Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

세포 세포 골격의 모델 시스템으로서의 (Poro-) 탄성 수축 Actomyosin 네트워크의 역학

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64377
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemical Engineering, Ben Gurion University of the Negev, 2Department of Chemical Engineering, Ilse Kats Institute for Nanoscale Science and Technology, Ben Gurion University of the Negev

Summary

이 연구에서는 통제된 조건에서 악토미오신 겔의 다공성 탄성을 연구하기 위해 시험관 내 재구성 접근법을 사용합니다. 악토미오신 겔과 포매된 용매의 역학을 정량화하여 네트워크 다공탄성을 입증합니다. 또한 실험적 과제, 일반적인 함정 및 세포 골격 역학과의 관련성에 대해서도 논의합니다.

Abstract

세포는 적극적으로 모양을 바꾸고 운동성을 가질 수 있으며, 이는 내부 구조를 능동적으로 재구성하는 능력에 달려 있습니다. 이 특징은 세포 세포 골격의 기계적 및 동적 특성, 특히 고유 수축 특성을 나타내는 극성 액틴 필라멘트, 미오신 모터 및 보조 단백질의 활성 겔인 악토미오신 세포 골격에 기인합니다. 일반적으로 받아 들여지는 견해는 세포 골격이 점탄성 물질로 작용한다는 것입니다. 그러나 이 모델은 실험 결과를 항상 설명할 수 없으며, 이는 세포골격을 다공탄성 활성 물질(세포질에 내장된 탄성 네트워크)로 설명하는 그림과 더 일치합니다. 미오신 모터에 의해 생성된 수축성 구배는 겔 기공을 가로질러 세포질의 흐름을 유도하며, 이는 세포골격과 세포질의 역학이 밀접하게 결합되어 있음을 추론합니다. 다공탄성의 주요 특징 중 하나는 겔 탄성률, 다공성 및 세포질(용매) 점도에 따라 달라지는 효과적인 확산 상수를 특징으로 하는 네트워크의 응력 확산 완화입니다. 세포는 구조와 물질 특성을 조절할 수 있는 여러 가지 방법이 있기 때문에 세포 골격 역학과 세포질 흐름 역학이 어떻게 결합되는지에 대한 우리의 현재 이해는 잘 알려져 있지 않습니다. 여기서, 시험관 내 재구성 접근법은 세포 세포 골격에 대한 모델 시스템으로서 다공성 악토미오신 겔의 물질 특성을 특성화하기 위해 사용됩니다. 겔 수축은 미오신 운동 수축력에 의해 구동되며, 이는 침투 용매의 흐름의 출현으로 이어진다. 이 논문은 이러한 젤을 준비하고 실험을 실행하는 방법을 설명합니다. 또한 용매 흐름과 겔 수축을 지역 및 글로벌 규모에서 측정하고 분석하는 방법에 대해서도 논의합니다. 데이터 정량화에 사용되는 다양한 스케일링 관계가 제공됩니다. 마지막으로, 세포 세포 골격 역학과의 관련성을 포함하여 실험적 과제와 일반적인 함정에 대해 논의합니다.

Introduction

살아있는 세포는 독특한 기계적 성질을 가지고 있습니다. 적용된 힘에 수동적으로 반응하는 능력 외에도 외부 자극에 반응하여 능동적으로 힘을 생성할 수 있습니다1. 다양한 세포 과정, 특히 세포 운동성 동안 필수적인 이러한 특성은 주로 세포 세포 골격, 특히 극성 액틴 필라멘트, 미오신 분자 모터 및 부속 단백질의 활성 겔인 악토미오신 세포 골격의 기계적 및 동적 특성에 기인합니다. 이러한 악토미오신 네트워크는 액틴 필라멘트를 가교결합하고 ATP 가수분해에 의해 연료가 공급되는 네트워크에서 기계적 응력을 능동적으로 생성하는 미오신 운동 단백질에 의해 구동되는 고유한 자기 조직화 및 수축 특성을 나타냅니다2.

세포골격3의 물질적 성질을 연구하기 위해 수많은 실험적, 이론적 연구가 수행되었다. 일반적으로 받아 들여지는 견해는 세포 골격이 점탄성 물질로 행동한다는 것이다4. 즉, 짧은 시간 척도에서 세포 골격은 탄성 물질로 작용하고 긴 시간 척도에서는 가교 단백질과 미오신 운동 분리 (및 재 부착)로 인해 점성 유체로 작용하여 네트워크가 동적으로 회전할 수 있습니다. 그러나, 많은 상황에서, 점탄성 모델은 실험 결과를 설명할 수 없으며, 이는 세포골격 및 보다 일반적으로는 다공탄성 활성 물질로서 기술되는 세포 세포질을 기술하는 그림과 더 일치한다 5,6. 이러한 유형의 재료를 특징 짓는 두 가지 주요 특징이 있습니다. (i) 첫 번째 주요 특징은 세포 블리빙(cell blebbing)7, 운동성(motility)8, 세포 모양 진동(cell shape oscillation)9과 같은 과정의 기초가 되는 미오신 모터(myosin motor)에 의해 구동되는 수축성 구배(contractability gradients)에 의해 겔 공극을 가로지르는 관통 세포질("용매")의 흐름의 생성이다. 이러한 세포질 흐름의 출현은 세포 운동성과 같이 국소적, 출혈 또는 전 세계적일 수 있습니다. 후자의 경우, 세포 후면에 수축 가해진 응력은 세포질 유체의 흐름을 세포 전면으로 유도하여 라멜리포디아 조립에 필요한 단백질 풀을 보충한다8. (ii) 두 번째 주요 특징은 응력의 완화가 확산되고 겔 탄성률, 겔 다공성 및 용매 점도에 따라 달라지는 유효 확산 상수를 특징으로 한다는 것입니다5. 다공탄성 확산 상수는 시스템이 적용된 응력에 얼마나 빨리 반응하는지를 결정합니다. 확산 상수가 높을수록 응력 재분포가 빨라집니다. 이것은 차례로 미오신 모터에 의해 생성된 활성 수축 응력과 같은 외부 또는 내부의 기계적 응력을 가한 후 세포 내 세포질 유체가 세포 내에서 재분배되는 데 걸리는 시간을 결정합니다. 따라서 이러한 예는 세포 골격과 세포질의 역학이 밀접하게 결합되어 있으며 별도로 치료할 수 없음을 보여줍니다3.

세포는 다양한 방식으로 기계적 특성을 조절할 수 있기 때문에 네트워크 역학과 유체 흐름 역학 간의 상호 작용은 잘 이해되지 않고 있습니다. 강력한 대안적 접근법은 다양한 미세 성분 및 시스템 파라미터를 완전히 제어할 수 있는 시험관 내 재구성 시스템을 사용하는 것이며, 이는 이러한 모델 시스템을 물리적 분석에 최적으로 만듭니다(10,11). 이 접근법은 액틴 기반 운동성 12,13,14,15,16,17,18, 악토미오신 네트워크의 2D 패터닝에 대한 단백질 구성 및 시스템 기하학의 영향을 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다 19,20,21,22, 그리고 다공성 악토미오신 겔의 네트워크 수축성과 유체 흐름 역학 사이의 상호 작용, 이는 이 논문의 초점입니다23.

이 원고에서는 제어 가능한 치수 및 재료 특성의 수축성 탄성 악토미오신 네트워크의 준비는 Ideses et al.23의 연구를 기반으로 논의됩니다. 수축 겔과 배출 된 용매의 역학을 분석하고 정량화하여, 이러한 악토 미오신 겔이 다공성 활성 물질로 설명 될 수 있음을 입증합니다. 응력 확산도에 대한 용매 점도의 영향을 연구하면 이러한 네트워크의 다공성 탄성 특성을 추가로 확인할 수 있습니다. 데이터 정량화에 사용되는 다양한 스케일링 관계가 제공됩니다. 마지막으로, 실험 과제, 일반적인 함정 및 실험 결과와 세포 골격의 관련성에 대해서도 논의합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 유리 표면 처리 및 부동태화:

알림: 이 섹션에는 (i) 세척 및 친수화, (ii) 실란화 및 (iii) 표면 패시베이션의 세 가지 주요 단계가 포함됩니다( 그림 1 참조).

  1. 세척 및 친수성
    1. 유리 표면 청소를 위해 피라냐 용액을 사용하십시오.
      참고 : 피라냐 용액은 30 % H 2 O 2 와 70 % H2SO4 (재료 표)의 혼합물입니다. 주요 목표는 커버슬립 표면에서 유기 오염을 제거하고 유리 표면에 OH 그룹을 노출시키는 것입니다. 이러한 방식으로, 유리 표면은 친수성이된다.
    2. 10-12 #1.5(22mm x 22mm) 유리 커버슬립(재료 표)을 수제 폴리테트라플루오로에틸렌 홀더(베이스 면적: 5.5cm x 5.5cm)에 넣습니다. 폴리테트라플루오로에틸렌 홀더를 400mL 비커(표 재료)에 옮기고 300mL의 피라냐 용액과 함께 2시간 동안 배양합니다. 얼음과 화학 후드에서이 단계를 수행하십시오.
      알림: 홀더 베이스에 나사로 고정된 폴리테트라플루오로에틸렌 폴은 길이가 12cm로 비커(11cm)보다 길기 때문에 홀더를 피라냐 용액 안팎으로 안전하게 옮기거나 빼낼 수 있습니다. 피라냐 용액은 여전히 반응성이 높고 매우 뜨거울 수 있기 때문에 반응을 멈추는 것이 필수적입니다. 반응을 멈추는 가장 쉬운 방법은 피라냐 용액을 물에 부어 (최소한) 50 배 희석을 달성하는 것입니다. 그런 다음 솔루션을 안전하게 폐기할 수 있습니다. 사용한 피라냐 용액을 밀폐 된 유리 병에 보관하지 마십시오 - 병 폭발로 끝날 수 있습니다.
    3. 폴리테트라플루오로에틸렌 홀더를 신선한 이중 증류수(DDW)로 채워진 깨끗한 비커에 옮겨 커버슬립에서 과도한 피라냐를 씻어냅니다.
    4. 비커를 초음파 처리 수조 (재료 표)로 옮기고 25 °C에서 10 분 동안 최대 전력으로 80Hz에서 초음파 처리합니다. 새로운 DDW로 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 매번 신선한 DDW를 사용하십시오.
  2. 실란화
    1. 홀더를 300mL의 순수 메탄올(재료 표)로 채워진 깨끗한 비커(400mL)에 옮긴 다음 초음파 처리 수조(재료 표)로 옮깁니다. 25 °C에서 30 분 동안 최대 전력으로 80Hz에서 초음파 처리합니다.
    2. 초음파 처리 후, 홀더를 15 mL의 DDW, 3.1 mL의 아세트산 (재료 표), 340 mL의 메탄올 및 7.6 mL의 실란 ((3-메르캅토프로필) 트리 메 톡시 실란)을 사용하여 제조 된 실란 용액으로 옮깁니다 (재료 표). 비커를 파라필름으로 밀봉하고 냉장고에 4°C에서 밤새 보관합니다.
      알림: 실란 용액의 준비 및 취급은 화학 후드에서 수행해야 합니다. 실란 화 단계 후, 사용한 실란 용액 (폐기물)을 화학 후드 내의 전용 유리 병에 넣습니다.
    3. 다음날 홀더를 300mL의 순수 메탄올로 채워진 깨끗한 비커에 15초 동안 옮깁니다. 이어서, 홀더를 깨끗한 비커에 옮기고, 폴리테트라플루오로에틸렌 홀더의 바닥을 건조시키기 전에 과량의 메탄올을 제거한다. 비커를 오븐(Table of Materials)으로 옮겨 120°C에서 5분 동안 유리 커버슬립을 건조시킵니다.
  3. 불활성 폴리머를 사용한 표면 패시베이션
    1. 유리 커버슬립을 불활성 폴리머로 배양하여 표면 패시베이션을 달성합니다(재료 표). 각 실험에 대해 두 개의 커버슬립을 가져와서 처음에 에탄올(EtOH)로 세척한 파라필름 층으로 코팅된 페트리 접시에 넣습니다(DDW/EtOH: 30/70 vol/vol)(재료 표).
    2. 각 커버슬립을 1mL의 4mg·mL-1 5kDa 분자량 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드(mPEG-mal, Mw=5kDa)(재료 표)를 1x 인산염 완충 식염수(PBS)(재료 표)에서 22°C에서 1시간 동안 배양합니다.
      알림: 소수성 파라필름 층에 커버슬립을 놓으면 친수성 PEG 폴리머 용액이 유리 커버슬립 표면에 가두어집니다. 배양 시간은 최적의 패시베이션을 달성하는 데 중요합니다. 45분에서 2시간 사이의 배양 시간을 사용하십시오. 이 배양 시간이 지나면 유리 커버슬립 표면이 열화되어 단백질 접착력과 투명성 손실이 발생할 수 있습니다.
    3. 배양 과정이 끝나면 각 커버슬립을 5mL의 DDW로 헹구고 N2 (가스)의 흐름으로 건조시킵니다. 커버슬립을 진공 상태에서 건조하지 마십시오. 커버슬립은 패시베이션 후 젖은 상태로 유지해야 하므로 즉시 페길화된 표면에 10mM Tris 1mL를 놓습니다. 2시간 이내에 커버슬립을 사용하십시오.
      알림: 유리 표면 오염을 방지하기 위해 층류 챔버에서 다양한 단계를 수행해야 합니다.

2. 단백질 정제

  1. 겔 여과 방법을 사용하여 토끼 골격근 아세톤 분말에서 G-actin을 정제합니다24.
    1. 액틴 정제에는 1 주일이 걸립니다. 정제된 G-액틴을 G-완충액(5 mM Tris pH 7.8, 0.01%NaN3, 0.1 mMCaCl2, 0.2 mM ATP, 및 1 mM DTT)에 보관하고, 얼음 위에 보관한다. 2 주 이내에 솔루션을 사용하십시오.
      알림: 이틀에 한 번씩 얼음을 교체하십시오.
    2. 액틴을 말레이미드 변성 형광 염료16 (재료 표)으로 라벨링합니다. Ono et al.25의 방법에 따라 GST-fascin을 정제합니다. 두 단백질을 액체 N2 에 급속 동결시키고 -80 °C에서 보관합니다.
  2. 토끼 골격근에서 미오신 II를 정제하기 위해 표준 프로토콜을 사용한다26. 정제된 미오신 II(이량체) 스톡 완충액에는 10mM Tris pH 7.4, 0.5M KCl 및 35% w/v 자당이 포함됩니다. 액체 N2 에서 미오신 을 급속 동결시키고 -80 °C에서 보관한다.
    참고: KCl의 고농도는 미오신 모터를 이량체 형태로 유지하는 반면, 높은 비율의 자당은 동결 시 모터의 활성이 방해받지 않도록 합니다. myosin II 원액으로 작업할 때 점성 유체 처리를 위한 전용 피펫을 사용하십시오(재료 표).
    1. 미오신 II 이량체를 형광 염료(재료 표)로 표지하여 조작된 시스테인 잔기19,27쌍에 표시한다. 그 목적을 위해 닭 모래주머니 RLC 돌연변이 A를 사용하십시오26. 표지된 미오신 II를 액체N2 중 급속 동결하고, -80°C에서 보관한다.
      참고: 이 표지 절차는 표지된 미오신이 천연 미오신 II 단백질로 활성화됨을 보장합니다.
  3. UV-Vis 분광 광도계(재료 표)를 사용하여 원유 단백질 용액의 흡광도를 측정하고 다음 흡광 계수를 사용하여 Beer-Lambert 법칙으로 단백질 농도를 추론합니다. G-액틴(ε290 = 26,460 M−1·cm−1), GST-파시온(ε 280 = 99,330 M−1·cm−1), 미오신 II 이량체(ε 280 = 268,800 M−1·cm−1), 및 RLC 돌연변이 A (ε280 = 3,960 M−1·cm−1)19.

3. 시료 전처리

참고: 미오신 II 모터의 큰 응집체와 강력한 수동 가교제 파신의 존재 하에서 액틴 단량체를 중합하여 거시적으로 수축하는 탄성 악토미오신 네트워크19,23을 생성합니다. 용액에 형광 비드를 첨가하면 겔 수축 동안 용매 흐름을 추적할 수 있습니다.

  1. 단백질 ( "actomyosin") 용액
    1. G-액틴을 제외하고 단백질을 -80°C에서 소량으로 보관하고 사용하기 전에 37°C에서 해동합니다. 악토미오신 용액의 총 부피는 40μL입니다.
    2. 10 mM Tris pH 7.4, 2 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM ATP, ATP 재생 시스템 (0.5 mg · mL-1 크레아틴 키나아제 및 5 mM 크레아틴 포스페이트), 200 μM EGTA (킬레이트 Ca2+ 이온), 표백 방지 용액 (0.1 mg · mL-1 포도당 산화 효소, 0.018 mg · mL-1 카탈라아제 및 5 mg · mL-1 포도당), 5μM G-액틴, 280nM GST-파시안 및 1.67nM 미오신 II. 표지 된 G- 액틴의 비율은 5 % (몰 백분율)입니다.
      참고: 낮은 비율의 라벨이 붙은 G-액틴을 사용하여 젤 수축의 진행 단계에서 형광 신호의 포화를 피하십시오.
  2. 미오신 II 모터 응집체 준비
    1. myosin 모터를 응집체 형태로 단백질 용액에 첨가하십시오. 큰 미오신 응집체(150 미오신 이량체/응집체)를 형성하려면 미오신 원액을 10mM Tris pH 7.4로 희석하여 최종 농도 25mM KCl에 도달합니다.
    2. 희석된 미오신 용액을 실온(RT)에서 10분 동안 보관한 후 사용할 때까지 얼음에 옮깁니다. 모터는 최대 2시간 동안 완전히 작동합니다.
  3. 용매 흐름 측정
    1. 겔 기공을 가로지르는 용매 흐름을 추적하려면 형광 비드를 악토미오신 용액에 추가합니다. 비드를 부동태화하여 비드와 악토미오신 네트워크 사이의 상호작용을 감소시킵니다. 실제적으로, 1 μL의 비드(재료표)를 5 μM G-액틴과 함께 RT에서 20분 동안 인큐베이션한 다음, 원심분리(재료표)에 의해 과량의 G-액틴을 제거한다(조건: 4°C에서 5분 동안 6,000 x g).
    2. 10mg·mL-1 소 혈청 알부민(BSA)(재료 표)으로 이 단계를 반복하여 코팅되지 않은 나머지 표면을 차단합니다. 실험에서 1:10,000 vol/vol의 최종 희석으로 비드를 사용합니다.
      알림: 모든 단계에서 비드/기공 크기 비율이 <1이 되도록 비드의 직경을 겔 기공 크기에 맞게 조정하는 것이 중요합니다.
  4. 용액 점도의 영향
    1. glycerol (재료의 표)를 actomyosin 용액에 첨가하여 용액의 점도를 조절하십시오. 0% 내지 34% 범위의 중량%로 글리세롤을 첨가하는 것은 용액 점도의 상응하는 η ω 내지 2.76 η ω의 증가를 유도하며, 여기서 η ω는 20°C에서의 물의 점도이다28.
      알림: 글리세롤로 작업할 때 점성 유체 처리를 위해 전용 피펫을 사용하는 것이 필수적입니다(재료 표).

4. 실험 실행

  1. 수제 샘플 홀더 취급
    1. PEG 부동태화 커버슬립 중 하나를 가져다가 그 위에 기름칠한 파라필름 스페이서를 놓고 샘플 홀더에 놓습니다.
      알림: 파라필름 스페이서를 다른 스페이서로 교체할 수 있습니다.
  2. 악토마이오신 용액 준비
    1. 다양한 미세 성분을 통합하고, 미오신 II 모터 응집체를 추가하고, 마지막으로 EGTA를 추가하여 미세 원심분리 튜브의 얼음 위에 악토미오신 용액을 준비합니다. 용액을 잘 섞는다. EGTA의 첨가는 실험의 시작 시간을 설정하는 악토미오신 네트워크 중합을 개시한다.
  3. 해당 용액 1.1μL를 홀더에 장착된 커버슬립에 놓고 두 번째 커버슬립을 맨 위에 놓습니다. 홀더를 조여 샘플을 밀봉합니다. 이 과정은 디스크와 같은 모양을 채택하는 방울을 약간 압착합니다. 낙하 직경은 2,800-3,000 μm 사이입니다.
  4. 현미경에 샘플 홀더를 놓고 수집을 시작합니다. 초기 획득 시간을 줄이기 위해 현미경을 미리 준비하십시오. 일반적으로 혼합 후 샘플 이미징을 시작하는 데 1-2분이 걸립니다.

5. 현미경 기술

  1. 전용 소프트웨어(Table of Materials)에 의해 제어되는 도립 형광 현미경(Table of Materials)을 사용하여 샘플을 이미지화합니다.
    1. 2.5x/0.075 Plan-NEOFLUAR 대물렌즈(재료 표)의 저배율을 사용하여 전체 겔 영역을 시각화하고 시간에 따른 거시적 수축을 추적합니다.
    2. 10x/0.3 Ph1 UPlanFL 대물렌즈(재료 표)를 사용하여 네트워크 다공성 및 구조를 특성화하고 시간 경과에 따른 네트워크 자체 구성 및 수축을 추적합니다.
      참고: 이 대물렌즈는 네트워크 내에서 미오신 II 모터 응집체의 위치를 파악하고 겔 기공을 가로지르는 형광 비드의 이동을 추적하는 데에도 유용합니다. 더 높은 배율은 감소된 시야를 희생시키면서 사용할 수 있으며, 이는 이중 색상 이미징 모드(재료 표)에서 훨씬 더 중요합니다.
  2. 488nm(액틴/형광 비드) 및 561nm(미오신 모터 응집체/형광 비드)에서 샘플을 여기시킵니다. 스트리밍 모드에서 전용 소프트웨어(재료 표)를 사용하여 프레임당 100ms의 속도로 이미지를 수집하고, EMCCD(Electron Multipliing Charge-Coupled Device) 카메라(재료 표)를 사용합니다.
    알림: 형광등 lamp (재료 표) 강도는 네트워크 수축 중 신호 포화를 피하기 위해 가능한 가장 낮은 값으로 유지되어야 합니다.
  3. 동시 2색 이미징
    1. 이 모드는 (i) 액틴 네트워크 내에서 미오신 모터 응집체의 국소화를 감지하고 (i) 네트워크 수축 동안 내부 및 외부의 외부 용매 흐름을 특성화하는 두 가지 목적으로 사용합니다.
    2. 액틴 및 미오신 II 모터를 각각 488nm 및 561nm에서 여기시키고 이중 방출 장치(재료 표)를 사용하여 EMCCD 카메라(재료 표)에 이미지를 동시에 기록합니다. 동일한 이미징 시스템을 사용하여 액틴 겔(488nm)과 형광 비드(561nm)를 동시에 이미징합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

실험당 두 개의 유리 커버슬립이 사용됩니다. 유리 커버슬립은 PEG 폴리머로 세척 및 부동태화됩니다. 패시베이션은 초기 실험 단계에서 가용화된 단백질이 유리 표면에 부착되는 것을 방지하고 수축 네트워크와 유리 벽의 상호 작용을 최소화하는 데 필수적입니다. 좋은 패시베이션을 달성하지 못하면 비효율적인 수축이 발생할 수 있으며 극단적인 경우 액틴 네트워크 형성을 억제할 수도 있습니다.

그림 1은 표면 처리 절차의 세 가지 주요 단계를 설명합니다. 이러한 단계는 다음을 포함한다 : (i) 커버 슬립 표면으로부터 유기 오염을 제거하고 유리 표면에 OH 그룹을 노출시키는 피라 냐 용액을 사용한 표면 세정 및 친수화; (ii) 실란을 유리 표면에 공유 결합시키는 것을 목표로하는 (3- 메르 캅토 프로필) 트리 메 톡시 실란을 사용한 표면 실란 화, 각 실란 분자는 SH 그룹으로 끝납니다. (iii) PEG 폴리머 (mPEG-mal, 5 kDa)에 의한 패시베이션 -이 단계에서, PEG 폴리머의 말레이미드 그룹은 (3-메르캅토프로필)트리메톡시실란의 SH 그룹과 공유 결합적으로 상호작용하여, 유리 표면에 PEG 단층의 형성을 초래한다.

피라냐 처리 및 실란화를 위해 10-12개의 유리 커버슬립 #1.5(22mm x 22mm)를 폴리테트라플루오로에틸렌 홀더(그림 2A)에 넣고 해당 홀더를 400mL 비커로 옮깁니다. 패시베이션 단계를 위해 두 개의 유리 커버슬립이 파라필름 코팅된 페트리 접시로 옮겨집니다(그림 2B). 소수성 파라필름 층에 커버슬립을 배치하면 친수성 PEG 폴리머 용액이 배양 시간 동안 유리 표면에 국한된 상태를 유지할 수 있습니다. 각 커버슬립은 22°C에서 1시간 동안 1x PBS에서 4mg·mL-1 5kDa mPEG-mal 1mL와 함께 배양됩니다(그림 2B). 이 PEG 중합체 분자량 및 농도에 대해, 유리 패시베이션은 PEG 단층의 형성을 유도하며, 여기서 각 PEG 중합체는 버섯과 같은 형태29에 있다. 배양 공정의 끝에서, 각각의 커버슬립을 5 mL의 DDW로 헹구고,N2 (가스)의 흐름으로 건조시킨다. 커버슬립을 즉시 사용하지 않을 경우 1mL의 10mM Tris를 페길화된 표면에 올려 커버슬립 표면을 젖은 상태로 유지해야 합니다. 커버슬립은 실험을 시작하기 직전에N2 (가스)의 흐름으로 건조됩니다. 2시간 이내에 커버슬립을 사용하는 것이 좋습니다.

거시적으로 수축성 탄성 악토미오신 네트워크는 5μM G-액틴과 16.7nM 미오신을 혼합하여 형성되며, 이는 큰 응집체(~150 미오신 이량체/응집체) 형태로 추가되고 280nM의 강력한 가교제 파시안. 이 솔루션에는 ATP 재생 시스템과 표백 방지 솔루션을 사용하여 일정하게 유지되는 1mM ATP가 포함되어 있습니다(프로토콜 섹션의 세부 정보 참조). 침투 용매의 흐름을 분석하기 위해, 형광 비드가 액토 미오신 용액에 첨가된다.

실험은 표준 현미경 스테이지의 치수에 맞는 수제 샘플 홀더에서 실행됩니다(그림 3). 두께 h(~150μm)의 그리스를 입힌 파라필름 스페이서를 두 개의 PEG 부동태화 커버슬립 중 하나에 놓고 해당 커버슬립을 샘플 홀더에 배치합니다(그림 3A). 그런 다음 다양한 미세 성분을 통합하고 마지막으로 G-액틴, 미오신 응집체를 첨가한 다음 액틴 중합을 유발하는 EGTA를 첨가하여 미세 원심분리 튜브의 얼음 위에서 악토미오신 용액을 준비합니다. 용액은 잘 혼합되어야 한다-이것은 실험의 시작 시간(t=0)을 설정한다. 즉시 1.1μL의 해당 용액을 커버슬립에 놓고(그림 3B), 두 번째 PEG 부동태화 커버슬립을 그 위에 놓고(그림 3C), 홀더를 나사로 고정하여 그 사이에 드롭을 가둡니다(그림 3D). 이 입자 부피 및 스페이서 유형의 경우 입자 직경은 약 3,000μm이지만 연구자는 이러한 추정 값에 의존해서는 안 됩니다. 실제 입자 두께와 직경은 항상 현미경 이미지에서 직접 측정해야 합니다. 두께의 경우 컨포칼 현미경을 사용해야 합니다.

샘플 홀더를 현미경에 놓고 수집을 시작합니다. 획득을 시작하는 시간을 최소한으로 줄이기 위해 현미경을 미리 준비해야 합니다. 샘플 이미징을 시작하는 데 일반적으로 1-2분이 걸립니다. 샘플은 488nm 및/또는 561nm에서 여기되고 전용 소프트웨어로 제어되는 도립 형광 현미경을 사용하여 이미지화됩니다. 이미지는 EMCCD 카메라를 사용하는 스트리밍 모드에서 프레임당 100ms(또는 그 이하)의 속도로 획득해야 합니다. 액틴 네트워크와 미오신 모터 응집체 또는 용액의 형광 비드를 동시에 이미지화하려면 이중 방출 시스템을 사용해야 합니다. 형광등의 강도는 네트워크 수축의 진행 단계에서 신호 포화를 피하기 위해 가능한 한 낮게 유지되어야 합니다.

2.5x/0.075 Plan-NEOFLUAR 대물렌즈는 젤의 측면 수축 역학과 젤의 길이 척도에서 유체 흐름 방향성 및 속도를 특성화하는 데 사용됩니다. 이들은 시간에 따른 겔 반경의 변화를 추적하는 데 유용한 저해상도 이미지이며, 이로부터 겔 방사형(측면) 수축 속도를 추론할 수 있습니다. 네트워크의 구조와 다공성, 네트워크 내 미오신 모터 응집체의 위치 및 겔 공극을 가로지르는 개별 형광 비드의 이동을 해결하려면 더 높은 배율의 대물렌즈(예: 10x/0.3 Ph1 UPlanFL 대물렌즈)를 사용해야 합니다. 더 높은 배율도 사용할 수 있지만 시야가 줄어들기 때문에 이중 색상 이미징 모드를 사용하는 경우 더 중요합니다. (2D) 형광 현미경 데이터는 측면 및 수직 방향 모두에서 수축 역학을 특성화하기 위해 3D로 수축 겔의 컨포칼 이미징으로 보완되어야 합니다. 컨포칼 현미경은 두 커버슬립 사이의 간격을 측정하는 데 사용되며, 이 거리는 초기 겔 두께를 정의합니다. 또한, 겔의 두께는 기계적으로 안정한 상태가 달성 될 때 실험이 끝날 때 측정되어야한다.

악토미오신 네트워크가 다공성 물질로서 거동한다는 것을 보여주기 위해서는 몇 가지 기준이 충족될 필요가 있다: (i) 네트워크가 리모델링되지 않아 탄성 물질로서 거동한다고 추론할 수 있고(도 4), (ii) 겔 기공을 가로지르는 물(용매) 흐름은 미오신 수축력에 의해 구동되고(도 5), (iii) 탄성 응력 완화는 효과적인 확산 상수를 특징으로 하며, D ~ κ/γ는 겔 유효 탄성률 κ와 유효 마찰 상수 γ에 따라 달라지며, 이는 움직이는 용매와 겔 기공 사이의 마찰을 설명합니다(그림 6). 아래에서는 각 기준에 대해 개별적으로 논의하고 현재 시스템에서 어떻게 충족되는지 보여줍니다.

목표 (i)

첫째, 겔 구조와 다공성을 분석하고 네트워크가 동적으로 리모델링되는지 여부를 결정해야 합니다. 악토미오신 네트워크의 개략도는 도 4A에 묘사되어 있다. 네트워크 형성은 액틴 필라멘트의 자발적인 핵 형성 및 중합으로 시작되며, 이후 다발됩니다(그림 4B). 그런 다음 네트워크는 액틴 다발의 거시적으로 등방성 상호 연결된 네트워크로 능동적으로 자체 조직화되며, 이는 시간이 지남에 따라 동적으로 거칠어지고 결국 수축합니다. 네트워크 자체 조직화 및 수축은 미오신 응집체에 의해 구동되며, 이는 주로 필라멘트 다발의 교차점에 국한됩니다(그림 4C). 미오신 응집체는 겔 수축을 통해 네트워크에 부착된 상태로 유지되며, 이로부터 이러한 악토미오신 겔이 탄성 활성 물질로 거동한다는 결론을 내릴 수 있습니다(그림 4C). 또한, 이러한 악토미오신 겔에서 수축은 필라멘트 다발의 종단 간 거리, l 종단 간 및 윤곽 길이, lcont를 비교하여 추론한 바와 같이 필라멘트 슬라이딩에 의해 제어됩니다(그림 4D,E). 이것은 액틴 필라멘트 좌굴에 의해 지배되는 α-액티닌에 의해 가교된 느슨한 액틴 다발의 수축과 대조된다29.

겔의 다공성은 용매 흐름이 이동하는 겔 기공의 크기를 특징으로합니다. 정제된 액틴 네트워크의 경우, 겔 내의 가교 결합 사이의 거리를 정의하는 메쉬 크기(여기서, 미오신 응집체)는 겔 공극 크기의 좋은 추정치를 제공합니다. 메쉬 크기는 (2D) 형광 이미지에서 직접 추출할 수 있으며 겔 기공에서 반대되는 액틴 다발 쌍 사이의 거리의 기하 평균에서 평가됩니다(그림 4B). 네트워크는 수축이 시작될 때까지 등방성이므로 수직(즉, 두께를 가로질러) 및 측면(반경을 따라) 방향의 평균 메쉬 크기는 ξ 0, = ξ 0,Equation 23 ll = ξ0(= 67μm)로 동일합니다. 액틴 다발은 수축하는 동안 직선으로 유지되기 때문에 메쉬와 기공 크기는 겔 두께와 직경의 변화에 비례하여 축소됩니다. 현재의 실험 시스템의 경우, 수직 수축이 실질적으로 종료된 후 면내(방사형) 수축이 시작되고(도시되지 않음), 방사형 수축은 ~0.3의 계수만큼 초기 두께보다 작은 일정한 겔 두께에서 진행된다. 결과적으로, 수축 평면 내의 메쉬 크기인 ξ ll(t) = r(t)/R은 반경 수축 동안 감소하지만, 여기서 r(t)는 시간 t에서 겔의 반경이고, 수직 방향의 평균 메쉬 크기는 일정하며, ξEquation 23 = 20μm입니다 23. 이러한 메쉬/기공 크기 값은 아래에 자세히 설명된 대로 겔 탄성률(κ) 및 마찰 계수(γ)를 평가하는 데 사용됩니다(목표 [iii], 그림 6).

목표 (ii)

이 목표는 외부 용매 흐름이 미오신 수축성에 의해 생성된다는 것을 입증하는 것을 포함합니다. 용매 흐름을 추적하기 위해, 형광 비드가 액토 미오신 용액에 첨가된다. 비드는 움직이는 비드와 악토미오신 네트워크 사이의 상호 작용을 줄이기 위해 부동태화됩니다. 전체적으로, 1 μL의 비드(재료 표)를 실온에서 20분 동안 5 μm G-액틴과 함께 배양하고, 과량의 G-액틴을 원심분리에 의해 제거합니다(재료 표, 자세한 내용은 프로토콜 섹션 참조). 이 단계는 10mg·mL-1 BSA(재료 표)로 반복됩니다. 비드는 1:10,000 v/v의 최종 희석으로 단백질 용액에 첨가됩니다. 비드가 겔 기공을 가로질러 자유롭게 움직일 수 있도록 하는 것이 목표이기 때문에 비드의 직경을 겔 기공 크기에 맞게 조정하여 크기 비율이 항상 <<1이 되도록 하는 것이 중요합니다. 따라서 평균 기공 크기가 15μm보다 클 때 수축의 초기 및 중간 단계(그림 5A,B)를 분석하기 위해 직경 2,300nm 비드를 사용하고, 기공 크기가 작을 때 직경 200nm 비드를 사용합니다(그림 5D-G). 비드의 질량 중심 위치는 표준 입자 추적 알고리즘(재료 표)을 사용하여 각 시간 t, (x(t),y(t))비드에 대해 추출되며, 이로부터 궤적(그림 5B) 및 로컬 비드 속도, 비드 속도, 비드, (x(t),y(t),Equation 13, 비드 비드와 그에 따른 침투 용매는 평균적으로 바깥쪽 반경 방향으로 이동하는 반면(그림 5A, B), 입자 이미지 속도계(PIV) 분석에서 볼 수 있듯이 겔은 안쪽으로 수축합니다(그림 6A의 녹색 화살표 참조). 이 방사형 운동은 국부 비드의 반경 방향 속도, νr을 추출함으로써 더욱 정교해질 수 있으며, 이는 단위 벡터에 의해 정의된 반경 방향 상에 국소 비드 속도를 투영함으로써 평가되고, Equation 15시간 t에서 겔 중심(x0, y0)과 비드 질량 중심 위치를 연결함으로써 더욱 정교해질 수 있다.Equation 17Equation 18

데이터는 비드가 겔 중심에서 바깥쪽으로 이동함에 따라 처음에는 속도가 증가한 다음 겔 경계에 가까워질수록 속도가 느려진다는 것을 보여줍니다(그림 5C). 특히, 비드 속도는 겔 반경 수축 속도보다 20배 더 클 수 있습니다( 그림 5C의 파란색 곡선). 채워진 원은 구슬이 젤을 떠나는 시간을 표시합니다. 비드는 일정 시간 동안 겔 경계를 벗어난 후에도 계속 움직입니다. 이 운동은 레이놀드 수가 <10-4이기 때문에 관성 효과로 인해 발생할 수 없습니다. 방사형 비드 속도는 겔 수축의 감소와 함께 시간이 지남에 따라 감소합니다. 특히, 겔 반경 수축 속도가 현저하게 감소하면 비드의 속도가 크게 변동합니다.

이러한 변동이 악토미오신의 다공성 구조로 인해 발생하는지 테스트하기 위해 네트워크는 겔의 수축이 상당히 느려졌을 때 가능한 더 높은 공간 분해능에서 비드의 움직임을 추적합니다(그림 5D-F). 구슬의 궤적은 실제로 구불구불하며(그림 5D,E), 겔의 다공성 구조를 반영하는 구슬의 국부 속도에 상당한 변동이 있습니다.

마지막으로, 겔 속도-용매 속도 상관 함수를 계산하면 국부적으로 유체 흐름이 수축하는 겔과 반대 방향으로 향한다는 것을 알 수 있습니다. 겔의 국소 밝은 점을 기준 마커로 사용하여 각 시점 t, (x(t),y(t))겔에 대한 질량 중심 위치를 계산할 수 있으며 국소 겔 속도를 도출Equation 20할 수 있습니다. 이어서, 겔 내의 각각의 비드 및 인접 지점에 대해, 국소 비드 속도-겔 속도 쌍 상관관계를 계산하여 두 벡터 사이의 각도 θ를 추출한다Equation 22: , 여기서 Equation 23 및 Equation 24 는 각각 비드 및 겔의 국소 속도(크기)이다. 데이터는 겔 공극 내에서 비드의 위치와 무관하게, 국부적으로, 유체 유동이 겔에 대해 반대 방향으로 향한다는 것을 보여준다(도 5G). 전반적으로, 상기 결과는 다공탄성 활성 물질에 대해 예상된 바와 같이, 미오신 수축성에 의해 외부로의 유체 유동이 생성된다는 것을 보여준다 3,7,23,30.

목표 (iii)

이 목표는 응력 완화가 네트워크 탄성 계수, 다공성 및 용매 점도에 따라 달라지는 효과적인 다공탄성 확산 상수 D를 특징으로 한다는 것을 입증하는 것을 포함합니다. 먼저, 수축 겔의 측면(평면 내) 속도를 정량화합니다(그림 6A). 먼저, 형광 이미지를 이진화하고, 각 시점 t, A(t)에서 겔 투영 면적을 추출한다. 이어서, 겔 반경이 계산된다 Equation 26 (도 6B). 이로부터, 시점 t에서의Equation 27 방사형 수축 속도가 도출되며, 이는 겔 에지 속도를 설명한다 (도 6C). 에지 속도는 시간 tmax에서 최대 속도 νmax에 도달할 때까지 에지 속도가 일정한 속도로 Equation 28증가하는 초기 선형 위상을 특징으로 하는 전형적인 시간 진화 프로파일을 보여줍니다. 그런 다음 속도는 기계적으로 안정된 상태에 도달할 때까지 특성 이완 시간 τ에 따라 기하급수적으로 감소합니다(그림 6C). rmax는 이완 단계가 시작될 때의 겔 반경입니다. 

다공탄성 물질의 경우, 이완 시간Equation 33은, 여기서 Equation 34 는 효과적인 다공탄성 확산 상수이고, κ는 유효 탄성 겔 모듈러스이며, γ는 액틴 겔 기공을 통한 수용액의 이동을 설명하는 유효 마찰 상수이다. 탄성 계수는 단위 부피당 에너지 단위를 가지며, 가교 결합 사이의 거리 또는 메쉬 크기에 의해 결정되는 겔 내의 단위 셀의 부피에 반비례한다Equation 35. 마찰 계수 γ는 용매 흐름에 수직인 공극 패싯에 따라 달라집니다. 면내 겔 수축의 경우, 관련 공극 패싯은 Equation 36, 결과적으로 마찰 계수 Equation 37이며, 여기서 η 용매 점도31,32입니다. 전반적으로, 본 발명자들은 다음과 같은 관계를 얻는다: Equation 39, 여기서 관련 면내 공극 크기는 Equation 40 tmax에서 평가된다. 전체적으로, 우리는 이완 시간이 용매 점도23에 따라 선형적으로 스케일링되어야 함을 추론하는 를 얻습니다Equation 41.

이 관계가 준수되는지 테스트하기 위해 다른 양의 글리세롤로 실험을 반복합니다. 글리세롤의 사용은 단백질, 특히 미오신 모터의 활성에 영향을 미치지 않을 것으로 예상되기 때문에 유리하다. 더욱이, 물-글리세롤 용액의 점도와 첨가된 글리세롤의 양 사이의 상관관계는 문헌28에서 이용 가능하다. 이러한 상관관계는 글리세롤 중량 퍼센트가 0%에서 34%로 증가하면 물-글리세롤 용액 점도가 η ω에서 2.76 η ω까지 비례적으로 증가한다는 것을 보여주며, 여기서 η ω는 20°C에서의 물 점도입니다. 이 글리세롤 범위와 동일한 초기 입자 직경(2R = 2,800μm)에 대해 점도가 증가하면 네트워크 중합 및 자가 조직화 단계의 지속 시간이 증가하지만 선형 가속 및 최대 방사형 수축 속도(νmax)는 크게 변하지 않습니다. 이러한 증거는 네트워크 재구성(다공성)과 미오신 활성 둘 다 용액 점도(23)에 의해 영향을 받지 않으며, 용매 점도의 효과는 탄성 응력이 완화되는 데 걸리는 시간에 본질적으로 반영되어야 함을 시사한다. 실제로, 이완 시간은 용액 점도에 대한 선형 의존성을 나타내며(그림 6D), 이는 위에서 도출된 스케일링 관계가 준수됨을 추론하여 시스템의 다공탄성 특성을 추가로 확인합니다.

Figure 1
그림 1: 유리 커버슬립 표면 처리 절차의 세 가지 주요 단계에 대한 개략도 . (i) 유리 표면 세정(피라냐 처리) 및 친수성화, (ii) 표면 실란화, (iii) mPEG-mal을 사용한 패시베이션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 유리 커버슬립 패시베이션. (A) 피라냐 세척 및 실란화는 12개의 선형 홈으로 구성된 수제 폴리테트라플루오로에틸렌 홀더를 사용하여 400mL 비커에서 수행됩니다. (B) 표면 패시베이션은 파라필름으로 코팅된 페트리 접시에서 수행됩니다. 각 커버슬립은 22°C에서 1시간 동안 1x PBS(재료 표)에서 4mg·mL-1의 5kDa mPEG-mal 1mL와 함께 배양됩니다. 소수성 파라필름 층은 친수성 PEG 폴리머 용액이 배양 시간 동안 유리 표면에 국한된 상태를 유지하도록 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 실험 실행 - 수제 샘플 홀더. 실험은 표준 현미경 단계의 치수에 맞는 수제 샘플 홀더에서 실행됩니다. (A) 두께 h (~150μm)의 그리스를 입힌 파라필름 스페이서를 PEG 부동태화 커버슬립에 놓고 해당 커버슬립을 샘플 홀더에 놓습니다. (B) 액토미오신 용액을 Eppendorf 튜브의 얼음 위에서 준비하고 해당 용액 1.1μL를 커버슬립에 놓습니다. 그런 다음 (C) 두 번째 PEG 부동태화 커버슬립을 그 위에 놓고 (D) 샘플 홀더를 나사로 고정하여 드롭을 가두어 디스크와 같은 모양을 채택합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: Poroelasticity 목표(i). 악토미오신 네트워크는 탄성 물질로 작용합니다. (A) 악토미오신 네트워크의 개략도. (B) 액토미오신 네트워크 형성. 형광 현미경 이미지는 액틴 필라멘트가 자발적으로 핵을 형성하고 등방성 상호 연결된 네트워크로 중합되어 시간이 지남에 따라 거칠어지고 결국 거시적으로 수축한다는 것을 보여줍니다. 네트워크의 다공성은 네트워크 메쉬 크기 ξ(이중 화살표)로 특성화됩니다. (C-E) 액토미오신 네트워크 수축은 액틴 필라멘트 다발 슬라이딩에 의해 구동됩니다. (C) 네트워크 수축은 겔 주변부("P")에서 시작하여 겔 벌크 내로 안쪽으로 전파됩니다. 흰색 화살표는 수축 방향을 나타냅니다. 겔 중심은 "C"로 표시되어 있습니다. 형광 이미지는 미오신 운동 응집체(561nm, 빨간색 점)가 액틴 네트워크(488nm, 녹색)에 내장되어 있고 네트워크 수축 내내 부착된 상태를 유지한다는 것을 보여줍니다. (D) 액틴 필라멘트 다발은 네트워크 수축 동안 직선으로 유지됩니다. 등고선 길이, l cont 및 끝 간 거리, l 끝 간 거리, l의 비율, 시간의 함수로. (E) t = 316초(빨간색 실선) 및 t = 327초(줄무늬, 회색)에서 등고선 길이와 종단 간 거리 사이의 비율 분포. 삽입: 일반적인 번들의 윤곽 길이(파란색) 및 종단 간 거리(흰색). 조건: (B,C,E[삽입]): 이미지는 EMCCD 카메라와 10x/0.3 Ph1 UPlanFL 공기 대물렌즈가 있는 도립 형광 현미경에서 일반 모드(B) 및 이미지 오버레이 후 듀얼 이미징 모드(C,E[삽입])에서 획득됩니다. 스케일 바는 (B,C) 100 μm 및 (E[삽입]) 50 μm입니다. 이 그림은 Ideses et al.23의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: Poroelasticity 목표(ii). 외부 용매 흐름은 미오신 운동 수축성에 의해 생성됩니다. (A) 수축의 중간 단계에서 저배율로 겔 이미징: 시간의 함수로서 용액에 첨가된 수축 액틴 네트워크(488nm, 왼쪽)와 2,300nm 형광 비드(561nm, 오른쪽)의 동시 형광 이미징. 원은 4개의 구슬의 위치를 표시합니다. 화살표는 비드 동작의 전역 방향을 표시합니다. (B) 9개의 선택된 구슬의 궤적이 묘사되어 있습니다. 화살표는 구슬 움직임의 글로벌 반경 방향을 표시합니다. 동그라미 십자형은 겔 중심(x0,y0) (C) 국소 방사형 비드 속도, νr(열린 원) 및 (방사형) 겔 에지 속도(파란색 점) 대 시간을 나타냅니다. 채워진 원은 주어진 비드가 겔 경계를 빠져나가는 시간을 나타냅니다. (D-F) 네트워크 다공성 및 진행된 수축 단계에서 겔 기공을 가로지르는 용매의 이동을 해결합니다. (D) 수축 겔 및 용액에 첨가된 직경 200 nm 형광 비드의 에피형광 이미지. 액틴과 비드는 모두 488nm에서 여기됩니다. 빨간색 원은 시간에 따른 구슬의 위치를 따릅니다. 회색 선은 겔 경계를 나타냅니다. (E) (D)에 나타낸 비드의 궤적. 표시된 필드에서 젤은 평균적으로 바닥으로 향합니다. 좌표는 카메라의 원점을 기준으로 측정됩니다. (F) 비드의 국부 속도는 겔의 다공성 구조를 반영합니다. 상단: 로컬 비드 속도(열린 원), 로컬 젤 속도(회색 원) 및 젤 가장자리 속도(파란색 원) 대 시간. 하단: 스냅샷은 선택한 시간 동안 비드의 위치를 보여줍니다. 구슬은 빨간색 원으로 표시됩니다. 점선은 비드가 젤에서 나오는 시간을 표시합니다. (G) 국소 겔과 국소 비드 속도 사이의 각도 분포. 조건: EMCCD 카메라와 (A) 2.5x/0.075 Plan-NEOFLUAR 대물렌즈 및 (D,F) 10x/0.3 Ph1 UPlanFL 대물렌즈가 있는 도립 형광 현미경에서 이미지를 획득합니다. 스케일 바는 (A) 400 μm, (D) 100 μm, (F) 및 50 μm입니다. 이 그림은 Ideses et al.23의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: Poroelasticity 목표(iii). 응력 완화는 효과적인 다공탄성 확산 상수를 특징으로 합니다. (A) 혼합 시간부터 정상 상태까지 낮은 배율에서 수축하는 악토미오신 겔의 평면도 형광 이미지. 속도장(녹색 화살표)은 PIV 분석에서 추출됩니다. EMCCD 카메라와 2.5x/0.075 Plan-NEOFLUAR 대물렌즈가 장착된 도립 형광 현미경으로 이미지를 획득합니다. 여기 파장은 488nm(액틴)입니다. 스케일 바는 500μm입니다. (B) 겔 반경 및 (C) 반경 수축 속도(즉, Equation 53 겔 에지 속도 대 시간). A는 가속도를 나타내고,Vmax 는 최대 속도를 나타내며, τ는 특징적인 이완 시간을 나타냅니다. (D) 악토미오신 네트워크는 다공탄성 활성 물질로 거동합니다. Equation 55 및 용매 점도, η 대 글리세롤 중량 퍼센트 (wt%). 양은 0 wt% 글리세롤에서의 값으로 표준화된다. 겔의 초기 반경은 R = 1,400 μm입니다. 오차 막대는 실험 값의 표준 편차입니다. 이 그림은 Ideses et al.23의 허가를 받아 복제되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

여기서, 시험관내 접근법은 세포 세포골격의 모델 시스템으로서, 그리고 보다 일반적으로는 다공탄성 물질로서 거동하는 것으로 밝혀진 세포 세포질의 다공탄성 악토미오신 겔의 역학을 특성화하기 위해 사용된다 3,5. 세포 세포 골격(세포질)의 유변학은 기계적 스트레스가 가해진 후 세포 내 세포질 유체가 세포 내에서 재분배되는 데 걸리는 시간을 나타내는 다공탄성 확산 상수를 특징으로 합니다. 세포는 모양을 조절하기 위해 이 메커니즘을 사용하는 것이 제안되었다5.

이러한 발견에 동기를 부여하여 우리는 시험관 내에서 다공성 탄성을 연구하기 위한 프레임워크를 개발했습니다. 제안된 모델 시스템을 사용하여 미오신 수축성이 유체 흐름의 출현에 어떻게 기여하는지, 네트워크 속도와 용매 속도, 방향성 및 속도가 시간과 공간에서 어떻게 상관되는지에 대한 통찰력을 제공합니다. 이를 통해 네트워크와 임베디드 용매가 상호 연결되어 있으며 별도의 객체로 간주 될 수 없음을 입증합니다. 실험 설정을 설명하고 젤을 준비하고 실험을 실행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 데이터 정량화를 위한 자세한 프레임워크도 제시됩니다. 제안된 프레임워크는 조사된 실험 시스템의 특이성에 관계없이 다양한 실험 설정 및 시스템에서 다공탄성을 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

우리는 스트레스 완화의 시간 척도의 변화를 분석하여 actomyosin 네트워크의 다공성 탄력성을 검증합니다. 우리는 actomyosin 용액에 다양한 양의 글리세롤을 첨가하여 배지의 점도를 변화시킴으로써이를 입증하기로 결정했습니다. 글리세롤을 사용하는 것의 장점은 네트워크의 다공성 및 구조에 영향을 미치지 않는다는 것이며, 따라서, 응력 완화에 대한 유일한 효과는 이동 용액과 겔 기공(23) 사이의 마찰의 증가이다. 네트워크 다공성의 변화는 탄성 계수와 네트워크 기공 크기가 모두 비선형 방식으로 이완 시간에 영향을 미치기 때문에 추가적인 합병증을 발생시켰을 것입니다(23,31,32).

성공적인 실험을 실행하려면 불활성 폴리머로 유리 커버슬립을 부동태화해야 합니다. 이 단계는 매우 중요합니다. 유리 패시베이션을 위해 여기에 사용된 절차는 패시베이션의 품질이 보존되는 경우 다른 절차로 대체될 수 있습니다(33,34). 표면 패시베이션 결함은 대규모 단백질 접착을 일으켜 네트워크 조립을 억제할 수 있습니다. 유리 패시베이션은 또한 수축 겔과 유리 표면의 상호 작용을 방지하는 데 중요합니다. 이것은 여기에서 고려된 유체-겔 마찰 외에 추가적인 마찰 용어로 이어질 것이며, 이는 추정하거나 정량화하기가 훨씬 더 어려울 것입니다. 표면 패시베이션 외에도 성공적인 실험을 위해서는 신선한 액틴을 사용해야 합니다. 또한, 모터의 활동도 중요하며, 새로운 미오신 배치의 준비는 3-4 개월마다 반복되어야합니다.

전반적으로, 이 실험적 접근법은 시험관 내에서 다공성 탄성을 연구하는 데 성공적인 것으로 나타났습니다. 현재 채택되고 있는 실험 절차의 한계는 초기 겔 치수를 보다 강력하게 제어하는 방법이다. 한 가지 옵션은 제어 가능한 치수의 미리 형성된 챔버를 사용하는 것입니다. 미리 형성된 챔버를 사용하면 연구원이 시스템 크기를 더 잘 제어할 수 있을 뿐만 아니라 시스템의 형상을 쉽게 변경할 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

단백질 정제 및 라벨링에 대해 Dina Aranovich에게 감사드립니다. GL은 Jabotinsky 박사 학위 장학금에 대해 이스라엘 과학 기술 우주부에 감사드립니다. ABG는 재정 지원에 대해 이스라엘 과학 재단(보조금 2101/20)과 이스라엘 과학 기술부(보조금 3-17491)에 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane Sigma-Aldrich Company 175617 Stored under Argon atmosphere at 4 °C 
Acetic acid Bio-Lab ltd 1070521
Alexa-Fluor 488 Invitrogene A10254 Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C 
Alexa-Fluor 647 Invitrogene A20347 Diluted with DMSO, stored under Argon atmosphere at -20 °C 
BSA Sigma -Aldrich Company A3059 Stored at 4 °C 
Catalase Sigma -Aldrich Company C9322 The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at -20 °C
Coverslips Mezel-glaser CG2222-1.5 Kept in milliQ-water after the Piranha treatment and used within 3 weeks
Creatine kinase Roche Life Science Products 10736988001 Prepared fresh in glycine buffer, kep on ice, and used within 3 days.  The stock bottle is kept under dry atmosphere (silica gel) at 4 °C
Creatine phosphate Roche Life Science Products 10621714001 When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months. The stock bottle is kept under Argon atmosphere and stored at 4 °C
DTT Roche Life Science Products 10708984001 When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months
Dual view Simultaneous Imaging System  Photometrics DV2-CUBE
EGTA MP Biomedicals 195174
EM-CCD Camera Andor Technology Ltd DV 887
EM-CCD Camera Photometrics Evolve Delta
Ethanol Bio-Lab ltd 525050300
Flourescence Lamp Rapp Optoelectronic
Fluoresbrite YG Microspheres Polysciences 17151-10 200 nm diameter
Glucose ICN Biomedicals Inc 194024 When dissolved should be kept at -20 °C and used within 3 months.
Glucose oxidase Sigma-Aldrich Company G7141 Kept in -20 °C and used within 3 months. The stock powder is kept under Argon atmosphere and kept at -20 °C
Glycerol ICN Biomedicals Inc 800687
Glycine MP Biomedicals 808822
Hydrogen Peroxide Sigma-Aldrich Company 216763 Stored at 4 °C 
KCl EMD Millipore Corp. 529552
Methanol Bio-Lab ltd 1368052100
MgCl2 EMD Millipore Corp. 442615
Microscope Leica Microsystems DMI3000
mPEG-mal Nanocs PG1-ML-5k  Mw = 5000 Da. Divided to small batches by weight. Stored under Argon atmosphere at -20 °C
Nile red microspheres Spherotech FP-2056-2  2300 nm diameter
Objective (10x) Leica Germany HC PL AP0 UPlanFL Numerical Aperture = 0.3
Objective (2.5x) Leica Germany 506304  Plan-NEOFLUAR Numerical Aperture = 0.075
Oven WTC Binder
Parafilm Amcor PM-996
PBS Buffer Sigma-Aldrich Company P4417
Shutter Driver Vincet Associates VMM D1
Silica gel Merck 1.01907.5000
Sonicator Elma Elmasonic P
Sulfuric acid Carlo Erba reagents 410301
DV2 Dual-Channel Simultaneous-Imaging System Photometrics
TRIS MP Biomedicals 819620
UV-VIS Spectrophotometer Pharmacia Ultraspec 2100 pro
MICROMAN E Gilson FD10001 1–10 uL
MATLAB R2017b MathWorks Data quantification 
MetaMorph  Molecular devices Control software of the optical imaging system; data quantification (particle tracking analysis, network mesh size)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., et al. Genesis, Modulation, and Regeneration of Skeletal Muscle In Molecular Biology of the Cell. 4th edition. , Garland Science. New York. (2002).
  2. Howard, J. Mechanics of Motor Proteins and the Cytoskeleton. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (2001).
  3. Mogilner, A., Manhart, A. Intracellular fluid mechanics: Coupling cytoplasmic flow with active cytoskeletal gel. Annual Review of Fluid Mechanics. 50 (1), 347-370 (2018).
  4. Bausch, A. R., Kroy, K. A bottom-up approach to cell mechanics. Nature Physics. 2 (4), 231-238 (2006).
  5. Moeendarbary, E., et al. The cytoplasm of living cells behaves as a poroelastic material. Nature Materials. 12 (3), 253-261 (2013).
  6. Charras, G. T., Mitchison, T. J., Mahadevan, L. Animal cell hydraulics. Journal of Cell Science. 122 (18), 3233-3241 (2009).
  7. Charras, G. T., Yarrow, J. C., Horton, M. A., Mahadevan, L., Mitchison, T. J. Non-equilibration of hydrostatic pressure in blebbing cells. Nature. 435 (7040), 365-369 (2005).
  8. Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11 (10), 1219-1224 (2009).
  9. Paluch, E., Piel, M., Prost, J., Bornens, M., Sykes, C. Cortical actomyosin breakage triggers shape oscillations in cells and cell fragments. Biophysical Journal. 89 (1), 724-733 (2005).
  10. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  11. Siton-Mendelson, O., Bernheim-Groswasser, A. Toward the reconstitution of synthetic cell motility. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 461-474 (2016).
  12. Bernheim-Groswasser, A., Wiesner, S., Golsteyn, R. M., Carlier, M. -F., Sykes, C. The dynamics of actin-based motility depend on surface parameters. Nature. 417 (6886), 308-311 (2002).
  13. Bieling, P., et al. Force feedback controls motor activity and mechanical properties of self-assembling branched actin networks. Cell. 164 (1-2), 115-127 (2016).
  14. Carvalho, K., et al. Actin polymerization or myosin contraction: two ways to build up cortical tension for symmetry breaking. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 368 (1629), 20130005 (2013).
  15. Dayel, M. J., et al. In silico reconstitution of actin-based symmetry breaking and motility. PLoS Biology. 7 (9), e1000201 (2009).
  16. Manhart, A., et al. Quantitative regulation of the dynamic steady state of actin networks. eLife. 8, 42413 (2019).
  17. Siton, O., et al. Cortactin releases the brakes in actin-based motility by enhancing WASP-VCA detachment from Arp2/3 branches. Current Biology. 21 (24), 2092-2097 (2011).
  18. Pontani, L. -L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophysical Journal. 96 (1), 192-198 (2009).
  19. Ideses, Y., Sonn-Segev, A., Roichman, Y., Bernheim-Groswasser, A. Myosin II does it all: Assembly, remodeling, and disassembly of actin networks are governed by myosin II activity. Soft Matter. 9 (29), 7127-7137 (2013).
  20. Backouche, F., Haviv, L., Groswasser, D., Bernheim-Groswasser, A. Active gels: Dynamics of patterning and self-organization. Physical Biology. 3 (4), 264 (2006).
  21. Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state. Nature Physics. 9 (9), 591-597 (2013).
  22. Linsmeier, I., et al. Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility. Nature Communications. 7 (1), 12615 (2016).
  23. Ideses, Y., et al. Spontaneous buckling of contractile poroelastic actomyosin sheets. Nature Communications. 9 (1), 2461 (2018).
  24. Spudich, J. A., Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction: I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).
  25. Ono, S., et al. Identification of an actin binding region and a protein kinase C phosphorylation site on human fascin. Journal of Biological Chemistry. 272 (4), 2527-2533 (1997).
  26. Margossian, S. S., Lowey, S. Preparation of myosin and its subfragments from rabbit skeletal muscle. In Methods in Enzymology. 85, Academic Press. Cambridge, MA. 55-71 (1982).
  27. Quinlan, M. E., Forkey, J. N., Goldman, Y. E. Orientation of the myosin light chain region by single molecule total internal reflection fluorescence polarization microscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1132-1142 (2005).
  28. Cheng, N. -S. Formula for the viscosity of a glycerol−water mixture. Industrial & Engineering Chemistry Research. 47 (9), 3285-3288 (2008).
  29. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  30. Strychalski, W., Guy, R. D. Intracellular pressure dynamics in blebbing cells. Biophysical Journal. 110 (5), 1168-1179 (2016).
  31. Head, D. A., Levine, A. J., MacKintosh, F. C. Distinct regimes of elastic response and deformation modes of crosslinked cytoskeletal and semiflexible polymer networks. Physical Review E. 68 (6), 061907 (2003).
  32. MacKintosh, F. C., Levine, A. J. Nonequilibrium mechanics and dynamics of motor-activated gels. Physical Review Letters. 100 (1), 018104 (2008).
  33. Melero, C., et al. Light-induced molecular adsorption of proteins using the PRIMO system for micro-patterning to study cell responses to extracellular matrix proteins. Journal of Visualized Experiments. (152), e60092 (2019).
  34. Bendix, P. M., et al. A quantitative analysis of contractility in active cytoskeletal protein networks. Biophysical Journal. 94 (8), 3126-3136 (2008).

Tags

Bioengineering 액틴 미오신 활성 수축 네트워크 액토미오신 다공탄성 유체 흐름 세포골격-세포질 속도-속도 상관관계
세포 세포 골격의 모델 시스템으로서의 (Poro-) 탄성 수축 Actomyosin 네트워크의 역학
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choudhary, S., Livne, G., Gat, S.,… More

Choudhary, S., Livne, G., Gat, S., Bernheim-Groswasser, A. The Mechanics of (Poro-)Elastic Contractile Actomyosin Networks As a Model System of the Cell Cytoskeleton. J. Vis. Exp. (193), e64377, doi:10.3791/64377 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter