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Bioengineering

インビトロ 基質スクリーニングのための精製組換え ショウジョウバエ カスパーゼを用いた切断アッセイ

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/64392
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMass Chan Medical School

Summary

ここでは、組換え ショウジョウバエ カスパーゼDroncおよびDriceを発現および精製するためのプロトコル、および in vitro 切断アッセイにおけるそれらの使用を紹介します。

Abstract

カスパーゼは、アポトーシスおよび非アポトーシスプロセスに関与する非常に特異的な細胞死プロテアーゼです。アポトーシス中のカスパーゼの役割は非常に明確に定義されており、カスパーゼの多くのアポトーシスタンパク質分解基質が同定および特徴付けられていますが、非アポトーシスプロセスに対するカスパーゼの役割は十分に理解されていません。特に、カスパーゼの非アポトーシス基質はこれまでにほとんど同定されていない。ここでは、潜在的なカスパーゼ基質の同定および特徴付けを容易にするために、 インビトロでの カスパーゼ切断アッセイにおける候補基質の試験を可能にするプロトコルが記載されている。このプロトコルには、組換えカスパーゼタンパク質の生産と精製、組換えまたは無細胞発現系での候補基質の生産、および実際の in vitro 切断反応とそれに続くSDS-PAGEおよびイムノブロッティングが含まれます。このプロトコルは、 ショウジョウバエ のカスパーゼDroncとDriceに合わせて調整されていますが、哺乳類を含む他の生物のカスパーゼにも簡単に適応できます。

Introduction

プログラムされた細胞死またはアポトーシスは、カスパーゼと呼ばれる高度に特殊化された細胞死プロテアーゼのクラスによって実行されます(参考文献1でレビュー)。カスパーゼは、触媒部位にCys残基を含むCysプロテアーゼです。彼らはコンセンサス切断部位を定義し、Asp残基の後にタンパク質分解的に基質を切断します(ただし、ショウジョウバエカスパーゼDroncはGlu残基の後に切断することも報告されています2)。それらは、イニシエーター(頂端または上流としても知られている)およびエフェクター(実行者または下流)カスパーゼに細分される。イニシエータカスパーゼはエフェクターカスパーゼを活性化します。例えば、哺乳動物において、開始剤カスパーゼカスパーゼ−9は、エフェクターカスパーゼカスパーゼカスパーゼ−33を切断および活性化する。同様に、ショウジョウバエメラノガスターでは、カスパーゼ-9-オルソログドロンクがカスパーゼ-3-オルソログDrice 2,4を切断して活性化します。アポトーシスの間、エフェクターカスパーゼは何百もの基質を切断し、細胞の死をもたらす5。

カスパーゼは、細胞内で不活性なプロ酵素(チモーゲン)として合成されます。この形態では、N末端プロドメイン、プロ酵素の中央部に触媒Cysを持つ大きなサブユニット、C末端1に小さなサブユニットが含まれています(図1)。活性化のメカニズムは、開始剤カスパーゼとエフェクターカスパーゼで異なります。開始剤カスパーゼ(カスパーゼ-9、Dronc)は、活性化のために二量体化を必要とし、これはアポトソーム6と呼ばれる大きなタンパク質複合体への取り込みによって起こる。アポトソームへの組み込みのために、カスパーゼ-9とDroncはN末端プロドメインにカスパーゼ活性化および動員ドメイン(CARD)を持っています(図1)。アポトソーム成分Apaf-1にもCARDが含まれており、CARD/CARD相互作用を介してカスパーゼ-9またはDroncをアポトソーム3,6,7にリクルートします。カスパーゼ-9およびDroncはアポトソーム内でタンパク質分解的にプロセシングすることができるが、このプロセシングは酵素活性に完全には必要ではない8,9。

対照的に、エフェクターカスパーゼ(カスパーゼ-3、Drice)は、そのプロドメインにCARDを持たず、活性化のために大きなタンパク質複合体に組み込まれません1。それらは、それぞれ活性カスパーゼ-9またはDronc1によるタンパク質分解切断に依存しています。活性エフェクターカスパーゼは、2つの大きなサブユニットと2つの小さなサブユニットで構成される四量体を形成し、2つの触媒部位を含みます(図1)。このプロトコルにとって重要なことは、大腸菌におけるカスパーゼの組換え発現は、Apaf-1の非存在下であっても、Drice 10およびDronc 2,8,9,11,12を含むカスパーゼの自動処理および活性化を引き起こす。この自動処理により、組換えカスパーゼタンパク質を用いた候補基質のin vitro切断アッセイを行うことができます。

カスパーゼはアポトーシスに関与するだけでなく、増殖、分化、細胞移動、神経細胞の剪定、自然免疫など、多くの非アポトーシス機能を持つこともできます13,14,15。現在、非アポトーシスプロセス中に活性カスパーゼを含むにもかかわらず、細胞がどのように生き残ることができるかは不明です。これらの細胞は、致死レベル16でのみカスパーゼを活性化するか、または原形質膜17,18などの細胞の非アポトーシス区画に活性カスパーゼを隔離する可能性があります。したがって、非アポトーシス基質の同定と検証は、カスパーゼが非アポトーシスプロセスをどのように媒介するかを明らかにするだけでなく、活性カスパーゼの存在下で細胞がどのように生き残ることができるかを理解するのにも役立ちます。

カスパーゼ基質としての候補タンパク質は、遺伝的および生化学的方法を用いて同定することができる。同定されたタンパク質は、コンセンサスDronc切断部位の存在について確認することができる。これは、タンパク質配列を視覚的に検査するか、CasCleave(https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/)19,20などのより洗練されたオンラインバイオインフォマティクスツールを使用することによって行うことができます。これらのツールは、カスパーゼの既知のコンセンサス切断部位と構造的考慮事項を使用して、カスパーゼの新しい標的を予測します。CasCleaveには、ヒトCaspases-1、-3、-6、-7、および-8からの検証済み基質の情報が組み込まれていますが、これらのカスパーゼとそのコンセンサス切断部位は十分に保存されているため、ここで説明する目的にも役立つ可能性があります。しかし、Dronc切断部位は明確に定義されていないため(2件の研究では、TATD/E 2とLALD9の2つの異なる最適な切断部位が特定された)、候補基質は、Driceを含む他のカスパーゼ切断部位の存在についても調べられている。

カスパーゼの予測基質を検証するには、追加のアッセイが必要です。これらのアッセイの1つは、所与のカスパーゼが実際にin vitroで候補タンパク質を切断できることの実証である。ここでは、 in vitro カスパーゼ切断アッセイのための便利なプロトコルを提供します。このプロトコルを使用して、候補基質はカスパーゼとしてDroncでテストされます。また、Driceの基板としてテストすることもできます。このプロトコルは ショウジョウバエ のカスパーゼDroncとDrice用に書かれていますが、他の生物のカスパーゼにも適応できます。

DroncおよびDriceの抽出および精製は、in vitro切断アッセイとともに、これらのカスパーゼによる触媒活性が失われるため、同じ日に実行する必要があります。このプロトコルは、以前の出版物8、9、11、12、21、22から変更および最適化されています。このプロトコルでは、4つの異なるカスパーゼタンパク質が大腸菌株BL21(DE3)pLysSで組換え発現されます。これらのタンパク質は、6xHis-Dronc wt、6xHis-Dronc C318A、6xHis-Dricewt、および6xHis-DriceC211Aです。これらの各タンパク質は、精製のためにN末端に6つのヒスチジン残基(6xHis)でタグ付けされています。Dronc wtおよびDricewtは野生型タンパク質であり、組換え発現時に活性カスパーゼに自動処理することができる。DroncC318AおよびDriceC211Aは、触媒Cys残基をAla残基に変更するDroncおよびDriceの変異型をコードする。これらのコンストラクトは触媒的に不活性であり、自動処理できません (図2Aを参照)。それらは切断アッセイのコントロールとして使用されます。DriceC211Aは自動処理できないため、ここで説明するin vitro切断アッセイにおけるDroncwtのモデル基質としても使用されます。

Protocol

1. 細菌における組換えカスパーゼ発現

  1. 標準プロトコル23を使用して、目的の遺伝子(カスパーゼまたは推定基質)をN末端および/またはC末端タグを持つ細菌発現ベクターにクローニングします。
    注:タグは組換えタンパク質の溶解度を高めることができ、組換えタンパク質の精製に使用されます。ここで、Dronc、Drice、およびそれらの触媒変異体はベクターpET28aにクローニングされ、N末端6xHisタグ(pET28a-6xHis-Dronc wt、pET28a-6xHis-Dronc C318A、pET28a-6xHis-Dricewt、pET28a-6xHis-Drice C211A)を提供する。(プライマー情報については、補足表1を参照してください)。
  2. 標準的な手順23,24を用いて、目的の遺伝子を有するベクターをコンピテントBL21(DE3)pLysS 大腸菌細胞に形質転換する。形質転換混合物を適切な抗生物質(pET28aの場合はカナマイシン)を含むLB寒天プレートにプレートして、形質転換細菌を選択します。(別表2参照)
  3. プレートからコロニーを選び、適切な抗生物質を含む5 mLのLB培地に接種して、振とうプラットフォーム上で37°C、220 rpmで一晩増殖させます。
  4. 翌日、抗生物質を含むLB培地30〜50 mL(サンプルあたり)を調製し、一晩培養した培養液1 mLを追加します。バイオフォトメーター/分光光度計を使用した600nm(OD600)での光学密度は、0.1〜0.2である必要があります。
  5. OD600 が0.6に達するまで、振とうプラットフォーム上で37°C、220rpmで培養物を成長させます。OD600 が0.6に達するまで、毎時ODを確認します。これには約2〜3時間かかります。
  6. タンパク質(カスパーゼ)の発現を誘導するには、IPTGを最終濃度0.1〜0.2 mMまで添加します(IPTGストックから1:1,000〜1:500に希釈、 補足表2を参照)。
  7. 培養物を30°C、220rpmで3時間培養します。
    注:時間と温度は、発現しているタンパク質の種類とその溶解度によって異なります。異なるカスパーゼまたは基質が発現する場合は、これらの条件を調整する必要があります。
  8. 3時間後、培養液を50 mL遠沈管で2,000 x g、4°Cで20分間スピンダウンします。上清を捨ててペレットを進めます。
    メモ: プロトコルはこの時点で停止し、後で続行できます。細菌ペレットは-80°Cで凍結することができる。

2.小規模組換えカスパーゼ抽出

  1. ペレット培養物を含む凍結チューブを-80°Cの保存から取り出し、氷上で10分間保持してペレットを柔らかくします。
  2. 10分後、1 mLの血清学的ピペットを備えたピペットコントローラーを使用して、新たに添加したプロテアーゼ阻害剤、10 mg/mLのリゾチームおよび50 U/mLのベンゾナーゼを添加した0.6 mLの細菌細胞溶解バッファー(補足表2)をペレット含有チューブに加えます。
  3. 同じピペットチップで、ペレット粒子のない透明な淡黄色の溶液が見えるまで上下にピペッティングしてペレットを溶解します。氷上で30分間インキュベートします。
  4. ライセートを適切な遠心チューブに移し、ライセートを17,000 x g で4°Cで40分間遠心分離します。
  5. 上清を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。これはカスパーゼを含む粗抽出物です。
  6. チューブを氷上に保ち、Ni-NTAアガロースで精製を進めます。

3. 小規模Hisタグカスパーゼ精製

  1. Ni-NTAアガロースの50%スラリーを、ステップ2.5からのカスパーゼ抽出物の各チューブに0.2 mL加えます。エンドオンエンドローテーター上でチューブを4°Cで1時間回転させます。
  2. 1時間後、Ni-NTAアガロースを含む抽出物を、先端をそのままにして1 mLのポリプロピレンカラムに加え、ラックに入れます。5分間放置します。
  3. 5分後、カラムのキャップを外し、上澄み液を重力流で流出させます。
  4. Ni-NTAアガロースの充填樹脂を乱さずに1 mLの洗浄バッファー(補足表2)をカラムに注意深く加え、重力流で洗浄します。
  5. 洗浄ステップを3回実行します。
  6. カスパーゼを溶出するには、洗浄バッファーを完全に排出した後、1.5 mLの微量遠心チューブをカラムの収集ノズルの下に置きます。
  7. 0.5 mLの溶出バッファー(使用直前に1xプロテアーゼ阻害剤を補充)を各カラムに加え、1.5 mLの微量遠心チューブに溶出液を回収します。
    注:細かく精製された溶出液は透明になります。
  8. 溶出液を氷上に保ち、Bradfordアッセイ25によってタンパク質の濃度を測定します。精製されたカスパーゼの純度/均質性をSDS-PAGEとそれに続くクーマシーブルー染色26で確認する。
    注:50 mL LB培養の収量は、0.5〜1.5 mgのカスパーゼタンパク質の範囲です。溶出には0.5 mLの溶出バッファーを使用すると、濃度は1〜3 mg/mLの範囲になります。精製されたカスパーゼ溶出物は、溶解および精製の同じ日に in vitro 切断アッセイに使用することが重要です。

4. 無細胞発現系における推定カスパーゼ基質の発現

注:このプロトコルでは、Droncの天然基質であるDriceは、 大腸菌 での組換え発現(上記のセクション3を参照)と、哺乳類の無細胞発現システムであるウサギ網状赤血球ライセート(RRL)での発現の両方によって調製されます(このセクション、以下を参照)。

  1. 標準的な手順23を用いて、推定基質の遺伝子をT7、T3、またはSP6プロモーターのいずれかを含む発現ベクターにクローニングする。
    注:このプロトコルでは、DriceC211A がモデル基質として使用されており、遺伝子発現用のT7プロモーターを搭載し、イムノブロッティングによる検出のために推定タンパク質基質にN末端Mycタグでタグ付けするベクターpT7CFE1-N-Mycにクローニングされました。
  2. RRLでは、候補基質は放射性または非放射性のいずれかで合成することができる。
    1. 非放射性合成:0.5 mLの微量遠心チューブに、25 μLのRRL、2 μLの反応バッファー、0.5 μLのアミノ酸混合物-マイナスロイシン(1 mM)、0.5 μLのアミノ酸混合物-マイナスメチオニン(1 mM)、1 μLのリボヌクレアーゼ阻害剤(40 U/μL)、2 μLのDNAテンプレート(0.5 μg/μL)、および1 μLのT7-RNAポリメラーゼを追加します。ヌクレアーゼフリーの水を加えて、反応の最終容量を50 μLに調整します。 ピペットチップでピペッティングまたは攪拌して成分を穏やかに混合し、短時間スピンダウンします。
      注:RRLライセートには、100〜200 mg / mLの内因性タンパク質が含まれています。 インビトロ 翻訳反応の場合は、RRLを50%濃度で添加します(ここでは25 μL/50 μL反応)。
    2. 放射性合成:0.5 mLの微量遠心チューブに、25 μLのRRLライセート、2 μLの反応バッファー、0.5 μLのアミノ酸混合物マイナスメチオニン(1 mM)、1 μLのリボヌクレアーゼ阻害剤(40 U/μL)、2 μLのDNAテンプレート(0.5 μg/μL)、2 μLのS35標識メチオニン(10 mCi/mLで1000 Ci/mmol)、および1 μLのT7-RNAポリメラーゼを加えます。ヌクレアーゼフリーの水を加えて、反応の最終容量を50 μLに調整します。 ピペットチップでピペッティングまたは攪拌して成分を穏やかに混合し、短時間スピンダウンします。チップとチューブは放射性廃棄物容器に廃棄してください。
      注意: ロイシンなしでアミノ酸混合物を追加しないでください。pT7CFE1ベクターは、タンパク質発現にT7プロモーターを使用します。他のベクターはT3またはSP6プロモーターを使用する。その場合、T7 RNAポリメラーゼの代わりにT3またはSP6 RNAポリメラーゼを使用する必要があります。DNAテンプレートが高純度であることを確認してください。
  3. 反応液を30°Cで90分間インキュベートします。
  4. 10秒間短時間回転させ、チューブを氷の上に置きます。RRL中の推定基質の発現レベルをSDS-PAGEおよびイムノブロッティング/オートラジオグラフィーで確認してください。
    注:切断反応に添加されるRRL抽出物の量は、検出方法(イムノブロッティングまたはS35 オートラジオグラフィーのいずれか)で検出できるタンパク質の量に基づいている必要があります。 in vitro 切断アッセイ(次のセクション)に進むか、-80°Cで保存してください。

5. RRLで生成された基質を用いた in vitro 切断アッセイ

  1. セクション4で説明されているように、生成された推定基板を取ります。このプロトコルでは、N-Myc-DriceC211A がモデル基板として使用されます。
  2. 推定基質の発現レベルに応じて(イムノブロットまたはオートラジオグラフィー分析によって個別に決定される、ステップ4.4を参照)、切断アッセイにおいて目的のタンパク質でプログラムされた1〜10μLのRRLを使用する。
  3. セクション1、2、および3で生成された精製カスパーゼタンパク質を10μg追加します。
  4. カスパーゼアッセイバッファーで総反応量を50 μLにします。
  5. 反応物を30°Cの水浴中で3時間インキュベートします。切断アッセイに適切なコントロールを含めるようにしてください。ここでは、触媒変異体DroncC318A を対照として用いる。
  6. 3時間後、チューブを氷上に移して反応を停止します。
  7. 50 mM DTTを含むLDSサンプルバッファーを1容量加えます。LDSサンプルバッファーを添加して反応を完全に停止させます。
  8. サンプルを75°Cのヒートブロックで10分間インキュベートします。
  9. 素早くスピンし、フリックして混合し、サンプルあたり24 μLをロードし、SDS-PAGE(セクション7を参照)を実行するか、サンプルを-20°Cで保存します。

6.細菌発現組換え基質タンパク質を用いた in vitro 切断アッセイ

  1. 10 μgの精製候補基質(ここではセクション1、2、および3で生成した6xHis-DriceC211A)を0.5 mLマイクロ遠心チューブに追加します。
  2. セクション1および2で生成された精製カスパーゼタンパク質を10μg添加します。カスパーゼアッセイバッファーを使用して、総容量を50 μLにします。
  3. 手順 5.5 から 5.9 に従います。

7. SDS-PAGEとイムノブロッティング

  1. 切断反応(24 μL)を4%-12%トリス-グリシンまたはビス-トリスグラジエントゲル(材料表)にロードし、タンパク質電気泳動およびイムノブロッティング(またはS35標識基質を使用する場合はオートラジオグラフィー)を実行して、標準的な手順27,28を使用して結果を視覚化します。
    注:ここでは、このプロトコルでは、MopsランニングバッファーとLDSローディングバッファーを含むBis-Trisグラジエントゲルを使用しました。一般に、トリス-グリシンゲルの一般的に使用されるPAGEプロトコルは、トリス-グリシン-SDSランニングバッファーとSDSローディングバッファーを使用して実行されます。

Representative Results

このプロトコルは、大腸菌におけるカスパーゼタンパク質誘導、組換えショウジョウバエカスパーゼDroncおよびDriceの精製、候補基質の合成、および候補基質(ここではDriceC211A)およびカスパーゼDroncとのin vitro切断反応のための段階的な指示を提供します。触媒変異体Drice C211Aは、自動処理活性を持たず(図2A)、Droncwtによって切断されるまで全長のままであるため、このアッセイのモデル基質として使用されました。DriceC211Aは、Droncwt製剤が酵素活性を有することを検証するためのポジティブコントロールとして常に使用する必要があります。

図2Aは、組換えカスパーゼの発現および精製の代表例を提供する。4つの異なる組換えカスパーゼが誘導および精製されました:6xHis-Droncwt、6xHis-DroncC318A、6xHis-Dricewt、および6xHis-Drice C211A。精製したカスパーゼをSDS-PAGEで実行し、イムノブロットし、抗His抗体(希釈1:5,000、続いて抗マウスIgG、HRP結合抗体(1:10,000))でブロットを調べました。未処理の6xHis-Dronc(proDronc)は55 kDaの相対分子量(MW r)で動作し(レーン2)、未処理の6xHis-Drice(proDrice)のMWrは35 kDa(レーン4)です。カスパーゼの自動処理は、N末端にHisタグが存在するためにカスパーゼの大きなサブユニットを表す小さなMWrのバンドの出現によって見ることができます(図1)。6x-Droncの場合、大きなサブユニットのMWrは40 kDa(レーン1)です。6x-Driceの大きなサブユニットは23 kDa(レーン3)で動作します。触媒変異体6xHis-DroncC318Aおよび6xHis-DriceC211Aは自動処理に失敗し、完全長タンパク質としてのみ検出可能です(レーン2および4)。

図 2B細菌で産生および精製された6xHis−Droncwt調製物が酵素活性を有することを実証するために、このプロトコルに記載されるようなインビトロ切断アッセイを実施した。陰性対照として、触媒変異体6xHis-DroncC318Aを用いた。基板はRRLで生成されたN-Myc-DriceC211Aであり、N末端にMycタグがタグ付けされている。インビトロ切断反応後、タンパク質をSDS-PAGEで分離し、イムノブロットし、抗Myc抗体(1:1,000に希釈)とブロットをインキュベートし、続いて抗マウスIgG、HRP結合抗体(1:10,000))でインキュベートしてN-Myc-DriceC211Aを検出しました。カスパーゼの切断の成功、したがって酵素活性は、全長の未処理の基質と比較して、より小さいMWrの少なくとも1つのバンドの出現によって実証することができる。未処理の全長N-Myc-Drice C211AのMWrは40 kDa(レーン2および4)ですが、処理済みのN-Myc-DriceC211Aの大きなサブユニットは30 kDa(レーン3)で動作します。レーン1は、プログラムされていないRRLライセート(プラスミド/転写産物は追加されていない)を表します。レーン2は、RRL発現によるDriceC211Aのインビトロ産生を実証する。レーン3は、6xHis-Droncwtによるインビトロ切断反応を含む。レーン4には、6xHis-DroncC318Aとのインビトロ切断反応が含まれています。

図 2Cこのプロトコルに従って、組換えおよび精製カスパーゼ(6xHis-Droncwtおよび6x-His-DroncC318A)および基質(6xHis-DriceC211A)の両方を使用するin vitro切断反応を、SDS-PAGEおよびイムノブロットによって分析した。切断反応の分析には、抗切断Drice抗体(1:5,000に希釈、続いて抗ウサギIgG、HRP結合抗体(1:10,000))をこのイムノブロットに使用しました。抗切断されたDrice抗体は、6xHis-DriceC211Aの大きなサブユニット(23 kDa)でそのネオエピトープを検出します 6xHis-Droncwt(レーン1)による処理後。触媒変異体6xHis-DronC318Aは、このアッセイでは6xHis-Drice C211Aを処理できず、全長6xHis-DriceC211Aは35 kDaのかすかな未処理バンドとして現れます(レーン2)。

Figure 1
図1:イニシエータカスパーゼカスパーゼ-9およびドロンクおよびエフェクターカスパーゼ-3およびドライスのドメイン構造。 カード - カスパーゼ活性化および募集ドメイン。Cys - 触媒システイン残基の相対位置;L - 大きなサブユニット。S - 小さなサブユニット。N末端プロドメインの位置が示される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:代表的な結果。 (A)抗His抗体でプローブした精製組換え6xHis-Droncおよび6xHis-Drice調製物のイムノブロット分析。未処理(プロドロンクとプロドリス)と切断された6xHis-Droncと6xHis-Driceは矢印で示されます。MWマーカーは左側に示されています。(B)抗Myc抗体でプローブしたカスパーゼ6xHis-Droncwt(レーン3)または6x-His-DroncC318A(レーン4)を使用したRRL生成N-Myc-Driceのin vitro切断反応のイムノブロット分析。プログラムされていない(N-Myc-DriceC211A)RRL反応は、レーン1と2でロードされ、分離されます。未処理(プロドリス)および切断されたN-Myc-Driceは矢印で示されています。MWマーカーは左側に示されています。(C)細菌で発現および精製された組換え6xHis-Drice C211Aとカスパーゼ6xHis-Droncwt(レーン1)または6x-His-DroncC318A(レーン2)のin vitro切断反応のイムノブロット分析、抗切断Drice抗体でプローブ。全長(proDrice)および切断された6xHis-DriceC211Aは矢印で示されています。MWマーカーは左側に示されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

附則表1 この表には、pET28aベクターのクローニングに使用されるプライマーが含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

附則表2 この表には、バッファーとメディアの構成が含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

カスパーゼとカスパーゼ機能に関する私たちの知識の大部分は、過去30年間のアポトーシスにおける激しい研究から得られています。イニシエーターカスパーゼがエフェクターカスパーゼをタンパク質分解的に処理することは非常によく確立されており、アポトーシス中に数百のタンパク質がエフェクターカスパーゼ基質として同定されています5,29。対照的に、非アポトーシスプロセスに対するカスパーゼの機能およびそれらが処理している非アポトーシス基質についてはほとんど知られていない。イニシエーターカスパーゼがここで重要な意思決定者であると考えられます。アポトーシスの間、それらはエフェクターカスパーゼを活性化し、細胞死を引き起こします。しかしながら、非アポトーシスプロセスを誘発するために、それらは非アポトーシスプロセスを制御する異なるタンパク質(エフェクターカスパーゼ以外)を活性化し得る。このプロトコルは、ショウジョウバエ17,30の開始カスパーゼDroncの基質として候補タンパク質をテストします。

切断アッセイにおいて試験される基質は、RRLなどの in vitro 哺乳動物無細胞発現系のいずれかで、または 大腸菌での組換え発現によって産生され得る。細菌発現よりもRRLを用いた インビトロ 発現にはいくつかの利点があります。RRL発現プロトコルはシンプルで高速であり、多くの異なる基質を並行して調製することができます。多くの場合、目的のタンパク質を含むRRL抽出物は、切断アッセイで使用する前に-80°Cで保存できます(ただし、これは基質ごとに個別に決定する必要があります)。推定基質はS35-Metで標識することができ、SDS-PAGE後のオートラジオグラフィーによる分析が容易である。これは、基質特異的抗体が利用できない場合に特に有用である。あるいは、S35−Met標識が望まない場合、推定基質をFlag、HA、またはMycタグなどの一般的なタグでタグ付けすることができ、これにより、イムノブロッティングによるカスパーゼ切断の検出が可能になります。

このプロトコルの成功は、組換えDroncおよびDriceタンパク質の慎重かつ一貫した精製にかかっていることを強く強調する必要があります。残念ながら、これらのタンパク質は、冷蔵庫にも冷凍も、短期間でも保存できません。それらは、保存された形で一晩で酵素活性を失います。したがって、それらは切断アッセイの日に新たに調製される必要がある。試験する候補タンパク質に関係なく、DriceC211Aは、Droncwt製剤の酵素活性を検証するためのポジティブコントロールとして常に使用する必要があります(図2B、Cを参照)。あるいは、DroncおよびDrice調製物の活性は、蛍光発生合成テトラペプチド基質2、9、31のインビトロ切断によっても試験することができる。

抗体が候補基質を検出するために使用される場合、それらはユーザ32、33によって検証される必要がある。これは、Flag、HA、Mycなどのエピトープタグを検出する市販の抗体にも当てはまります。抗体の質が悪いと、重要な結果が不明瞭になる可能性があります。異なるタグを持つN末端とC末端の両方で候補基質を二重エピトープタグ付けすることも推奨されます34。切断が発生した場合、二重タグ付けは両方の切断産物を追跡するのに役立ち、切断が1つ以上の部位で発生したかどうかを解明するのに役立つ可能性があります。

このプロトコルは、Droncの既知の生物学的基質であるDriceを簡単に検証できますが、制限もあります。1つの制限は、これが組換えタンパク質を用いた in vitro プロトコルであることである。これらのアッセイでは、カスパーゼは非生理学的に高濃度で存在し、これは大腸菌で自発的に自動処理できることの観察から明らかである 。 自発的な自動処理は、通常、生理学的条件下では発生しません。この高いカスパーゼ濃度は、偽陽性をもたらす偽活性を引き起こす可能性があります。偽陽性は、 in vitro 切断反応におけるカスパーゼ濃度を下げることによって排除することができる。さらに、以下でより詳細に概説するように、本物の基質を確認し、偽陽性を排除するために追加のアッセイが必要です。

組換えカスパーゼは、in vivoの通常の細胞環境におけるものと同じ特異性を有しない可能性がある。例えば、カスパーゼの活性は、翻訳後修飾によって修飾することができる。これらは組換えタンパク質には存在しません。さらに、生体内では、Droncをはじめとする開始剤カスパーゼがアポトソームなどの大きなタンパク質複合体に組み込まれる。このプロトコルの条件下では、アポトソームの形成は達成されない。それにはショウジョウバエApaf-1(別名ダークまたはHac-1)35-37の組換え発現が必要であり、独自の課題があります。したがって、インビトロでは、Droncはインビボで持っているのと同じ特異性を持たない可能性があります。

また、Droncは非アポトーシスプロセスのために異なるタンパク質複合体に組み込まれることも考えられる。これは、Droncに異なる切断特異性を与える可能性があり、これはDroncが非アポトーシス条件下でアポトーシスを誘導しない理由も説明できる可能性があります。これに関連して、CasCleaveは既知の切断コンセンサス部位を使用して、新しいカスパーゼ基質を予測する。しかし、同じ切断コンセンサス部位が非アポトーシスプロセスにも使用されるかどうかは不明です。実際、最近、カスパーゼ-3は、ニワトリ胚の発達中の聴覚脳幹における非アポトーシスプロセス中にその好ましいコンセンサス部位を変化させることが示された38。同様に、開始カスパーゼが異なるタンパク質複合体に組み込まれている場合、それらは異なる特異性を有する可能性があり、したがって異なるコンセンサス配列で切断され得る。

これらの制限は、このプロトコルに記載されるインビトロ切断アッセイのみに依存するだけでは十分ではないことを示しています。このプロトコルを使用して得られた結果をさらに検証するために、代替アプローチを採用する必要があります。理想的には、in vivoアッセイを使用して、以下の質問に対処する必要があります:候補タンパク質はin vivoでの非アポトーシスプロセス中にタンパク質分解的に処理されていますか?もしそうなら、同じ切断部位がインビボとインビトロで使用されますか?切断部位の突然変異誘発によって切断がブロックされた場合の結果は何ですか?候補基質の処理はカスパーゼに依存していますか、もしそうなら、どれですか?非アポトーシスプロセスに対する切断断片の役割は何ですか?これらの問題は、標準的な遺伝学的およびトランスジェニック法を用いて、C.エレガンスやショウジョウバエなどの遺伝子モデル生物で容易に対処することができる。

要約すると、このプロトコルは、酵素的に活性なカスパーゼ、特に ショウジョウバエ カスパーゼDroncおよびDriceを生成するための信頼性の高い一貫した方法を説明しています。このプロトコルの最終的な目標は、Droncが遺伝学的、生化学的、またはバイオインフォマティクスのアプローチによって同定された候補基質を in vitroで切断できるかどうかを調べることです。前の段落で説明したように、これらのタンパク質を in vivoでカスパーゼ基質として検証するには、追加のアッセイが必要です。後生動物全体のカスパーゼ遺伝子の保存の程度を考えると、このプロトコルを他の生物からのカスパーゼにも適応させることができるはずです。

Disclosures

著者は競合する利益を宣言しません。

Acknowledgments

エリフ・カンバー・カヤ博士がラボでプロトコルを確立するのに協力してくれたことに感謝します。ガイ・サルヴェセン博士は、DriceC211A 変異体9を親切に提供してくれました。この研究は、国立衛生研究所(NIH)の国立総合医学研究所(NIGMS)からの助成金番号2R35GM118330のMIRA賞によって資金提供されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備において何の役割も果たしていませんでした。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin Fisher BP1760-25
Anti-His antibody Sigma-Aldrich MA1-21315
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell signaling 7076P2
Anti-Myc antibody Santa Cruz Biotechnology sc-40
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell signaling 7074P2
Benchtop Centrifuge Eppendorf 5415 R
Benzonase Sigma-Aldrich E1014-5KU
BioPhotometer Eppendorf #6131
BL21 (DE3) pLysS Competent Cells Promega L1195
Centrifuge rotor Beckman Coulter JA-25.50
CHAPS  Sigma-Aldrich C3023-1G
ChemiDoc with image software Bio-Rad Universal Hood II For Chemiluminiscence imaging
Chemiluminiscence Substrate Thermofisher Scientific 34095 For Chemiluminiscence imaging
Cleaved Drosophila ICE (drICE) (Asp230) Antibody Cell Signaling Technology 9478S
Disposable cuvettes Fisher Scientific 14955128 Used to measure bacterial growth and protein concentration
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad #1610610
Erlenmeyer flasks, 1000 mL Millipore sigma CLS49801L For LB agar media preparation and autoclaving
Erlenmeyer flasks, 250 mL Millipore sigma CLS4980250 For bacterial culture growth and induction.
Ethylene-diamine-tetra-acetic Acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Gel extraction kit Qiagen 28704
Gel tank SDS-PAGE system Thermofisher Scientific STM1001
Glycine Sigma-Aldrich G8898
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) Thermofisher scientific 87786
HEPES Sigma-Aldrich H3375
His-Drice-pET28a  This study N/A Available from authors
His-DriceC211A-pET28a  This study N/A Available from authors
His-Dronc-pET28a  This study N/A Available from authors
His-DroncC318A-pET28a  This study N/A Available from authors
Imidazole Sigma-Aldrich I2399-100G
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermofisher Scientific FERR0392
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5
LB Agar, Miller (Powder) Fisher Scientific BP1425-500
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426-500
Lysozyme Thermofisher Scientific 90082
Microbiological plate incubator Fisher Scientific 11-690-650D For colony growth after transformation
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL Eppendorf 22363611
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 22363204
Midiprep kit Qiagen 12243
Mini tube rotator Fisher Scientific 05-450-127 for mixing bacterial lysates and Ni-NTA agarose
Miniprep kit Qiagen 27106
Motorized Pipette Controller Gilson F110120 For using serological pipettes
NaH2PO4 Fisher Scientific BP330-1
Ni-NTA Agarose Qiagen 30210
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Midi Protein Gel, 20-well Thermofisher Scientific WG1402BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Thermofisher Scientific NP0007
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) Thermofisher Scientific NP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20x) Invitrogen NP00061
Orbital shaking incubator with temperature control New Brunswick Scientific C25 incubator shaker
Petridish 100 mm x 15 mm Fisher Scientific FB0875712
Plating beads Zymo research S1001 For spreading culture on AmpR/KanR plates
Polypropylene Columns (1 mL) Qiagen 34924 For purification of His-tagged proteins
Precision Plus Protein Standards Bio-Rad #161-0374
Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad #5000006
pT7CFE1-NMyc Thermofisher Scientific 88863 For cloning substrates for RRL expression
PVDF membrane Invitrogen LC2007
14 mL Polypropylene round bottom tubes Fisher Scientific 352029 For growing plasmid cultures
QiaRack Qiagen 19095 For holding polypropylene columns during purification
Refrigerated High speed Centrifuge Beckman Coulter Avanti J-25
rRNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N251A For RRL expression
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium Hydroxide Fisher Scientific BP359-500
Sterile Falcon tubes, 15 mL Fisher Scientific 05-527-90
Sterile Falcon tubes, 50 mL Fisher Scientific 14-959-49A
Sucrose Sigma-Aldrich S70903-250G
1 mL Serological Pipets, Sterile celltreat 229001B For bacterial cell lysis in 50 mL tubes
TnT Coupled Reticulocyte Lysate -T7 Promega L4611
Tris-base Fisher Scientific BP154-1
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Waterbath Fisher Scientific 2340
Western wet transferring cassette Thermofisher Scientific STM2001

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References

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<em>インビトロ</em> 基質スクリーニングのための精製組換え <em>ショウジョウバエ</em> カスパーゼを用いた切断アッセイ
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Yarikipati, P., Bergmann, A. In… More

Yarikipati, P., Bergmann, A. In Vitro Cleavage Assays using Purified Recombinant Drosophila Caspases for Substrate Screening. J. Vis. Exp. (188), e64392, doi:10.3791/64392 (2022).

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