (se tabell 1) till varje rör, med undantag för rören ostoppade och levande döda. Blanda och inkubera i 5 min.
- Tillsätt 50 μl antikroppsblandningslösning (se tabell 1) till varje rör, utom de ofärgade och levande döda rören, och inkubera i 30 minuter i mörkret och täck ishinken med aluminiumfolie.
- Tillsätt 2 ml FACS-buffert till varje rör och centrifugera vid 250 x g i 5 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten och återsuspendera i 300-500 μL FACS-buffert.
5. Flödescytometri
- Inställningar för instrumentkontroll.
OBS: I detta protokoll analyseras provet med en 4 lasrar Cytek Aurora flödescytometer. En annan lämplig flödescytometer kan användas för att upptäcka markörer av intresse.- Öppna programvaran för instrumentstyrning (se Materialförteckning). Högst upp i fönstret väljer du fliken Förvärv och klickar på Ny +. Ett fönster som heter Skapa nytt experiment visas.
- I avsnittet Bibliotek, i fältet Typ för filter, skriver du PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 och Zombie Aqua och klickar på Lägg till efter att ha skrivit var och en. Fluorofornamnen ska ses till höger. Klicka sedan på Nästa för att gå vidare till fliken Grupp .
- På fliken Grupp klickar du på symbolen med ett rör för att lägga till hjärtat för analysen.
- Klicka på + Referensgrupp så visas ett fönster. I kolumnen fluorescerande tagg väljer du Zombie Aqua och i kolumnen för kontrolltyp väljer du Celler och klickar sedan på Spara.
- Klicka på fliken Nästa > Markörer . en tabell visas med namnen på fluoroforerna. Skriv motsvarande cellmarkör i den första raden i varje fluoroforkolumn och skriv Enter: CD45 för PerCP-Cy5.5; CD19 för BV421; CD11b för Alexa Fluor 700; B220 för PE; och live-dead för Zombie Aqua.
- Klicka på Nästa två gånger för att gå till fliken Förvärv . I Händelser till post för experimentgruppen skriver du 10 000 000 och i samma fält för referensgruppsraden skriver du 200 000. Klicka på Spara och öppna. De andra inställningarna ska finnas kvar som standard, Stopptid till 10 000 och Stoppa volym till 3 000.
- Klicka längst ner till vänster på Instrumentkontroll. Ställ in spänningen på FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. Välj sedan Förvärvskontroll. För alternativet Flödeshastighet väljer du Hög i rullgardinsmenyn.
- Skaffa referensprover med en cytometer och blanda i programvara.
- Vörda det ofärgade hjärtröret och placera det ordentligt på provinjektionsporten (SIP). Se till att den gröna indikatorpilen pekar på rätt prov och klicka sedan på Start i kontrollpanelen för förvärv i cytometerprogramvaran och vänta tills händelserna har spelats in. Gör samma sak för den levande dödsfärgade hjärtvävnaden.
- Välj menyn Unmix och ställ in följande kontroller:
- Markera kryssrutorna för PE, PerCP-Cy5.5, BV421 och Alexa Fluor 700 i kolumnen från biblioteket. Se till att Zombie Aqua är avmarkerat i samma kolumn. Längst ner, kontrollera alternativet autofluorescens som en fluorescerande tagg.
- Klicka på Nästa för att gå vidare till fliken Identifiera positiva/negativa populationer . På den här fliken visas ett diagram med FSC-A jämfört med SSC-B-A. Klicka och dra polygonens punkter för att välja ett område mellan 1,0 M och 4,0 M på FSC-A-axeln och mellan 0,2 M och 3,0 M på SSC-B-A-axeln.
- I nästa diagram till höger visas V5-A på X-axeln. Flytta grindarna för att välja hälften av toppen längst till höger som positiv och en region på vänster sida av diagrammet som negativ. I diagrammet med titeln Referensgrupp - Unstained, välj en befolkning i ett liknande intervall. För detta måste det oröstade inga positiva-negativa ställas in.
- Skaffa experimentella prover.
- För varje rör som innehåller ett prov för en enskild mus, virvla röret och placera det säkert på SIP. Se till att den gröna indikatorpilen pekar på rätt exempel, klicka sedan på Start i kontrollpanelen för förvärv i cytometerprogramvaran och vänta tills händelserna har registrerats.
- Gating strategi.
- Välj fliken Standardiserat oblandat kalkylblad . Skapa ett FSC-A jämfört med SSC-A-diagram med hjälp av punktdiagramverktyget ovanpå. Välj händelser som är högre än 0,4 M på FSC-A-axeln och högre än 0,8 M på SSC-A-axeln med hjälp av polygonmarkeringsverktyget. Dubbelklicka i detta urval så visas en ny tomt.
- Från den nyskapade tomten högerklickar du på X-axeletiketten och väljer AF-A; högerklicka på Y-axelns etikett och välj Live-dead stain. Klicka på rektangelvalsverktyget överst och välj alla händelser under 105 på den levande döda axeln som motsvarar den nedre live-dead-signalen. Dubbelklicka i detta urval så visas en ny tomt.
- I det nya diagrammet högerklickar du för att välja PerCP-Cy5.5-A för X-axeln och SSC-A för Y-axeln . Använd markeringsverktyget Rektangel och markera de händelser som är högre än 104 på PerCP-Cy5.5-A-axeln och som motsvarar de positiva cellerna i CD45. Dubbelklicka på urvalet så visas en ny tomt.
- I det nya diagrammet högerklickar du för att välja FSC-A för X-axeln och FSC-H för Y-axeln. Använd urvalsverktyget Polygon för att välja de händelser som följer en trend där FSC-A-värdet och SSC-A-värdet är desamma. med detta kommer celldubblarna att tas bort och populationen i urvalet kommer att kallas CD45+ -populationen. Dubbelklicka på urvalet för att visa en ny tomt med CD45 + -befolkningen.
- Från CD45 + -befolkningsdiagrammet högerklickar du för att välja BV421 på X-axeln jämfört med SSC-A på Y-axeln. Använd markeringsverktyget Polygon och välj populationen till höger på BV421-axeln . Detta är B-cellpopulationen. Dubbelklicka två gånger i denna population för att skapa två nya tomter med B-cellpopulationen.
- Högerklicka för att ställa in det första B-celldiagrammet med PE-A vid X-axeln och BV421-A på Y-axeln . Populationen till höger motsvarar de intravaskulära B-cellerna, och populationen till vänster representerar de interstitiella B-cellerna. Använd polygonmarkeringsverktyget för att göra ett urval av båda.
- Högerklicka för att ställa in det andra B-celldiagrammet med Alexa Fluor 700-A på X-axeln och SSC-A på Y-axeln . Populationen till vänster motsvarar CD11b-cellerna, och händelserna till höger (om sådana finns) motsvarar CD11b+-cellerna.
- Högerklicka på varje val och klicka sedan på Gate Properties. Klicka på Antal och % förälder för att visa storlekar och procentsatser. Registrera antalet händelser och procentsatser för ytterligare dataanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När förvärvet är klart och alla händelser har samlats in bör data analyseras enligt standardflödescytometripraxis. Analysens fokus varierar beroende på det individuella målet för varje experiment. I detta fall eftersträvades kvantifiering av intravaskulära och extravaskulära B-celler, och det uttrycktes som antalet celler per mg vävnad.
Vid användning av en spektral cytometer rekommenderas att analysen startas med en initial grind för att avlägsna skräp med storlekar som inte ligger inom ett intervall som motsvarar immunceller, följt av avlägsnande av den levande döda fläcken + -signalen. Detta möjliggör detektion av en ren population av CD45-positiva celler som motsvarar leukocyter (figur 1). Efter avlägsnande av dubbletter, i ett naivt oskadat hjärta, förväntas det att cirka 20% av CD45 + -cellerna kommer att vara CD19 + B-celler (Figur 2A, 18,1% B-celler i detta representativa experiment). Av dessa celler är i genomsnitt 5, 5% belägna i det interstitiella utrymmet, medan 94, 5% är belägna i det intravaskulära utrymmet (Figur 2B). Från hela B-cellpopulationen som finns i hjärtat motsvarar endast cirka 1,6% B1-celler baserat på ytmarkören CD11b (vilket vanligtvis anses vara tillräckligt för att klassificera en murin CD19+ -cell som en B1-cell med hög grad av konfidens 1,34,35), och de andra 98,4% motsvarar B2-celler (Figur 2C).
Figur 1: Flödescytometri gating strategi som används för att detektera och karakterisera myokardiella associerade B-celler. (A) FSC-A vs. SSC-A: Diagrammet visar alla insamlade händelser, och det valda området ritas för att berika analysen med händelser som ligger inom storleksintervallet för leukocyter. (B) Autofluorescens kontra levande-död färgning: Det valda området motsvarar den nedre levande döda signalen. Porten som dras tar bort döda celler och några andra cellskräp som binder till den levande döda färgningen. (C) CD45-signal kontra SSC-A: Det valda området motsvarar CD45 + -cellerna (dvs. myokardiella leukocyter). (D) FSC-A vs. FSC-H: Denna grind dras för att ta bort celldubbletter (omarkerade händelser). (E) CD19-signal kontra SSC-A: Det valda området motsvarar myokardiella B-celler. (F) B220 vs. CD19: Området inuti den svarta fyrkanten motsvarar de intramyokardiella B-cellerna (CD19 +, B220-), och området inuti den röda fyrkanten motsvarar den intravaskulära B-cellpopulationen. (G) CD11b vs. SSC-A: Området inuti den svarta cirkeln motsvarar CD11b + (B1-celler), och området inuti den röda cirkeln motsvarar CD11b- (B2-celler). Procentsatserna som visas på varje panel representerar den genomsnittliga procentandelen som den visade populationen representerar från föräldrapopulationen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa diagram som rapporterar det genomsnittliga antalet B-celler per milligram myokardvävnad . (A) Genomsnittligt antal CD45+ och CD19+ celler/mg murin myokardvävnad. Procentandelen som visas motsvarar procentandelen celler från föräldrapopulationen (CD45+). (B) Genomsnittligt antal CD19 + -celler och procentandelen B-celler som finns i det interstitiella (extravaskulära) utrymmet i intravaskulära utrymmen. (C) Absolut antal och procentandel myokardiella B-celler som uttrycker markörer för B1- eller B2-celler. Felstaplar motsvarar medelvärdets standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Denna tabell innehåller de lösningar och reagenser som behövs för proceduren. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En växande mängd bevis tyder på att B-celler spelar en viktig roll i samband med myokardiell fysiologi och myokardiell ombyggnad / anpassning till skada 7,8,9,10,11,12,13,36. Flödescytometri är ett utmärkt verktyg för att studera immuncellpopulationer i vilken vävnad som helst och nästan ett obligatoriskt verktyg för alla studier som fokuserar på B-celler i hjärtat.
Den framväxande litteraturen om B-celler och hjärtat rapporterar redan kontrasterande fynd om mycket grundläggande aspekter, såsom antalet B-celler i hjärtat och förändringar i myokardiellt B-cellantal med skada. B-celler har rapporterats som den vanligaste immuncellen i gnagarhjärtan7. Andra studier utvärderade dock deras relativa prevalens jämfört med andra myeloida celler och visade markant lägre siffror26,27. Pinto et al.26 fann att B-celler utgjorde cirka 9% av de totala leukocyterna, medan Yu et al.27 rapporterade 10%. Adamo et al.7 rapporterade att den genomsnittliga andelen B-celler i förhållande till leukocytnummer var cirka 20%, vilket är mycket nära de 18,1% som rapporterats i detta manuskript. Andra studier har rapporterat att B-celler har en mycket låg prevalens i myokardiet28.
Flera kritiska experimentella steg kan förklara variationerna i B-cellnummer som rapporterats i litteraturen. Namnlösa: Skillnader i hjärtats perfusion, vävnadsbrytning och matsmältning kan väsentligt påverka antalet B-celler som återvinns per mg hjärtvävnad. Perfusion med buffertar som innehåller kalciumkelaterande medel och inget kalcium, eller perfusion med högre volym eller perfusionshastighet, kan lossa B-cellerna som är fästa vid endotelet och minska återvinningsutbytet. Alltför fin vävnadsbrytning kan leda till översmältning av vävnaden och förlust av cellviabilitet. En minskning av cellviabiliteten kan också vara resultatet av smältning under en längre tid eller med högre enzymkoncentrationer.
Andelen CD45+-celler som motsvarar B-celler kan ligga i ett intervall mellan 15%-30% i en vild mus. Beroende på vilken musstam som används, ålder och genetisk bakgrund kan detta värde variera. Procentandelen bör dock förbli liknande i den studerade gruppen. Stor variation i antal och procentandel av B-celler mellan möss som tillhör samma grupp tyder på att ett experimentellt fel kan uppstå. Låga procentsatser kan indikera ett överskott i perfusionsstyrka och tid. Global minskning av CD45 + -celler kan indikera att vävnaden översmälts.
Protokollet som beskrivs här har optimerats för att ge ett konsekvent utbyte av B-celler från det smälta murina hjärtat och för att möjliggöra diskriminering av intravaskulära kontra extravaskulära B-celler6. Diskriminering av intravaskulära kontra extravaskulära B-celler uppnås via intravaskulär injektion av en antikropp omedelbart före avlivning. Antikroppen som injiceras intravaskulärt diffunderar lätt genom kärlen och möter alla intravaskulära B-celler. Om djuret offras tillräckligt snart och hjärtat skördas omedelbart, har antikroppen inte tid att diffundera i det extravaskulära utrymmet och fläcka extravaskulära B-celler. Eftersom tiden mellan den intravaskulära injektionen av antikroppen och organskörden är kritisk, rekommenderas att inokulera med antikroppen och samla ett enskilt mushjärta i taget. Intravaskulär injektion av antikroppar kan utelämnas om diskrimineringen av intravaskulära kontra extravaskulära B-celler inte är av intresse. Gatingstrategin som visas i figur 1 skulle förbli densamma förutom det sista steget, vilket inte skulle vara möjligt på grund av bristen på B220-märkning. Beroende på den experimentella designen kan vilken fluorofor som helst från panelen som visas modifieras till en färg som passar med den använda panelen. Det är också viktigt att tänka på att valet av ytmarkörer kan modifieras enligt behoven hos den grupp som utför det; till exempel, om man i den experimentella designen tror att CD11b-uttryck på B1-celler kan minskas, rekommenderas tillsats av olika markörer, såsom IgM, IgD och CD537.
Observera att det kan vara nödvändigt att bearbeta ett hjärta bara för att köra kompensationskontroller för flödescytometri. Detta rekommenderas första gången experimentet optimeras. I följande experiment kan det vara tillräckligt att spara lite vävnad vid hjärtuppsamlingstillfället, eftersom det skulle ge tillräckligt med celler för att köra en negativ "ostoppad" kontroll och en positiv "levande död" fläckkontroll. Enskilda kontroller för de andra färgerna kan antingen importeras från tidigare experiment eller genereras med hjälp av pärlor.
Vissa steg i protokollet kan modifieras utan att ändra resultaten av experimentet. Till exempel kan anestesimetoden ändras för en föredragen beroende på forskarens erfarenhet; Användningen av isofluran istället för 2,2,2-tribrometanol kan minska tiden mellan administrering av anestesi och hjärtuppsamling. Dessutom kan hjärtats perfusion göras manuellt utan användning av en sprutpump så länge den utförs långsamt, försiktigt och konsekvent.
Trots det exakta utförandet av protokollet kan oerfarna operatörer stöta på hög variation mellan prover inom samma experimentella session eller mellan olika experimentella sessioner. Baserat på erfarenhet försvinner denna variation när forskaren har haft möjlighet att bli fullt bekant med arbetsflödet. Det rekommenderas därför att alla som vill implementera detta protokoll bedömer dess reproducerbarhet i två till tre försökskörningar innan de samlar in viktiga data om sina forskningsprojekt.
Sammanfattningsvis tar befintliga metoder för att isolera immunceller från hjärtat och analysera dem via flödescytometri vanligtvis inte hänsyn till immuncellernas förmåga att fästa vid endotelet, och antingen standardiserar inte perfusion eller implementerar omfattande perfusion, med antagandet att någon immuncell i det intravaskulära utrymmet är en förorening som måste rensas. Detta ignorerar uppfattningen att intravaskulära immunceller som följs till endotelet har biologisk relevans. Protokollet som här presenteras har optimerats för att maximera återhämtningen av myokardiella immunceller med särskild uppmärksamhet på myokardiella B-celler, intravaskulära och extravaskulära. Vi förväntar oss att detta protokoll kommer att vara av intresse för alla de forskare som arbetar inom hjärtimmunologi och är intresserade av att utforska den funktion som B-celler kan spela i friska och skadade hjärtan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Luigi Adamo är medgrundare av i-Cordis, LLC, ett företag som fokuserar på utveckling av immunmodulerande molekyler för behandling av hjärtsvikt, med ett specifikt intresse för derivat av det B-cellmodulerande läkemedlet pirfenidon. De återstående författarna har inga konflikter att förklara.
Acknowledgments
Denna studie finansierades av NHLBI-bidragen 5K08HLO145108-03 och 1R01HL160716-01 som tilldelades Luigi Adamo.
Aurora Flow Cytometer som användes för att utveckla denna studie finansierades av NIH Grant S10OD026859. Vi erkänner stödet från JHU Ross Flow Cytometry Core.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
| (CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
| 0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
| 1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
| 10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
| 1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
| 15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
| 1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
| 200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
| 3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
| ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
| Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
| Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
| Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
| Anesthesia Induction Chamber - Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
| BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
| CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
| Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
| Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
| Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
| Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
| Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
| Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
| DNase I - 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
| Easypet 3 - Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
| Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
| Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
| FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
| GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
| HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
| Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
| Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
| Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
| McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
| Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
| PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
| PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
| Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
| Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
| Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
| PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
| R 4.1.1 | The R Foundation | ||
| Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
| Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
| Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
| Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
| Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
| SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
| Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
| Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
| Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
| Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
| Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
| Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
| Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
| TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
| Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
| VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
| VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
| VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |
References
- Adamo, L., Rocha-Resende, C., Mann, D. L. The emerging role of B lymphocytes in cardiovascular disease. Annual Review of Immunology. 38, 99-121 (2020).
- Gowans, J. L., Knight, E. J. The route of re-circulation of lymphocytes in the rat. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 159 (975), 257-282 (1964).
- Kunkel, E. J., Butcher, E. C. Chemokines and the tissue-specific migration of lymphocytes. Immunity. 16 (1), 1-4 (2002).
- Tanaka, T., et al. Molecular determinants controlling homeostatic recirculation and tissue-specific trafficking of lymphocytes. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (2), 120-134 (2004).
- Rocha-Resende, C., et al. Developmental changes in myocardial B cells mirror changes in B cells associated with different organs. JCI Insight. 5 (16), (2020).
- Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), 139377 (2020).
- Adamo, L., et al. Modulation of subsets of cardiac B lymphocytes improves cardiac function after acute injury. JCI Insight. 3 (11), (2018).
- Rocha-Resende, C., Pani, F., Adamo, L. B cells modulate the expression of MHC-II on cardiac CCR2(-) macrophages. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 157, 98-103 (2021).
- Zouggari, Y., et al. B lymphocytes trigger monocyte mobilization and impair heart function after acute myocardial infarction. Nature Medicine. 19 (10), 1273-1280 (2013).
- Wu, L., et al. IL-10-producing B cells are enriched in murine pericardial adipose tissues and ameliorate the outcome of acute myocardial infarction. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21673-21684 (2019).
- Heinrichs, M., et al. The healing myocardium mobilizes a distinct B-cell subset through a CXCL13-CXCR5-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 117 (13), 2664-2676 (2021).
- Sun, Y., et al. Splenic marginal zone B lymphocytes regulate cardiac remodeling after acute myocardial infarction in mice. Journal of the American College of Cardiology. 79 (7), 632-647 (2022).
- Yan, X., et al. Temporal dynamics of cardiac immune cell accumulation following acute myocardial infarction. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 62, 24-35 (2013).
- Iwata, M., et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of beta(1)-adrenergic receptors induces beta-adrenergic receptor desensitization and myocardial hypertrophy in vivo. Circulation Research. 88 (1), 578-586 (2001).
- Jahns, R., et al. Direct evidence for a beta 1-adrenergic receptor-directed autoimmune attack as a cause of idiopathic dilated cardiomyopathy. The Journal of Clinical Investigation. 113 (10), 1419-1429 (2004).
- Christ, T., et al. Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (8), 1515-1525 (2001).
- Jane-wit, D., et al. Adrenergic receptor autoantibodies mediate dilated cardiomyopathy by agonistically inducing cardiomyocyte apoptosis. Circulation. 116 (4), 399-410 (2007).
- Ludwig, R. J., et al. Mechanisms of autoantibody-induced pathology. Frontiers in Immunology. 8, 603 (2017).
- Haudek, S. B., et al. Fc receptor engagement mediates differentiation of cardiac fibroblast precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (29), 10179-10184 (2008).
- Staudt, A., Eichler, P., Trimpert, C., Felix, S. B., Greinacher, A. Fc(gamma) receptors IIa on cardiomyocytes and their potential functional relevance in dilated cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 49 (16), 1684-1692 (2007).
- Zhang, M., et al. The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 41 (1), 62-67 (2006).
- Zhang, M., et al. Identification of a specific self-reactive IgM antibody that initiates intestinal ischemia/reperfusion injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (11), 3886-3891 (2004).
- Schulze, K., Becker, B. F., Schauer, R., Schultheiss, H. P. Antibodies to ADP-ATP carrier--an autoantigen in myocarditis and dilated cardiomyopathy--impair cardiac function. Circulation. 81 (3), 959-969 (1990).
- Matsumoto, Y., Park, I. K., Kohyama, K. B-cell epitope spreading is a critical step for the switch from C-protein-induced myocarditis to dilated cardiomyopathy. The American Journal of Pathology. 170 (1), 43-51 (2007).
- Caforio, A. L. P., et al. Current state of knowledge on aetiology, diagnosis, management, and therapy of myocarditis: a position statement of the European Society of Cardiology Working Group on Myocardial and Pericardial Diseases. European Heart Journal. 34 (33), 2636-2648 (2013).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Horckmans, M., et al. Pericardial adipose tissue regulates granulopoiesis, fibrosis and cardiac function after myocardial infarction. Circulation. 137 (9), 948-960 (2017).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of macrophage subsets and stromal cells from human and mouse myocardial specimens. Journal of Visualized Experiments. (154), e60015 (2019).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- Coffman, R. L., Weissman, I. L. B220: a B cell-specific member of th T200 glycoprotein family. Nature. 289 (5799), 681-683 (1981).
- Montecino-Rodriguez, E., Dorshkind, K. B-1 B cell development in the fetus and adult. Immunity. 36 (1), 13-21 (2012).
- Bermea, K., Bhalodia, A., Huff, A., Rousseau, S., Adamo, L. The role of B cells in cardiomyopathy and heart failure. Current Cardiology Reports. , 01722-01724 (2022).
- Zhao, T. X., et al. Rituximab in patients with acute ST-elevation myocardial infarction: an experimental medicine safety study. Cardiovascular Research. 118 (3), 872-882 (2022).
- Kushnir, N., et al. B2 but not B1 cells can contribute to CD4+ T-cell-mediated clearance of rotavirus in SCID mice. Journal of Virology. 75 (12), 5482-5490 (2001).
