Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

في المختبر مقايسات الانقسام باستخدام كاسباز ذبابة الفاكهة المؤتلف المنقى لفحص الركيزة

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64392
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMass Chan Medical School

Summary

نقدم هنا بروتوكولا للتعبير عن ذبابة الفاكهة المؤتلفة وتنقيتها ، واستخدامها في فحوصات الانقسام في المختبر .

Abstract

Caspases هي بروتياز موت الخلايا محددة للغاية تشارك في عمليات موت الخلايا المبرمج وغير موت الخلايا المبرمج. في حين أن دور الكاسباز أثناء موت الخلايا المبرمج قد تم تحديده جيدا وتم تحديد وتوصيف العديد من ركائز التحلل البروتيني المبرمج للكاسباز ، فإن دور الكاسباز في العمليات غير المبرمج غير مفهوم جيدا. على وجه الخصوص ، تم تحديد عدد قليل من ركائز غير موت الخلايا المبرمج من caspases حتى الآن. هنا ، من أجل تسهيل تحديد وتوصيف ركائز caspase المحتملة ، يتم وصف بروتوكول يسمح باختبار الركائز المرشحة في مقايسات انقسام caspase في المختبر . يتضمن هذا البروتوكول إنتاج وتنقية بروتينات الكاسباز المؤتلفة ، وإنتاج الركائز المرشحة إما بشكل مؤتلف أو في نظام تعبير خال من الخلايا ، وتفاعل الانقسام الفعلي في المختبر متبوعا ب SDS-PAGE و immunoblotting. تم تصميم هذا البروتوكول لذبابة الفاكهة كاسباس درونك ودريس ولكن يمكن تكييفه بسهولة مع كاسباز من الكائنات الحية الأخرى ، بما في ذلك الثدييات.

Introduction

يتم تنفيذ موت الخلايا المبرمج أو موت الخلايا المبرمج بواسطة فئة من بروتياز موت الخلايا عالية التخصص تسمى كاسباز (تمت مراجعتها في المرجع1). Caspases هي بروتياز Cys تحتوي على بقايا Cys في الموقع الحفاز. لقد حددوا مواقع الانقسام التوافقي والركائز المشقوقة بروتينيا بعد بقايا Asp (على الرغم من أنه تم الإبلاغ أيضا عن أن ذبابة الفاكهة caspase Dronc قد تم الإبلاغ عنها أيضا للالتصاق بعد بقايا Glu2). وهي مقسمة إلى بادئ (يعرف أيضا باسم القمي أو المنبع) والمستجيب (الجلاد أو المصب) كاسباس. كاسباس البادئ تنشيط كاسباس المستجيب. على سبيل المثال ، في الثدييات ، يشق البادئ caspase Caspase-9 وينشط المستجيب caspase Caspase-33. وبالمثل ، في ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر ، يشق كاسباس-9-أورثولوج درونك وينشط كاسباس-3-أورثولوج دريس 2,4. أثناء موت الخلايا المبرمج ، تشق كاسباس المستجيب مئات الركائز مما يؤدي إلى موت الخلية5.

يتم تصنيع Caspases كإنزيمات غير نشطة (zymogens) في الخلية. في هذا الشكل ، تحتوي على مجال N-terminal ، ووحدة فرعية كبيرة مع Cys الحفاز في الجزء المركزي من الإنزيم ، ووحدة فرعية صغيرة في C-terminus 1 (الشكل 1). تختلف آلية التنشيط بين البادئ والمستجيب. يتطلب كاسباس البادئ (Caspase-9 ، Dronc) dimerization للتنشيط ، والذي يحدث عن طريق الاندماج في مركب بروتين كبير ، يسمى apoptosome6. للدمج في apoptosome ، يحمل Caspase-9 و Dronc مجال تنشيط وتوظيف caspase (CARD) في المجال prodomain N-terminal (الشكل 1). يحتوي المكون apoptosome Apaf-1 أيضا على CARD ويجند Caspase-9 أو Dronc عبر تفاعل CARD / CARD في apoptosome3،6،7. بينما يمكن معالجة Caspase-9 و Dronc بروتينا في apoptosome ، فإن هذه المعالجة ليست مطلوبة بالكامل للنشاط الأنزيمي 8,9.

في المقابل ، لا تحمل كاسباس المستجيب (Caspase-3 ، Drice) بطاقة في نطاقاتها ولا يتم دمجها في مجمعات البروتين الكبيرة للتنشيط1. وهي تعتمد على الانقسام المحلل للبروتين بواسطة Caspase-9 أو Dronc1 النشط ، على التوالي. يشكل المستجيب النشط كاسباز رباعيا يتكون من وحدتين فرعيتين كبيرتين ووحدتين فرعيتين صغيرتين ، وبالتالي يحتوي على موقعين حفازين (الشكل 1). الأهم من ذلك بالنسبة لهذا البروتوكول ، أن التعبير المؤتلف عن الكاسباس في الإشريكية القولونية يسبب المعالجة التلقائية وتنشيط الكاسباز ، بما في ذلك Drice10 و Dronc2،8،9،11،12 ، حتى في حالة عدم وجود Apaf-1. تسمح هذه المعالجة التلقائية بإجراء فحوصات الانقسام في المختبر للركائز المرشحة مع بروتين كاسباز المؤتلف.

لا تشارك Caspases فقط في موت الخلايا المبرمج ، ولكن يمكن أن يكون لها أيضا العديد من الوظائف غير المبرمج ، بما في ذلك الانتشار ، والتمايز ، وهجرة الخلايا ، وتقليم الخلايا العصبية ، والمناعة الفطرية ، وغيرها 13،14،15. من غير المعروف حاليا كيف يمكن للخلايا البقاء على قيد الحياة على الرغم من احتوائها على كاسباس نشط أثناء العمليات غير المبرمجة. من الممكن أن تقوم هذه الخلايا بتنشيط caspases فقط عند المستويات شبه المميتة16 أو أنها تعزل caspases النشطة في مقصورات غير موت الخلايا المبرمج للخلية مثل غشاء البلازما17,18. لذلك ، فإن تحديد الركائز غير المبرمج والتحقق منها لن يكشف فقط كيف تتوسط الكاسباس في العمليات غير المبرمج ، بل قد يساعد أيضا في فهم كيف يمكن للخلايا البقاء على قيد الحياة في وجود كاسباس نشط.

يمكن تحديد البروتينات المرشحة كركائز كاسباز باستخدام الطرق الوراثية والكيميائية الحيوية. يمكن التحقق من البروتينات المحددة لوجود مواقع انقسام Dronc الإجماعية. يمكن القيام بذلك عن طريق فحص تسلسل البروتين بصريا أو استخدام أدوات معلوماتية حيوية أكثر تطورا عبر الإنترنت مثل CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/) 19،20. تستخدم هذه الأدوات مواقع الانقسام التوافقية المعروفة للكاسباس والاعتبارات الهيكلية للتنبؤ بأهداف جديدة للكاسباز. بينما يتضمن CasCleave معلومات الركائز التي تم التحقق منها من Caspases-1 و -3 و -6 و -7 و -8 ، فقد يكون مفيدا أيضا للأغراض الموضحة هنا حيث يتم الحفاظ على هذه الكاسباس ومواقع الانقسام التوافقية الخاصة بها بشكل جيد. ومع ذلك ، نظرا لأن موقع انقسام Dronc غير محدد جيدا (حددت دراستان موقعين مختلفين للانقسام الأمثل ، TATD / E2 و LALD9) ، يتم فحص الركائز المرشحة أيضا لوجود موقع انقسام caspase آخر ، بما في ذلك Drice.

للتحقق من صحة الركائز المتوقعة من caspases ، من الضروري إجراء فحوصات إضافية. أحد هذه المقايسات هو إثبات أن كاسباز معين يمكن أن يشق البروتين المرشح في المختبر. هنا ، نقدم بروتوكولا مناسبا لفحوصات الانقسام في المختبر . باستخدام هذا البروتوكول ، يتم اختبار الركائز المرشحة باستخدام Dronc مثل caspase. يمكن أيضا اختبارها كركائز من Drice. على الرغم من أن هذا البروتوكول مكتوب لذبابة الفاكهة caspases Dronc و Drice ، إلا أنه يمكن أيضا تكييفه مع caspases من الكائنات الحية الأخرى.

يجب إجراء استخراج وتنقية Dronc و Drice جنبا إلى جنب مع فحص الانقسام في المختبر في نفس اليوم بسبب فقدان النشاط الحفاز بواسطة هذه الكاسباس. تم تعديل هذا البروتوكول وتحسينه من المنشورات السابقة8،9،11،12،21،22. في هذا البروتوكول ، يتم التعبير عن أربعة بروتينات كاسباز مختلفة بشكل مؤتلف في سلالة الإشريكية القولونية BL21 (DE3) pLysS. هذه البروتينات هي: 6xHis-Dronc بالوزن ، 6xHis-DroncC318A ، 6xHis-Driceبالوزن ، و 6xHis-DriceC211A. يتم تمييز كل من هذه البروتينات ب 6 بقايا هستيدين (6xHis) في المحطة N للتنقية. Dronc wt و Dricewt هما بروتينات من النوع البري ويمكنهما المعالجة التلقائية في الكاسباز النشط عند التعبير المؤتلف. يقوم DroncC318A و DriceC211A بتشفير أشكال متحولة من Dronc و Drice التي تغير بقايا Cys التحفيزية إلى بقايا Ala. هذه التركيبات غير نشطة تحفيزيا ولا يمكنها المعالجة التلقائية (انظر الشكل 2 أ). يتم استخدامها كضوابط في فحص الانقسام. نظرا لأن DriceC211A لا يمكنه المعالجة التلقائية ، فإنه يستخدم أيضا كركيزة نموذجية ل Droncwt في مقايسة الانقسام في المختبر الموضحة هنا.

Protocol

1. تعبير كاسباز المؤتلف في البكتيريا

  1. استنساخ الجين محل الاهتمام (Caspase أو الركيزة المفترضة) في ناقل تعبير بكتيري مع علامة (علامات) N- و / أو C-terminal باستخدام البروتوكولات القياسية23.
    ملاحظة: يمكن أن تزيد العلامات من قابلية ذوبان البروتينات المؤتلفة وتستخدم لتنقية البروتينات المؤتلفة. هنا ، يتم استنساخ Dronc و Drice وطفراتهما التحفيزية في المتجه pET28a ، والذي يوفر علامة N-terminal 6xHis (pET28a-6xHis-Droncwt ، pET28a-6xHis-Dronc C318A ، pET28a-6xHis-Driceبالوزن ، pET28a-6xHis-DriceC211A) ؛ (للحصول على معلومات أولية انظر الجدول التكميلي 1).
  2. تحويل النواقل مع الجينات ذات الاهتمام إلى خلايا BL21 (DE3) pLysS E. coli المختصة باستخدام الإجراءات القياسية23،24. ضع خليط التحويل على ألواح أجار LB بالمضاد الحيوي المناسب (كاناميسين في حالة pET28a) لاختيار البكتيريا المحولة. (انظر الجدول التكميلي 2.)
  3. اختر مستعمرة من الصفيحة وقم بتلقيحها في 5 مل من وسط LB يحتوي على المضاد الحيوي المناسب لتنمو طوال الليل عند 37 درجة مئوية عند 220 دورة في الدقيقة على منصة اهتزاز.
  4. في اليوم التالي ، قم بإعداد 30-50 مل (لكل عينة) من وسط LB بالمضادات الحيوية وأضف 1 مل من الثقافة المزروعة طوال الليل. يجب أن تكون الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) باستخدام مقياس ضوئي حيوي / مقياس طيف ضوئي بين 0.1 و 0.2.
  5. قم بتنمية الثقافة عند 37 درجة مئوية عند 220 دورة في الدقيقة على منصة اهتزاز حتى يصلOD 600 إلى 0.6. تحقق من OD600 كل ساعة حتى يصل إلى 0.6. يستغرق هذا حوالي 2 إلى 3 ساعات.
  6. للحث على تعبير البروتين (caspase) ، أضف IPTG إلى التركيز النهائي من 0.1-0.2 mM (تمييع 1: 1,000-1: 500 من مخزون IPTG ، انظر الجدول التكميلي 2).
  7. تنمو الثقافات لمدة 3 ساعات عند 30 درجة مئوية عند 220 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: يعتمد الوقت ودرجة الحرارة على نوع البروتين الذي يتم التعبير عنه وقابليته للذوبان. قد تحتاج هذه الشروط إلى تعديل إذا تم التعبير عن كاسباس أو ركائز مختلفة.
  8. بعد 3 ساعات ، قم بتدوير الثقافات في أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية عند 2000 × جم. تجاهل الطاف والمضي قدما في بيليه.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول عند هذه النقطة ومتابعته لاحقا. يمكن تجميد الكريات البكتيرية عند -80 درجة مئوية.

2. استخراج كاسباس المؤتلف على نطاق صغير

  1. قم بإزالة الأنابيب المجمدة مع مزارع الحبيبات من التخزين -80 درجة مئوية واحتفظ بها على الثلج لمدة 10 دقائق لتليين الحبيبات.
  2. بعد 10 دقائق، أضف 0.6 مل من محلول تحلل الخلايا البكتيرية (الجدول التكميلي 2) المكمل بمثبطات الأنزيم البروتيني المضافة حديثا، و10 ملغ/مل من الليزوزيم و50 يو/مل من البنزوناز في الأنابيب المحتوية على الحبيبات باستخدام وحدة تحكم ماصة مع ماصة مصلية سعة 1 مل.
  3. باستخدام نفس طرف الماصة, قم بإذابة الحبيبات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل حتى يظهر محلول أصفر باهت شفاف بدون أي جزيئات حبيبات. احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
  4. انقل المحللة إلى أنابيب الطرد المركزي المناسبة وقم بجهاز طرد مركزي عند 17000 × جم لمدة 40 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  5. نقل المواد الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. هذا هو المستخلص الخام الذي يحتوي على الكاسباس.
  6. احتفظ بالأنابيب على الجليد واستمر في التنقية باستخدام Ni-NTA agarose.

3. تنقية كاسباس ذات علامات صغيرة

  1. أضف 0.2 مل من ملاط 50٪ من أغاروز Ni-NTA إلى كل أنبوب من مستخلصات الكاسباز من الخطوة 2.5. قم بتدوير الأنابيب على دوار من طرف إلى طرف لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  2. بعد 1 ساعة ، أضف المستخلص مع Ni-NTA agarose إلى أعمدة البولي بروبلين سعة 1 مل مع الطرف سليما ، ويوضع في رف. دعها تقف لمدة 5 دقائق.
  3. بعد 5 دقائق ، قم بإزالة غطاء الأعمدة واترك المادة الطافية تتدفق عن طريق تدفق الجاذبية.
  4. أضف بعناية 1 مل من مخزن الغسيل المؤقت (الجدول التكميلي 2) إلى الأعمدة دون إزعاج الراتنج المعبأ من أغاروز Ni-NTA واغسله من خلال تدفق الجاذبية.
  5. نفذ خطوة الغسيل ثلاث مرات.
  6. لشطف الكاسباس ، ضع أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل تحت فوهة تجميع الأعمدة بعد التصريف الكامل لمخزن الغسيل المؤقت.
  7. أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت للشطف (مكمل بمثبطات الأنزيم البروتيني 1x مباشرة قبل الاستخدام) إلى كل عمود واجمع الشطف في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: سيكون الشطف المنقى الناعم شفافا في اللون.
  8. الحفاظ على الشطف على الجليد وقياس تركيز البروتينات بواسطة مقايسة برادفورد25. تأكد من نقاء / تجانس الكاسباس المنقى بواسطة SDS-PAGE متبوعا بتلوين Coomassie Blue26.
    ملاحظة: يتراوح إنتاج مزرعة 50 مل رطل بين 0.5 و 1.5 مجم من بروتين الكاسباز. بالنظر إلى أن 0.5 مل من محلول الشطف يستخدم للشطف ، فإن التركيز يتراوح من 1 إلى 3 مجم / مل. من المهم استخدام شطف الكاسباز المنقى لمقايسات الانقسام في المختبر في نفس يوم التحلل والتنقية لأن مستحضرات الكاسباز هذه تفقد النشاط طوال الليل.

4. التعبير عن ركيزة كاسباز المفترضة في أنظمة التعبير الخالية من الخلايا

ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم تحضير Drice ، الركيزة الطبيعية ل Dronc ، عن طريق كل من التعبير المؤتلف في E. coli (انظر القسم 3 أعلاه) وعن طريق التعبير في تحلل الخلايا الشبكية للأرانب (RRL) ، وهو نظام تعبير خال من خلايا الثدييات (هذا القسم ، انظر أدناه).

  1. استنساخ جين الركيزة المفترضة في ناقل تعبير يحتوي إما على مروج T7 أو T3 أو SP6 باستخدام الإجراءات القياسية23.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول ، يتم استخدام DriceC211A كركيزة نموذجية وتم استنساخها في الناقل pT7CFE1-N-Myc ، الذي يحمل محفز T7 للتعبير الجيني ويضع علامات على ركيزة البروتين المفترضة بعلامة Myc N-terminal للكشف عن طريق النشاف المناعي.
  2. في RRL ، يمكن تصنيع الركائز المرشحة إما إشعاعيا أو غير إشعاعي.
    1. التوليف غير المشع: في أنبوب طرد مركزي دقيق 0.5 مل ، أضف 25 ميكرولتر من RRL ، و 2 ميكرولتر من مخزن التفاعل ، و 0.5 ميكرولتر من خليط الأحماض الأمينية - ناقص الليوسين (1 مللي مول) ، و 0.5 ميكرولتر من خليط الأحماض الأمينية - ناقص الميثيونين (1 مللي مول) ، و 1 ميكرولتر من مثبط الريبونوكلياز (40 وحدة / ميكرولتر) ، و 2 ميكرولتر من قالب الحمض النووي (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر) ، و 1 ميكرولتر من بوليميراز T7-RNA. أضف الماء الخالي من النيوكلياز لضبط الحجم النهائي للتفاعل إلى 50 ميكرولتر. امزج المكونات برفق عن طريق السحب أو التحريك بطرف ماصة ، وقم بتدويرها لفترة وجيزة.
      ملاحظة: يحتوي محلول RRL على 100-200 مجم / مل من البروتينات الذاتية. بالنسبة لتفاعلات الترجمة في المختبر ، أضف RRL بتركيز 50٪ (هنا تفاعل 25 ميكرولتر / 50 ميكرولتر).
    2. التخليق الإشعاعي: في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 مل ، أضف 25 ميكرولتر من محلول RRL ، و 2 ميكرولتر من محلول التفاعل ، و 0.5 ميكرولتر من خليط الأحماض الأمينية ناقص الميثيونين (1 مللي مول) ، و 1 ميكرولتر من مثبط الريبونوكلياز (40 وحدة / ميكرولتر) ، و 2 ميكرولتر من قالب الحمض النووي (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر) ، و 2 ميكرولتر من الميثيونين المسمى S35 (1000 Ci / mmol عند 10 mCi / mL) و 1 ميكرولتر من T7-RNA Polymerase. أضف الماء الخالي من النيوكلياز لضبط الحجم النهائي للتفاعل إلى 50 ميكرولتر. امزج المكونات برفق عن طريق السحب أو التحريك بطرف ماصة ، وقم بتدويرها لفترة وجيزة. تخلص من الأطراف والأنابيب في حاوية النفايات المشعة.
      ملاحظة: لا تضف خليط الأحماض الأمينية بدون الليوسين. يستخدم ناقل pT7CFE1 مروج T7 للتعبير عن البروتين. تستخدم المتجهات الأخرى مروجي T3 أو SP6. في هذه الحالة ، يجب استخدام بوليميراز T3 أو SP6 RNA بدلا من بوليميراز T7 RNA. يرجى التأكد من أن قالب الحمض النووي عالي النقاء.
  3. احتضان التفاعل عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
  4. تدور لفترة وجيزة لمدة 10 ثوان ووضع الأنابيب على الجليد. تحقق من مستوى التعبير عن الركيزة المفترضة في RRL بواسطة SDS-PAGE و immunoblotting / التصوير الشعاعي الذاتي.
    ملاحظة: يجب أن تعتمد كمية مستخلص RRL المضافة إلى تفاعل الانقسام على كمية البروتين التي يمكن اكتشافها بواسطة طريقة الكشف (إما النشاف المناعي أو التصوير الشعاعي الذاتي S35 ). انتقل إلى مقايسة الانقسام في المختبر (القسم التالي) أو قم بتخزينها عند -80 درجة مئوية.

5. مقايسة الانقسام في المختبر مع ركائز تم إنشاؤها باستخدام RRL

  1. خذ الركيزة (الركيز) المفترضة المتولدة ، كما هو موضح في القسم 4. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام N-Myc-DriceC211A كركيزة نموذجية.
  2. اعتمادا على مستوى التعبير عن الركيزة المفترضة (التي يتم تحديدها بشكل منفصل عن طريق تحليل المناعة أو التصوير الشعاعي الذاتي ، انظر الخطوة 4.4) ، استخدم 1-10 ميكرولتر من RRL المبرمج مع البروتين محل الاهتمام في مقايسة الانقسام.
  3. أضف 10 ميكروغرام من بروتين كاسباز المنقى المتولد في الأقسام 1 و 2 و 3.
  4. ارفع إجمالي حجم التفاعل إلى 50 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت لمقايسة الكاسباز.
  5. احتضان التفاعلات في حمام مائي عند 30 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. تأكد من تضمين عناصر التحكم المناسبة في فحص الانقسام. هنا ، يتم استخدام الطافر الحفاز DroncC318A كعنصر تحكم.
  6. بعد 3 ساعات ، أوقف التفاعلات عن طريق نقل الأنابيب على الجليد.
  7. أضف وحدة تخزين واحدة من المخزن المؤقت لعينة LDS يحتوي على 50 mM DTT. يتم إيقاف التفاعل تماما مع إضافة المخزن المؤقت لعينة LDS.
  8. احتضان العينات عند 75 درجة مئوية في كتلة حرارية لمدة 10 دقائق.
  9. قم بالدوران بسرعة ، واخلطها عن طريق النقر ، وقم بتحميل 24 ميكرولتر لكل عينة وقم بتشغيل SDS-PAGE (انظر القسم 7) أو قم بتخزين العينات عند -20 درجة مئوية.

6. مقايسة الانقسام في المختبر مع بروتين الركيزة المؤتلف المعبر عنه بكتيريا

  1. أضف 10 ميكروغرام من الركيزة المرشحة المنقاة (هنا 6xHis-DriceC211A ، التي تم إنشاؤها في الأقسام 1 و 2 و 3) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 مل.
  2. أضف 10 ميكروغرام من بروتينات الكاسباز المنقاة المتولدة في القسمين 1 و 2. ارفع الحجم الكلي إلى 50 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت لمقايسة caspase.
  3. اتبع الخطوات من 5.5 إلى 5.9.

7. SDS-PAGE و immunoblotting

  1. قم بتحميل تفاعلات الانقسام (24 ميكرولتر) على 4٪ -12٪ من المواد الهلامية المتدرجة Tris-Glycine أو Bis-Tris (جدول المواد) وقم بإجراء الرحلان الكهربائي للبروتين والنشاف المناعي (أو التصوير الشعاعي الذاتي في حالة استخدام ركائز تحمل علامة S35) لتصور النتائج باستخدام الإجراءات القياسية27,28.
    ملاحظة: هنا ، في هذا البروتوكول ، تم استخدام المواد الهلامية المتدرجة Bis-Tris مع المماسح التي تعمل على تشغيل المخزن المؤقت ومخزن تحميل LDS. بشكل عام ، تعمل بروتوكولات PAGE شائعة الاستخدام لجل Tris-Glycine باستخدام المخزن المؤقت لتشغيل Tris-Glycine-SDS ويعمل المخزن المؤقت لتحميل SDS بشكل جيد.

Representative Results

يوفر هذا البروتوكول تعليمات خطوة بخطوة لتحريض بروتين الكاسباز في الإشريكية القولونية ، وتنقية كاسباس ذبابة الفاكهة المؤتلف درونك ودريس ، وتوليف الركائز المرشحة ، وتفاعل الانقسام في المختبر مع الركائز المرشحة (هنا DriceC211A) و caspase Dronc. تم استخدام الطافر الحفاز DriceC211A كركيزة نموذجية في هذا الفحص لأنه لا يحتوي على نشاط معالجة تلقائية (الشكل 2A) ويظل كامل الطول حتى يتم شقه بواسطةDronc wt. يجب دائما استخدام DriceC211A كعنصر تحكم إيجابي للتحقق من أن مستحضر Droncبالوزن له نشاط إنزيمي.

يقدم الشكل 2 أ مثالا تمثيليا لتعبير وتنقية الكاسبازات المؤتلفة. تم تحفيز وتنقية أربعة كاسباسات مؤتلفة مختلفة: 6xHis-Droncبالوزن ، 6xHis-DroncC318A ، 6xHis-Driceبالوزن ، و 6xHis-DriceC211A. تم تشغيل الكاسباس المنقى بواسطة SDS-PAGE ، مناعيا ، وتم فحص اللطخة بجسم مضاد ل He (مخفف 1: 5,000 ؛ متبوعا ب IgG المضاد للفأر ، الجسم المضاد المرتبط ب HRP (1: 10,000)). يعمل 6xHis-Dronc غير المعالج (proDronc) بوزن جزيئي نسبي (MW r) يبلغ 55 كيلو دالتون (الممر 2) و 6xHis-Drice غير المعالج (proDrice) لديه MWr يبلغ 35 كيلو دالتون (الممر 4). يمكن رؤية المعالجة التلقائية للكاسباس من خلال ظهور نطاقات أصغر MWr والتي بسبب وجود علامة His-tag في النهاية N تمثل الوحدات الفرعية الكبيرة من caspases (الشكل 1). في حالة 6x-Dronc ، تحتوي الوحدة الفرعية الكبيرة على MWr تبلغ 40 كيلو دالتون (الممر 1). تعمل الوحدة الفرعية الكبيرة من 6x-Drice بسرعة 23 كيلو دالتون (الممر 3). تفشل الطفرات التحفيزية 6xHis-DroncC318A و 6xHis-DriceC211A في المعالجة التلقائية ولا يمكن اكتشافها إلا كبروتينات كاملة الطول (الممرات 2 و 4).

الشكل 2 ب لإثبات أن مستحضر 6xHis-Droncبالوزن المنتج والمنقى بكتيريا له نشاط إنزيمي ، تم إجراء اختبار الانقسام في المختبر كما هو موضح في هذا البروتوكول. كعنصر تحكم سلبي ، تم استخدام الطافر الحفاز 6xHis-DroncC318A. كانت الركيزة عبارة عن N-Myc-DriceC211A تم إنشاؤها بواسطة RRL ، والتي تم تمييزها بعلامة Myc في المحطة N. بعد تفاعل الانقسام في المختبر ، تم فصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE ، المناعية وتم تحضين البقع بجسم مضاد مضاد ل Myc (مخفف 1: 1,000) متبوعا ب IgG المضاد للفأر ، الجسم المضاد المرتبط ب HRP (1: 10,000)) للكشف عن N-Myc-DriceC211A. يمكن إثبات الانقسام الناجح وبالتالي النشاط الأنزيمي للكاسباز من خلال ظهور نطاق واحد على الأقل من MWr الأصغر مقارنة بالشكل الكامل غير المعالج للركيزة. يحتوي N-Myc-Drice C211A غير المعالج والكامل الطول على MWr يبلغ 40 كيلو دالتون (الممرات 2 و 4) ، في حين أن الوحدة الفرعية الكبيرة ل N-Myc-DriceC211A المعالجة تعمل عند 30 كيلو دالتون (الممر 3). يمثل الممر 1 محللة RRL غير المبرمجة (لم تتم إضافة البلازميد / النص). يوضح Lane 2 الإنتاج المختبري ل DriceC211A بواسطة تعبير RRL. يحتوي الممر 3 على تفاعل الانقسام في المختبر مع 6xHis-Droncwt. يحتوي الممر 4 على تفاعل الانقسام في المختبر مع 6xHis-DroncC318A.

الشكل 2 ج تم تحليل تفاعل الانقسام في المختبر الذي يستخدم كلا من caspase المؤتلف والمنقى (6xHis-Droncwt و 6x-His-DroncC318A) والركيزة (6xHis-DriceC211A) وفقا لهذا البروتوكول ، بواسطة SDS-PAGE و immunoblot. لتحليل تفاعل الانقسام ، تم استخدام الجسم المضاد Drice المضاد للشقوق (المخفف 1: 5000 ؛ متبوعا ب IgG المضاد للأرانب ، الجسم المضاد المرتبط ب HRP (1: 10,000)) في هذه البقعة المناعية. يكتشف الجسم المضاد Drice المضاد للشقوق نهايته الجديدة في الوحدة الفرعية الكبيرة (23 كيلو دالتون) من 6xHis-DriceC211A فقط بعد المعالجة بواسطة 6xHis-Droncwt (الممر 1). الطافر الحفاز 6xHis-DroncC318A غير قادر على معالجة 6xHis-Drice C211A في هذا الفحص ويظهر 6xHis-DriceC211A كامل الطول كنطاق خافت غير معالج يبلغ 35 كيلو دالتون (الممر 2).

Figure 1
الشكل 1: بنية مجال كاسباس البادئ كاسباس -9 ودرونك والمستجيب كاسباس كاسباس -3 ودريس. CARD - مجال تنشيط وتوظيف caspase ؛ Cys - الموقع النسبي لبقايا السيستين التحفيزية ؛ لام - وحدة فرعية كبيرة ؛ S - وحدة فرعية صغيرة. يشار إلى موقع prodomains N-terminal. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: النتائج التمثيلية. (أ) تحليل اللطخة المناعية لمستحضرات 6xHis-Dronc و 6xHis-Drice المنقاة المؤتلفة ، والتي يتم فحصها باستخدام جسم مضاد له. يشار إلى غير المعالجة (proDronc و proDrice) والمشقوقة 6xHis-Dronc و 6xHis-Drice بواسطة الأسهم. يشار إلى علامات MW على اليسار. (ب) تحليل اللطخة المناعية لتفاعل الانقسام في المختبر ل N-Myc-Drice المتولد عن RRL مع كاسباس 6xHis-Droncبالوزن (الممر 3) أو 6x-His-DroncC318A (الممر 4) الذي تم فحصه باستخدام جسم مضاد ل Myc. يتم تحميل تفاعلات RRL غير المبرمجة والمبرمجة (N-Myc-DriceC211A) وفصلها في المسارين 1 و 2. يشار إلى غير المعالجة (proDrice) و N-Myc-Drice المشقوقة بواسطة الأسهم. يشار إلى علامات MW على اليسار. (ج) تحليل اللطخة المناعية لتفاعل الانقسام في المختبر للمؤتلف 6xHis-Drice C211A المعبر عنه بكتريا والمنقى مع كاسباس 6xHis-Droncبالوزن (الممر 1) أو 6x-His-DroncC318A (الممر 2) ، تم فحصه باستخدام جسم مضاد مضاد للشقوق. يشار إلى الطول الكامل (proDrice) والمشقوق 6xHis-DriceC211A بالأسهم. يشار إلى علامات MW على اليسار. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول التكميلي 1: يحتوي هذا الجدول على مواد أولية تستخدم للاستنساخ في متجه pET28a. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: يحتوي هذا الجدول على تكوين المخازن المؤقتة والوسائط. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

تم اشتقاق الجزء الأكبر من معرفتنا حول وظيفة الكاسباز والكاسباز من العمل المكثف في موت الخلايا المبرمج خلال العقود الثلاثة الماضية. من الثابت جدا أن كاسباس البادئ يعالج كاسباس المستجيب بروتينيا ، وقد تم تحديد مئات البروتينات على أنها ركائز كاسباز المستجيب أثناء موت الخلايا المبرمج 5,29. في المقابل ، لا يعرف الكثير عن وظيفة caspases للعمليات غير المبرمج والركائز غير المبرمج التي يعالجونها. من المتصور أن يكون كاسباس البادئ من صناع القرار الرئيسيين هنا. أثناء موت الخلايا المبرمج ، فإنها تنشط كاسباس المستجيب مما يسبب موت الخلايا. ومع ذلك ، لتحفيز عمليات غير موت الخلايا المبرمج ، فإنها قد تنشط بروتينات مختلفة (بخلاف كاسباس المستجيب) ، والتي تتحكم في العملية غير المبرمجة. يختبر هذا البروتوكول البروتينات المرشحة كركائز من البادئ caspase Dronc في ذبابة الفاكهة 17,30.

يمكن إنتاج الركائز المراد اختبارها في مقايسة الانقسام إما في نظام تعبير خال من الخلايا في الثدييات في المختبر مثل RRL أو عن طريق التعبير المؤتلف في الإشريكية القولونية. هناك العديد من المزايا للتعبير في المختبر باستخدام RRL على التعبير البكتيري. بروتوكول التعبير RRL بسيط وسريع ، مما يسمح بإعداد العديد من الركائز المختلفة بالتوازي. في كثير من الحالات ، يمكن تخزين مستخلص RRL الذي يحتوي على البروتين محل الاهتمام عند -80 درجة مئوية قبل استخدامه في مقايسة الانقسام (على الرغم من أن هذا يحتاج إلى تحديد منفصل لكل ركيزة). يمكن تسمية الركيزة المفترضة ب S35-Met ، مما يسمح بالتحليل السهل عن طريق التصوير الشعاعي الذاتي بعد SDS-PAGE. هذا مفيد بشكل خاص ، إذا لم يكن هناك جسم مضاد خاص بالركيزة. بدلا من ذلك ، إذا لم يكن وضع العلامات S35-Met مرغوبا فيه ، فيمكن تمييز الركيزة المفترضة بعلامات شائعة مثل علامات Flag أو HA أو Myc ، مما يسمح باكتشاف انشقاق caspase عن طريق النشاف المناعي.

يجب التأكيد بقوة على أن نجاح هذا البروتوكول يعتمد على التنقية الدقيقة والمتسقة لبروتينات Dronc و Drice المؤتلفة. لسوء الحظ ، لا يمكن تخزين هذه البروتينات - ولا حتى على المدى القصير - لا في الثلاجة ولا تجميدها. يفقدون النشاط الأنزيمي بين عشية وضحاها في أي شكل مخزن. لذلك ، يجب أن يكونوا مستعدين طازجا في يوم فحص الانقسام. بغض النظر عن البروتين (البروتينات) المرشح الذي يتم اختباره ، يجب دائما استخدام DriceC211A كعنصر تحكم إيجابي للتحقق من النشاط الأنزيمي لإعداد Droncwt (انظر الشكل 2B ، C). بدلا من ذلك ، يمكن أيضا اختبار نشاط مستحضرات Dronc و Drice عن طريق الانقسام في المختبر لركائز رباعي الببتيد الاصطناعية الفلورية2،9،31.

إذا تم استخدام الأجسام المضادة للكشف عن الركائز المرشحة ، فيجب التحقق من صحتها من قبل المستخدم32,33. ينطبق ذلك أيضا على الأجسام المضادة المتاحة تجاريا والتي تكتشف علامات epitope مثل Flag أو HA أو Myc أو غيرها. يمكن أن تحجب جودة الأجسام المضادة الرديئة النتائج المهمة. يوصى أيضا بوضع علامات مزدوجة على الركائز المرشحة على كل من N- و C-terminus بعلامات مختلفة34. في حالة حدوث الانقسام ، يساعد وضع العلامات المزدوجة على تتبع كل من منتجات الانقسام وقد يساعد في توضيح ما إذا كان الانقسام يحدث في موقع واحد أو أكثر.

في حين أن هذا البروتوكول يتحقق بسهولة من صحة الركيزة البيولوجية المعروفة ل Dronc ، Drice ، إلا أن هناك أيضا قيودا. أحد القيود هو أن هذا بروتوكول في المختبر مع البروتينات المؤتلفة. في هذه المقايسات ، توجد الكاسباز بتركيز عال غير فسيولوجي ، وهو ما يتضح من ملاحظة أنه يمكنهم المعالجة التلقائية تلقائيا في الإشريكية القولونية. عادة لا تحدث المعالجة التلقائية التلقائية في ظل الظروف الفسيولوجية. قد يتسبب تركيز الكاسباز العالي هذا في نشاط زائف يؤدي إلى إيجابيات كاذبة. يمكن القضاء على الإيجابيات الكاذبة عن طريق خفض تركيز الكاسباز في تفاعل الانقسام في المختبر . علاوة على ذلك ، كما هو موضح بمزيد من التفصيل أدناه ، من الضروري إجراء فحوصات إضافية لتأكيد الركائز الأصلية والقضاء على الإيجابيات الخاطئة.

قد لا يكون للكاسباز المؤتلف نفس الخصوصية التي تتمتع بها في بيئتها الخلوية الطبيعية في الجسم الحي. على سبيل المثال ، يمكن تعديل نشاط caspases عن طريق تعديلات ما بعد الترجمة. هذه غير موجودة على البروتينات المؤتلفة. علاوة على ذلك ، في الجسم الحي ، يتم دمج كاسباس البادئ ، بما في ذلك Dronc في مجمعات بروتينية كبيرة مثل apoptosome. في ظل ظروف هذا البروتوكول ، لا يتحقق تشكيل apoptosome. سيتطلب ذلك تعبيرا مؤتلفا عن ذبابة الفاكهة Apaf-1 (المعروفة أيضا باسم Dark أو Hac-1) 35-37 التي تواجه تحديات خاصة بها. لذلك ، في المختبر ، قد لا يكون ل Dronc نفس الخصوصية التي يتمتع بها في الجسم الحي.

من المتصور أيضا أن يتم دمج Dronc في مركب بروتيني مختلف للعمليات غير المبرمجة. قد يمنح هذا خصوصية انقسام مختلفة ل Dronc ، مما قد يفسر أيضا سبب عدم تحفيز Dronc لموت الخلايا المبرمج في ظل ظروف غير موت الخلايا المبرمج. فيما يتعلق بهذا ، يستخدم CasCleave مواقع إجماع الانقسام المعروفة للتنبؤ بركائز كاسباز جديدة. ومع ذلك ، فمن غير المعروف ما إذا كانت نفس مواقع إجماع الانقسام تستخدم أيضا في العمليات غير المبرمجة. في الواقع ، في الآونة الأخيرة ، تبين أن Caspase-3 يغير موقع الإجماع المفضل لديه خلال عملية غير موت الخلايا المبرمج في جذع الدماغ السمعي النامي في جنين الفرخ38. وبالمثل ، إذا تم دمج كاسباس البادئ في مجمعات بروتينية مختلفة ، فقد يكون لها خصوصية مختلفة وبالتالي قد تلتصق بتسلسلات إجماع مختلفة.

توضح هذه القيود أنه لا يكفي الاعتماد فقط على مقايسات الانقسام في المختبر الموصوفة في هذا البروتوكول . يجب استخدام نهج بديلة لزيادة التحقق من صحة النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول. من الناحية المثالية ، يجب استخدام المقايسات في الجسم الحي لمعالجة الأسئلة التالية: هل تتم معالجة البروتين المرشح بروتينيا أثناء العملية غير المبرمج في الجسم الحي؟ إذا كان الأمر كذلك ، فهل يتم استخدام نفس موقع الانقسام في الجسم الحي وفي المختبر؟ ما هي النتيجة إذا تم حظر الانقسام عن طريق الطفرات في موقع الانقسام؟ هل تعتمد معالجة الركيزة المرشحة على الكاسباس ، وإذا كان الأمر كذلك ، فأي واحد؟ ما هو دور شظايا الانقسام في العملية غير المبرمجة؟ يمكن معالجة هذه الأسئلة بسهولة في الكائنات النموذجية الجينية مثل C. elegans و Drosophila باستخدام الطرق الجينية والمحورة وراثيا القياسية.

باختصار ، يصف هذا البروتوكول طريقة موثوقة ومتسقة لإنتاج كاسباس نشط إنزيميا ، وتحديدا كاسباس ذبابة الفاكهة درونك ودريس. الهدف النهائي من هذا البروتوكول هو فحص ما إذا كان Dronc يمكنه شق الركائز المرشحة في المختبر ، والتي تم تحديدها من خلال مناهج الجينات أو الكيمياء الحيوية أو المعلوماتية الحيوية. كما هو موضح في الفقرة السابقة ، هناك حاجة إلى فحوصات إضافية للتحقق من صحة هذه البروتينات كركائز كاسباز في الجسم الحي. بالنظر إلى درجة حفظ جينات الكاسباز عبر الميتازوا ، يجب أن يكون من الممكن تكييف هذا البروتوكول مع الكاسباز من الكائنات الحية الأخرى أيضا.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgments

نود أن نشكر الدكتورة إليف كامبر كايا على مساعدتها في وضع البروتوكول في المختبر. قدم الدكتور جاي سالفيسن متحولة DriceC211A 9. تم تمويل هذا العمل من خلال جائزة MIRA من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (NIGMS) التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) بموجب المنحة رقم 2R35GM118330. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin Fisher BP1760-25
Anti-His antibody Sigma-Aldrich MA1-21315
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell signaling 7076P2
Anti-Myc antibody Santa Cruz Biotechnology sc-40
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell signaling 7074P2
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5415 R
Benzonase Sigma-Aldrich E1014-5KU
BioPhotometer Eppendorf #6131
BL21 (DE3) pLysS Competent Cells Promega L1195
Centrifuge rotor Beckman Coulter JA-25.50
CHAPS  Sigma-Aldrich C3023-1G
ChemiDoc with image software Bio-Rad Universal Hood II For Chemiluminiscence imaging
Chemiluminiscence Substrate Thermofisher Scientific 34095 For Chemiluminiscence imaging
Cleaved Drosophila ICE (drICE) (Asp230) Antibody Cell Signaling Technology 9478S
Disposable cuvettes Fisher Scientific 14955128 Used to measure bacterial growth and protein concentration
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad #1610610
Erlenmeyer flasks, 1000 mL Millipore sigma CLS49801L For LB agar media preparation and autoclaving
Erlenmeyer flasks, 250 mL Millipore sigma CLS4980250 For bacterial culture growth and induction.
Ethylene-diamine-tetra-acetic Acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Gel extraction kit Qiagen 28704
Gel tank SDS-PAGE system Thermofisher Scientific STM1001
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermofisher scientific 87786
HEPES Sigma-Aldrich H3375
His-Drice-pET28a  This study N/A Available from authors
His-DriceC211A-pET28a  This study N/A Available from authors
His-Dronc-pET28a  This study N/A Available from authors
His-DroncC318A-pET28a  This study N/A Available from authors
Imidazole Sigma-Aldrich I2399-100G
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermofisher Scientific FERR0392
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5
LB Agar, Miller (Powder) Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Thermofisher Scientific 90082
Microbiological plate incubator Fisher Scientific 11-690-650D For colony growth after transformation
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL Eppendorf 22363611
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 22363204
Midiprep kit Qiagen 12243
Mini tube rotator Fisher Scientific 05-450-127 for mixing bacterial lysates and Ni-NTA agarose
Miniprep kit Qiagen 27106
Motorized Pipette Controller Gilson F110120 For using serological pipettes
NaH2PO4 Fisher Scientific BP330-1
Ni-NTA Agarose Qiagen 30210
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Midi Protein Gel, 20-well Thermofisher Scientific WG1402BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermofisher Scientific NP0007
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) Thermofisher Scientific NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20x) Invitrogen NP00061
Orbital shaking incubator with temperature control New Brunswick Scientific C25 incubator shaker
Petridish 100 mm x 15 mm Fisher Scientific FB0875712
Plating beads Zymo research S1001 For spreading culture on AmpR/KanR plates
Polypropylene Columns (1 mL) Qiagen 34924 For purification of His-tagged proteins
Precision Plus Protein Standards Bio-Rad #161-0374
Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad #5000006
pT7CFE1-NMyc Thermofisher Scientific 88863 For cloning substrates for RRL expression
PVDF membrane Invitrogen LC2007
14 mL Polypropylene round bottom tubes Fisher Scientific 352029 For growing plasmid cultures
QiaRack Qiagen 19095 For holding polypropylene columns during purification
Refrigerated High speed Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-25
rRNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N251A For RRL expression
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Sterile Falcon tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-527-90
Sterile Falcon tubes, 50 mL Fisher Scientific 14-959-49A
Sucrose Sigma-Aldrich S70903-250G
1 mL Serological Pipets, Sterile celltreat 229001B For bacterial cell lysis in 50 mL tubes
TnT Coupled Reticulocyte Lysate -T7 Promega L4611
Tris-base Fisher Scientific BP154-1
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Waterbath Fisher Scientific 2340
Western wet transferring cassette Thermofisher Scientific STM2001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kumar, S. Caspase function in programmed cell death. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 32-43 (2007).
  2. Hawkins, C. J., et al. The Drosophila caspase DRONC cleaves following glutamate or aspartate and is regulated by DIAP1, HID, and GRIM. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 27084-27093 (2000).
  3. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
  4. Meier, P., Silke, J., Leevers, S. J., Evan, G. I. The Drosophila caspase DRONC is regulated by DIAP1. EMBO Journal. 19 (4), 598-611 (2000).
  5. Timmer, J. C., Salvesen, G. S. Caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 66-72 (2007).
  6. Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11549-11556 (1999).
  7. Zou, H., Henzel, W. J., Liu, X., Lutschg, A., Wang, X. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. Cell. 90 (3), 405-413 (1997).
  8. Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 8359-8362 (1999).
  9. Snipas, S. J., Drag, M., Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Activation mechanism and substrate specificity of the Drosophila initiator caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (5), 938-945 (2008).
  10. Fraser, A. G., Evan, G. I. Identification of a Drosophila melanogaster ICE/CED-3-related protease, drICE. EMBO Journal. 16 (10), 2805-2813 (1997).
  11. Denton, D., Mills, K., Kumar, S. Methods and protocols for studying cell death in Drosophila. Methods in Enzymology. 446, 17-37 (2008).
  12. Dorstyn, L., Kumar, S. A biochemical analysis of the activation of the Drosophila caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (3), 461-470 (2008).
  13. Aram, L., Yacobi-Sharon, K., Arama, E. CDPs: caspase-dependent non-lethal cellular processes. Cell Death and Differentiation. 24 (8), 1307-1310 (2017).
  14. Arama, E., Baena-Lopez, L. A., Fearnhead, H. O. Non-lethal message from the Holy Land: The first international conference on nonapoptotic roles of apoptotic proteins. FEBS Journal. 288 (7), 2166-2183 (2021).
  15. Baena-Lopez, L. A. All about the caspase-dependent functions without cell death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 77-78 (2018).
  16. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. Journal of Cell Biology. 196 (4), 513-527 (2012).
  17. Amcheslavsky, A., et al. Plasma membrane localization of apoptotic caspases for non-apoptotic functions. Developmental Cell. 45 (4), 450-464 (2018).
  18. Bergmann, A. Are membranes non-apoptotic compartments for apoptotic caspases. Oncotarget. 9 (60), 31566-31567 (2018).
  19. Song, J., et al. Cascleave: towards more accurate prediction of caspase substrate cleavage sites. Bioinformatics. 26 (6), 752-760 (2010).
  20. Wang, M., et al. Cascleave 2.0, a new approach for predicting caspase and granzyme cleavage targets. Bioinformatics. 30 (1), 71-80 (2014).
  21. Kamber Kaya, H. E., Ditzel, M., Meier, P., Bergmann, A. An inhibitory mono-ubiquitylation of the Drosophila initiator caspase Dronc functions in both apoptotic and non-apoptotic pathways. PLoS Genetics. 13 (2), 1006438 (2017).
  22. Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Caspases: preparation and characterization. Methods. 17 (4), 313-319 (1999).
  23. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  24. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).
  25. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  26. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  27. Hirano, S. Western blot analysis. Methods in Molecular Biology. 926, 87-97 (2012).
  28. Kim, B. Western blot techniques. Methods in Molecular Biology. 1606, 133-139 (2017).
  29. Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
  30. Fogarty, C. E., et al. Extracellular reactive oxygen species drive apoptosis-induced proliferation via Drosophila macrophages. Current Biology. 26 (5), 575-584 (2016).
  31. Song, Z., et al. Biochemical and genetic interactions between Drosophila caspases and the proapoptotic genes rpr, hid, and grim. Molecular and Cellular Biology. 20 (8), 2907-2914 (2000).
  32. Edfors, F., et al. Enhanced validation of antibodies for research applications. Nature Communications. 9 (1), 4130 (2018).
  33. Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
  34. Brizzard, B. Epitope tagging. Biotechniques. 44 (5), 693-695 (2008).
  35. Kanuka, H., et al. Control of the cell death pathway by Dapaf-1, a Drosophila Apaf-1/CED-4-related caspase activator. Molecular Cell. 4 (5), 757-769 (1999).
  36. Rodriguez, A., et al. Dark is a Drosophila homologue of Apaf-1/CED-4 and functions in an evolutionarily conserved death pathway. Nature Cell Biology. 1 (5), 272-279 (1999).
  37. Zhou, L., Song, Z., Tittel, J., Steller, H. HAC-1, a Drosophila homolog of APAF-1 and CED-4 functions in developmental and radiation-induced apoptosis. Molecular Cell. 4 (5), 745-755 (1999).
  38. Weghorst, F., Mirzakhanyan, Y., Hernandez, K. L., Gershon, P. D., Cramer, K. S. Non-Apoptotic caspase activity preferentially targets a novel consensus sequence associated with cytoskeletal proteins in the developing auditory brainstem. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844844 (2022).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 188،
<em>في المختبر</em> مقايسات الانقسام باستخدام كاسباز <em>ذبابة الفاكهة</em> المؤتلف المنقى لفحص الركيزة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yarikipati, P., Bergmann, A. In… More

Yarikipati, P., Bergmann, A. In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening. J. Vis. Exp. (188), e64392, doi:10.3791/64392 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter