Summary
Aqui apresentamos um protocolo para expressar e purificar Drosophila caspases recombinantes Dronc e Drice, e seu uso em ensaios de clivagem in vitro .
Abstract
As caspases são proteases de morte celular muito específicas que estão envolvidas em processos apoptóticos e não apoptóticos. Embora o papel das caspases durante a apoptose tenha sido muito bem definido e muitos substratos proteolíticos apoptóticos das caspases tenham sido identificados e caracterizados, o papel das caspases para processos não apoptóticos não é bem compreendido. Em particular, poucos substratos não apoptóticos de caspases foram identificados até o momento. Aqui, a fim de facilitar a identificação e caracterização de potenciais substratos de caspase, é descrito um protocolo que permite o teste de substratos candidatos em ensaios de clivagem de caspase in vitro . Este protocolo inclui a produção e purificação de proteínas caspase recombinantes, a produção dos substratos candidatos de forma recombinante ou em um sistema de expressão livre de células e a reação real de clivagem in vitro seguida de SDS-PAGE e immunoblotting. Este protocolo é adaptado para as caspases Drosophila Dronc e Drice, mas pode ser facilmente adaptado para caspases de outros organismos, incluindo mamíferos.
Introduction
A morte celular programada ou apoptose é executada por uma classe de proteases de morte celular altamente especializadas denominadas caspases (revisadas na referência1). Caspases são proteases Cys que contêm um resíduo de Cys no sítio catalítico. Eles definiram locais de clivagem de consenso e clivam substratos proteoliticamente após resíduos de Asp (embora a Drosophila caspase Dronc também tenha sido relatada para clivar após resíduos de Glu2). Eles são subdivididos em caspases iniciadoras (também conhecidas como apical ou upstream) e effector (executor ou downstream). As caspases do iniciador ativam as caspases do efetor. Por exemplo, em mamíferos, o iniciador caspase Caspase-9 cliva e ativa o efetor caspase Caspase-33. Da mesma forma, em Drosophila melanogaster, a caspase-9-ortholog Dronc cliva e ativa a caspase-3-ortholog Drice 2,4. Durante a apoptose, as caspases efetoras clivam centenas de substratos levando à morte da célula5.
As caspases são sintetizadas como proenzimas inativas (zimogens) na célula. Nesta forma, eles contêm um prodomínio N-terminal, uma grande subunidade com o Cys catalítico na porção central da proenzima e uma pequena subunidade no C-terminal 1 (Figura 1). O mecanismo de ativação é diferente entre as caspases do iniciador e do efetor. As caspases iniciadoras (Caspase-9, Dronc) requerem dimerização para ativação, que ocorre pela incorporação em um grande complexo proteico, denominado apoptossomo6. Para a incorporação no apoptossoma, a Caspase-9 e o Dronc possuem um domínio de ativação e recrutamento da caspase (CARD) no prodomínio N-terminal (Figura 1). O componente apoptossomo Apaf-1 também contém um CARD e recruta Caspase-9 ou Dronc via interação CARD/CARD no apoptossomo 3,6,7. Embora a Caspase-9 e o Dronc possam ser processados proteoliticamente no apoptossoma, esse processamento não é totalmente necessário para a atividade enzimática 8,9.
Em contraste, as caspases efetoras (Caspase-3, Drice) não carregam um CARD em seus pró-domínios e não são incorporadas em grandes complexos proteicos para ativação1. Eles são dependentes da clivagem proteolítica pela Caspase-9 ativa ou Dronc1, respectivamente. A caspase efetora ativa forma um tetrâmero composto por duas subunidades grandes e duas pequenas, e assim contém dois sítios catalíticos (Figura 1). É importante ressaltar para este protocolo a expressão recombinante de caspases em E. coli causa autoprocessamento e ativação de caspases, incluindo Drice 10 e Dronc 2,8,9,11,12, mesmo na ausência de Apaf-1. Este autoprocessamento permite realizar ensaios de clivagem in vitro de substratos candidatos com proteína caspase recombinante.
As caspases não estão envolvidas apenas na apoptose, mas também podem ter muitas funções não apoptóticas, incluindo proliferação, diferenciação, migração celular, poda neuronal, imunidade inata e outras13,14,15. Atualmente, não se sabe como as células podem sobreviver, apesar de conter caspases ativas durante processos não apoptóticos. É possível que essas células ativem caspases apenas em níveis subletais16 ou sequestrem caspases ativas em compartimentos não apoptóticos da célula, como a membrana plasmática17,18. Portanto, a identificação e verificação de substratos não apoptóticos não apenas revelará como as caspases medeiam processos não apoptóticos, mas também pode ajudar a entender como as células podem sobreviver na presença de caspases ativas.
Proteínas candidatas como substratos de caspase podem ser identificadas usando métodos genéticos e bioquímicos. As proteínas identificadas podem ser verificadas quanto à presença dos locais de clivagem de Dronc de consenso. Isso pode ser feito inspecionando visualmente a sequência proteica ou utilizando ferramentas de bioinformática on-line mais sofisticadas, como CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/)19,20. Essas ferramentas usam os conhecidos locais de clivagem de consenso de caspases e considerações estruturais para prever novos alvos de caspases. Embora o CasCleave incorpore as informações de substratos verificados de Caspases-1, -3, -6, -7 e -8 humanos, ele também pode, no entanto, ser útil para os fins descritos aqui, pois essas caspases e seus locais de clivagem de consenso são bem conservados. No entanto, como o local de clivagem de Dronc não está bem definido (dois estudos identificaram dois locais de clivagem ideais diferentes, TATD/E2 e LALD9), os substratos candidatos também são examinados quanto à presença de outro local de clivagem da caspase, incluindo Drice.
Para validar os substratos previstos das caspases, são necessários ensaios adicionais. Um desses ensaios é a demonstração de que uma dada caspase pode realmente clivar a proteína candidata in vitro. Aqui, fornecemos um protocolo conveniente para ensaios de clivagem em caspase in vitro . Usando este protocolo, os substratos candidatos são testados com Dronc como caspase. Eles também podem ser testados como substratos de Drice. Embora este protocolo seja escrito para as caspases Drosophila Dronc e Drice, ele também pode ser adaptado para caspases de outros organismos.
A extração e purificação de Dronc e Drice, juntamente com o ensaio de clivagem in vitro, devem ser realizadas no mesmo dia devido à perda de atividade catalítica por essas caspases. Este protocolo foi modificado e otimizado a partir de publicações anteriores 8,9,11,12,21,22. Neste protocolo, quatro proteínas caspase diferentes são expressas recombinantemente na cepa BL21 (DE3) de E. coli pLysS. Essas proteínas são: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt e 6xHis-DriceC211A. Cada uma dessas proteínas é marcada com 6 resíduos de histidina (6xHis) no terminal N para purificação. Dronc wt e Dricewt são as proteínas do tipo selvagem e podem se auto-processar na caspase ativa após a expressão recombinante. DroncC318A e DriceC211A codificam formas mutantes de Dronc e Drice que mudam o resíduo catalítico de Cys para um resíduo de Ala. Essas construções são cataliticamente inativas e não podem ser processadas automaticamente (consulte a Figura 2A). Eles são usados como controles no ensaio de clivagem. Como o DriceC211A não pode ser autoprocessado, ele também é usado como substrato modelo para o Droncwt no ensaio de clivagem in vitro descrito aqui.
Protocol
1. Expressão de caspase recombinante em bactérias
- Clone o gene de interesse (Caspase ou substrato putativo) em um vetor de expressão bacteriana com tag(s) N- e/ou C-terminal(is) usando protocolos padrão23.
NOTA: As etiquetas podem aumentar a solubilidade das proteínas recombinantes e são usadas para purificação das proteínas recombinantes. Aqui, Dronc, Drice e seus mutantes catalíticos são clonados no vetor pET28a, que fornece uma tag N-terminal 6xHis (pET28a-6xHis-Dronc wt, pET28a-6xHis-Dronc C318A, pET28a-6xHis-Dricewt, pET28a-6xHis-Drice C211A); (para informações sobre a cartilha, ver Quadro Suplementar 1). - Transformar os vetores com os genes de interesse em células BL21 (DE3) pLysS E. coli competentes utilizando procedimentos padrão23,24. Chapear a mistura de transformação em placas de ágar LB com o antibiótico apropriado (canamicina no caso de pET28a) para selecionar bactérias transformadas. (Consulte a Tabela Suplementar 2.)
- Colher uma colónia da placa e inocular em 5 ml de meio LB contendo o antibiótico adequado para crescer durante a noite a 37 °C a 220 rpm numa plataforma de agitação.
- No dia seguinte, prepare 30-50 mL (por amostra) de meio LB com antibiótico e adicione 1 mL da cultura cultivada durante a noite. A densidade óptica a 600 nm (OD600) utilizando um biofotómetro/espectrofotómetro deve situar-se entre 0,1 e 0,2.
- Aumente a cultura a 37 °C a 220 rpm em uma plataforma de agitação até que o OD600 atinja 0,6. Verifique o OD600 a cada hora até atingir 0,6. Isso leva cerca de 2 a 3 h.
- Para induzir a expressão de proteína (caspase), adicione IPTG a uma concentração final de 0,1-0,2 mM (diluir 1:1.000-1:500 do estoque de IPTG, ver Tabela Suplementar 2).
- Cultivar as culturas durante 3 h a 30 °C a 220 rpm.
NOTA: O tempo e a temperatura dependem do tipo de proteína que está sendo expressa e de sua solubilidade. Essas condições podem precisar ser ajustadas se diferentes caspases ou substratos forem expressos. - Após 3 h, girar as culturas em tubos de centrífuga de 50 mL por 20 min a 4 °C a 2.000 x g. Descarte o sobrenadante e prossiga com o pellet.
Observação : O protocolo pode ser interrompido neste ponto e continuado mais tarde. Os pellets bacterianos podem ser congelados a -80 °C.
2. Extração de caspases recombinantes em pequena escala
- Remova os tubos congelados com as culturas peletizadas do armazenamento de -80 °C e mantenha-os no gelo por 10 minutos para suavizar o pellet.
- Após 10 min, adicionar 0,6 mL de tampão de lise celular bacteriana (Tabela Suplementar 2) suplementado com inibidores de protease recém-adicionados, 10 mg/mL de lisozima e 50 U/mL de benzonase nos tubos contendo pellets usando um controlador de pipeta com uma pipeta sorológica de 1 mL.
- Com a mesma ponta da pipeta, dissolva o pellet pipetando para cima e para baixo até que uma solução amarelo-pálida clara sem quaisquer partículas de pellet seja visível. Incubar por 30 min no gelo.
- Transferir o lisado para tubos de centrifugação apropriados e centrifugar os lisados a 17.000 x g durante 40 min a 4 °C.
- Transfira os sobrenadantes para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Este é o extrato bruto que contém as caspases.
- Mantenha os tubos no gelo e prossiga para a purificação com agarose Ni-NTA.
3. Purificação de caspases em pequena escala
- Adicionar 0,2 ml da pasta a 50% de agarose Ni-NTA a cada tubo dos extractos de caspase do passo 2.5. Girar os tubos sobre um rotador de ponta a ponta durante 1 h a 4 °C.
- Após 1 h, adicionar o extracto com a agarose Ni-NTA a colunas de polipropileno de 1 ml com a ponta intacta, colocadas num rack. Deixe repousar por 5 min.
- Após 5 minutos, remova a tampa das colunas e deixe o sobrenadante fluir para fora por gravidade.
- Adicionar cuidadosamente 1 ml do tampão de lavagem (Tabela Suplementar 2) às colunas sem perturbar a resina embalada de agarose Ni-NTA e lavá-la através do fluxo de gravidade.
- Execute a etapa de lavagem três vezes.
- Para a eluição das caspases, colocar 1,5 mL de tubos de microcentrífuga sob o bocal coletor das colunas após a drenagem completa do tampão de lavagem.
- Adicionar 0,5 ml do tampão de eluição (suplementado com inibidores da protease 1x imediatamente antes da utilização) a cada coluna e recolher o eluato nos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
NOTA: O eluato purificado fino será de cor transparente. - Mantenha os eluídos no gelo e meça a concentração de proteínas pelo ensaio de Bradford25. Confirmar a pureza/homogeneidade das caspases purificadas por SDS-PAGE seguida de coloração Coomassie Blue26.
NOTA: O rendimento de uma cultura de 50 mL de LB varia entre 0,5 e 1,5 mg de proteína caspase. Dado que 0,5 mL de tampão de eluição é usado para eluição, a concentração varia de 1 a 3 mg/mL. É importante usar os eluítes de caspase purificados para ensaios de clivagem in vitro no mesmo dia de lise e purificação, pois essas preparações de caspase perdem atividade durante a noite.
4. Expressão do substrato de caspase putativa em sistemas de expressão livre de células
NOTA: Neste protocolo, o Drice, o substrato natural do Dronc, é preparado tanto pela expressão recombinante em E. coli (ver secção 3 acima) como pela expressão no lisado de reticulócitos de coelho (RRL), um sistema de expressão livre de células de mamíferos (esta secção, ver abaixo).
- Clone o gene do substrato putativo em um vetor de expressão contendo um promotor T7, T3 ou SP6 usando procedimentos padrão23.
NOTA: Neste protocolo, DriceC211A está sendo usado como substrato modelo e foi clonado no vetor pT7CFE1-N-Myc, que carrega um promotor T7 para expressão gênica e marca o substrato proteico putativo com um Myc-tag N-terminal para detecção por immunoblotting. - Na RRL, os substratos candidatos podem ser sintetizados radioativamente ou não radioativamente.
- Síntese não radioativa: Em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL, adicione 25 μL de RRL, 2 μL de tampão de reação, 0,5 μL de Mistura de Aminoácidos -Menos Leucina (1 mM), 0,5 μL de Mistura de Aminoácidos-Menos Metionina (1 mM), 1 μL de Inibidor de Ribonuclease (40 U/μL), 2 μL de DNA Molde (0,5 μg/μL) e 1 μL de T7-RNA Polimerase. Adicione água livre de nuclease para ajustar o volume final da reação a 50 μL. Misture suavemente os componentes pipetando ou mexendo com a ponta da pipeta e gire brevemente para baixo.
NOTA: O lisado RRL contém 100-200 mg/mL das proteínas endógenas. Para reações de tradução in vitro , adicione o RRL na concentração de 50% (aqui reação de 25 μL/50 μL). - Síntese radioativa: Em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL, adicione 25 μL de lisato RRL, 2 μL de tampão de reação, 0,5 μL de Mistura de Aminoácidos-Menos Metionina (1 mM), 1 μL de Inibidor de Ribonuclease (40 U/μL), 2 μL de DNA Molde (0,5 μg/μL), 2 μL de Metionina Marcada com S35 (1000 Ci/mmol a 10 mCi/mL) e 1 μL de Polimerase T7-RNA. Adicione água livre de nuclease para ajustar o volume final da reação a 50 μL. Misture suavemente os componentes pipetando ou mexendo com a ponta da pipeta e gire brevemente para baixo. Descarte pontas e tubos em um recipiente de resíduos radioativos.
NOTA: Não adicione a mistura de aminoácidos sem leucina. O vetor pT7CFE1 usa um promotor T7 para a expressão de proteínas. Outros vetores usam promotores T3 ou SP6. Nesse caso, as RNA polimerases T3 ou SP6 devem ser usadas em vez da RNA polimerase T7. Por favor, certifique-se de que o modelo de DNA é de alta pureza.
- Síntese não radioativa: Em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL, adicione 25 μL de RRL, 2 μL de tampão de reação, 0,5 μL de Mistura de Aminoácidos -Menos Leucina (1 mM), 0,5 μL de Mistura de Aminoácidos-Menos Metionina (1 mM), 1 μL de Inibidor de Ribonuclease (40 U/μL), 2 μL de DNA Molde (0,5 μg/μL) e 1 μL de T7-RNA Polimerase. Adicione água livre de nuclease para ajustar o volume final da reação a 50 μL. Misture suavemente os componentes pipetando ou mexendo com a ponta da pipeta e gire brevemente para baixo.
- Incubar a reacção a 30 °C durante 90 min.
- Gire brevemente por 10 s e coloque os tubos no gelo. Verificar o nível de expressão do substrato putativo em RRL por SDS-PAGE e imunoblotting/autorradiografia.
NOTA: A quantidade de extrato de RRL adicionada à reação de clivagem deve ser baseada na quantidade de proteína que pode ser detectada pelo método de detecção (imunoblotting ou autorradiografia S35 ). Proceder ao ensaio de clivagem in vitro (secção seguinte) ou guardá-lo a -80 °C.
5. Ensaio de clivagem in vitro com substratos gerados com RRL
- Tomar o(s) substrato(s) putativo(s) gerado(s), conforme descrito na secção 4. Neste protocolo, N-Myc-DriceC211A é usado como substrato modelo.
- Dependendo do nível de expressão do substrato putativo (a ser determinado separadamente por imunoblot ou análise de autorradiografia, ver etapa 4.4), use 1-10 μL do RRL programado com a proteína de interesse no ensaio de clivagem.
- Adicionar 10 μg de proteína caspase purificada gerada nas secções 1, 2 e 3.
- Elevar o volume total de reação para 50 μL com tampão de ensaio de caspase.
- Incubar as reacções em banho-maria a 30 °C durante 3 h. Certifique-se de incluir os controles apropriados no ensaio de clivagem. Aqui, o mutante catalítico DroncC318A é usado como controle.
- Após 3 h, pare as reações transferindo os tubos no gelo.
- Adicione um volume de buffer de amostra SUD contendo 50 mM de TDT. A reação é interrompida completamente com a adição de buffer de amostra SUD.
- Incubar as amostras a 75 °C num bloco de calor durante 10 minutos.
- Girar rapidamente, misturar agitando, carregar 24 μL por amostra e executar o SDS-PAGE (ver secção 7) ou armazenar as amostras a -20 °C.
6. Ensaio de clivagem in vitro com proteína de substrato recombinante expressa por bactérias
- Adicionar 10 μg de substrato candidato purificado (aqui 6xHis-DriceC211A, gerado nas seções 1, 2 e 3) a um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL.
- Adicionar 10 μg das proteínas caspase purificadas geradas nas secções 1 e 2. Reduza o volume total para 50 μL usando o buffer de ensaio de caspase.
- Siga as etapas 5.5 a 5.9.
7. SDS-PAGE e immunoblotting
- Carregar as reações de clivagem (24 μL) em géis de gradiente Tris-Glycine ou Bis-Tris a 4%-12% (Tabela de Materiais) e realizar eletroforese de proteínas e immunoblotting (ou autorradiografia se usando substratos marcados com S35) para visualizar os resultados usando procedimentos padrão27,28.
NOTA: Aqui, neste protocolo, foram utilizados géis gradiente Bis-Tris com buffer de execução Mops e buffer de carregamento LDS. Em geral, os protocolos PAGE comumente usados de géis de Tris-Glycine são executados usando o buffer de corrida Tris-Glycine-SDS e o buffer de carregamento SDS funcionam bem.
Representative Results
Este protocolo fornece instruções passo-a-passo para a indução da proteína caspase em E. coli, purificação do recombinante Drosophila caspases Dronc e Drice, a síntese de substratos candidatos e a reação de clivagem in vitro com substratos candidatos (aqui DriceC211A) e a caspase Dronc. O mutante catalítico DriceC211A foi utilizado como substrato modelo neste ensaio por não possuir atividade de autoprocessamento (Figura 2A) e permanecer de comprimento total até ser clivado peloDronc wt. DriceC211A deve ser sempre usado como um controle positivo para validar que a preparação Droncwt tem atividade enzimática.
A Figura 2A fornece um exemplo representativo da expressão e purificação de caspases recombinantes. Quatro caspases recombinantes diferentes foram induzidas e purificadas: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt e 6xHis-DriceC211A. As caspases purificadas foram executadas por SDS-PAGE, imunoblotted, e o blot foi sondado com um anticorpo anti-His (diluído 1:5.000; seguido por IgG anti-rato, anticorpo ligado à HRP (1:10.000)). O 6xHis-Dronc não processado (proDronc) funciona a um peso molecular relativo (MW r) de 55 kDa (pista 2) e o 6xHis-Drice não processado (proDrice) tem um MWr de 35 kDa (pista 4). O autoprocessamento das caspases é visível pelo aparecimento de bandas de MWr menores que, devido à presença da His-tag no N-terminal, representam as grandes subunidades das caspases (Figura 1). No caso do 6x-Dronc, a grande subunidade tem um MWr de 40 kDa (pista 1). A grande subunidade de 6x-Drice corre a 23 kDa (pista 3). Os mutantes catalíticos 6xHis-DroncC318A e 6xHis-DriceC211A não conseguem se autoprocessar e só são detectáveis como proteínas de comprimento total (faixas 2 e 4).
Figura 2B Para demonstrar que a preparaçãoem peso 6xHis-Dronc produzida e purificada por bactérias tem atividade enzimática, foi realizado um ensaio de clivagem in vitro, conforme descrito neste protocolo. Como controle negativo, foi utilizado o mutante catalítico 6xHis-DroncC318A. O substrato foi N-Myc-DriceC211A gerado por RRL, que é marcado com uma etiqueta Myc no terminal N. Após a reação de clivagem in vitro, as proteínas foram separadas por SDS-PAGE, imunoblotted e as manchas foram incubadas com um anticorpo anti-Myc (diluído 1:1.000) seguido de IgG anti-camundongo, anticorpo ligado à HRP (1:10.000)) para detectar N-Myc-DriceC211A. A clivagem bem-sucedida e, portanto, a atividade enzimática da caspase podem ser demonstradas pelo aparecimento de pelo menos uma banda de MWr menor em comparação com a forma total e não processada do substrato. N-Myc-Drice C211A não processado e de comprimento total tem um MWr de 40 kDa (pistas 2 e 4), enquanto a grande subunidade de N-Myc-DriceC211A processado funciona a 30 kDa (pista 3). A faixa 1 representa o lisado RRL não programado (sem plasmídeo/transcrito adicionado). A pista 2 demonstra a produção in vitro de DriceC211A por expressão RRL. A faixa 3 contém a reação de clivagem in vitro com 6xHis-Droncwt. A faixa 4 contém a reação de clivagem in vitro com 6xHis-DroncC318A.
Figura 2C Uma reação de clivagem in vitro que utiliza caspase recombinante e purificada (6xHis-Droncwt e 6x-His-DroncC318A) e substrato (6xHis-DriceC211A) de acordo com este protocolo, foi analisada por SDS-PAGE e immunoblot. Para a análise da reação de clivagem, o anticorpo Drice anticlivado (diluído 1:5.000; seguido por IgG anti-coelho, anticorpo ligado à HRP (1:10.000)) foi usado neste immunoblot. O anticorpo Drice anticlivado detecta seu neoepítopo na grande subunidade (23 kDa) de 6xHis-DriceC211A somente após o processamento por 6xHis-Droncwt (pista 1). O mutante catalítico 6xHis-DroncC318A é incapaz de processar 6xHis-Drice C211A neste ensaio e 6xHis-DriceC211A de comprimento total aparece como uma banda não processada fraca de 35 kDa (pista 2).
Figura 1: Estrutura do domínio das caspases iniciadoras Caspase-9 e Dronc e das caspases efetoras Caspase-3 e Drice. CARD - domínio de ativação e recrutamento de caspase; Cys - localização relativa do resíduo catalítico de cisteína; L - subunidade grande; S - subunidade pequena. A localização dos prodomínios N-terminal é indicada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados representativos . (A) Análise de immunoblot de preparações recombinantes purificadas 6xHis-Dronc e 6xHis-Drice, sondadas com um anticorpo anti-His. Não processados (proDronc e proDrice) e clivados 6xHis-Dronc e 6xHis-Drice são indicados por setas. Os marcadores MW são indicados à esquerda. (B) Análise de immunoblot da reação de clivagem in vitro de N-Myc-Drice gerado por RRL com caspases 6xHis-Droncwt (pista 3) ou 6x-His-DroncC318A (pista 4) sondadas com um anticorpo anti-Myc. As reações RRL não programadas e programadas (N-Myc-DriceC211A) são carregadas e separadas nas faixas 1 e 2. Não processado (proDrice) e clivado N-Myc-Drice são indicados por setas. Os marcadores MW são indicados à esquerda. (C) Análise de immunoblot da reação de clivagem in vitro do recombinante 6xHis-DriceC211A expresso e purificado bacterialmente com caspases 6xHis-Droncwt (pista 1) ou 6x-His-DroncC318A (pista 2), sondado com um anticorpo Drice anticlivagante. Full-length (proDrice) e clivado 6xHis-DriceC211A são indicados por setas. Os marcadores MW são indicados à esquerda. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Quadro complementar 1: Esta tabela contém primers usados para clonagem no vetor pET28a. Clique aqui para baixar este arquivo.
Quadro complementar 2: Esta tabela contém a composição de buffers e mídia. Clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
A maior parte do nosso conhecimento sobre caspases e função da caspase foi derivada de um intenso trabalho em apoptose durante as últimas três décadas. Está muito bem estabelecido que as caspases iniciadoras processam proteoliticamente as caspases efetoras, e centenas de proteínas têm sido identificadas como substratos efetores da caspase durante a apoptose 5,29. Em contraste, muito menos se sabe sobre a função das caspases para processos não-apoptóticos e quais substratos não-apoptóticos eles estão processando. É concebível que as caspases iniciadoras sejam os principais tomadores de decisão aqui. Durante a apoptose, eles ativam caspases efetoras causando morte celular. No entanto, para desencadear processos não apoptóticos, eles podem ativar diferentes proteínas (além das caspases efetoras), que controlam o processo não apoptótico. Este protocolo testa proteínas candidatas como substratos da caspase iniciadora Dronc em Drosophila 17,30.
Os substratos a serem testados no ensaio de clivagem podem ser produzidos em um sistema de expressão livre de células de mamíferos in vitro , como o RRL, ou por expressão recombinante em E. coli. Existem várias vantagens para a expressão in vitro usando RRL sobre a expressão bacteriana. O protocolo de expressão RRL é simples e rápido, permitindo que muitos substratos diferentes sejam preparados em paralelo. Em muitos casos, o extrato de RRL contendo a proteína de interesse pode ser armazenado a -80 °C antes do uso no ensaio de clivagem (embora isso precise ser determinado separadamente para cada substrato). O substrato putativo pode ser marcado com S35-Met, o que permite fácil análise por autorradiografia após SDS-PAGE. Isso é particularmente útil, se nenhum anticorpo específico do substrato estiver disponível. Alternativamente, se a rotulagem S35-Met não for desejada, o substrato putativo pode ser marcado com tags comuns, como tags Flag, HA ou Myc, o que permite a detecção de clivagem da caspase por immunoblotting.
É preciso enfatizar fortemente que o sucesso deste protocolo depende da purificação cuidadosa e consistente das proteínas recombinantes Dronc e Drice. Infelizmente, essas proteínas não podem ser armazenadas – nem mesmo a curto prazo – nem na geladeira nem congeladas. Eles perdem a atividade enzimática durante a noite em qualquer forma armazenada. Portanto, eles precisam ser preparados recentemente no dia do ensaio de clivagem. Independentemente da(s) proteína(s) candidata(s) a ser testada(s), DriceC211A deve ser sempre utilizado como controlo positivo para validar a actividade enzimática da preparação empeso de Dronc (ver Figura 2B,C). Alternativamente, a atividade das preparações de Dronc e Drice também pode ser testada por clivagem in vitro de substratos tetrapeptídicos sintéticos fluorogênicos 2,9,31.
Se os anticorpos forem utilizados para detectar os substratos candidatos, eles precisam ser validados pelo usuário32,33. Isso também se aplica a anticorpos comercialmente disponíveis que detectam marcas de epítopos, como Flag, HA, Myc ou outros. A má qualidade dos anticorpos pode obscurecer resultados importantes. Recomenda-se também a marcação de epítopos duplos dos substratos candidatos nos terminais N e C com diferentes marcações34. Se ocorrer clivagem, a marcação dupla ajuda a rastrear ambos os produtos de clivagem e pode ajudar a elucidar se a clivagem ocorrer em um ou mais locais.
Embora este protocolo valide facilmente o substrato biológico conhecido de Dronc, Drice, também existem limitações. Uma limitação é que este é um protocolo in vitro com proteínas recombinantes. Nestes ensaios, as caspases estão presentes em uma concentração não fisiologicamente alta, o que é evidente a partir da observação de que elas podem se autoprocessar espontaneamente em E. coli. O autoprocessamento espontâneo geralmente não ocorre sob as condições fisiológicas. Esta alta concentração de caspase pode causar atividade espúria, resultando em falsos positivos. Os falsos positivos podem ser eliminados diminuindo a concentração de caspase na reação de clivagem in vitro . Além disso, conforme descrito em mais detalhes abaixo, ensaios adicionais são necessários para confirmar substratos genuínos e eliminar falsos positivos.
As caspases recombinantes podem não ter a mesma especificidade que têm em seu ambiente celular normal in vivo. Por exemplo, a atividade das caspases pode ser modificada por modificações pós-traducionais. Estes não estão presentes nas proteínas recombinantes. Além disso, in vivo, as caspases iniciadoras, incluindo o Dronc, são incorporadas em grandes complexos proteicos, como o apoptossoma. Sob as condições deste protocolo, a formação do apoptossomo não é alcançada. Isso exigiria a expressão recombinante de Drosophila Apaf-1 (também conhecido como Dark ou Hac-1)35-37, que tem desafios próprios. Portanto, in vitro, o Dronc pode não ter a mesma especificidade que tem in vivo.
Também é concebível que o Dronc seja incorporado em um complexo proteico diferente para processos não apoptóticos. Isso pode conferir uma especificidade de clivagem diferente a Dronc, o que também poderia explicar por que o Dronc não induz apoptose em condições não apoptóticas. Relacionado a isso, CasCleave usa os locais de consenso de clivagem conhecidos para prever novos substratos de caspase. No entanto, não se sabe se os mesmos locais de consenso de clivagem também são usados para processos não apoptóticos. De fato, recentemente, foi demonstrado que a Caspase-3 altera seu local de consenso preferido durante um processo não apoptótico no desenvolvimento auditivo do tronco encefálico no embrião de pintinho38. Da mesma forma, se as caspases iniciadoras forem incorporadas em diferentes complexos proteicos, elas podem ter uma especificidade diferente e, portanto, podem se separar em diferentes sequências de consenso.
Essas limitações ilustram que não é suficiente confiar apenas nos ensaios de clivagem in vitro descritos neste protocolo. Abordagens alternativas devem ser empregadas para validar ainda mais os resultados obtidos usando este protocolo. Idealmente, ensaios in vivo devem ser usados para abordar as seguintes questões: A proteína candidata é processada proteoliticamente durante o processo não apoptótico in vivo? Em caso afirmativo, o mesmo local de clivagem é usado in vivo e in vitro? Qual é a consequência se a clivagem é bloqueada pela mutagênese do local da clivagem? O processamento do substrato candidato depende de caspases e, em caso afirmativo, qual? Qual o papel dos fragmentos de clivagem para o processo não apoptótico? Essas questões podem ser facilmente abordadas nos organismos modelo genético, como C. elegans e Drosophila, usando métodos genéticos e transgênicos padrão.
Em resumo, este protocolo descreve um método confiável e consistente para produzir caspases enzimaticamente ativas, especificamente as caspases Drosophila Dronc e Drice. O objetivo final deste protocolo é examinar se o Dronc pode clivar substratos candidatos in vitro, que foram identificados por abordagens genéticas, bioquímicas ou bioinformáticas. Como explicado no parágrafo anterior, ensaios adicionais são necessários para validar essas proteínas como substratos de caspase in vivo. Dado o grau de conservação dos genes da caspase em todos os metazoários, deve ser possível adaptar este protocolo às caspases de outros organismos também.
Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer à Dra. Elif Kamber-Kaya por sua ajuda para estabelecer o protocolo no laboratório. O Dr. Guy Salvesen gentilmente forneceu o mutante DriceC211A 9. Este trabalho foi financiado por um prêmio MIRA do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS) dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) sob o número de concessão 2R35GM118330. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Anti-His antibody | Sigma-Aldrich | MA1-21315 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7076P2 | |
| Anti-Myc antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7074P2 | |
| Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| BioPhotometer | Eppendorf | #6131 | |
| BL21 (DE3) pLysS Competent Cells | Promega | L1195 | |
| Centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023-1G | |
| ChemiDoc with image software | Bio-Rad | Universal Hood II | For Chemiluminiscence imaging |
| Chemiluminiscence Substrate | Thermofisher Scientific | 34095 | For Chemiluminiscence imaging |
| Cleaved Drosophila ICE (drICE) (Asp230) Antibody | Cell Signaling Technology | 9478S | |
| Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955128 | Used to measure bacterial growth and protein concentration |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610610 | |
| Erlenmeyer flasks, 1000 mL | Millipore sigma | CLS49801L | For LB agar media preparation and autoclaving |
| Erlenmeyer flasks, 250 mL | Millipore sigma | CLS4980250 | For bacterial culture growth and induction. |
| Ethylene-diamine-tetra-acetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Gel tank SDS-PAGE system | Thermofisher Scientific | STM1001 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermofisher scientific | 87786 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| His-Drice-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-DriceC211A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-Dronc-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| His-DroncC318A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | |
| Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermofisher Scientific | FERR0392 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LB Agar, Miller (Powder) | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lysozyme | Thermofisher Scientific | 90082 | |
| Microbiological plate incubator | Fisher Scientific | 11-690-650D | For colony growth after transformation |
| Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 22363611 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Midiprep kit | Qiagen | 12243 | |
| Mini tube rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | for mixing bacterial lysates and Ni-NTA agarose |
| Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
| Motorized Pipette Controller | Gilson | F110120 | For using serological pipettes |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | BP330-1 | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Midi Protein Gel, 20-well | Thermofisher Scientific | WG1402BOX | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermofisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) | Thermofisher Scientific | NP0001 | |
| NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Invitrogen | NP00061 | |
| Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | C25 incubator shaker | |
| Petridish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plating beads | Zymo research | S1001 | For spreading culture on AmpR/KanR plates |
| Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | 34924 | For purification of His-tagged proteins |
| Precision Plus Protein Standards | Bio-Rad | #161-0374 | |
| Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
| pT7CFE1-NMyc | Thermofisher Scientific | 88863 | For cloning substrates for RRL expression |
| PVDF membrane | Invitrogen | LC2007 | |
| 14 mL Polypropylene round bottom tubes | Fisher Scientific | 352029 | For growing plasmid cultures |
| QiaRack | Qiagen | 19095 | For holding polypropylene columns during purification |
| Refrigerated High speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | |
| rRNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251A | For RRL expression |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sterile Falcon tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
| Sterile Falcon tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S70903-250G | |
| 1 mL Serological Pipets, Sterile | celltreat | 229001B | For bacterial cell lysis in 50 mL tubes |
| TnT Coupled Reticulocyte Lysate -T7 | Promega | L4611 | |
| Tris-base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Waterbath | Fisher Scientific | 2340 | |
| Western wet transferring cassette | Thermofisher Scientific | STM2001 |
References
- Kumar, S. Caspase function in programmed cell death. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 32-43 (2007).
- Hawkins, C. J., et al. The Drosophila caspase DRONC cleaves following glutamate or aspartate and is regulated by DIAP1, HID, and GRIM. Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 27084-27093 (2000).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
- Meier, P., Silke, J., Leevers, S. J., Evan, G. I. The Drosophila caspase DRONC is regulated by DIAP1. EMBO Journal. 19 (4), 598-611 (2000).
- Timmer, J. C., Salvesen, G. S. Caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (1), 66-72 (2007).
- Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11549-11556 (1999).
- Zou, H., Henzel, W. J., Liu, X., Lutschg, A., Wang, X. Apaf-1, a human protein homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of caspase-3. Cell. 90 (3), 405-413 (1997).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Snipas, S. J., Drag, M., Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Activation mechanism and substrate specificity of the Drosophila initiator caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (5), 938-945 (2008).
- Fraser, A. G., Evan, G. I. Identification of a Drosophila melanogaster ICE/CED-3-related protease, drICE. EMBO Journal. 16 (10), 2805-2813 (1997).
- Denton, D., Mills, K., Kumar, S. Methods and protocols for studying cell death in Drosophila. Methods in Enzymology. 446, 17-37 (2008).
- Dorstyn, L., Kumar, S. A biochemical analysis of the activation of the Drosophila caspase DRONC. Cell Death and Differentiation. 15 (3), 461-470 (2008).
- Aram, L., Yacobi-Sharon, K., Arama, E. CDPs: caspase-dependent non-lethal cellular processes. Cell Death and Differentiation. 24 (8), 1307-1310 (2017).
- Arama, E., Baena-Lopez, L. A., Fearnhead, H. O. Non-lethal message from the Holy Land: The first international conference on nonapoptotic roles of apoptotic proteins. FEBS Journal. 288 (7), 2166-2183 (2021).
- Baena-Lopez, L. A. All about the caspase-dependent functions without cell death. Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 77-78 (2018).
- Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. Journal of Cell Biology. 196 (4), 513-527 (2012).
- Amcheslavsky, A., et al. Plasma membrane localization of apoptotic caspases for non-apoptotic functions. Developmental Cell. 45 (4), 450-464 (2018).
- Bergmann, A. Are membranes non-apoptotic compartments for apoptotic caspases. Oncotarget. 9 (60), 31566-31567 (2018).
- Song, J., et al. Cascleave: towards more accurate prediction of caspase substrate cleavage sites. Bioinformatics. 26 (6), 752-760 (2010).
- Wang, M., et al. Cascleave 2.0, a new approach for predicting caspase and granzyme cleavage targets. Bioinformatics. 30 (1), 71-80 (2014).
- Kamber Kaya, H. E., Ditzel, M., Meier, P., Bergmann, A. An inhibitory mono-ubiquitylation of the Drosophila initiator caspase Dronc functions in both apoptotic and non-apoptotic pathways. PLoS Genetics. 13 (2), 1006438 (2017).
- Stennicke, H. R., Salvesen, G. S. Caspases: preparation and characterization. Methods. 17 (4), 313-319 (1999).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th edition). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), e253 (2007).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
- Hirano, S. Western blot analysis. Methods in Molecular Biology. 926, 87-97 (2012).
- Kim, B. Western blot techniques. Methods in Molecular Biology. 1606, 133-139 (2017).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death and Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
- Fogarty, C. E., et al. Extracellular reactive oxygen species drive apoptosis-induced proliferation via Drosophila macrophages. Current Biology. 26 (5), 575-584 (2016).
- Song, Z., et al. Biochemical and genetic interactions between Drosophila caspases and the proapoptotic genes rpr, hid, and grim. Molecular and Cellular Biology. 20 (8), 2907-2914 (2000).
- Edfors, F., et al. Enhanced validation of antibodies for research applications. Nature Communications. 9 (1), 4130 (2018).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
- Brizzard, B. Epitope tagging. Biotechniques. 44 (5), 693-695 (2008).
- Kanuka, H., et al. Control of the cell death pathway by Dapaf-1, a Drosophila Apaf-1/CED-4-related caspase activator. Molecular Cell. 4 (5), 757-769 (1999).
- Rodriguez, A., et al. Dark is a Drosophila homologue of Apaf-1/CED-4 and functions in an evolutionarily conserved death pathway. Nature Cell Biology. 1 (5), 272-279 (1999).
- Zhou, L., Song, Z., Tittel, J., Steller, H. HAC-1, a Drosophila homolog of APAF-1 and CED-4 functions in developmental and radiation-induced apoptosis. Molecular Cell. 4 (5), 745-755 (1999).
- Weghorst, F., Mirzakhanyan, Y., Hernandez, K. L., Gershon, P. D., Cramer, K. S. Non-Apoptotic caspase activity preferentially targets a novel consensus sequence associated with cytoskeletal proteins in the developing auditory brainstem. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844844 (2022).
