Her presenterer vi en protokoll for å uttrykke og rense rekombinante Drosophila caspases Dronc og Drice, og deres bruk i in vitro cleavage assays.
Caspases er svært spesifikke celledødsproteaser som er involvert i apoptotiske og ikke-apoptotiske prosesser. Mens rollen som caspases under apoptose har vært svært godt definert og mange apoptotiske proteolytiske substrater av caspases har blitt identifisert og karakterisert, er rollen som caspases for ikke-apoptotiske prosesser ikke godt forstått. Spesielt har få ikke-apoptotiske substrater av caspases blitt identifisert så langt. Her, for å lette identifisering og karakterisering av potensielle caspase substrater, beskrives en protokoll som tillater testing av kandidatsubstrater i caspase cleavage assays in vitro . Denne protokollen inkluderer produksjon og rensing av rekombinante kaspaseproteiner, produksjon av kandidatsubstratene enten rekombinant eller i et cellefritt ekspresjonssystem, og den faktiske in vitro-spaltningsreaksjonen etterfulgt av SDS-PAGE og immunoblotting. Denne protokollen er skreddersydd for Drosophila caspases Dronc og Drice, men kan enkelt tilpasses for caspases fra andre organismer, inkludert pattedyr.
Programmert celledød eller apoptose utføres av en klasse høyt spesialiserte celledødsproteaser kalt caspases (gjennomgått i referanse1). Caspases er Cys proteaser som inneholder en Cys rest i det katalytiske stedet. De har definert konsensus spaltningssteder og spaltesubstrater proteolytisk etter Asp-rester (selv om Drosophila caspase Dronc også er rapportert å spalte etter glurester2). De er delt inn i initiator (også kjent som apikal eller oppstrøms) og effektor (bøddel eller nedstrøms) caspases. Initiator caspases aktivere effektor caspases. For eksempel, hos pattedyr, klipper initiativtakeren Caspase-9 og aktiverer effektoren caspase Caspase-33. På samme måte, i Drosophila melanogaster, klipper caspase-9-ortholog Dronc og aktiverer caspase-3-ortholog Drice 2,4. Under apoptose spalter effektorkaspaser hundrevis av substrater som fører til cellens død5.
Caspases syntetiseres som inaktive proenzymer (zymogener) i cellen. I denne formen inneholder de et N-terminalt prodomain, en stor underenhet med katalytisk Cys i den sentrale delen av proenzymet, og en liten underenhet ved C-enden 1 (figur 1). Aktiveringsmekanismen er forskjellig mellom initiator- og effektorkaspaser. Initiator caspases (Caspase-9, Dronc) krever dimerisering for aktivering, som oppstår ved inkorporering i et stort proteinkompleks, kalt apoptosomet6. For inkorporering i apoptosomet har Caspase-9 og Dronc et caspase aktiverings- og rekrutteringsdomene (CARD) i det N-terminale prodomenet (figur 1). Apoptosomkomponenten Apaf-1 inneholder også et CARD og rekrutterer Caspase-9 eller Dronc via CARD/CARD-interaksjon til apoptosomet 3,6,7. Mens Caspase-9 og Dronc kan behandles proteolytisk i apoptosomet, er denne behandlingen ikke fullt ut nødvendig for enzymatisk aktivitet 8,9.
I motsetning til dette bærer effektor-caspaser (Caspase-3, Drice) ikke et kort i sine prodomener og er ikke innlemmet i store proteinkomplekser for aktivering1. De er avhengige av proteolytisk spaltning av henholdsvis aktiv Caspase-9 eller Dronc1. Den aktive effektoren caspase danner en tetramer sammensatt av to store og to små underenheter, og inneholder dermed to katalytiske steder (figur 1). Viktig for denne protokollen forårsaker rekombinant ekspresjon av caspases i E. coli automatisk behandling og aktivering av caspases, inkludert Drice 10 og Dronc 2,8,9,11,12, selv i fravær av Apaf-1. Denne automatiske behandlingen gjør det mulig å utføre in vitro spaltningsanalyser av kandidatsubstrater med rekombinant caspaseprotein.
Caspases er ikke bare involvert i apoptose, men de kan også ha mange ikke-apoptotiske funksjoner, inkludert spredning, differensiering, cellemigrasjon, nevronbeskjæring, medfødt immunitet og andre13,14,15. Det er foreløpig ukjent hvordan celler kan overleve til tross for at de inneholder aktive caspaser under ikke-apoptotiske prosesser. Det er mulig at disse cellene aktiverer caspases bare ved sub-dødelige nivåer16 eller de sekvestrerer aktive caspases i ikke-apoptotiske rom i cellen som plasmamembranen17,18. Derfor vil identifisering og verifisering av ikke-apoptotiske substrater ikke bare avsløre hvordan caspases formidler ikke-apoptotiske prosesser, men kan også bidra til å forstå hvordan celler kan overleve i nærvær av aktive caspases.
Kandidatproteiner som caspasesubstrater kan identifiseres ved hjelp av genetiske og biokjemiske metoder. Identifiserte proteiner kan kontrolleres for tilstedeværelsen av konsensus Dronc-spaltningssteder. Dette kan gjøres ved å visuelt inspisere proteinsekvensen eller bruke mer sofistikerte online bioinformatiske verktøy som CasCleave (https://sunflower.kuicr.kyoto-u.ac.jp/~sjn/Cascleave/) 19,20. Disse verktøyene bruker de kjente konsensusspaltningsstedene til caspases og strukturelle hensyn for å forutsi nye mål for caspases. Mens CasCleave inkorporerer informasjonen om verifiserte substrater fra humane Caspases-1, -3, -6, -7 og -8, kan det likevel også være nyttig for de formål som er beskrevet her, da disse caspasene og deres konsensusspaltningssteder er godt bevart. Men fordi Dronc-spaltningsstedet ikke er godt definert (to studier identifiserte to forskjellige optimale spaltningssteder, TATD / E2 og LALD9), undersøkes kandidatsubstratene også for tilstedeværelse av andre kaspasespaltningssteder, inkludert Drice.
For å validere de forutsagte substratene til caspases, er det nødvendig med ytterligere analyser. En av disse analysene er demonstrasjonen av at en gitt caspase faktisk kan spalte kandidatproteinet in vitro. Her gir vi en praktisk protokoll for in vitro caspase cleavage assays. Ved hjelp av denne protokollen testes kandidatsubstrater med Dronc som caspase. De kan også testes som substrater av Drice. Selv om denne protokollen er skrevet for Drosophila caspases Dronc og Drice, kan den også tilpasses for caspases fra andre organismer.
Ekstraksjonen og rensingen av Dronc og Drice sammen med in vitro-spaltningsanalysen må utføres samme dag på grunn av tap av katalytisk aktivitet av disse caspasene. Denne protokollen er endret og optimalisert fra tidligere publikasjoner 8,9,11,12,21,22. I denne protokollen uttrykkes fire forskjellige caspaseproteiner rekombinant i E. coli-stammen BL21 (DE3) pLysS. Disse proteinene er: 6xHis-Dronc wt, 6xHis-DroncC318A, 6xHis-Dricewt og 6xHis-DriceC211A. Hvert av disse proteinene er merket med 6 histidinrester (6xHis) ved N-terminalen for rensing. Dronc wt og Dricewt er villtypeproteinene og kan automatisk behandle inn i den aktive caspasen ved rekombinant ekspresjon. DroncC318A og DriceC211A koder for mutante former av Dronc og Drice som endrer den katalytiske Cys-resten til en Ala-rest. Disse konstruksjonene er katalytisk inaktive og kan ikke automatisk behandle (se figur 2A). De brukes som kontroller i spaltningsanalysen. Fordi DriceC211A ikke kan behandle automatisk, brukes den også som modellsubstrat for Droncwt i in vitro-spaltningsanalysen beskrevet her.
Hovedtyngden av vår kunnskap om caspases og caspase funksjon har kommet fra intenst arbeid i apoptose i løpet av de siste tre tiårene. Det er meget godt etablert at initiator caspases proteolytisk behandler effektorkaspaser, og hundrevis av proteiner har blitt identifisert som effektorkaspasesubstrater under apoptose 5,29. I motsetning til dette er mye mindre kjent om funksjonen av caspases for ikke-apoptotiske prosesser og hvilke ikke-apoptotiske substrater de behandler. Det kan tenkes at initiativtaker-caspases er sentrale beslutningstakere her. Under apoptose aktiverer de effektorkaspaser som forårsaker celledød. For å utløse ikke-apoptotiske prosesser kan de imidlertid aktivere forskjellige proteiner (annet enn effektorkasser), som styrer den ikke-apoptotiske prosessen. Denne protokollen tester kandidatproteiner som substrater av initiatoren caspase Dronc i Drosophila 17,30.
Substratene som skal testes i spaltningsanalysen kan produseres enten i et in vitro pattedyrcellefritt uttrykkssystem som RRL eller ved rekombinant uttrykk i E. coli. Det er flere fordeler ved in vitro-uttrykk ved bruk av RRL fremfor bakterieuttrykk. RRL-uttrykksprotokollen er enkel og rask, slik at mange forskjellige underlag kan fremstilles parallelt. I mange tilfeller kan RRL-ekstraktet som inneholder proteinet av interesse lagres ved -80 ° C før bruk i spaltningsanalysen (selv om dette må bestemmes separat for hvert substrat). Det antatte substratet kan merkes med S35-Met, noe som gjør det enkelt å analysere ved autoradiografi etter SDS-PAGE. Det er spesielt nyttig hvis det ikke finnes noe substratspesifikt antistoff. Alternativt, hvis S35-Met-merking ikke er ønsket, kan det antatte substratet merkes med vanlige koder som Flag, HA eller Myc-koder, noe som gjør det mulig å oppdage caspase-spaltning ved immunoblotting.
Det må sterkt understrekes at suksessen til denne protokollen avhenger av forsiktig og konsekvent rensing av de rekombinante Dronc- og Drice-proteinene. Dessverre kan disse proteinene ikke lagres – ikke engang kortsiktig – verken i kjøleskapet eller frosset. De mister den enzymatiske aktiviteten over natten i en hvilken som helst lagret form. Derfor må de tilberedes ferskt på dagen for spaltningsanalysen. Uansett hvilke kandidatprotein(er) som testes, bør DriceC211A alltid brukes som en positiv kontroll for å validere den enzymatiske aktiviteten til Droncwt-preparatet (se figur 2B,C). Alternativt kan aktiviteten til Dronc- og Drice-preparatene også testes ved in vitro-spaltning av fluorogene syntetiske tetrapeptidsubstrater 2,9,31.
Hvis antistoffer brukes til å oppdage kandidatsubstratene, må de valideres av brukeren32,33. Det gjelder også kommersielt tilgjengelige antistoffer som oppdager epitopmerker som Flag, HA, Myc eller andre. Dårlig antistoffkvalitet kan skjule viktige resultater. Dobbelt-epitop-merking av kandidatsubstratene på både N- og C-terminalen med forskjellige tagger anbefales også34. Hvis spalting oppstår, bidrar dobbeltmerking til å spore begge spaltningsproduktene og kan bidra til å belyse hvis spalting skjer på ett eller flere steder.
Selv om denne protokollen enkelt validerer det kjente biologiske substratet til Dronc, Drice, er det også begrensninger. En begrensning er at dette er en in vitro-protokoll med rekombinante proteiner. I disse analysene er caspasene tilstede ved en ufysiologisk høy konsentrasjon, noe som fremgår av observasjonen at de spontant kan autoprosessere i E. coli. Den spontane autoprosesseringen skjer vanligvis ikke under de fysiologiske forholdene. Denne høye caspasekonsentrasjonen kan forårsake falsk aktivitet som resulterer i falske positiver. Falske positiver kan elimineres ved å senke caspasekonsentrasjonen i in vitro-spaltningsreaksjonen. Videre, som beskrevet mer detaljert nedenfor, er det nødvendig med ytterligere analyser for å bekrefte ekte substrater og for å eliminere falske positiver.
De rekombinante caspasene har kanskje ikke samme spesifisitet som de har i sitt normale cellulære miljø in vivo. For eksempel kan aktiviteten til caspases modifiseres ved posttranslasjonelle modifikasjoner. Disse er ikke tilstede på de rekombinante proteinene. Videre inkorporeres initiatorkaspaser, inkludert Dronc, in vivo, i store proteinkomplekser som apoptosomet. Under betingelsene i denne protokollen oppnås ikke dannelsen av apoptosomet. Det ville kreve rekombinant uttrykk for Drosophila Apaf-1 (aka Dark eller Hac-1) 35-37 som har egne utfordringer. Derfor, in vitro, kan Dronc ikke ha samme spesifisitet som den har in vivo.
Det kan også tenkes at Dronc er inkorporert i et annet proteinkompleks for ikke-apoptotiske prosesser. Dette kan gi en annen spaltningsspesifisitet til Dronc, noe som også kan forklare hvorfor Dronc ikke induserer apoptose under ikke-apoptotiske forhold. Relatert til dette bruker CasCleave de kjente spaltningskonsensusstedene for å forutsi nye caspasesubstrater. Det er imidlertid ukjent om de samme spaltningskonsensusstedene også brukes til ikke-apoptotiske prosesser. Faktisk ble det nylig vist at Caspase-3 endrer sitt foretrukne konsensussted under en ikke-apoptotisk prosess i den utviklende auditive hjernestammen i kyllingembryoet38. På samme måte, hvis initiator-caspaser inkorporeres i forskjellige proteinkomplekser, kan de ha en annen spesifisitet og kan dermed spalte ved forskjellige konsensussekvenser.
Disse begrensningene illustrerer at det ikke er tilstrekkelig å bare stole på in vitro-spaltningsanalysene som er beskrevet i denne protokollen. Alternative tilnærminger bør benyttes for ytterligere å validere resultatene oppnådd ved hjelp av denne protokollen. Ideelt sett bør in vivo-analyser brukes til å ta opp følgende spørsmål: Behandles kandidatproteinet proteolytisk under den ikke-apoptotiske prosessen in vivo? Hvis ja, er det samme spaltningsstedet brukt in vivo og in vitro? Hva er konsekvensen hvis spaltningen er blokkert av mutagenese av spaltningsstedet? Er behandlingen av kandidatsubstratet avhengig av caspases, og i så fall hvilken? Hva er rollen til spaltningsfragmentene for den ikke-apoptotiske prosessen? Disse spørsmålene kan enkelt løses i de genetiske modellorganismer som C. elegans og Drosophila ved hjelp av standard genetiske og transgene metoder.
Oppsummert beskriver denne protokollen en pålitelig og konsistent metode for å produsere enzymatisk aktive caspases, spesielt Drosophila caspases Dronc og Drice. Det endelige målet med denne protokollen er å undersøke om Dronc kan spalte kandidatsubstrater in vitro, som ble identifisert ved genetiske, biokjemiske eller bioinformatiske tilnærminger. Som forklart i forrige avsnitt, er det nødvendig med ytterligere analyser for å validere disse proteinene som caspase substrater in vivo. Gitt graden av bevaring av caspase gener over metazoa, bør det være mulig å tilpasse denne protokollen til caspases fra andre organismer også.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Elif Kamber-Kaya for hennes hjelp til å etablere protokollen i laboratoriet. Dr. Guy Salvesen ga vennlig DriceC211A mutant9. Dette arbeidet ble finansiert av en MIRA-pris fra National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) fra National Institutes of Health (NIH) under tilskuddsnummer 2R35GM118330. Finansiørene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om publisering eller utarbeiding av manuskriptet.
Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
Anti-His antibody | Sigma-Aldrich | MA1-21315 | |
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7076P2 | |
Anti-Myc antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell signaling | 7074P2 | |
Benchtop Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
BioPhotometer | Eppendorf | #6131 | |
BL21 (DE3) pLysS Competent Cells | Promega | L1195 | |
Centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA-25.50 | |
CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023-1G | |
ChemiDoc with image software | Bio-Rad | Universal Hood II | For Chemiluminiscence imaging |
Chemiluminiscence Substrate | Thermofisher Scientific | 34095 | For Chemiluminiscence imaging |
Cleaved Drosophila ICE (drICE) (Asp230) Antibody | Cell Signaling Technology | 9478S | |
Disposable cuvettes | Fisher Scientific | 14955128 | Used to measure bacterial growth and protein concentration |
Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610610 | |
Erlenmeyer flasks, 1000 mL | Millipore sigma | CLS49801L | For LB agar media preparation and autoclaving |
Erlenmeyer flasks, 250 mL | Millipore sigma | CLS4980250 | For bacterial culture growth and induction. |
Ethylene-diamine-tetra-acetic Acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Gel tank SDS-PAGE system | Thermofisher Scientific | STM1001 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x) | Thermofisher scientific | 87786 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
His-Drice-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
His-DriceC211A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
His-Dronc-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
His-DroncC318A-pET28a | This study | N/A | Available from authors |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-100G | |
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermofisher Scientific | FERR0392 | |
Kanamycin | Fisher Scientific | BP906-5 | |
LB Agar, Miller (Powder) | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
LB Broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
Lysozyme | Thermofisher Scientific | 90082 | |
Microbiological plate incubator | Fisher Scientific | 11-690-650D | For colony growth after transformation |
Microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 22363611 | |
Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
Midiprep kit | Qiagen | 12243 | |
Mini tube rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | for mixing bacterial lysates and Ni-NTA agarose |
Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
Motorized Pipette Controller | Gilson | F110120 | For using serological pipettes |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | BP330-1 | |
Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Midi Protein Gel, 20-well | Thermofisher Scientific | WG1402BOX | |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermofisher Scientific | NP0007 | |
NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20x) | Thermofisher Scientific | NP0001 | |
NuPAGE Transfer Buffer (20x) | Invitrogen | NP00061 | |
Orbital shaking incubator with temperature control | New Brunswick Scientific | C25 incubator shaker | |
Petridish 100 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Plating beads | Zymo research | S1001 | For spreading culture on AmpR/KanR plates |
Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | 34924 | For purification of His-tagged proteins |
Precision Plus Protein Standards | Bio-Rad | #161-0374 | |
Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | #5000006 | |
pT7CFE1-NMyc | Thermofisher Scientific | 88863 | For cloning substrates for RRL expression |
PVDF membrane | Invitrogen | LC2007 | |
14 mL Polypropylene round bottom tubes | Fisher Scientific | 352029 | For growing plasmid cultures |
QiaRack | Qiagen | 19095 | For holding polypropylene columns during purification |
Refrigerated High speed Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-25 | |
rRNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251A | For RRL expression |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | |
Sterile Falcon tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-527-90 | |
Sterile Falcon tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S70903-250G | |
1 mL Serological Pipets, Sterile | celltreat | 229001B | For bacterial cell lysis in 50 mL tubes |
TnT Coupled Reticulocyte Lysate -T7 | Promega | L4611 | |
Tris-base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Waterbath | Fisher Scientific | 2340 | |
Western wet transferring cassette | Thermofisher Scientific | STM2001 |