Summary
In dieser Arbeit wird ein in vitro Rekonstitutionsansatz verwendet, um die Poroelastizität von Aktomyosingelen unter kontrollierten Bedingungen zu untersuchen. Die Dynamik des Aktomyosingels und des eingebetteten Lösungsmittels wird quantifiziert, wodurch die Netzwerkporoelastizität nachgewiesen wird. Wir diskutieren auch die experimentellen Herausforderungen, häufige Fallstricke und die Relevanz für die Mechanik des Zellzytoskeletts.
Abstract
Zellen können aktiv ihre Form verändern und beweglich werden, eine Eigenschaft, die von ihrer Fähigkeit abhängt, ihre innere Struktur aktiv neu zu organisieren. Diese Eigenschaft wird auf die mechanischen und dynamischen Eigenschaften des Zellzytoskeletts zurückgeführt, insbesondere auf das Aktomyosin-Zytoskelett, das ein aktives Gel aus polaren Aktinfilamenten, Myosinmotoren und akzessorischen Proteinen ist, die intrinsische Kontraktionseigenschaften aufweisen. Die allgemein akzeptierte Ansicht ist, dass sich das Zytoskelett wie ein viskoelastisches Material verhält. Dieses Modell kann jedoch nicht immer die experimentellen Ergebnisse erklären, die eher mit einem Bild übereinstimmen, das das Zytoskelett als poroelastisches aktives Material beschreibt - ein elastisches Netzwerk, das in Zytosol eingebettet ist. Kontraktilitätsgradienten, die von den Myosinmotoren erzeugt werden, treiben den Fluss des Zytosols durch die Gelporen an, was darauf schließen lässt, dass die Mechanik des Zytoskeletts und des Zytosols eng gekoppelt sind. Ein Hauptmerkmal der Poroelastizität ist die diffusive Relaxation von Spannungen im Netzwerk, die durch eine effektive Diffusionskonstante gekennzeichnet ist, die vom Elastizitätsmodul des Gels, der Porosität und der Viskosität des Zytosols (Lösungsmittels) abhängt. Da Zellen viele Möglichkeiten haben, ihre Struktur und Materialeigenschaften zu regulieren, ist unser derzeitiges Verständnis darüber, wie die Mechanik des Zytoskeletts und die Dynamik des Zytosolflusses gekoppelt sind, noch wenig verstanden. Hier wird ein in vitro Rekonstitutionsansatz verwendet, um die Materialeigenschaften von poroelastischen Aktomyosingelen als Modellsystem für das Zellzytoskelett zu charakterisieren. Die Gelkontraktion wird durch die motorische Kontraktilität des Myosins angetrieben, die zur Entstehung eines Flusses des eindringenden Lösungsmittels führt. Der Artikel beschreibt, wie diese Gele hergestellt und Experimente durchgeführt werden. Wir diskutieren auch, wie der Lösungsmittelfluss und die Gelkontraktion sowohl auf lokaler als auch auf globaler Ebene gemessen und analysiert werden können. Die verschiedenen Skalierungsrelationen, die für die Datenquantifizierung verwendet werden, werden angegeben. Abschließend werden die experimentellen Herausforderungen und häufigen Fallstricke diskutiert, einschließlich ihrer Relevanz für die Mechanik des Zellzytoskeletts.
Introduction
Lebende Zellen haben einzigartige mechanische Eigenschaften. Neben der Fähigkeit, passiv auf einwirkende Kräfte zu reagieren, sind sie auch in der Lage, aktiv Kräfte als Reaktion auf äußere Reize zu erzeugen1. Diese Eigenschaften, die für eine Vielzahl von zellulären Prozessen, insbesondere während der Zellmotilität, unerlässlich sind, werden in erster Linie auf die mechanischen und dynamischen Eigenschaften des Zellzytoskeletts zurückgeführt, insbesondere auf das Aktomyosin-Zytoskelett, das ein aktives Gel aus polaren Aktinfilamenten, Myosin-Molekularmotoren und akzessorischen Proteinen ist. Diese Aktomyosin-Netzwerke weisen intrinsische Selbstorganisations- und Kontraktionseigenschaften auf, die von den Myosin-Motorproteinen angetrieben werden, die die Aktinfilamente vernetzen und aktiv mechanische Spannungen in dem Netzwerk erzeugen, das durch ATP-Hydrolyse angetrieben wird2.
Zahlreiche experimentelle und theoretische Studien wurden durchgeführt, um die Materialeigenschaften des Zytoskeletts3 zu untersuchen. Die allgemein akzeptierte Ansicht ist, dass sich das Zytoskelett wie ein viskoelastisches Material verhält4. Das bedeutet, dass sich das Zytoskelett auf kurzen Zeitskalen wie ein elastisches Material verhält und sich auf langen Zeitskalen aufgrund der Vernetzung von Proteinen und der Ablösung (und Wiederanheftung) des Myosinmotors wie eine viskose Flüssigkeit verhält, wodurch sich das Netzwerk dynamisch drehen kann. In vielen Situationen kann das viskoelastische Modell jedoch nicht die experimentellen Ergebnisse beschreiben, die eher mit einem Bild übereinstimmen, das das Zytoskelett und allgemeiner das Zellzytoplasma als poroelastisches aktives Material beschreibt 5,6. Zwei Hauptmerkmale charakterisieren diese Art von Materialien. (i) Das erste Hauptmerkmal ist die Erzeugung eines Flusses des eindringenden Zytosols (des "Lösungsmittels") durch die Gelporen durch Kontraktilitätsgradienten, die von den Myosinmotoren angetrieben werden, was Prozessen wie Zellblasen7, Motilität8 und Zellformoszillationen9 zugrunde liegt. Die Entstehung solcher zytosolischen Flüsse kann lokal sein, zum Blebbing, oder global, wie bei der Zellmotilität. Im letzteren Fall treiben die kontraktil aufgebrachten Spannungen an der Zellrückseite den Fluss der zytosolischen Flüssigkeit in Richtung Zellfront an, wodurch der Proteinpool wieder aufgefüllt wird, der für die Lamellipodien-Assemblierung benötigtwird 8. (ii) Das zweite Hauptmerkmal besteht darin, dass die Relaxation von Spannungen diffusiv ist und durch eine effektive Diffusionskonstante gekennzeichnet ist, die vom Elastizitätsmodul des Gels, der Porosität des Gels und der Viskosität des Lösungsmittelsabhängt 5. Die poroelastische Diffusionskonstante bestimmt, wie schnell das System auf eine aufgebrachte Spannung reagiert. Höhere Diffusionskonstanten entsprechen einer schnelleren Spannungsumverteilung. Dies wiederum bestimmt, wie lange es dauert, bis die intrazelluläre zytosolische Flüssigkeit nach mechanischer Belastung, sei es von außen oder von innen, wie z. B. den aktiven kontraktilen Belastungen, die von Myosinmotoren erzeugt werden, innerhalb der Zelle umverteilt wird. Diese Beispiele zeigen somit, dass die Mechanik des Zytoskeletts und des Zytosols eng gekoppelt sind und nicht getrennt voneinander behandelt werden können3.
Da Zellen ihre mechanischen Eigenschaften auf unterschiedliche Weise regulieren können, ist das Zusammenspiel zwischen Netzwerkmechanik und Strömungsdynamik noch wenig verstanden. Ein leistungsfähiger alternativer Ansatz ist die Verwendung von in vitro rekonstituierten Systemen, die eine vollständige Kontrolle über die verschiedenen mikroskopischen Bestandteile und die Systemparameter ermöglichen, wodurch diese Modellsysteme optimal für die physikalische Analyse geeignet sind10,11. Dieser Ansatz wurde erfolgreich eingesetzt, um den Einfluss der Proteinzusammensetzung und der Systemgeometrie auf die Aktin-basierte Motilität 12,13,14,15,16,17,18 und die 2D-Musterung von Aktomyosin-Netzwerken 19,20,21,22 zu untersuchen und das Zusammenspiel zwischen Netzwerkkontraktilität und Fluidströmungsdynamik poroelastischer Aktomyosingele, das im Mittelpunkt dieser Arbeitsteht 23.
In diesem Manuskript wird die Herstellung von kontraktilen elastischen Aktomyosin-Netzwerken mit kontrollierbaren Dimensionen und Materialeigenschaften auf der Grundlage der Arbeiten von Ideses et al.23 diskutiert. Die Dynamik des kontrahierenden Gels und des drainierten Lösungsmittels wird analysiert und quantifiziert, wodurch gezeigt wird, dass diese Aktomyosingele als poroelastisches aktives Material beschrieben werden können. Die Untersuchung des Einflusses der Lösungsmittelviskosität auf die Spannungsdiffusionsfähigkeit bestätigt die poroelastische Natur dieser Netzwerke. Die verschiedenen Skalierungsrelationen, die für die Datenquantifizierung verwendet werden, werden bereitgestellt. Schließlich werden auch die experimentellen Herausforderungen, die häufigsten Fallstricke und die Relevanz der experimentellen Ergebnisse für das Zellzytoskelett diskutiert.
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Protocol
1. Glasoberflächenbehandlung und Passivierung:
HINWEIS: Dieser Abschnitt umfasst drei Hauptschritte (siehe Abbildung 1): (i) Reinigung und Hydrophilierung, (ii) Silanisierung und (iii) Oberflächenpassivierung.
- Reinigung und Hydrophilierung
- Verwenden Sie Piranha-Lösung für die Reinigung von Glasoberflächen.
HINWEIS: Die Piranha-Lösung ist ein Gemisch aus 30 % H2 O2 und 70 %H2 SO4 (Materialtabelle). Sein Hauptziel ist es, organische Verunreinigungen von Deckglasoberflächen zu entfernen und die OH-Gruppen auf der Glasoberfläche freizulegen. Auf diese Weise wird die Glasoberfläche hydrophil. - Legen Sie 10-12 #1,5 (22 mm x 22 mm) Glasdeckgläser (Materialtabelle) in einen selbstgebauten Polytetrafluorethylenhalter (Grundfläche: 5,5 cm x 5,5 cm). Übertragen Sie den Polytetrafluorethylenhalter in ein 400-ml-Becherglas (Materialtabelle) und inkubieren Sie ihn 2 h lang mit 300 ml Piranha-Lösung. Führen Sie diesen Schritt auf Eis und in einer chemischen Haube durch.
Anmerkungen: Die an der Halterbasis verschraubte Polytetrafluorethylenstange ist 12 cm lang und damit länger als der Becher (11 cm), was ein sicheres Umsetzen/Herausziehen des Halters in/aus der Piranha-Lösung ermöglicht. Da die Piranha-Lösung immer noch sehr reaktiv und sehr heiß sein kann, ist es unbedingt erforderlich, die Reaktion zu stoppen. Der einfachste Weg, die Reaktion zu stoppen, besteht darin, die Piranha-Lösung in (Leitungs-)Wasser zu gießen, um eine 50-fache Verdünnung (mindestens) zu erreichen. Die Lösung kann dann bedenkenlos entsorgt werden. Bewahren Sie die gebrauchte Piranha-Lösung niemals in einer geschlossenen Glasflasche auf – dies könnte zu einer Flaschenexplosion führen. - Füllen Sie den Polytetrafluorethylenhalter in ein sauberes Becherglas, das mit frischem doppelt destilliertem Wasser (DDW) gefüllt ist, um überschüssigen Piranha von den Deckgläsern zu waschen.
- Füllen Sie das Becherglas in ein Beschallungsbad (Materialtabelle) und beschallen Sie es 10 Minuten lang bei 80 Hz bei voller Leistung bei 25 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zwei weitere Male mit frischem DDW. Verwenden Sie jedes Mal frisches DDW.
- Verwenden Sie Piranha-Lösung für die Reinigung von Glasoberflächen.
- Silanisierung
- Füllen Sie den Halter in ein sauberes Becherglas (400 ml), das mit 300 ml reinem Methanol gefüllt ist (Materialtabelle) und dann in ein Beschallungsbad (Materialtabelle). Beschallung bei 80 Hz bei voller Leistung für 30 min bei 25 °C.
- Nach der Beschallung wird der Halter in eine Silanlösung überführt, die mit 15 ml DDW, 3,1 ml Essigsäure (Materialtabelle), 340 ml Methanol und 7,6 ml Silan ((3-Mercaptopropyl)trimethoxysilan) hergestellt wurde (Materialtabelle). Den Becher mit Parafilm verschließen und über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank aufbewahren.
Anmerkungen: Die Herstellung und Handhabung der Silanlösung muss in einer chemischen Haube erfolgen. Geben Sie nach dem Silanisierungsschritt die verbrauchte Silanlösung (Abfall) in eine spezielle Glasflasche in der Chemikalienhaube. - Am nächsten Tag wird der Halter für 15 s in ein sauberes Becherglas gefüllt, das mit 300 ml reinem Methanol gefüllt ist. Setzen Sie dann den Halter in ein sauberes Becherglas ein, nicht bevor Sie den Boden des Polytetrafluorethylenhalters getrocknet haben, um überschüssiges Methanol zu entfernen. Stellen Sie das Becherglas in den Ofen (Materialtabelle), um die Glasdeckgläser 5 min bei 120 °C zu trocknen.
- Oberflächenpassivierung mit einem inerten Polymer
- Erreichen Sie eine Oberflächenpassivierung, indem Sie die Glasdeckgläser mit einem inerten Polymer inkubieren (Materialtabelle). Nehmen Sie für jedes Experiment zwei Deckgläser und legen Sie sie in eine Petrischale, die mit einer Parafilmschicht beschichtet ist, die zunächst mit Ethanol (EtOH) gereinigt wurde (DDW/EtOH: 30/70 vol/vol) (Materialtabelle).
- Inkubieren Sie jedes Deckglas mit 1 ml eines 4 mg·ml−1 5 kDa molekularen Methoxy-Polyethylenglykolmaleimid (mPEG-mal, Mw = 5 kDa) (Materialtabelle) in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (Materialtabelle) für 1 h bei 22 °C.
Anmerkungen: Durch das Platzieren der Deckgläser auf einer hydrophoben Parafilmschicht wird die hydrophile PEG-Polymerlösung auf die Oberfläche des Glasdeckglases beschränkt. Die Inkubationszeit ist entscheidend für eine optimale Passivierung. Verwenden Sie die Inkubationszeiten zwischen 45 min und 2 h. Oberhalb dieser Inkubationszeit kann sich die Oberfläche der Glasdeckgläser verschlechtern, was zu Proteinadhäsion und Transparenzverlust führt. - Spülen Sie am Ende des Inkubationsprozesses jedes Deckglas mit 5 ml DDW aus und trocknen Sie es mit einem Fluss vonN2 (Gas). Trocknen Sie die Deckgläser nicht unter Vakuum. Da die Deckgläser nach der Passivierung feucht gehalten werden müssen, geben Sie sofort 1 ml 10 mM Tris auf die pegylierten Oberflächen. Verwenden Sie die Deckgläser innerhalb von 2 Stunden.
Anmerkungen: Die verschiedenen Schritte müssen in einer Laminar-Flow-Kammer durchgeführt werden, um eine Kontamination der Glasoberfläche zu vermeiden.
2. Protein-Reinigung
- Reinigen Sie G-Aktin aus Acetonpulver der Skelettmuskulatur von Kaninchen mit der Gelfiltrationsmethode24.
- Die Aktinreinigung dauert 1 Woche. Bewahren Sie das gereinigte G-Aktin in G-Puffer auf (5 mM Tris pH 7,8, 0,01 % NaN3, 0,1 mM CaCl 2,0,2 mM ATP und 1 mM DTT) und lagern Sie es auf Eis. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 2 Wochen.
Anmerkungen: Ersetzen Sie das Eis alle paar Tage. - Markierung des Aktins mit einem maleimidmodifizierten Fluoreszenzfarbstoff16 (Materialtabelle). Reinigen Sie das GST-Fascin nach der Methode von Ono et al.25. Beide Proteine werden in flüssigem N2 schockgefroren und bei −80 °C gelagert.
- Die Aktinreinigung dauert 1 Woche. Bewahren Sie das gereinigte G-Aktin in G-Puffer auf (5 mM Tris pH 7,8, 0,01 % NaN3, 0,1 mM CaCl 2,0,2 mM ATP und 1 mM DTT) und lagern Sie es auf Eis. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 2 Wochen.
- Verwenden Sie ein Standardprotokoll zur Aufreinigung von Myosin II aus dem Skelettmuskel26 des Kaninchens. Der gereinigte Myosin-II-Puffer (Dimere) enthält 10 mM Tris pH 7,4, 0,5 M KCl und 35 % w/v Saccharose. Das Myosin wird in FlüssigkeitN2 schockgefroren und bei −80 °C gelagert.
Anmerkungen: Die hohe Konzentration von KCl hält die Myosinmotoren in einer dimeren Form, während der hohe Anteil an Saccharose sicherstellt, dass die Aktivität der Motoren beim Einfrieren nicht beeinträchtigt wird. Verwenden Sie eine spezielle Pipette für die Handhabung viskoser Flüssigkeiten, wenn Sie mit Myosin II-Stammlösungen arbeiten (Materialtabelle).- Markierung der Myosin-II-Dimere mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Materialtabelle) an Paaren von technisch hergestellten Cysteinresten19,27. Verwenden Sie zu diesem Zweck eine Hühnermagen-RLC-Mutante A26. Das markierte Myosin II wird in FlüssigkeitN2 schockgefroren und bei −80 °C gelagert.
HINWEIS: Dieses Markierungsverfahren stellt sicher, dass das markierte Myosin als natives Myosin II-Protein aktiv ist.
- Markierung der Myosin-II-Dimere mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Materialtabelle) an Paaren von technisch hergestellten Cysteinresten19,27. Verwenden Sie zu diesem Zweck eine Hühnermagen-RLC-Mutante A26. Das markierte Myosin II wird in FlüssigkeitN2 schockgefroren und bei −80 °C gelagert.
- Verwenden Sie ein UV-Vis-Spektralphotometer (Materialtabelle), um die Absorption der Stammproteinlösungen zu messen, und leiten Sie die Proteinkonzentrationen mit dem Beer-Lambert-Gesetz unter Verwendung der folgenden Extinktionskoeffizienten ab: G-Aktin (ε290 = 26.460 M−1·cm−1), GST-Fascin (ε 280 = 99.330 M−1·cm−1), Myosin-II-Dimer (ε280 = 268.800 M−1·cm−1), und RLC-Mutante A (ε280 = 3.960 M−1·cm−1)19.
3. Probenvorbereitung
HINWEIS: Polymerisieren Sie die Aktinmonomere in Gegenwart großer Aggregate von Myosin-II-Motoren und dem starken passiven Vernetzer Fascin zur Herstellung makroskopisch kontraktiler elastischer Aktomyosin-Netzwerke19,23. Die Zugabe von fluoreszierenden Kügelchen zur Lösung ermöglicht es, den Lösungsmittelfluss während der Gelkontraktion zu verfolgen.
- Proteinlösung ("Aktomyosin")
- Mit Ausnahme von G-Aktin sollten die Proteine in kleinen Aliquoten bei −80 °C aufbewahrt und vor der Verwendung bei 37 °C aufgetaut werden. Das Gesamtvolumen der Aktomyosinlösung beträgt 40 μl.
- Bereiten Sie die Lösung vor, indem Sie 10 mM Tris pH 7,4, 2 mMMgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, ein ATP-Regeneriersystem (0,5 mg·ml−1 Kreatinkinase und 5 mM Kreatinphosphat), 200 μM EGTA (Chelate Ca2+ -Ionen), eine Anti-Bleichlösung (0,1 mg·ml−1 Glukoseoxidase, 0,018 mg·ml−1 Katalase und 5 mg·ml−1 Glukose), 5 μM G-Aktin, 280 nM GST-Faschin und 1,67 nM Myosin II. Der prozentuale Anteil an markiertem G-Aktin beträgt 5% (molare Prozentzahl).
Anmerkungen: Verwenden Sie einen geringen Prozentsatz an markiertem G-Aktin, um die Sättigung des Fluoreszenzsignals in den fortgeschrittenen Stadien der Gelkontraktion zu vermeiden.
- Herstellung von Myosin-II-Motoraggregaten
- Fügen Sie der Proteinlösung die Myosinmotoren in Form von Aggregaten hinzu. Um große Myosin-Aggregate (150 Myosin-Dimere/Aggregat) zu bilden, wird die Myosin-Stammlösung mit 10 mM Tris pH 7,4 verdünnt, um eine Endkonzentration von 25 mM KCl zu erreichen.
- Bewahren Sie die verdünnte Myosinlösung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) auf und geben Sie sie dann bis zur Verwendung auf Eis. Die Motoren sind bis zu 2 h voll aktiv.
- Messung des Lösemittelflusses
- Um den Lösungsmittelfluss durch die Gelporen zu verfolgen, fügen Sie die fluoreszierenden Kügelchen der Aktomyosinlösung hinzu. Reduzieren Sie die Wechselwirkung zwischen den Beads und dem Aktomyosin-Netzwerk, indem Sie die Beads passivieren. In der Praxis inkubieren Sie 1 μl Kügelchen (Materialtabelle) mit 5 μM G-Aktin für 20 min bei RT und entfernen dann überschüssiges G-Aktin durch Zentrifugation (Materialtabelle) (Bedingungen: 6.000 x g für 5 min bei 4 °C).
- Wiederholen Sie diesen Schritt mit 10 mg·ml−1 Rinderserumalbumin (BSA) (Materialtabelle), um (möglicherweise) die verbleibende unbeschichtete Oberfläche zu blockieren. Verwenden Sie die Kügelchen in einer Endverdünnung von 1:10.000 vol/vol in den Experimenten.
Anmerkungen: Es ist wichtig, den Durchmesser der Perlen so an die Gelporengröße anzupassen, dass das Verhältnis von Perle zu Porengröße in allen Phasen <1 beträgt.
- Einfluss der Viskosität der Lösung
- Kontrollieren Sie die Viskosität der Lösung, indem Sie der Aktomyosinlösung Glycerin (Materialtabelle) hinzufügen. Die Zugabe von Glycerin in einem Gewichtsprozentbereich von 0 % bis 34 % induziert eine entsprechende Erhöhung der Lösungsviskosität von η ω auf 2,76 η ω, wobei η ω die Viskosität von Wasser bei 20 °C28 ist.
HINWEIS: Bei der Arbeit mit Glycerin ist es wichtig, eine spezielle Pipette für die Handhabung viskoser Flüssigkeiten zu verwenden (Materialtabelle).
- Kontrollieren Sie die Viskosität der Lösung, indem Sie der Aktomyosinlösung Glycerin (Materialtabelle) hinzufügen. Die Zugabe von Glycerin in einem Gewichtsprozentbereich von 0 % bis 34 % induziert eine entsprechende Erhöhung der Lösungsviskosität von η ω auf 2,76 η ω, wobei η ω die Viskosität von Wasser bei 20 °C28 ist.
4. Durchführen eines Experiments
- Hausgemachtes Probenhalter-Handling
- Nehmen Sie eines der PEG-passivierten Deckgläser, legen Sie einen gefetteten Parafilm-Abstandshalter darauf und legen Sie es in den Probenhalter.
Anmerkungen: Man kann den Parafilm-Abstandshalter durch einen beliebigen Abstandshalter ersetzen.
- Nehmen Sie eines der PEG-passivierten Deckgläser, legen Sie einen gefetteten Parafilm-Abstandshalter darauf und legen Sie es in den Probenhalter.
- Herstellung der Aktomyosinlösung
- Bereiten Sie die Aktomyosinlösung auf Eis in einem Mikrozentrifugenröhrchen zu, indem Sie die verschiedenen mikroskopischen Bestandteile einbauen, die Myosin-II-Motoraggregate hinzufügen und zuletzt EGTA hinzufügen. Mischen Sie die Lösung gut. Die Zugabe von EGTA initiiert die Polymerisation des Aktomyosin-Netzwerks, die den Startzeitpunkt des Experiments festlegt.
- Geben Sie 1,1 μl dieser Lösung auf das am Halter befestigte Deckglas und legen Sie das zweite Deckglas darauf. Schrauben Sie den Halter fest, um die Probe zu versiegeln. Bei diesem Vorgang wird der Tropfen leicht zusammengedrückt, der eine scheibenartige Form annimmt. Die Tropfendurchmesser liegen zwischen 2.800 und 3.000 μm.
- Setzen Sie den Probenhalter auf das Mikroskop und starten Sie die Aufnahme. Bereiten Sie das Mikroskop im Voraus vor, um die anfängliche Erfassungszeit zu verkürzen. Es dauert in der Regel 1-2 Minuten nach dem Mischen, um mit der Probenbildgebung zu beginnen.
5. Mikroskopie-Techniken
- Bilden Sie die Proben mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop (Materialtabelle) ab, das von einer speziellen Software (Materialtabelle) gesteuert wird.
- Verwenden Sie niedrige Vergrößerungen von 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR Objektiv (Materialtabelle), um den gesamten Gelbereich zu visualisieren und seine makroskopische Kontraktion mit der Zeit zu verfolgen.
- Verwenden Sie ein 10x/0,3 Ph1 UPlanFL-Objektiv (Table of Materials), um die Porosität und Struktur des Netzwerks zu charakterisieren und die Selbstorganisation und Kontraktion des Netzwerks mit der Zeit zu verfolgen.
HINWEIS: Dieses Objektiv ist auch nützlich, um die Myosin-II-Motoraggregate innerhalb des Netzwerks zu lokalisieren und die Bewegung fluoreszierender Kügelchen durch die Gelporen zu verfolgen. Höhere Vergrößerungen können auf Kosten eines reduzierten Sichtfelds verwendet werden, was im zweifarbigen Bildmodus noch wichtiger ist (Materialtabelle).
- Die Proben werden bei 488 nm (Aktin/Fluoreszenz-Beads) und 561 nm (Myosin-Motoraggregate/Fluoreszenz-Beads) angeregt. Erfassen Sie die Bilder mit einer Geschwindigkeit von 100 ms pro Bild mit einer speziellen Software (Table of Materials) im Streaming-Modus mit einer EMCCD-Kamera (Electron Multiplying Charge-Coupled Device) (Table of Materials).
HINWEIS: Die Intensität der Leuchtstofflampe (Materialtabelle) sollte auf dem niedrigstmöglichen Wert gehalten werden, um eine Signalsättigung während der Netzwerkkontraktion zu vermeiden. - Simultane zweifarbige Bildgebung
- Verwenden Sie diesen Modus für zwei Zwecke: (i) Detektion der Lokalisation der Myosinmotoraggregate innerhalb des Aktinnetzwerks und (i) Charakterisierung des nach außen gerichteten Lösungsmittelflusses innerhalb und außerhalb während der Netzwerkkontraktion.
- Die Aktin- und Myosin-II-Motoren werden bei 488 nm bzw. 561 nm angeregt und die Bilder gleichzeitig auf einer EMCCD-Kamera (Materialtabelle) mit einer Dual-Emission-Apparatur (Materialtabelle) aufgenommen. Verwenden Sie dasselbe Bildgebungssystem, um gleichzeitig das Aktingel (488 nm) und die fluoreszierenden Kügelchen (561 nm) abzubilden.
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Representative Results
Pro Versuch werden zwei Glasdeckgläser verwendet. Die Glasdeckgläser werden mit PEG-Polymeren gereinigt und passiviert. Die Passivierung ist unerlässlich, um zu verhindern, dass die gelösten Proteine bereits in frühen Versuchsstadien an den Glasoberflächen haften und um die Wechselwirkung des kontrahierenden Netzwerks mit den Glaswänden zu minimieren. Gelingt es nicht, eine gute Passivierung zu erreichen, kann dies zu einer ineffizienten Kontraktion führen und im Extremfall sogar die Bildung von Aktinnetzwerken hemmen.
Abbildung 1 beschreibt die drei Hauptschritte der Oberflächenbehandlung. Diese Schritte umfassen Folgendes: (i) Oberflächenreinigung und Hydrophilierung mit einer Piranha-Lösung, die organische Verunreinigungen von den Deckglasoberflächen entfernt und die OH-Gruppen auf der Glasoberfläche freilegt; ii) Oberflächensilanisierung mit (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilan, die darauf abzielt, das Silan kovalent an die Glasoberfläche zu binden, wobei jedes Silanmolekül mit einer SH-Gruppe endet; (iii) Passivierung mit PEG-Polymeren (mPEG-mal, 5 kDa) – in diesem Schritt interagiert die Maleimidgruppe des PEG-Polymers kovalent mit der SH-Gruppe auf dem (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilan, was zur Bildung einer PEG-Monoschicht auf der Glasoberfläche führt.
Für die Piranha-Behandlung und Silanisierung werden 10-12 Glasdeckgläser #1.5 (22 mm x 22 mm) in einen Polytetrafluorethylen-Halter (Abbildung 2A) gelegt und dieser Halter in ein 400-ml-Becherglas überführt. Für den Passivierungsschritt werden zwei Glasdeckgläser auf eine parafilmbeschichtete Petrischale übertragen (Abbildung 2B). Durch das Aufbringen der Deckgläser auf einer hydrophoben Parafilmschicht wird sichergestellt, dass die hydrophile PEG-Polymerlösung während der gesamten Inkubationszeit auf der Glasoberfläche verbleibt. Jedes Deckglas wird mit 1 mL 4 mg·mL−1 5 kDa mPEG-mal in 1x PBS für 1 h bei 22 °C inkubiert (Abbildung 2B). Für das Molekulargewicht und die Konzentration dieses PEG-Polymers führt die Glaspassivierung zur Bildung einer PEG-Monoschicht, wobei jedes PEG-Polymer in einer pilzartigen Konformation29 vorliegt. Am Ende des Inkubationsprozesses wird jedes Deckglas mit 5 ml DDW gespült und mit einem Fluss vonN2 (Gas) getrocknet. Wenn die Deckgläser nicht sofort verwendet werden, sollte 1 ml 10 mM Tris auf die pegylierten Oberflächen aufgetragen werden, um die Deckglasoberflächen feucht zu halten. Die Deckgläser werden kurz vor Beginn eines Experiments mit einem Durchfluss vonN2 (Gas) getrocknet. Es ist besser, die Deckgläser innerhalb von 2 Stunden zu verwenden.
Makroskopisch kontraktile elastische Aktomyosin-Netzwerke werden durch Mischen von 5 μM G-Aktin mit 16,7 nM Myosin gebildet, das in Form von großen Aggregaten (~150 Myosin-Dimeren/Aggregaten) und 280 nM des starken Vernetzers Faschin zugegeben wird. Die Lösung enthält 1 mM ATP, das mit einem ATP-regenerierenden System und einer Anti-Bleichlösung konstant gehalten wird (siehe Details im Abschnitt Protokoll). Um den Fluss des eindringenden Lösungsmittels zu analysieren, werden der Aktomyosinlösung fluoreszierende Kügelchen zugesetzt.
Die Experimente werden in einem selbstgebauten Probenhalter durchgeführt, der den Abmessungen eines Standard-Mikroskoptisches entspricht (Abbildung 3). Ein gefetteter Parafilm-Abstandshalter mit einer Dicke von h (~150 μm) wird auf eines von zwei PEG-passivierten Deckgläsern aufgebracht, und dieses Deckglas wird in den Probenhalter gelegt (Abbildung 3A). Dann wird die Aktomyosinlösung auf Eis in einem Mikrozentrifugenröhrchen hergestellt, indem die verschiedenen mikroskopischen Bestandteile eingearbeitet werden, zuletzt das G-Aktin, Myosin-Aggregate und dann EGTA, das die Aktinpolymerisation auslöst, hinzugefügt werden. Die Lösung muss gut gemischt werden - dies legt die Startzeit der Experimente fest (t = 0). Sofort werden 1,1 μl dieser Lösung auf das Deckglas gegeben (Abbildung 3B), das zweite PEG-passivierte Deckglas wird darauf gelegt (Abbildung 3C) und der Halter wird verschraubt, um den Tropfen zwischen ihnen zu begrenzen (Abbildung 3D). Für dieses Tropfenvolumen und diesen Abstandshaltertyp beträgt der Tropfendurchmesser etwa 3.000 μm, aber die Forscher sollten sich nicht auf diese geschätzten Werte verlassen. Die tatsächliche Tropfendicke und der Durchmesser sollten immer direkt aus den Mikroskopiebildern gemessen werden. Für die Dicke sollte ein konfokales Mikroskop verwendet werden.
Der Probenhalter wird auf das Mikroskop aufgesetzt und die Erfassung gestartet. Das Mikroskop sollte im Voraus vorbereitet werden, um die Zeit bis zum Beginn der Aufnahme auf ein Minimum zu reduzieren. In der Regel dauert es 1-2 Minuten, um mit der Probenbildgebung zu beginnen. Die Proben werden bei 488 nm und/oder 561 nm angeregt und mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop abgebildet, das von einer speziellen Software gesteuert wird. Die Bilder sollten mit einer Geschwindigkeit von 100 ms pro Bild (oder weniger) im Streaming-Modus mit einer EMCCD-Kamera aufgenommen werden. Um gleichzeitig das Aktinnetzwerk und die Myosinmotoraggregate bzw. die fluoreszierenden Beads in der Lösung abzubilden, sollte ein Dual-Emission-System verwendet werden. Die Intensität der Leuchtstofflampe sollte so gering wie möglich gehalten werden, um eine Signalsättigung in den fortgeschrittenen Stadien der Netzwerkkontraktion zu vermeiden.
Ein 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR-Objektiv wird verwendet, um die laterale Kontraktionsdynamik des Gels und die Strömungsrichtung und -geschwindigkeit des Fluids auf der Längenskala des Gels zu charakterisieren. Dabei handelt es sich um niedrig aufgelöste Bilder, die nützlich sind, um die Änderungen des Gelradius mit der Zeit zu verfolgen, aus denen die radiale (laterale) Kontraktionsgeschwindigkeit des Gels abgeleitet werden kann. Um die Struktur und Porosität des Netzwerks, die Position der Myosinmotoraggregate innerhalb des Netzwerks und die Bewegung einzelner fluoreszierender Beads durch die Gelporen aufzulösen, sollten Objektive mit höherer Vergrößerung verwendet werden (z. B. ein 10x/0,3 Ph1 UPlanFL-Objektiv). Höhere Vergrößerungen können ebenfalls verwendet werden, jedoch auf Kosten eines reduzierten Sichtfelds, was bei Verwendung des zweifarbigen Bildgebungsmodus von größerer Bedeutung ist. Die (2D-)Fluoreszenzmikroskopiedaten sollten durch eine konfokale Bildgebung des kontrahierenden Gels in 3D ergänzt werden, um die Kontraktionsdynamik sowohl in lateraler als auch in vertikaler Richtung zu charakterisieren. Die konfokale Mikroskopie wird verwendet, um den Abstand zwischen den beiden Deckgläsern zu messen - dieser Abstand definiert die anfängliche Geldicke. Zusätzlich sollte die Dicke des Gels am Ende des Experiments gemessen werden, wenn ein mechanisch stabiler Zustand erreicht ist.
Mehrere Kriterien müssen erfüllt sein, um zu zeigen, dass sich die Aktomyosin-Netzwerke wie ein poroelastisches Material verhalten: (i) das Netzwerk baut sich nicht um, was darauf schließen würde, dass es sich wie ein elastisches Material verhält (Abbildung 4), (ii) der Wasserfluss (Lösungsmittel) durch die Gelporen wird durch die Myosinkontraktilität angetrieben (Abbildung 5), und (iii) die elastische Spannungsrelaxation ist durch eine effektive Diffusionskonstante gekennzeichnet, D ~ κ/γ, das vom effektiven Elastizitätsmodul des Gels (κ) abhängt, und der effektiven Reibungskonstante γ, die für die Reibung zwischen dem sich bewegenden Lösungsmittel und den Gelporen verantwortlich ist (Abbildung 6). Im Folgenden gehen wir auf jedes Kriterium einzeln ein und zeigen, wie es im aktuellen System erfüllt wird.
Ziel (i)
Zunächst sollte die Gelstruktur und Porosität analysiert und festgestellt werden, ob sich das Netzwerk dynamisch umbaut. Eine schematische Darstellung des Aktomyosin-Netzwerks ist in Abbildung 4A dargestellt. Die Netzwerkbildung beginnt mit der spontanen Nukleation und Polymerisation der Aktinfilamente, die sich anschließend bündeln (Abbildung 4B). Das Netzwerk organisiert sich dann aktiv selbst zu einem makroskopisch isotrop miteinander verbundenen Netzwerk von Aktinbündeln, das sich mit der Zeit dynamisch vergröbert und schließlich zusammenzieht. Die Selbstorganisation und Kontraktion des Netzwerks wird durch die Myosin-Aggregate angetrieben, die überwiegend an den Schnittpunkten der Filamentbündel lokalisiert sind (Abbildung 4C). Die Myosin-Aggregate bleiben durch Gelkontraktion an das Netzwerk gebunden, woraus geschlossen werden kann, dass sich diese Aktomyosin-Gele als elastische aktive Materialien verhalten (Abbildung 4C). Darüber hinaus wird die Kontraktion in diesen Aktomyosin-Gelen durch das Gleiten des Filaments bestimmt, was durch den Vergleich der End-to-End-Abstände der Filamentbündel, l Ende-zu-Ende, und der Konturlängen, lcont, abgeleitet wird (Abbildung 4D,E). Dies steht im Gegensatz zur Kontraktion von losen, durch α-Aktinin vernetzten Aktinbündeln, die von Aktinfilamentknickendominiert werden 29.
Die Porosität des Gels wird durch die Größe der Gelporen charakterisiert, durch die sich der Lösungsmittelstrom bewegt. Für gereinigte Aktinnetzwerke liefert die Maschenweite, die den Abstand zwischen den Quervernetzungen im Gel (hier die Myosinaggregate) definiert, auch eine gute Abschätzung der Gelporengröße. Die Maschenweite kann direkt aus den (2D-)Fluoreszenzbildern extrahiert werden und wird aus dem geometrischen Mittel der Abstände zwischen Paaren gegenüberliegender Aktinbündel in einer Gelpore ausgewertet (Abbildung 4B). Da das Netzwerk bis zum Einsetzen der Kontraktion isotrop ist, sind die mittleren Maschenweiten in vertikaler (d. h. über die Dicke) und lateraler (entlang des Radius) Richtung gleich, ξ 0, = ξ 0,ll
= ξ0 ( = 67 μm). Da die Aktinbündel während der Kontraktion gerade bleiben, schrumpfen die Netz- und Porengrößen proportional zu den Änderungen der Geldicke und des Durchmessers. Für das aktuelle experimentelle System beginnt die (radiale) Kontraktion in der Ebene, nachdem die vertikale Kontraktion praktisch beendet ist (nicht gezeigt), so dass die radiale Kontraktion mit einer konstanten Geldicke verläuft, die um den Faktor ~0,3 kleiner ist als die ursprüngliche Dicke. Während also die Maschenweite innerhalb der Kontraktionsebene, ξ ll (t) = r(t)/R, während der radialen Kontraktion abnimmt, wobei r(t) der Radius des Gels zum Zeitpunkt t ist, ist die mittlere Maschenweite in senkrechter Richtung konstant, ξ
= 20μm23. Diese Werte der Netz-/Porengrößen werden verwendet, um den Gelelastizitätsmodul, κ und den Reibungskoeffizienten γ zu bewerten, wie unten beschrieben (Ziel [iii], Abbildung 6).
Ziel (ii)
Dieses Ziel beinhaltet den Nachweis, dass durch die Kontraktilität des Myosins ein nach außen gerichteter Lösungsmittelfluss erzeugt wird. Um den Lösungsmittelfluss zu verfolgen, werden der Aktomyosinlösung fluoreszierende Kügelchen zugesetzt. Die Beads werden passiviert, um die Wechselwirkung zwischen den sich bewegenden Beads und dem Aktomyosin-Netzwerk zu reduzieren. Insgesamt wird 1 μl Beads (Materialtabelle) mit 5 μm G-Aktin für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert, und überschüssiges G-Aktin wird durch Zentrifugation entfernt (Materialtabelle, Details siehe Protokollkapitel). Dieser Schritt wird mit 10 mg·mL-1 BSA (Table of Materials) wiederholt. Die Kügelchen werden in einer Endverdünnung von 1:10.000 v/v in die Proteinlösung gegeben. Da es darum geht, dass sich die Kügelchen frei über die Gelpore bewegen können, ist es wichtig, den Durchmesser der Kügelchen an die Gelporengröße anzupassen, so dass ihr Größenverhältnis immer <<1 beträgt. Daher werden Perlen mit einem Durchmesser von 2.300 nm verwendet, um die Anfangs- und Zwischenstadien der Kontraktion zu analysieren (Abbildung 5A,B), wenn die durchschnittliche Porengröße größer als 15 μm ist, und Perlen mit einem Durchmesser von 200 nm, wenn die Porengröße kleiner ist (Abbildung 5D-G). Die Position des Massenschwerpunkts der Perlen wird für jedes Mal, t, (x(t),y(t))Perle, extrahiert, wobei ein Standard-Partikelverfolgungsalgorithmus (Materialtabelle) verwendet wird, 
aus dem die Flugbahn (Abbildung 5B) und die lokale Perlengeschwindigkeit abgeleitet werden können. Die Kügelchen und damit das eindringende Lösungsmittel bewegen sich im Mittel in radialer Richtung nach außen (Abbildung 5A,B), während sich das Gel nach innen zusammenzieht, wie die Analyse der Partikelbildgeschwindigkeitsmessung (PIV) zeigt (siehe die grünen Pfeile in Abbildung 6A). Diese radiale Bewegung kann weiter ausgearbeitet werden, indem die Radialgeschwindigkeit νr der lokalen Beads extrahiert wird, die ausgewertet wird, indem die lokale Perlengeschwindigkeit auf die radiale Richtung projiziert wird, die durch den Einheitsvektor definiert ist, der den Gelmittelpunkt (x 0, y0) und die Position des Massenschwerpunkts der Bead zum Zeitpunkt t: verbindet, 
wobei 
Die Daten zeigen, dass die Geschwindigkeiten der Kügelchen zunächst zunehmen, wenn sie sich vom Gelzentrum nach außen bewegen, und sich dann verlangsamen, wenn sie sich der Gelgrenze nähern (Abbildung 5C). Bemerkenswert ist, dass die Perlengeschwindigkeit 20-mal größer sein kann als die radiale Kontraktionsgeschwindigkeit des Gels (blaue Kurve in Abbildung 5C). Die gefüllten Kreise markieren die Zeit, in der die Perlen das Gel verlassen. Die Kügelchen bewegen sich nach dem Verlassen der Gelgrenze für einige Zeit weiter. Diese Bewegung kann nicht auf Trägheitseffekte zurückzuführen sein, da die Reynold-Zahl <10-4 beträgt. Die radiale Perlengeschwindigkeit nimmt mit der Zeit ab, die mit der Abnahme der Gelkontraktion einhergeht. Bemerkenswert ist, dass die Geschwindigkeit der Kügelchen signifikant schwankt, wenn die radiale Kontraktionsgeschwindigkeit des Gels deutlich abgenommen hat.
Um zu testen, ob diese Fluktuationen auf die poröse Struktur des Aktomyosins zurückzuführen sind, verfolgt das Netzwerk die Bewegung der Kügelchen mit einer höheren räumlichen Auflösung, was möglich ist, wenn sich die Kontraktion des Gels deutlich verlangsamt hat (Abbildung 5D-F). Die Flugbahn der Kügelchen ist in der Tat gewunden (Abbildung 5D,E), mit signifikanten Schwankungen in der lokalen Geschwindigkeit der Kügelchen, die die poröse Struktur des Gels widerspiegelt - das heißt, die lokale Geschwindigkeit ist in der Nähe des Porenzentrums am schnellsten und in der Nähe eines Aktinbündels am langsamsten (Abbildung 5F).
Schließlich zeigt die Berechnung der Korrelationsfunktion zwischen Gelgeschwindigkeit und Lösungsmittelgeschwindigkeit, dass die Fluidströmung lokal entgegengesetzt zum kontrahierenden Gel gerichtet ist. Unter Verwendung lokaler heller Flecken im Gel als Passermarken kann ihre Schwerpunktposition für jeden Zeitpunkt t, (x(t),y(t))gel, berechnet und die lokale Gelgeschwindigkeit abgeleitet werden: 
. Dann wird für jede Perle und einen nahe gelegenen Punkt im Gel die Korrelation zwischen lokaler Perlengeschwindigkeit und Gelgeschwindigkeit berechnet, um den Winkel θ zwischen den beiden Vektoren zu extrahieren: 
, wobei 
und 
die lokalen Geschwindigkeiten (Größe) der Perle bzw. des Gels sind. Die Daten zeigen, dass unabhängig von der Position des Beads innerhalb der Gelpore lokal der Flüssigkeitsstrom in die entgegengesetzte Richtung zum Gel gerichtet ist (Abbildung 5G). Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass durch Myosinkontraktilität eine nach außen gerichtete Flüssigkeitsströmung erzeugt wird, wie es für ein poroelastisches aktives Material zu erwartenist 3,7,23,30.
Ziel (iii)
Ziel ist es, zu zeigen, dass die Spannungsrelaxation durch eine effektive poroelastische Diffusionskonstante D gekennzeichnet ist, die vom elastischen Modul des Netzwerks, der Porosität und der Lösungsmittelviskosität abhängt. Zunächst wird die laterale (in der Ebene) Geschwindigkeit des kontrahierenden Gels quantifiziert (Abbildung 6A). Zuerst werden die Fluoreszenzbilder binarisiert und der gelprojizierte Bereich zu jedem Zeitpunkt t, A(t), extrahiert. Anschließend wird der Gelradius berechnet 
(Abbildung 6B). Daraus wird die radiale Kontraktionsgeschwindigkeit zum Zeitpunkt t, abgeleitet,
die die Gelkantengeschwindigkeit beschreibt (Abbildung 6C). Die Kantengeschwindigkeit zeigt ein typisches zeitliches Entwicklungsprofil, das durch eine anfängliche lineare Phase gekennzeichnet ist, in der die Kantengeschwindigkeit mit konstanter Rate zunimmt, bis eine maximale Geschwindigkeit, ν max, 
zum Zeitpunkt t max erreicht ist. Die Geschwindigkeit nimmt dann exponentiell mit einer charakteristischen Relaxationszeit τ ab, bis ein mechanisch stabiler Zustand erreicht ist (Abbildung 6C). Der rmaxist der Gelradius zu Beginn dieser Entspannungsphase.
Für ein poroelastisches Material ist die Relaxationszeit 
, wobei 
eine effektive poroelastische Diffusionskonstante, κ ein effektiver elastischer Gelmodul und γ eine effektive Reibungskonstante ist, die die Bewegung der wässrigen Lösung durch die Aktingelporen berücksichtigt. Der Elastizitätsmodul hat Energieeinheiten pro Volumeneinheit und ist umgekehrt proportional zum Volumen einer Elementarzelle im Gel, bestimmt durch den Abstand zwischen den Vernetzungen oder die Maschenweite, so dass 
. Der Reibungskoeffizient γ hängt von der Porenfacette ab, die senkrecht zum Lösungsmittelfluss steht. Für die Gelkontraktion in der Ebene ist die relevante Porenfacette und folglich der Reibungskoeffizient 
, wobei η die Lösungsmittelviskosität31,32 ist
. Insgesamt ergibt sich folgender Zusammenhang: 
, wobei die relevante Porengröße 
in der Ebene mit tmax bewertet wird. Insgesamt erhalten 
wir , was darauf schließen lässt, dass die Relaxationszeit linear mit der Lösungsmittelviskosität23 skalieren sollte.
Um zu testen, ob dieser Zusammenhang eingehalten wird, werden die Experimente mit unterschiedlichen Mengen an Glycerin wiederholt. Die Verwendung von Glycerin ist vorteilhaft, da nicht erwartet wird, dass es die Aktivität von Proteinen, insbesondere der Myosinmotoren, beeinflusst. Darüber hinaus sind in der Literatur Korrelationen zwischen der Viskosität von Wasser-Glycerin-Lösungen und der Menge des zugesetzten Glycerins verfügbar28. Diese Korrelationen zeigen, dass eine Erhöhung des Glyceringewichtsprozentsatzes von 0 % auf 34 % zu einer proportionalen Erhöhung der Viskosität der Wasser-Glycerin-Lösung von η ω auf 2,76 η ω führt, wobei η ωdie Wasserviskosität bei 20 °C ist. In diesem Glycerinbereich und bei gleichem Anfangstropfendurchmesser von 2R = 2.800 μm verlängert eine Erhöhung der Viskosität die Dauer der Netzwerkpolymerisations- und Selbstorganisationsphasen, obwohl die lineare Beschleunigung und die maximale radiale Kontraktionsgeschwindigkeit (νmax) grob unverändert bleiben. Diese Evidenz deutet darauf hin, dass sowohl die Netzwerkreorganisation (Porosität) als auch die Myosinaktivität von der Lösungsviskosität23 nicht beeinflusst werden, und der Effekt der Lösungsmittelviskosität sollte sich im Wesentlichen in der Zeit widerspiegeln, die benötigt wird, bis sich die elastischen Spannungen entspannen. In der Tat zeigt die Relaxationszeit eine lineare Abhängigkeit von der Viskosität der Lösung (Abbildung 6D), was darauf schließen lässt, dass die oben abgeleitete Skalierungsbeziehung eingehalten wird, was die poroelastische Natur des Systems weiter bestätigt.
Abbildung 1: Schematische Beschreibung der drei Hauptschritte der Oberflächenbehandlung von Glasdeckgläsern: (i) Reinigung der Glasoberfläche (Piranha-Behandlung) und Hydrophilierung, (ii) Oberflächensilanisierung und (iii) Passivierung mit mPEG-mal. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Glasdeckglas-Passivierung. (A) Die Piranha-Reinigung und Silanisierung erfolgt in einem 400-ml-Becherglas unter Verwendung eines selbstgebauten Polytetrafluorethylen-Halters, der aus 12 linearen Rillen besteht. (B) Die Oberflächenpassivierung wird in einer parafilmbeschichteten Petrischale durchgeführt. Jedes Deckglas wird mit 1 mL 5 kDa mPEG-mal bei 4mg·mL−1 in 1x PBS (Table of Materials) für 1 h bei 22 °C inkubiert. Die hydrophobe Parafilmschicht sorgt dafür, dass die hydrophile PEG-Polymerlösung während der gesamten Inkubationszeit auf der Glasoberfläche verbleibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Durchführung eines Experiments - der selbstgebaute Probenhalter. Die Experimente werden in einem selbstgebauten Probenhalter durchgeführt, der den Abmessungen eines Standard-Mikroskoptisches entspricht. (A) Ein gefetteter Parafilm-Abstandshalter mit der Dicke h (~150 μm) wird auf ein PEG-passiviertes Deckglas aufgebracht, und dieses Deckglas wird in den Probenhalter gelegt. (B) Die Aktomyosinlösung wird auf Eis in einem Eppendorf-Röhrchen hergestellt, und 1,1 μl dieser Lösung werden auf das Deckglas gegeben; dann wird (C) ein zweites PEG-passiviertes Deckglas darauf gelegt, und (D) der Probenhalter wird verschraubt, um den Tropfen einzuschließen, der eine scheibenartige Form annimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Poroelastizitätsziel (i). Das Aktomyosin-Netzwerk verhält sich wie ein elastisches Material. (A) Schematische Darstellung eines Aktomyosin-Netzwerks. (B) Bildung von Actomyosin-Netzwerken. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen zeigen, dass die Aktinfilamente spontan nukleieren und zu einem isotropen, miteinander verbundenen Netzwerk polymerisieren, das sich mit der Zeit vergröbert und schließlich makroskopisch zusammenzieht. Die Porosität des Netzwerks wird durch die Netzmaschenweite ξ (Doppelpfeil) charakterisiert. (C-E) Die Kontraktion des Aktomyosin-Netzwerks wird durch das Gleiten des Aktinfilamentbündels angetrieben. (C) Die Netzwerkkontraktion beginnt an der Gelperipherie ("P") und breitet sich nach innen in das Gelvolumen aus. Die weißen Pfeile zeigen die Richtung der Kontraktion an. Die Gelmitte ist mit einem "C" gekennzeichnet. Die Fluoreszenzbilder zeigen, dass die myosinmotorischen Aggregate (561 nm, rote Punkte) in das Aktinnetzwerk (488 nm, grün) eingebettet sind und während der gesamten Netzwerkkontraktion daran gebunden bleiben. (D) Die Aktinfilamentbündel bleiben während der Netzwerkkontraktion gerade. Das Verhältnis der Konturlänge l cont und des Ende-zu-Ende-Abstandes lEnde-zu-Ende in Abhängigkeit von der Zeit. (E) Verteilung des Verhältnisses zwischen der Konturlänge und dem Ende-zu-Ende-Abstand bei t = 316 s (durchgehend rot) und t = 327 s (gestreift, grau). Einschub: Konturlänge (blau) und Ende-zu-Ende-Abstand (weiß) eines typischen Bündels. Bedingungen: (B,C,E[Inset]): Die Bilder werden auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit einer EMCCD-Kamera und einem 10x/0,3 Ph1 UPlanFL Luftobjektiv im regulären Modus (B) und im Dual-Imaging-Modus nach der Bildüberlagerung (C,E[Inset]) aufgenommen. Die Maßstabsbalken sind (B,C) 100 μm und (E[inset]) 50 μm. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Ideses et al.23 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Poroelastizitätsziel (ii). Ein nach außen gerichteter Lösungsmittelfluss wird durch die motorische Kontraktilität des Myosins erzeugt. (A) Abbildung des Gels bei geringer Vergrößerung in Zwischenstadien der Kontraktion: gleichzeitige Fluoreszenzbildgebung eines kontrahierenden Aktinnetzwerks (488 nm, links) und 2.300 nm Fluoreszenzkügelchen, die der Lösung (561 nm, rechts) als Funktion der Zeit hinzugefügt wurden. Die Kreise markieren die Positionen von vier Perlen. Die Pfeile markieren die globale Richtung der Wulstbewegung. (B) Die Flugbahnen von neun ausgewählten Perlen sind dargestellt. Die Pfeile markieren die globale radiale Richtung der Bewegung der Perlen. Das eingekreiste Kreuz bezeichnet den Gelmittelpunkt (x0,y0) (C) die lokale radiale Perlengeschwindigkeit νr (offene Kreise) und die (radiale) Gelkantengeschwindigkeit (blaue Punkte) über die Zeit. Die gefüllten Kreise geben die Zeit an, in der eine bestimmte Perle die Gelgrenze verlässt. (D-F) Auflösung der Netzwerkporosität und der Bewegung des Lösungsmittels durch die Gelporen in fortgeschrittenen Stadien der Kontraktion. (D) Epifluoreszenzbilder des kontrahierenden Gels und fluoreszierender Kügelchen mit einem Durchmesser von 200 nm, die der Lösung hinzugefügt wurden. Sowohl das Aktin als auch die Beads werden bei 488 nm angeregt. Die roten Kreise folgen der Position einer Perle mit der Zeit. Die graue Linie zeigt die Gelgrenze an. (E) Flugbahn der in (D) dargestellten Perle. Im gezeigten Feld zieht sich das Gel im Mittel nach unten zusammen. Die Koordinaten werden relativ zum Ursprung der Kamera gemessen. (F) Die lokale Geschwindigkeit der Perle spiegelt die poröse Struktur des Gels wider. Oben: Lokale Perlengeschwindigkeit (offene Kreise), lokale Gelgeschwindigkeit (graue Kreise) und Gelkantengeschwindigkeit (blaue Kreise) in Abhängigkeit von der Zeit. Unten: Schnappschüsse zeigen die Position der Perle für ausgewählte Zeiten. Die Perle ist durch einen roten Kreis gekennzeichnet. Die gestrichelte Linie markiert den Zeitpunkt, zu dem die Perle das Gel verlässt. (G) Verteilung der Winkel zwischen dem lokalen Gel und den lokalen Beadgeschwindigkeiten. Bedingungen: Die Bilder werden auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit einer EMCCD-Kamera und (A) einem 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR-Objektiv und (D,F) einem 10x/0,3 Ph1 UPlanFL-Objektiv aufgenommen. Die Maßstabsbalken sind (A) 400 μm, (D) 100 μm, (F) und 50 μm. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Ideses et al.23 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Poroelastizitätsziel (iii). Die Spannungsrelaxation ist durch eine effektive poroelastische Diffusionskonstante gekennzeichnet. (A) Draufsicht-Fluoreszenzbilder eines kontrahierenden Aktomyosin-Gels bei geringer Vergrößerung von der Mischzeit bis zum stationären Zustand. Das Geschwindigkeitsfeld (grüne Pfeile) wird aus der PIV-Analyse extrahiert. Die Bilder werden an einem inversen Fluoreszenzmikroskop mit einer EMCCD-Kamera und einem 2,5x/0,075 Plan-NEOFLUAR-Objektiv aufgenommen. Die Anregungswellenlänge beträgt 488 nm (Aktin). Der Maßstabsbalken beträgt 500 μm. (B) Gelradius und (C) radiale Kontraktionsgeschwindigkeit (d. h. die Gelkantengeschwindigkeit 
über die Zeit). A bezeichnet die Beschleunigung, VMax bezeichnet die maximale Geschwindigkeit und τ ist eine charakteristische Relaxationszeit. (D) Die Aktomyosin-Netzwerke verhalten sich wie ein poroelastisch aktives Material. 
und Lösungsmittelviskosität, η, im Vergleich zu Glyceringewicht in Prozent (Gew.-%). Die Mengen werden auf ihre Werte bei 0 Gew.-% Glycerin normiert. Der Anfangsradius des Gels beträgt R = 1.400 μm. Die Fehlerbalken sind die Standardabweichungen der experimentellen Werte. Diese Abbildung wurde mit freundlicher Genehmigung von Ideses et al.23 reproduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Hier wird ein in vitro Ansatz verwendet, um die Mechanik von poroelastischen Aktomyosingelen als Modellsystem des Zellzytoskeletts und allgemeiner des Zellzytoplasmas zu charakterisieren, das sich nachweislich als poroelastisches Material verhält 3,5. Die Rheologie des Zellzytoskeletts (Zytoplasma) wurde durch eine poroelastische Diffusionskonstante charakterisiert, die bestimmt, wie lange es dauert, bis sich die intrazelluläre zytosolische Flüssigkeit nach mechanischer Belastung innerhalb der Zelle umverteilt. Es wurde vorgeschlagen, dass Zellen diesen Mechanismus nutzen, um ihre Form zu regulieren5.
Motiviert durch diese Erkenntnisse haben wir ein Framework entwickelt, um Poroelastizität in vitro zu untersuchen. Mit Hilfe des vorgeschlagenen Modellsystems geben wir Aufschluss darüber, wie die Kontraktilität von Myosin zur Entstehung einer Fluidströmung beiträgt und wie Netzwerkgeschwindigkeit und Lösungsmittelgeschwindigkeit, Direktionalität und Geschwindigkeit in Zeit und Raum korrelieren. Auf diese Weise zeigen wir, dass das Netzwerk und das eingebettete Lösungsmittel miteinander verbunden sind und nicht als separate Objekte betrachtet werden können. Wir beschreiben den Versuchsaufbau und stellen ein detailliertes Protokoll für die Herstellung der Gele und die Durchführung eines Experiments zur Verfügung. Ein detaillierter Rahmen für die Datenquantifizierung wird ebenfalls vorgestellt. Der vorgeschlagene Rahmen kann leicht angepasst werden, um die Poroelastizität in einer Vielzahl von Versuchsaufbauten und -systemen zu untersuchen, unabhängig von der Spezifität des untersuchten experimentellen Systems.
Wir validieren die Poroelastizität der Aktomyosin-Netzwerke, indem wir die Veränderungen in der Zeitskala der Stressrelaxation analysieren. Wir demonstrieren dies, indem wir die Viskosität des Mediums variieren, indem wir der Aktomyosinlösung verschiedene Mengen Glycerin hinzufügen. Der Vorteil der Verwendung von Glycerin besteht darin, dass es die Porosität und Struktur der Netzwerke nicht beeinträchtigt und somit die einzige Wirkung auf die Spannungsrelaxation die Erhöhung der Reibung zwischen der sich bewegenden Lösung und den Gelporen23 ist. Änderungen der Netzwerkporosität hätten eine zusätzliche Komplikation hervorgerufen, da sowohl der Elastizitätsmodul als auch die Größe der Netzwerkporen die Relaxationszeit auf nichtlineare Weise beeinflussen 23,31,32.
Um erfolgreiche Experimente durchführen zu können, müssen die Glasdeckgläser mit einem inerten Polymer passiviert werden. Dieser Schritt ist entscheidend. Das hier angewandte Verfahren zur Glaspassivierung kann durch andere Verfahren ersetzt werden, wenn die Qualität der Passivierung erhalten bleibt33,34. Eine fehlerhafte Oberflächenpassivierung kann zu einer massiven Proteinadhäsion führen, die den Netzwerkaufbau hemmen kann. Die Glaspassivierung ist auch wichtig, um die Wechselwirkung des kontrahierenden Gels mit den Glasoberflächen zu verhindern. Dies würde zu einem zusätzlichen Reibungsterm führen, zusätzlich zu der hier betrachteten Fluid-Gel-Reibung, der deutlich schwieriger abzuschätzen oder zu quantifizieren wäre. Erfolgreiche Experimente erfordern neben der Oberflächenpassivierung auch den Einsatz von frischem Aktin. Darüber hinaus ist auch die Aktivität der Motoren entscheidend, und die Herstellung frischer Myosinchargen sollte alle 3-4 Monate wiederholt werden.
Insgesamt hat sich dieser experimentelle Ansatz als erfolgreich erwiesen, um die Poroelastizität in vitro zu untersuchen. Eine Einschränkung des derzeit angewandten experimentellen Vorgehens besteht darin, die anfänglichen Gelabmessungen robuster zu kontrollieren. Eine Möglichkeit wäre die Verwendung von vorgeformten Kammern mit kontrollierbaren Abmessungen. Die Verwendung von vorgeformten Kammern würde es dem Forscher auch ermöglichen, nicht nur die Systemgröße besser zu kontrollieren, sondern auch die Geometrie des Systems leicht zu ändern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Dina Aranovich für die Proteinreinigung und -kennzeichnung. G.L. dankt dem israelischen Ministerium für Wissenschaft, Technologie und Raumfahrt für das Jabotinsky-Promotionsstipendium. A.B.G. dankt der Israel Science Foundation (Grant 2101/20) und dem Ministry of Science and Technology - State of Israel (Grant 3-17491) für die finanzielle Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane | Sigma-Aldrich Company | 175617 | Stored under Argon atmosphere at 4 °C |
| Acetic acid | Bio-Lab ltd | 1070521 | |
| Alexa-Fluor 488 | Invitrogene | A10254 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Alexa-Fluor 647 | Invitrogene | A20347 | Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| BSA | Sigma -Aldrich Company | A3059 | Stored at 4 °C |
| Catalase | Sigma -Aldrich Company | C9322 | The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C |
| Coverslips | Mezel-glaser | CG2222-1.5 | Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks |
| Creatine kinase | Roche Life Science Products | 10736988001 | Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days. The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C |
| Creatine phosphate | Roche Life Science Products | 10621714001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C |
| DTT | Roche Life Science Products | 10708984001 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months |
| Dual view Simultaneous Imaging System | Photometrics | DV2-CUBE | |
| EGTA | MP Biomedicals | 195174 | |
| EM-CCD Camera | Andor Technology Ltd | DV 887 | |
| EM-CCD Camera | Photometrics | Evolve Delta | |
| Ethanol | Bio-Lab ltd | 525050300 | |
| Flourescence Lamp | Rapp Optoelectronic | ||
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences | 17151-10 | 200 nm diameter |
| Glucose | ICN Biomedicals Inc | 194024 | When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich Company | G7141 | Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C |
| Glycerol | ICN Biomedicals Inc | 800687 | |
| Glycine | MP Biomedicals | 808822 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich Company | 216763 | Stored at 4 °C |
| KCl | EMD Millipore Corp. | 529552 | |
| Methanol | Bio-Lab ltd | 1368052100 | |
| MgCl2 | EMD Millipore Corp. | 442615 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DMI3000 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-5k | Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C |
| Nile red microspheres | Spherotech | FP-2056-2 | 2300 nm diameter |
| Objective (10x) | Leica Germany | HC PL AP0 | UPlanFL Numerical Aperture = 0.3 |
| Objective (2.5x) | Leica Germany | 506304 | Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075 |
| Oven | WTC Binder | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PBS Buffer | Sigma-Aldrich Company | P4417 | |
| Shutter Driver | Vincet Associates | VMM D1 | |
| Silica gel | Merck | 1.01907.5000 | |
| Sonicator | Elma | Elmasonic P | |
| Sulfuric acid | Carlo Erba reagents | 410301 | |
| DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System | Photometrics | ||
| TRIS | MP Biomedicals | 819620 | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia | Ultraspec 2100 pro | |
| MICROMAN E | Gilson | FD10001 | 1–10 uL |
| MATLAB R2017b | MathWorks | Data quantification | |
| MetaMorph | Molecular devices | Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size) |
References
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