Summary
이 원고는 생존 설치류 고환 절제술과 난소 절제술을 신속하게 수행하는 일관된 방법을 설명합니다.
Abstract
성호르몬 신호전달은 신경퇴행성 질환을 포함한 다양한 질병의 진행뿐만 아니라 여러 장기 시스템에서 중요한 역할을 합니다. 쥐 모델 시스템에서 성호르몬 수치를 조작하면 장기/조직 및 질병 진행에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 고환 절제술(고환 절제술)과 난소 절제술(난소 절제술)은 내인성 성 호르몬을 고갈시켜 약물 또는 기타 전달 방법을 통해 정확한 호르몬 수치를 제공할 수 있는 방법을 제공합니다. 여기에서 우리는 성 호르몬 감소를 위한 쥐 모델 시스템에서 고환 절제술과 난소 절제술을 위한 신속하고 최소 침습적인 방법을 제공합니다. 이 프로토콜은 음낭을 통한 고환의 수술 준비 및 절제, 좌우 측면의 두 절개를 통한 난소 절제에 대해 자세히 설명합니다.
Introduction
고환과 난소는 성호르몬 생성을 담당하는 주요 기관입니다. 테스토스테론과 에스트로겐 생성으로 이어지는 호르몬 소통의 연쇄 작용은 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH)의 방출과 함께 시상하부에서 시작되는 잘 특성화된 과정입니다.1 GnRH의 방출은 뇌하수체에서 황체 형성 호르몬(LH)과 난포 자극 호르몬(FSH)의 방출을 유발합니다. 이 호르몬이 혈류로 들어가면 신체의 다른 조직에 영향을 미칩니다. LH의 주요 표적은 고환(남성)과 난소(여성)입니다2. LH에 반응하여, 고환은 테스토스테론을 생성하고 풀어 놓는다3. 마찬가지로, 난소는 에스트로겐을 생산한다4. 이러한 호르몬의 의도된 효과는 수정을 위해 세포와 신체를 준비하고 생식 기관이 기능하도록 하는 것이지만 다른 많은 신체 시스템이 영향을 받을 수 있습니다.
성 호르몬은 여러 가지 생리적 기능과 관련이 있습니다. 예를 들어, 에스트로겐은 파골세포에 의한 뼈의 재흡수를 방지하여 뼈의 항상성을 유지하는 데 도움이 됩니다. 이러한 이유로, 난소 절제술된 마우스 모델은 골다공증과 같은 뼈 질환의 생리학을 연구하는데 사용될 수 있다 5,6,7. 테스토스테론과 에스트로겐은 또한 많은 심혈관 및 신경 퇴행성 질환의 연구 대상입니다. 최근에는 테스토스테론 분비 증가와 고지방 식단이 혈관 산화 스트레스와 관련이 있는 것으로 나타났다8. 뇌에서는 난소 절제술 후 LH의 변화가 공간 기억의 변화를 일으켰다9. 난소 절제술에 따른 에스트로겐 감소는 해마의 세포 사멸을 연구하기 위한 모델 시스템이 되었는데, 이는 세포사멸을 유도하여 기억력 결핍을 초래할 수 있기 때문이다10. 테스토스테론은 또한 신장 이식 후 생쥐 모델과 인간 모두에서 신장의 성장에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다11.
호르몬이 결핍된 쥐 모델을 만들면 다양한 질병이나 조직에 대한 성 호르몬과 호르몬 폭포를 연구할 수 있습니다. 이는 고환(고환 절제술) 또는 난소 제거(난소 절제술)를 외과적으로 제거하여 달성할 수 있습니다. 이 절차는 이유식 연령(21일) 또는 임의의 성체 연령만큼 어린 모든 균주의 마우스에서 수행될 수 있습니다. 난소 절제술은 암컷 마우스에서 시행되는 반면, 고환 절제술은 수컷 마우스에서 시행됩니다. 이러한 장기를 제거함으로써 에스트로겐과 테스토스테론의 수치와 프로게스테론과 같은 많은 유도체를 크게 줄일 수 있습니다12,13. 생쥐에서 고환절제술 또는 난소절제술을 수행하는 과정은 적절한 기술로 빠르고 최소 침습적일 수 있습니다. 이러한 장기를 안전하고 효율적인 방식으로 신속하게 절제하면 올바른 수술을 통해 100%의 생존율을 유지하여 마우스 수를 최소화하면서 신속하게 수술할 수 있습니다. 여기에서는 고환과 난소의 신속한 절제를 위한 프로토콜을 자세히 설명하고 연구자들이 이 수술을 빠르고 안전하게 수행할 수 있도록 적절한 수술 후 모니터링을 보여줍니다. 또한 이 시술을 수행할 때 외과의에게 해부학적 랜드마크를 제공하기 위해 성기 및 주변 조직의 시각적 예를 포함합니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 UTSW의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(APN#2019-102840)의 승인을 받았습니다.
1. 쥐 고환 절제술
- 무균 작업 필드를 준비하고 필요한 수술 기구가 멸균되어 쉽게 사용할 수 있는지 확인하십시오. 설치류 생존 수술을 위한 무균 관행을 따르십시오.
- 수컷 쥐의 체중을 기록하고 기관 지침에 따라 선호하는 마취 방법을 투여합니다. 이 프로토콜에서는 마취를 유지하기 위해 정밀 기화기를 통해 2% 이소플루란을 전달했습니다. 시술 전에 기관 지침에 따라 진통제를 투여하십시오. 이 프로토콜에서는 1.0mg/kg 부프레노르핀 SR 및 5mg/kg 멜록시캠을 피하 투여했습니다.
- 쥐가 마취되면 눈 부상, 각막 건조 또는 궤양의 형성을 방지하기 위해 윤활 아이 젤로 동물의 눈을 덮습니다.
- 진행하기 전에 발가락 꼬집기 반응 테스트를 수행하여 적절한 마취면을 확인하십시오.
- 동물을 무균 수술장에 놓기 전에 동물의 수술 부위를 준비하십시오.
- 그런 다음 가위를 사용하여 마우스의 서혜부와 음낭 부분을 면도합니다.
참고: 음경보다 아래쪽 복부를 면도하면 수술 중에 더 나은 시각화가 가능합니다. - 면으로 감싼 어플리케이터를 사용하여 제모 크림( 재료 표 참조)을 동물의 피부에 얇게 바르고 방금 면도한 음낭과 주변 부위를 덮습니다. 30초 동안 기다렸다가 깨끗한 거즈 조각으로 크림을 제거합니다.
- 70% 에탄올에 적신 거즈 스폰지를 사용하여 해당 부위에 남아 있는 크림과 머리카락을 닦아냅니다.
알림: 이 단계에서 70% 에탄올은 제모 크림을 완전히 제거하는 데 도움이 됩니다. 수술 부위의 방부제 준비는 1.8 단계에서 수행됩니다.
- 그런 다음 가위를 사용하여 마우스의 서혜부와 음낭 부분을 면도합니다.
- 마우스를 수술 부위로 옮기고 수술 중 동물의 체온을 유지할 수 있는 열원을 사용할 수 있는지 확인하십시오. 동물을 수술용 드레이프 위에 누운 자세로 놓고 부드러운 접착 테이프를 사용하여 쥐의 발을 수술용 매트에 부착합니다.
- 고환이 복부로 올라가면 고환이 내려가도록 복부를 조심스럽게 촉진합니다. 장갑을 낀 손을 사용하여 복부에 아래쪽으로 부드러운 롤링 압력을 가합니다.
알림: 이 수술은 해부 내시경으로 수행하거나 확대를 위해 한 쌍의 확대경을 사용하는 것이 더 쉽습니다. 해부 스코프 하에서 이 작업을 수행하는 경우 잠시 시간을 내어 스코프의 시야 아래에 마우스의 음낭을 배치하십시오. 부드러운 테이프를 사용하여 쥐의 다리나 복부를 수술 부위에 부착하여 올바른 위치에 유지되도록 할 수 있습니다. - 베타딘 서지컬 스크럽(또는 이와 유사한 살균 피부 준비 스크럽)으로 피부를 문지른 다음 알코올 70% 스크럽을 최소 3회 이상 문질러 적절한 피부 소독을 합니다. 각 스크럽에 대해 바깥쪽으로 방사형 동작으로 문지르므로 절개 부위의 중앙을 먼저 문지르고 면도 수술 부위의 바깥쪽 경계가 마지막으로 문지르는 것으로 끝납니다.
- 이때 멸균 수술 장갑을 착용하십시오. 절차의 다음 단계에서는 무균 기술을 사용하십시오. 드레이프 재료로 몸을 덮기 위해 동물 위에 작은 절개(수술 부위에 맞도록 약 0.5-1인치 정사각형으로 절단)가 있는 멸균 수술용 드레이프로 마우스를 덮습니다.
- 승인된 기관 동물 복지 지침에 따라 수술용 메스 칼날 또는 이와 유사한 도구를 사용하여 약 1cm -1.5cm 길이의 음낭에 복부 정중선 절개를 만듭니다.
- 피부의 잘린 테두리를 잡고 끝이 뭉툭한 기구를 사용하여 피부와 조직 아래를 분리합니다. 절개 부위의 측면, 상부 및 하부 경계에서 시간을 내어 이 작업을 수행합니다.
- 주걱과 집게를 사용하여 피부의 절개 부위를 고환 중 하나의 중앙에 위치하도록 이동하여 고환을 분리합니다. 이것이 어렵다면 1.11로 돌아가 피부를 아래 레이어에서 더 분리하십시오.
- 한 쌍의 구부러진 집게를 고환의 양쪽에 놓습니다. 고환이 바깥쪽으로 나오도록 부드러운 아래쪽 압력을 가합니다. 집게를 사용하여 고환 위에 있는 얇고 투명한 근육층을 잡습니다. 이것이 크레마스터 근육입니다. 올바른 근육층의 확인은 이 층과 그 아래의 고환에서 독립적으로 움직이는 순환을 관찰하여 이루어집니다.
참고: 정확한 조직의 식별은 투명성과 기본 조직과 독립적으로 움직일 수 있는 능력에 의해 확인됩니다.- 근육의 정점이 잡힐 때까지 집게를 사용하여 근육 조직을 조작합니다. 이것은 가장 낮은 부분이어야 하며 그 아래에 고환과 부고환이 있어야 합니다.
- 집게로 크레마스터 근육을 잡고 고환과 부고환에서 부드럽게 멀어집니다. 작은 Vannas 스프링 가위를 사용하여 정점에서 첫 번째 고환의 cremaster 근육을 통해 0.5cm를 절개합니다.
- 절단된 cremaster 근육의 뒤쪽 가장자리에 잠금 클램프를 놓습니다. 좁은 한 쌍의 지혈제 또는 한 쌍의 잠금 마이크로 바늘 홀더를 사용하십시오. 조직이 클램핑되면 기구를 마우스 측면에 부드럽게 놓아 조직을 cl로 유지합니다.amp다음 절차 단계 동안 아래로 고정합니다.
- 집게를 사용하여 1.14단계에서 만든 절개의 상부 경계를 잡습니다. 크레마스터 근육의 양쪽 끝이 수축되는 동안 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 구멍 내부로 손을 뻗어 고환을 부드럽게 잡습니다.
- 근육의 구멍을 통해 바깥쪽으로 당깁니다. 수술 부위에 혈관과 혈액이 뚫린 흔적이 있는지 주의 깊게 관찰하십시오.
- 고환, 부고환, 부착된 정자 및 혈관은 조직이 적절하게 외부화될 때 분명해집니다.
- 부고환과 고환의 꼬리-등쪽 끝 근처에는 고환이 크레마스터 근육에 부착되는 섬유질이 있습니다. 외부 조직을 옆으로 굴려 이 삽입 지점을 찾습니다. 근육 손상을 방지하고 조직을 추가로 분리하고 시각화할 수 있도록 절단합니다. 두 쌍의 집게를 사용하여 클램프 및 찢어짐 기술을 수행합니다.
- 서혜부 지방 패드에서 고환 주변의 지방 조직을 찾으십시오. 한 쌍의 집게를 사용하여 지방 패드를 잡고 부드럽게 당겨 외부로 만듭니다.
- 지방 패드를 따라 이동하는 혈관을 잡아당기면 출혈이 발생할 수 있으므로 잡지 마십시오.
- 정자, 혈관 및 외부 조직에 근접한 나머지 지방 패드를 찾아 한 쌍의 지혈제를 사용하여 고정합니다. 원위 고환에 약간의 긴장을 유지하면서 지혈제 클램프의 원위부에 있는 정자와 혈관을 소작합니다.
- 완료되면 cl을 천천히 풀어주세요.amp 소작된 끝 부분에 근접하고 출혈 징후가 있는지 확인합니다. 있는 경우 이 단계를 반복합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 소작되는 조직의 말단부에 부드러운 장력을 유지하는 것이 도움이 됩니다.
- 정삭의 잘린 그루터기가 몸 안으로 다시 들어가도록 합니다. 크레마스터 근육의 잘린 두 끝을 잡고 함께 가져옵니다. 조직의 절개 크기를 평가하고 4-0 또는 5-0 흡수성 봉합사를 사용하여 조직을 봉합합니다. 절개 크기에 따라 1개 또는 2개의 봉합사가 필요합니다. 봉합사 가위를 사용하여 봉합사 끝을 0.5cm로 자릅니다.
- 음낭의 반대쪽에서 1.13-1.20단계를 반복하여 두 번째 고환을 제거합니다.
- 피부 절개 부위를 봉합할 준비를 합니다.
- 양쪽 조직 그루터기의 좋은 지혈을 보장합니다. 지혈이 잘 되지 않으면 수술 부위에 잔류 출혈이 발생합니다. 이 경우 출혈 부위를 찾아 소작하십시오. 이것은 뭉툭한 기구로 조직을 느리고 조심스럽게 조작함으로써 피할 수 있습니다.
- 수술 부위에 피가 보이면 멸균된 면 팁 어플리케이터를 사용하여 해당 부위를 건조시켜 더 잘 볼 수 있습니다. 주사기를 사용하여 해당 부위에 식염수를 떨어뜨려 수술 부위에서 멀리 떨어진 혈액이나 체액을 세척합니다.
- 절개 부위의 양쪽을 함께 당겨 봉합할 준비를 합니다. cremaster 절개 부위의 봉합된 끝이 피부 절개 부위로 돌출되지 않도록 합니다. 필요한 경우 봉합사 끝을 더 다듬습니다.
- 피부를 닫습니다.
- 상처 클립을 사용하는 경우 집게를 사용하여 피부를 보호하고 아래 조직에서 떼어냅니다. 절개 부위 중앙에 상처 클립 하나를 놓습니다. 피부가 잘 잘렸는지 확인하십시오. 절개 부위가 너무 커서 상처 클립 하나로 충분히 닫을 수 없는 경우, 절개 부위의 상부 및 하부 부위에 수술용 피부 접착제를 도포할 수 있습니다.
- 봉합사를 사용하는 경우 아래 조직을 잡지 않고 피부를 통해 필요한 수의 봉합사를 배치합니다. 이러한 유형의 절개는 4-0 비흡수성 봉합사 재료를 사용하여 2-3개의 단일 단속 봉합사가 필요합니다.
- 수술 부위 주변의 피부를 식염수와 멸균된 면봉 어플리케이터로 부드럽게 닦아 마른 혈액이나 잔류 소독 스크럽을 제거합니다.
2. 쥐 난소 절제술
- 무균 작업 필드를 준비하고 필요한 수술 기구가 멸균되어 쉽게 사용할 수 있는지 확인하십시오. 설치류 생존 수술을 위한 무균 관행을 따르십시오.
- 암컷 쥐의 체중을 기록하고 기관 지침에 따라 선호하는 마취 방법을 투여합니다. 이 프로토콜에서는 마취를 유지하기 위해 정밀 기화기를 통해 2% 이소플루란을 전달했습니다. 시술 전에 기관 지침에 따라 진통제를 투여하십시오. 이 프로토콜에서는 1.0mg/kg 부프레노르핀 SR 및 5mg/kg 멜록시캠을 피하 투여했습니다.
- 눈 부상, 각막 건조 또는 궤양의 형성을 피하기 위해 동물의 눈에 윤활 아이 젤을 투여하십시오. 작업 중 동물의 체온을 유지하기 위해 열원을 사용할 수 있는지 확인하십시오. 발가락 꼬집기 반응을 확인하여 적절한 마취면을 확인하십시오.
- 동물을 수술 필드에 배치하기 전에 동물의 수술 부위를 준비하십시오.
- 가위를 사용하여 동물의 등 배외측 부위에 있는 털을 부드럽게 면도합니다. 엉덩이의 위쪽 경계 위와 흉곽의 아래쪽 경계 아래 영역과 이러한 랜드마크 사이의 영역에서 머리카락을 제거합니다.
- 솜 끝이 달린 어플리케이터를 사용하여 동물의 피부에 제모 크림을 바르고 방금 면도한 부위를 덮습니다. 30초 동안 기다렸다가 거즈 조각으로 크림을 제거하고 남아 있는 잔모를 제거합니다.
- 70% 에탄올을 적신 거즈 스폰지를 사용하여 수술 부위에 남아 있는 크림과 머리카락을 닦아냅니다.
알림: 이 단계에서 70% 에탄올은 제모 크림을 완전히 제거하는 데 도움이 됩니다. 수술 부위의 소독 준비는 단계 2.5에서 수행됩니다.
- 수술 부위에서 동물을 측면 위치(한 번에 하나의 난소를 제거하기 위한 절개용)에 놓고 열원을 사용할 수 있는지 확인하십시오. 베타딘 수술용 스크럽(또는 이와 유사한 소독용 피부 제제 스크럽)으로 수술 부위를 문지른 다음 70% 알코올을 최소 3회 문질러 적절한 피부 소독을 합니다. 각 스크럽에 대해 바깥쪽으로 방사형 동작으로 스크럽하여 절개 부위의 중앙을 먼저 문지르고 면도 수술 부위의 바깥쪽 경계를 마지막으로 문지릅니다.
- 이때 멸균 수술 장갑을 착용하십시오. 절차의 다음 단계에서는 무균 기술을 사용하십시오. 몸이 드레이프 재료로 덮이도록 동물 위에 작은 절개가 있는 수술용 드레이프(수술 부위에 맞게 드레이프에서 약 0.5-1인치 정사각형으로 절단)를 놓습니다.
- 마우스의 엉덩이와 갈비뼈 사이의 중간 지점을 찾아 수술 절개를 위한 이상적인 위치를 찾습니다( 그림 2 참조). 집게로 피부를 잡고 이 위치에서 피부를 1.0cm 절개합니다.
- 끝이 뭉툭한 기구(탐침, 수술용 주걱 또는 끝이 뭉툭한 지혈제)를 사용하여 근육 조직 아래에서 피부를 분리합니다. 절개 부위의 측면, 상부 및 하부 경계에서 시간을 내어 이 작업을 수행합니다.
- 복부의 배외측 근육벽을 찾습니다. 필요한 경우 피부와 근육층 사이에 있는 지방 조직을 제거합니다. 성숙한 쥐에서는 이 지방 조직이 더 두드러집니다. 이 지방 조직을 쥐의 꼬리 끝으로 움직여 근육 벽을 노출시킵니다.
- 지방 조직은 색에 따라 복벽과 구별됩니다 : 지방 조직은 창백한 흰색으로 보이고 더 표면적으로 놓여 있는 반면, 복벽은 분홍색으로 보이며 지방 조직보다 더 깊숙이 있습니다.
- 쥐이빨 집게로 복벽을 잡고 0.5cm를 절개합니다.
- 한 쌍의 집게로 이 절개 부위의 한쪽 테두리를 잡고 두 번째 쌍을 사용하여 체강 내부로 들어가 난소, 자궁 뿔 및 지방 패드를 찾습니다. 근육 벽의 절개 부위를 통해 근육을 부드럽게 당겨 근육을 아래 조직에서 분리하고 외부로 만듭니다. 자궁 뿔과 난소 사이의 전이를 찾습니다.
- 으깨고 찢는 기술을 수행하여 난소를 절단합니다.
- 자궁 뿔의 말단 끝에 하나의 클램프를 놓고 첫 번째 말단에 두 번째 클램프를 놓습니다. 두 클램프로 세게 압력을 가하면서 더 말단부가 더 먼 클램프를 몸에서 멀리 떨어뜨려 그 사이의 연결을 끊습니다. 출혈과 조직 손상을 최소화하려면 이 과정에서 근위 클램프를 고정하고 몸에서 잡아당기지 않도록 주의하십시오.
- 또는 소작을 사용하십시오. 한 쌍의 겸자 또는 지혈제를 사용하여 자궁 뿔을 원하는 소작 지점에 근위부로 고정합니다. 소작 도구를 사용하여 조직을 절단하십시오.
- 근위 클램프를 부드럽고 천천히 해제하고 출혈 징후가 있는지 확인합니다.
- 조직 그루터기가 체강 안으로 후퇴하도록 합니다. 복벽을 잡고 부드럽게 위로 당깁니다. 출혈 가능성이 높아지므로 조직 그루터기를 안쪽으로 밀어 넣지 마십시오.
- 절개 부위의 경계를 근육 벽으로 옮기고 함께 모아 봉합할 준비를 합니다.
- 1-2 흡수성 봉합사 재료를 사용하여 복부 근육벽에 4-0개의 단일 중단 봉합사를 배치합니다. 봉합사 가위를 사용하여 봉합사 끝을 0.5cm로 자릅니다.
- 피부가 자연스러운 휴식 상태로 돌아갈 수 있도록 절개 부위를 봉합한 다음 위쪽으로 올리고 아래 조직이나 봉합사 끝을 잡지 않도록 주의합니다. 상처 난 피부에 1-2개의 상처 클립을 놓습니다. 기관 지침에 따라 4-0 비흡수성 봉합사 재료를 사용하여 피부를 봉합할 수도 있습니다.
- 다른 쪽 난소를 제거하려면 다른 쪽이 위를 향하도록 마우스의 위치를 전환합니다. 2.17단계에서 상처가 잘린 피부에 너무 많은 압력이 가해지지 않도록 마우스의 위치를 전환할 때 부드럽게 하십시오.
- 이 쪽에서 2.5-2.17 단계를 반복하십시오.
- 수술 부위 주변의 피부를 식염수와 멸균된 면봉 어플리케이터로 부드럽게 닦아 마른 혈액이나 잔류 소독 스크럽을 제거합니다.
3. 수술 후 관리
- 기관 지침에 따라 수술 후 최대 72시간 동안 진통제를 투여하십시오. 동물의 수술 과정을 기록하고 날짜, 시간, 마취제 및 진통제를 기록합니다. 여기서, 부프레노르핀은 서서히 방출되고 멜록시캄은 수술 전에 투여된다.
- 동물의 수술이 끝나면 마른 종이 타월을 깐 깨끗한 케이지로 옮깁니다. 이 케이지를 열원에 2/3 놓고 케이지의 나머지 1/3은 열을 차단합니다. 쥐가 마취에서 회복될 때까지 쥐를 케이지에 함께 두지 마십시오.
- 동물이 케이지 주위를 자유롭게 돌아다닐 수 있는 능력을 되찾도록 한 후 일반 동물 침구가 있는 깨끗한 케이지에 다시 넣습니다. 이때, 마우스는 모두 마취에서 회복된 경우 함께 수용될 수 있습니다.
- 수술 후 처음 며칠 동안은 촉촉한 음식과 물을 쉽게 구할 수 있도록 하십시오. 케이지 바닥에 축축한 음식을 놓습니다. 쥐의 수술 부위를 자주 확인하고 감염이나 출혈의 징후가 있는지 확인하십시오.
- 수술 후에는 쥐를 단독으로 또는 동일한 절차를 동시에 받은 다른 동물과 함께 수용해야 합니다. 수술을 받고 회복 중인 쥐가 수술을 받지 않은 쥐와 같은 케이지에 있는 것은 위험할 수 있으므로 피해야 합니다.
- 난소 절제술을 받고 등 배외측에 상처 클립이 있는 쥐의 경우 케이지에서 설치류 이글루 서식지를 제거하여 치유 첫 주 동안 쥐의 상처 클립이 이글루에 걸릴 가능성을 줄입니다.
- 치유 시간의 처음 72시간까지 12시간마다 감염, 통증 또는 수술 합병증의 징후가 있는지 동물을 계속 모니터링하십시오.
- 수술 후 10-14일 후에 상처 클립 제거 도구를 사용하여 상처 클립을 제거합니다.
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Representative Results
여기에 제시된 절차는 C57BL/6J 배경에서 1-3개월 된 마우스에서 수행된다. 시술 당시 수컷 마우스의 무게는 16-28g, 암컷 마우스의 무게는 14-24g이었다. 이 절차는 젖을 뗄 때부터 성체가 될 때까지 다양한 연령대의 마우스에 적용할 수 있도록 최적화되었습니다.
외과적 고환 절제술은 그림 1A와 같이 복부 음낭의 단일 피부 절개를 포함합니다. 두 고환은 한 번에 하나씩 제거되고 정관과 정자 혈관을 통해 절단되어 고환과 부착된 부고환이 제거됩니다(그림 1B). 제거된 내용물에는 그림 1C에 표시된 고환, 부고환 및 서혜부 지방 패드가 포함됩니다. 고환의 성공적인 제거는 제거된 조직을 육안으로 관찰하고 체강을 닫기 전에 조직 그루터기의 좋은 지혈을 보장함으로써 확인할 수 있습니다. 고환 절제술의 성공 여부는 절개 부위가 치유된 잘 회복된 마우스를 관찰하여 측정할 수 있습니다(그림 1D). 고환 절제술을 받은 마우스는 시술 후 일주일 이내에 마우스 혈청에서 측정된 테스토스테론 수치의 감소를 보여줍니다(그림 1E).
외과적 양측 난소 절제술은 암컷 쥐의 좌우 등쪽을 절개하여 시행합니다(그림 2A). 한쪽 난소만 제거해야 하는 경우 측면 절개 방법을 사용할 수 있습니다. 이 접근법에서는 복벽을 절개하고 난소 지방 패드를 찾습니다. 그림 2B에 묘사된 바와 같이 지방 패드, 난소, 난관 및 원위 자궁 뿔이 외부화되고 원위 자궁 뿔이 절단됩니다. 이 기술은 난소와 난관을 제거하는 결과를 낳습니다. 난소와 난관은 원위 자궁 뿔을 포함하지 않고 제거할 수 있지만, 남아 있는 난소 세포가 쥐를 발정 주기로 계속 유지할 위험이 있습니다. 원위 자궁 뿔을 포함하면 전체 난소와 유관이 제거되고 성 호르몬이 고갈되어 쥐가 더 이상 순환하지 않습니다. 그림 2C 는 몸 밖으로 절개된 쥐 여성의 생식 기관의 예를 나타낸다. 난소 자체가 주변 조직보다 훨씬 작다는 것을 관찰할 수 있습니다. 해부 스코프 또는 확대경은 이러한 조직을 식별하는 데 도움이 됩니다. 그림 2D 는 자궁 지방 패드의 조직을 제거한 해부 스코프에서 난소 해부학을 보여주므로 더 나은 시각화가 가능합니다. 이 시술의 성공 여부는 치유된 절개 부위를 보여주는 잘 회복된 마우스의 관찰로 측정할 수 있습니다 (그림 2E).
난소 절제술은 주변 조직의 교란을 최소화하면서 신속하게 시행할 때 안전하고 효율적입니다. 여기에 설명된 절차를 따르면 피부와 복벽 절개가 올바르게 배치되어 자궁 조직을 빠르게 찾을 수 있습니다. 흉곽의 아래쪽 경계와 다리 뼈의 위쪽 경계를 식별하면 관심 조직 근처에서 절개가 이루어집니다. 갈비뼈의 아래쪽 경계와 다리뼈의 위쪽 경계의 중간 정도에 위치하며 척추 측면 약 1.5cm에 위치하여 측면 절개 접근법을 시행할 때 수술 부위의 위치를 잘 잡을 수 있습니다(그림 2A).
외과적 난소 절제술의 확진은 자궁 위축의 관찰을 통해 확인할 수 있습니다. 그림 2F 는 생후 6개월 된 쥐의 자궁 뿔을 절제한 모습이고, 그림 2G 는 생후 3개월에 난소 절제술을 받은 6개월 된 쥐의 자궁 뿔을 보여줍니다. 난소 절제술을 받은 자궁 뿔은 더 얇아 보이며 말단부의 난소에 대한 부착이 부족합니다. 이 수술 기법의 확인 방법은 난소를 제거함으로써 자궁 조직이 위축된다는 것을 효과적으로 보여줍니다.
조직을 성공적으로 확인하고 절제한 후에는 상처를 봉합하고 수술 후 주의 깊은 모니터링을 통해 수술을 완료할 수 있습니다. 적절한 무균 기술(14 )은 생존 수술을 수행할 때 좋은 결과를 보장하는 데 중요하다. 쥐가 절개 부위에서 치유되기 시작하면 통증 및 수술 합병증의 징후를 찾기 위해 모니터링이 수행됩니다. 가능한 수술 합병증은 조직을 절개하거나 조작하려고 시도하는 동안 혈관을 찌르거나 찔러 내부 출혈을 일으키는 것입니다. 이것은 수술 부위 주변의 피부 아래에 지속적으로 붉고 홍조가 나타나는 것으로 나타납니다. 이와 같은 합병증을 피하려면 절개 부위의 위치를 적절하게 파악하고 수술용 현미경이나 확대경을 사용하여 외과의의 시력을 보조해야 합니다. 수술 후 첫 3일 동안은 12시간마다 시력 검사를 받는 것이 좋습니다. 수술에 성공하면 상처가 깨끗하게 치유됩니다(그림 1D, 2E).
그림 1: 남성 쥐 고환 절제술. (A) 수컷 쥐가 고환 제거를 위해 음낭을 외과적으로 절개한 위치와 함께 누운 자세로 표시되며 빨간색으로 표시됩니다. (B) 고환 절제술 수술 중 촬영한 이미지로, 박리 지점을 녹색으로 표시합니다. (C) 수컷 쥐의 절개된 고환, 지방 패드 및 부고환. (D) 고환 절제술 후 음낭 절개 부위에 상처가 잘 아물린 수컷 쥐. (E) ELISA 보간법으로 측정한 마우스 혈청 테스토스테론 농도(ng/mL). 두 그룹 모두 9주 된 쥐를 나타냅니다. 외과적 고환절제술은 생후 8주에 시행되었습니다. N = 그룹당 3마리의 마우스. 샘플은 세 번에 걸쳐 실행되었습니다. 혈청 샘플은 심장 천자에 의해 수집되고 분석 시점까지 동결되었습니다. *, p < 0.05. 오차 막대 = SEM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 여성 쥐 난소 절제술. (A) 등쪽에서 단일 난소를 제거하기 위해 수술 절개 부위가 있는 측면 위치에 표시된 암컷 마우스(빨간색으로 표시). 다른 중요한 해부학적 랜드마크가 강조 표시됩니다. (B) 수술 중 촬영한 이미지로, 외피화된 난소, 난관 및 원위 자궁 뿔을 묘사하고 박리 지점이 녹색으로 표시되어 있습니다. (C) 암컷 쥐의 자궁 뿔, 난소 및 지방 패드를 절개했습니다. (D) 지방 패드의 지방을 제거한 자궁 뿔의 절개된 난소, 난관 및 원위 부분을 클로즈업하여 난소를 더 잘 시각화할 수 있습니다. (E) 난소 절제술 후 절개 부위에 상처가 잘 아물지 않은 암컷 쥐. (F) 절개된 쥐의 자궁 뿔. (G) 난소 절제술 후 3개월 동안 쥐의 자궁 뿔을 절개하여 자궁 위축을 나타냄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 쥐 난소 절제술과 고환 절제술에 대한 그래픽 초록. 고환 제거와 난소 제거를 포함하는 수컷 마우스의 고환 절제술 절차와 난소 제거를 포함하는 난소 절제술 절차의 그림 표현으로, 둘 다 성호르몬이 고갈된 마우스 모델을 초래합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
고환과 난소를 외과적으로 제거하면 호르몬 결핍이 조절된 상태에서 쥐의 생리학을 연구할 수 있습니다. 이 기술은 신경 퇴행, 미네랄 대사, 심혈관 및 생식 건강을 포함한 많은 과학 분야에서 중요합니다 15,16,17,18,19,20,21. 여기에서는 성호르몬을 고갈시키기 위한 생존 수술을 통해 쥐 난소와 고환을 빠르고 안전하며 효과적으로 제거하기 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 숙련된 외과 의사가 이러한 시술을 수행할 경우 5분 정도 소요될 수 있으므로 생쥐의 생존율이 매우 높습니다.
생쥐 수술을 계획할 때 고려해야 할 몇 가지 사항에는 최상의 절개 부위와 동물의 생리학이 포함됩니다. 고환 절제술의 경우, 마우스 고환은 또한 정중선 복부 절개(13)에 의해 복부를 통해 제거될 수 있다. 이 기술은 복막강을 열 뿐만 아니라 서혜부 지방 패드를 빠르게 식별하는 데 의존합니다. 초보 외과 의사의 경우 이 기술을 신속하게 수행하기가 어렵습니다. 쥐가 아주 어릴 때는 지방 패드도 덜 발달하여 찾기가 더 어렵습니다. 이 프로토콜에 설명된 음낭 접근법은 마우스 수술을 처음 접하거나, 작고 어린 마우스를 수술하거나, 복부 절개로 인해 복막강 내 다른 장기를 방해할 가능성을 최소화하려는 연구자에게 적합한 옵션입니다.
외과적 난소 절제술은 한쪽 또는 양쪽 난소를 제거하는 것입니다. 대부분의 수술 절차와 마찬가지로 안전하고 빠른 방법은 일반적으로 피부와 근막 아래를 절개하는 것을 가능한 한 작게 만드는 것입니다. 이를 통해 봉합사와 상처 클립을 줄이고 더 빨리 치유할 수 있습니다. 절개 부위를 작게 만들 수 있는 것은 연습을 통해 얻을 수 있는 기술이지만, 절개 부위에 대한 자신감이 있으면 도움이 됩니다. 그림 2A 는 최적의 절개 지점을 찾는 방법의 예를 보여줍니다. 쥐의 해부학적 구조가 작기 때문에 난소는 간 근처에, 쥐의 왼쪽에는 비장 근처에 있습니다. 실수로 이러한 장기를 탐색하고 당기면 원치 않는 출혈이나 해를 입을 수 있습니다. 정확한 절개 위치와 주변 해부학적 랜드마크 식별에 대한 자세한 안내를 제공하여 이 기술을 돕고 부작용의 가능성을 줄입니다.
여기에서는 수술 후 일주일 이내에 쥐의 순환 호르몬 수치를 효과적으로 낮추기 위해 이 절차를 사용할 수 있는 방법과 수술 후 시간이 지남에 따라 남은 생식선 조직이 어떻게 위축되는지에 대한 예를 제공합니다. 이전의 방법 및 연구는 폐경 또는 안드로갱이 마우스 모델을 생성하기 위해 이러한 작업을 수행할 수 있는 방법을 자세히 설명하지만, 이들 중 다수는 마우스가 아닌 랫트 모델에서 수행된다12,22. 쥐와 생쥐는 비슷한 해부학적 구조를 가지고 있지만 쥐 시스템은 더 작은 해부학적 구조를 가지고 있습니다. 여기에서는 생후 3주 정도의 어린 마우스 모델에서 안정적으로 작동하는 방법을 제공합니다. 전반적으로, 이 두 프로토콜은 생존 설치류 고환절제술 및 난소절제술을 신속하게 수행하고, 쥐의 해부학적 구조를 인식하고, 수술 합병증을 최소화하여 일관되고 효과적인 결과를 위한 기반을 만드는 일관된 방법을 나타냅니다.
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Disclosures
이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
수술 교육 및 프로토콜 검토에 도움을 주신 University of Texas Southwestern Medical Center Animal Resource Center에 감사드립니다. 귀중한 도움을 주신 Wert Lab 지원팀에 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(NIH P30EY030413)의 자금 지원을 받았습니다. Biorender.com 는 만화 설계도를 만드는 데 사용되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL Syringe | BD | 309659 | |
| 30G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| AutoClip System | Fine Science Tools | 12020-00 | |
| Betadine Solution | Fisher Scientific | NC0158124 | |
| Cotton-Tipped Applicators | Fisher Scientific | 10-000-692 | |
| Double -ended Micro Spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Galilean Loupes | Fine Science Tools | 28050-30 | Optional, can provide better clarity during procedure |
| Gauze Sponges, 4"x4" | Fisher Scientific | 13-761-52 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| High Temp Cautery Kit | Fine Science Tools | 18010-00 | Using the fine tip attachment |
| Needle Holders | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| PGA Absorbable Suture:4-0 / NFS-2 Reverse Cutting 19MM / 30 IN | Covetrus | 29242 | 4-0 or 5-0 Absorbable sutures are best |
| Rodent Warming pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Straight Locking Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 140-60-09 | |
| Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Veet Sensitive Hair Remover Gel Cream | Amazon | N/A | |
| Wahl Professional Animal Compact Trimmer and Grooming Kit, Blue | Amazon | #9861-900 |
References
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