Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية قياس الانقباض في خلايا عضلة القلب الأولية البشرية البالغة من قلوب المتبرعين باستخدام نظام MyoBLAZER ، وهو منصة موثوقة لتقييم التغيرات التي يسببها الدواء في الانقباض أثناء التطور قبل السريري.
Abstract
يعد تقييم التغيرات في انقباض القلب أمرا ضروريا أثناء التطوير قبل السريري للمركبات الجديدة التي تستهدف القلب وغير القلب. تصف هذه الورقة بروتوكولا لتقييم التغيرات في الانقباض في خلايا عضلة القلب البطينية الأولية البشرية البالغة باستخدام MyoBLAZER ، وهي طريقة بصرية غير جراحية تحافظ على علم وظائف الأعضاء الطبيعي وعلم الأدوية للخلايا. تقيس طريقة التسجيل البصري هذه باستمرار الانقباض العابر من خلايا متعددة بالتوازي ، مما يوفر معلومات متوسطة الإنتاجية وقيمة لكل خلية فردية في مجال الرؤية ، مما يتيح تتبع تأثيرات الدواء في الوقت الفعلي. يتم تحفيز تقلصات الخلايا العضلية القلبية عن طريق تحفيز المجال الكهربائي المنظم ، ويتم تغذية صور المجال الساطع المكتسبة إلى برنامج معالجة الصور الذي يقيس تقصير القطعة العضلية عبر خلايا عضلية قلبية متعددة. تولد هذه الطريقة بسرعة نقاط نهاية مختلفة تتعلق بحركية مراحل الانكماش والاسترخاء ، ويمكن بعد ذلك تفسير البيانات الناتجة فيما يتعلق بالتركيزات المختلفة لمقالة الاختبار. تستخدم هذه الطريقة أيضا في المراحل المتأخرة من التطوير قبل السريري لإجراء دراسات ميكانيكية للمتابعة لدعم الدراسات السريرية الجارية. وبالتالي ، فإن النموذج القائم على خلايا عضلة القلب الأولية البشرية البالغة جنبا إلى جنب مع النظام البصري لمراقبة الانقباض المستمر لديه القدرة على المساهمة في حقبة جديدة من قابلية ترجمة بيانات القلب في المختبر في تطوير العلاج الطبي قبل السريري.
Introduction
انقباض عضلة القلب (التقلص العضلي) ، الذي يمثل القدرة الطبيعية لعضلة القلب على الانقباض ، هو خاصية رئيسية لوظيفة القلب ويعتمد على ديناميكيات الاقتران الكهروميكانيكي. التغيرات التي يسببها الدواء في انقباض عضلة القلب مطلوبة لعلاج أمراض القلب (على سبيل المثال ، قصور القلب) وغير مرغوب فيها في سياق السمية القلبية (على سبيل المثال ، انخفاض في جزء طرد البطين الأيسر). لذلك ، يجب أن ترتبط نماذج الانقباض قبل السريرية بالتنبؤ الدقيق للتأكد من أن الأدوية الجديدة يمكن أن تنجح أثناء التطوير السريري. ومع ذلك ، فإن الاستراتيجيات قبل السريرية الحالية ، التي تعتمد على النماذج الخلوية الاصطناعية الاختزالية (على سبيل المثال ، خطوط الخلايا الخالدة المعدلة وراثيا التي تفرط في التعبير عن أهداف قلبية محددة ذات أهمية) والنماذج الحيوانية غير البشرية ، أظهرت قيودا كبيرة ووجد أنها مرتبطة بمعدلات استنزاف عالية للأدوية (أي معدل مرتفع من الإشارات الخاطئة)1،2،3،4. وفقا لذلك ، من الضروري إنشاء نماذج جديدة وموثوقة لانقباض القلب الخلوي البشري مرتبطة بقوة عالية (أي معدل مرتفع من الإشارات الحقيقية) للتنبؤ بنتائج الأدوية في البشر ، وبالتالي المساعدة في تسريع إطلاق علاجات جديدة5.
الأساليب الرائدة التي تم إنشاؤها مؤخرا لاستعادة قلوب المتبرعين البشريين للبحث6،7،8،9،10 وفي تقنيات عزل خلايا عضلة القلب 11،12،13،14،15 وفرت فرصة فريدة لإجراء الدراسات البشرية أثناء التطور قبل السريري. تحقيقا لهذه الغاية ، أظهرت خلايا عضلة القلب الأولية البشرية البالغة بالفعل فائدة في تقييم التغيرات التي يسببها الدواء في انقباض قلب الإنسان11،12،13،14. توضح المقالة الحالية بالتفصيل بروتوكول التحقيق في تأثيرات انقباض المركبات الجديدة في خلايا عضلة القلب البشرية البالغة.
Protocol
تم تنفيذ جميع الطرق وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة. كانت جميع القلوب البشرية المستخدمة في الدراسات غير قابلة للزرع وتم الحصول عليها أخلاقيا بموافقة قانونية مستنيرة (الشخص الأول أو أقرب الأقرباء) من المتبرعين بالأعضاء الجثثية في الولايات المتحدة (الولايات المتحدة). تمت الموافقة المسبقة على بروتوكولات الاسترداد والتجارب في المختبر من قبل مجالس المراجعة المؤسسية (IRBs) في مراكز الزرع داخل شبكة زراعة الأعضاء الأمريكية (OPTN). علاوة على ذلك ، يمكن تتبع جميع عمليات نقل قلوب المتبرعين بالكامل ومراجعتها بشكل دوري من قبل السلطات الفيدرالية الأمريكية.
ملاحظة: تطبيق جميع إجراءات السلامة اللازمة أثناء تنفيذ هذا البروتوكول ، بما في ذلك ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (مثل معاطف المختبر ونظارات السلامة والقفازات).
1. عزل خلايا عضلة القلب (يوم واحد قبل قياس الانقباض)
- أعد تشغيل قلوب المتبرعين فور وصولها إلى المختبر باستخدام محلول شلل القلب المثلج6 وعزل الخلايا العضلية الأولية البشرية البالغة إنزيميا من البطينين11،12،13،14،15.
- بعد ذلك ، حافظ على خلايا عضلة القلب معلقة وقم بتخزينها ب 10 مل من المحلول A (110 مللي متر سكروز ، 0.005 مللي مول CaCl 2 ، 3 mM MgCl 2 ، 70 mM KOH ، 60 mM حمض اللاكتوبيونيك ، 10 mM KH 2 PO4 ، 20 mM توراين ، 20 mM L- هيستيدين ، 20 mM HEPES ، 2 mM L- حمض الجلوتاميك ، 2 mM L- (-) - حمض الماليك ، درجة الحموضة 7.4 مع KOH) في 20 مل قارورة ويتون (جدول المواد) في درجة حرارة مبردة حتى يتم استجوابها تجريبيا.
ملاحظة: قم بتخزين 200000 خلية لكل قارورة.
2. إعداد طلاء Laminin (1 يوم قبل قياس الانقباض)
- ضع غطاء زجاجي واحد (25 مم × 25 مم مربع ، جدول المواد) في كل بئر من لوحة استزراع ثمانية آبار (جدول المواد).
- بعد ذلك ، قم بتغطية أغطية الأغطية باللامينين بتركيز 5 ميكروغرام / مل. للقيام بذلك ، أضف 800 ميكرولتر من مخزون Laminin 521 المؤتلف البشري (جدول المواد ، المخزن في -20 درجة مئوية) إلى 7.2 مل من المحلول B (145 mM NaCl ، 4 mM KCl ، 2.5 mM CaCl 2 ، 1 mM MgCl2 ، 11.1 mM Glucose ، و 10 mM HEPES ، الرقم الهيدروجيني 7.4 مع NaOH) واخلطه جيدا.
- قم بإسقاط 200 ميكرولتر من محلول اللامينين المخفف في وسط كل غطاء. ثم غطي الطبق وركصيه في ثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية.
ملاحظة: قم بإعداد عدة ألواح استزراع ذات ثمانية آبار لضمان وجود ما يكفي من أغطية الطلاء المطلية باللامينين.
3. إعداد خلايا عضلة القلب المتسامحة مع الكالسيوم2+ (في يوم قياس الانقباض)
- أخرج قنينة من الخلايا من الثلاجة ، ونضح المحلول A من القارورة وأضف 10 مل مبردة من المحلول B.
ملاحظة: تأكد من عدم شفط الخلايا وتفريق المحلول B في القارورة عن طريق وضع الماصة داخل الجزء العلوي من جدار القارورة. - قم بتغطية قارورة الخلايا ثم قم بتدويرها برفق للتأكد من تشتت الخلايا في جميع أنحاء المحلول (ب). أخيرا ، اترك الخلايا تستقر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
4. إعداد نظام التسجيل (في يوم قياس الانقباض)
ملاحظة: يشتمل نظام التسجيل على صندوق للتحكم في درجة الحرارة ، ومحفز ، ونضح مدفوع بالضغط يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر ، وزجاجات تروية مدفوعة بالضغط ، وبرنامج اقتناء داخلي يسمح باختيار مناطق الاهتمام (ROIs) وعرض الانقباض العابر ، والمجهر المقلوب ، وغرفة الخلية ، والكاميرا (الشكل 1).
- قم بتشغيل نظام فراغ الشفط. بعد ذلك ، قم بإزالة غطاء المجهر ، وقم بتشغيله ، وقم بتوصيل الكاميرا (جدول المواد ، الشكل 1) ، وأخيرا ، تأكد من تشغيل المروحة لضمان عدم ارتفاع درجة حرارة الكاميرا.
- بعد ذلك ، قم بتشغيل لوحة تسخين المجهر (جدول المواد) وصندوق التحكم في درجة الحرارة (جدول المواد ، الشكل 1) ، واضبطها على درجة حرارة التشغيل المناسبة. بعد ذلك ، قم بتشغيل محفز المجال (جدول المواد ، الشكل 1) ونظام الضغط. أخيرا ، قم بتوصيل أنبوب المحلول (جدول المواد) بغرفة التسجيل (جدول المواد ، الشكل 1).
5. تحضير مركبات الاختبار (في يوم قياس الانقباض)
- تمييع ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO; جدول المواد) 1000 ضعف في المحلول C (145 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 4 مللي مول KCl ، 1.8 مللي مول CaCl 2 ، 1 مللي متر MgCl2 ، 11.1 مللي متر جلوكوز ، و 10 مللي مول HEPES ، درجة الحموضة 7.4 مع NaOH) لصنع محلول مركبة DMSO بنسبة 0.1٪.
- لاختبار مركب عند 1 أضعاف و 10 أضعاف و 100 ضعف و 1000 ضعف من تعرضه العلاجي البالغ 0.001 ميكرومتر ، قم بإذابة مركب الاختبار في DMSO بتركيز 1 mM.
- قم بتخفيف هذا الحل بشكل متسلسل باستخدام DMSO لإنتاج ثلاثة مخزونات DMSO أخرى (على سبيل المثال ، 0.001 mM و 0.01 mM و 0.1 mM). أخيرا ، قم بتخفيف كل مخزون مركب اختبار بمقدار 1000 ضعف في 100 مل من المحلول C للحصول على تركيزات الاختبار النهائية (0.001 ميكرومتر ، 0.01 ميكرومتر ، 0.1 ميكرومتر ، و 1 ميكرومتر).
- أضف محلول السيارة ومحاليل التركيزات النهائية للميكرومولار للمركب إلى زجاجات زجاجية سعة 100 مل (جدول المواد ، الشكل 1) ثم قم بتوصيل الزجاجات بنظام التروية المدفوع بالضغط (جدول المواد ، الشكل 1).
- بعد ذلك ، قم بتجهيز نظام التروية ببرنامج يحركه الكمبيوتر (جدول المواد) باستخدام ضغط 200-300 ملي بار لتقديم تدفق تروية مستمر بمعدل 1.8 مل / دقيقة.
ملاحظة: لا تقم بإجراء التجربة إذا وجد أن مركب الاختبار مرتبط بمشكلة الذوبان. أيضا ، قم بصياغة حلول الاختبار المركبة من محاليل المخزون في غضون 30 دقيقة قبل التطبيق التجريبي على الخلايا.
6. طلاء خلايا عضلة القلب (في يوم قياس الانقباض)
- خذ صفيحة من ثمانية آبار تحتوي على أغطية مغطاة باللامينين من الثلاجة التي تبلغ درجة حرارتها 4 درجات مئوية وضع غطاء واحد بعناية في غرفة تسجيل جيدة التنظيف (الشكل 1). ثم أعد الطبق المكون من ثمانية آبار إلى الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية حتى الطلاء التالي.
ملاحظة: استخدم منديلا خاليا من النسالة (جدول المواد) لمسح غطاء الغطاء المطلي مع الحفاظ على غطاء الغطاء مغطى بطبقة رقيقة من اللامينين. تأكد أيضا من التخلص من أغطية الغطاء المستخدمة في حاوية الأدوات الحادة. - بعد ذلك ، خذ قارورة متصاعدة من الخلايا (الخطوة 3.2) ونضح المحلول B من القارورة للوصول إلى أصغر حجم ممكن دون فقد الخلايا (~ 200 ميكرولتر). بعد ذلك ، قم بتوزيع 200 ميكرولتر من الخلايا في غرفة مجهر التسجيل المثبتة على مرحلة المجهر المقلوب (جدول المواد).
- دع الخلايا تستقر على الغطاء لمدة 5 دقائق. أثناء انتظار استقرار الخلايا تماما ، افتح مجال الرؤية على المجهر وحدد ما إذا كانت كثافة الخلية كافية (~ 70٪) لبدء التشغيل التجريبي.
ملاحظة: تأكد من أن الشفط لا يستنشق جميع الخلايا بعيدا إذا تم الاستغناء عن أكثر من 200 ميكرولتر.
7. تسجيل انقباض عضلة القلب
- بعد اكتمال الطلاء ، قم بموازنة الخلايا لمدة 5 دقائق عن طريق تعطيرها باستمرار بالمحلول C باستخدام نظام التروية المدفوع بالضغط (جدول المواد). اضبط الشفط بشكل صحيح ، وقم بتشغيل كل من صندوق التحكم في درجة الحرارة ولوحة التسخين ، واضبطهما على التسليم ~ 35 °C.
- بعد ذلك ، قم بتحفيز الخلايا بجهد فوق العتبة بتردد سرعة 1 هرتز (نبضة ثنائية القطب مدتها 3 مللي ثانية) على محفز مجال مع زوج من الأسلاك البلاتينية الموضوعة على جوانب متقابلة من الغرفة متصلة بمحفز المجال.
- اضبط سعة النبض المحفز على 1 فولت ، ثم قم بزيادته حتى تبدأ خلايا عضلة القلب في توليد دورات انكماش واسترخاء. استخدم قيمة عتبة 1.5x طوال التجربة.
ملاحظة: حدد الخلايا السليمة ذات التشكل على شكل قضيب والتشققات الواضحة. بعد ذلك ، اضبط مجال الرؤية وركز على عرض أكبر عدد ممكن من الخلايا المتقلصة (الشكل 2 أ). - بعد ذلك ، اعرض الصور الرقمية للخلايا داخل برنامج الاستحواذ لنظام تسجيل الانقباض البصري. يستخدم هذا البرنامج كاميرا عالية الدقة ومعدل إطارات عالي بمعدل 150 إطارا في الثانية (جدول المواد ، الشكل 1) لتسجيل دفق فيديو يحتوي على خلايا عضلية متعددة في نفس الإطار.
ملاحظة: يوفر هذا دقة زمنية ومكانية كافية لالتقاط وقياس ديناميكيات القطعة العضلية للعديد من الخلايا العضلية السليمة في وقت واحد. يتم الاستفادة من المعالجات الحديثة ذات العد الأساسي العالي لتمكين الحساب المتوازي للتغيرات في طول القطعة العضلية من دفق الفيديو في الوقت الفعلي (يتم جمع بيانات الكثافة الضوئية من مناطق الاهتمام التي يحددها المستخدم [ROI] الموضوعة على صور خلايا عضلة القلب السليمة وبالتوازي مع محور الانكماش ، الشكل 2 ب). تظهر بيانات الكثافة البصرية نطاقات ساطعة ومظلمة تتوافق مع خطوط Z لخلايا عضلة القلب (الشكل 1 ، الشكل 2C). أخيرا ، يتم عرض هذه البيانات للمستخدم لأغراض المراقبة وحفظها على قرص لتحليلها لاحقا (الشكل 2C).- تجنب مناطق الخلايا التي لا يتم التركيز عليها. أيضا ، لا تضع عائد الاستثمار بالقرب من حافة الخلايا ، لأن التغييرات في تقلص الخلايا أثناء تطبيق الأدوية يمكن أن تتسبب في عدم قدرة عائد الاستثمار على قراءة تقلص الخلايا.
- عند اكتمال اختيار عائد الاستثمار وتفي الانقباضات بالمعايير اللازمة للاستخدام (على سبيل المثال ، تقصير القطعة العضلية >1٪ ؛ الانكماش الإيقاعي عند تطبيق تردد سرعة 1 هرتز ، غياب أحداث عدم انتظام ضربات القلب) ، ابدأ التجربة لتقييم آثار المركب. يوضح الجدول 1 بروتوكول التحفيز وتسلسل تطبيق المركب لتركيزات الاختبار. وسيدير برنامج الاقتناء، بطريقة آلية، الحصول على البيانات وعرضها ووضع العلامات على تركيزات الاختبار ووقت المعالجة.
ملاحظة: قم بتطبيق تركيزات الاختبار إذا ظل الانكماش عند سعة ثابتة طوال فترة خط الأساس للمركبة. استبعاد الخلايا التي تعرض إما تشغيلا أو متهدما. تأكد أيضا من تحويل التروية إلى تركيزات الاختبار المختلفة طوال التجربة.
- عند الانتهاء من التجربة وتخزين البيانات على الخادم ، قم بإيقاف تشغيل التروية والسخان ، وإيقاف التحفيز ، وتنظيف غرفة المجهر بالماء المقطر ، ثم إزالة الغطاء الزجاجي ، وتجفيف الغرفة جيدا.
ملاحظة: نظف الحجرة جيدا لأن هذا أمر بالغ الأهمية لتجنب تعريض المجموعة التالية من الخلايا لأي مركب قبل الأوان ، وبالتالي إبطال أي بيانات تم جمعها. - بعد ذلك ، قم بإجراء طلاء جديد لخلايا عضلة القلب وقم بإجراء تجربة إضافية للحصول على بيانات كافية لإكمال اختبار المركب أو اختبار مركب جديد.
8. إيقاف تشغيل نظام تسجيل الانقباض البصري
- عند اكتمال الاختبار اليومي للمركب (المركبات) ، قم أولا بإيقاف تشغيل جميع المعدات غير الضرورية لتنظيف النظام ونسخ البيانات لتحليلها في وضع عدم الاتصال.
- بعد ذلك ، قم بإزالة الزجاجات سعة 100 مل (جدول المواد) التي تحتوي على محاليل تركيزات الاختبار النهائية واستبدلها بزجاجات زجاجية مملوءة في منتصف الطريق بمحلول مركز RBS 25 (جدول المواد). قم بلف محلول RBS من خلال غرفة المجهر لمدة 5 دقائق ، ثم افصل أنبوب التروية عن الغرفة ، وقم بتنظيفه بالماء المقطر ، وأخيرا جففه جيدا.
ملاحظة: تأكد من أن الفراغ يعمل بشكل جيد لمنع أي فيضان محتمل. - بعد ذلك ، قم بتوصيل أنبوب التروية بأنبوب الصرف. باستخدام برنامج نظام التروية المدفوع بالضغط (جدول المواد) ، قم بتشغيل حل RBS لمدة 10 دقائق مع ضمان ضبط الضغط ومعدل التدفق بشكل مناسب. بعد ذلك ، قم برش 1٪ DMSO لمدة 5 دقائق ثم قم بتقطير الماء لمدة 15-20 دقيقة لإكمال تنظيف نظام التروية.
- أطفئ ضوء المجهر وضع غطاءه. ثم افصل أسلاك الكاميرا من الصندوق الموجود على جانب المجهر وأوقف تشغيل المروحة. تأكد من إرسال جميع الزجاجات المستخدمة للتنظيف والأوتوكلاف. أخيرا ، تأكد من امتلاء جميع دلاء الصرف بمقدار 1/4 أو أقل.
ملاحظة: تأكد من وجود ما يكفي من أغطية الغلاف المطلية باللامينين للاستخدام في اليوم التالي. - أخيرا ، انسخ الملفات الموجودة في مجلد الاستحواذ لجميع التجارب التي أجريت على كل نظام تسجيل والصقها في خادم نسخ احتياطي آمن لإجراء تحليل إضافي في وضع عدم الاتصال. بعد ذلك ، احذف جميع ملفات البيانات من مجلد الاستحواذ.
9. تحليل بيانات الانقباض
- قم بإجراء تحليل دون اتصال باستخدام برنامج التحليل وماكرو مخصص لمتوسط البيانات. يقوم برنامج التحليل بحساب والإبلاغ عن مقاييس مختلفة من بيانات ديناميكيات القطعة العضلية التي ينتجها برنامج الاستحواذ. يتم توفير قائمة مفصلة بهذه المعلمات في الشكل 2D.
ملاحظة: يسمح تطبيق تقنيات البرامج منخفضة المستوى بتحليل العديد من عمليات تشغيل التسجيلات في 5 ثوان. المعلمة الرئيسية لتقييم التغيرات التي يسببها الدواء في الانقباض هي سعة الانقباض (تقصير القطعة العضلية ٪ = التغير في طول القطعة العضلية). يتم حسابه على أنه طول القطعة العضلية عند ذروة الانكماش / طول القطعة العضلية أثناء الراحة ومتوسطها على آخر 20 عابرا للانقباض لكل تركيز اختبار. - حدد التأثيرات المركبة للاختبار على متوسط سعة الانقباض بالنسبة لحالة التحكم في السيارة الأساسية المحددة لكل خلية عضلية قلبية.
- عبر عن متوسط النتائج كمتوسط ± SEM وأنتج رسما بيانيا يرسم تأثير تركيز مركب الاختبار على سعة الانقباض. بعد ذلك ، قم بملاءمة منحنى التركيز والاستجابة لمعادلة هيل باستخدام برنامج التحليل (جدول المواد) لاشتقاق قيم IC50 (التركيز الذي ينتج تثبيطا بنسبة 50٪ لسعة الانقباض) وقيم EC50 (التركيز الذي ينتج عنه زيادة بنسبة 50٪ في سعة الانقباض).
- بالإضافة إلى سعة الانقباض ، يمكنك أيضا حساب المعلمات الأخرى:
- الانقباض اللاحق: حدد الانقباض اللاحق على أنه انكماش ثانوي عفوي عابر للخلية العضلية القلبية يحدث قبل الانقباض العادي التالي وينتج عنه تقلص غير طبيعي وغير متزامن.
- فشل الانكماش: حدد فشل الانكماش على أنه عدم قدرة التحفيز الكهربائي على إحداث انكماش.
- التباين قصير المدى (STV) والبديلات: تصور هاتين المعلمتين في مخططات بوانكاريه لتقلب سعة الانكماش.
- احسب STV (∑|جرقم + ١ − ج| (20 × √2) −1) مع آخر 20 عابرا لكل فترة تركيز مقالة تحكم واختبار. حدد المولدات على أنها عابرة متكررة متناوبة قصيرة وطويلة السعة الانقباضية.
- لحساب حدوث عدم انتظام ضربات القلب ، قم بتطبيع قيم STV لقيمة التحكم في السيارة لكل خلية ، ورسم الانكماش اللاحق ، وفشل الانكماش ، و STV ، والمولدات ، والتعبير عنها كنسبة مئوية من حدوث الخلايا التي تظهر كل إشارة.
- أكمل التنميط الميكانيكي متعدد المعلمات بحساب الوقت ذروة Ato ، والاضمحلال إلى استرخاء 30٪ (الاضمحلال 30) ، والاضمحلال إلى استرخاء 90٪ (الاضمحلال 90) ، والوقت حتى الاسترخاء بنسبة 90٪ (TR90) (الشكل 2D) ، وطول القطعة العضلية الأساسية ، والوقت حتى ذروة 50٪ ، وارتفاع الذروة ، وطول القطعة العضلية عند انقباض الذروة ، وسرعة الانكماش القصوى ، وسرعة الاسترخاء القصوى12. مثل سعة الانقباض ، عبر عن هذه المعلمات بالنسبة إلى حالة التحكم الأساسية المحددة لكل خلية عضلية قلبية ورسمها بيانيا في مخططات التركيز والاستجابة.
Representative Results
الموصوف في هذا البروتوكول هو إجراء لقياس الانقباض في خلايا عضلة القلب الأولية البشرية البالغة المعزولة من المتبرعين بالأعضاء وتقييم التغيرات الحادة في معلمات الانقباض التي يسببها مركب الاختبار. يتم قياس عابر الانقباض باستخدام نظام هندسة الخلية القائم على الفيديو ، MyoBLAZER ، الذي يقيس ديناميكيات القطعة العضلية ، ويتم محاكاة حالة القلب البالغة عن طريق تحفيز الانقباض مع التحفيز الكهربائي عند تردد السرعة الفسيولوجية (1 هرتز). يتم تأكيد الجدوى الوظيفية للخلايا العضلية القلبية من خلال تقييم اقتران الإثارة والانكماش (أي المعالجة الخلوية التي تربط الإثارة الكهربائية [جهد الفعل الساركوليم] بالانكماش). لا توجد عابرات انقباض تلقائية في خلايا عضلة القلب البشرية ، وتستجيب خلايا عضلة القلب للتحفيز الكهربائي الخارجي مع دورات الانقباض / الاسترخاء (الشكل 2C ، E) ، وكذلك إلى الأيزوبروتيرينول ، وهو ناهض β الأدرينالية (الشكل 2F ، G). يسبب الأيزوبروتيرينول زيادة تعتمد على التركيز في الانقباض (الشكل 2G) ، ويمكن أيضا وصف آثاره على حركية انقباض عابر (الشكل 2D)12.
الشكل 1: الإعداد التجريبي لنظام تسجيل الانقباض البصري. يتم إجراء تسجيلات انقباض المجال الساطع من خلايا عضلة القلب الأولية البشرية البالغة كما هو موضح سابقا11،12،13،14. يتضمن الإعداد (A) صندوق التحكم في درجة الحرارة ، (B) محفز المجال ، (C ، D) نظام الإرواء المدفوع بالضغط ، (E) برنامج يحركه ضغط الكمبيوتر ، (F) الضغط بالإضافة إلى الزجاجات ، (G) برنامج الاستحواذ ، (H) اختيار عائد الاستثمار مع برنامج الاستحواذ ، (I) عرض عابرات الانقباض مع برنامج الاستحواذ ، (J) المجهر المقلوب ، (K) غرفة المجهر ، و ( L) الكاميرا. يتم إعطاء جميع ميزات المعدات في جدول المواد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التحقق من صحة قياس انقباض الخلايا العضلية القلبية البشرية وتأثير التحفيز β الأدرينالي. (أ) صورة مجهرية بتباين الطور لخلية عضلية قلبية أولية بشرية بالغة تمثيلية، (ب) مناطق الاهتمام التي يحددها المستخدم (ROI) موضوعة فوق صور الخلايا العضلية القلبية السليمة وموازية لمحور الانكماش، (ج) عرض الانقباض العابر الذي تم الحصول عليه من نفس عائد الاستثمار في (ب)) مع برنامج الاقتناء ، (د) المعلمات المتعلقة بالانقباض العابر المقاس باستخدام برنامج الاقتناء: سعة الانقباض ، وقت الذروة ، الاضمحلال 30 ، الاضمحلال 90 ، TR90. يمكن أيضا قياس معلمات إضافية: طول القطعة العضلية الأساسية ، والوقت حتى ذروة 50٪ ، وارتفاع الذروة ، وطول القطعة العضلية عند ذروة الانقباض ، وسرعة الانكماش القصوى ، وسرعة الاسترخاء القصوى. (ه) عابرات انقباض نموذجية مسجلة من خلية عضلية بطينية أولية بشرية بالغة بتردد سرعة 1 هرتز في وجود التحكم في السيارة (F) وبعد التعرض ل 30 نانومتر إيزوبروتيرينول ، وهو ناهض غير انتقائي β الأدرينالية. تم جمع عابرات الانقباض الموضحة في اللوحتين E و F من نفس الخلية العضلية القلبية. تم استخدام الأيزوبروتيرينول من خلايا عضلة القلب البشرية التي تسير بسرعة 1 هرتز تردد لتوليد معلومات الفاعلية. (ز) منحنى التركيز والاستجابة التراكمي النموذجي الناتج عن قياس انقباض الخلايا العضلية القلبية البشرية باستخدام الأيزوبروتيرينول (ن = 8 خلايا). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تسلسل التروية | حل السيارة | تركيز 1 (ميكرومتر) | التركيز 2 (ميكرومتر) | تركيز 3 (ميكرومتر) | تركيز 4 (ميكرومتر) | غسل |
| وقت العلاج | 120 ثانية | 300 ثانية | 300 ثانية | 300 ثانية | 300 ثانية | 300 ثانية |
| تردد التحفيز | 1 هرتز | 1 هرتز | 1 هرتز | 1 هرتز | 1 هرتز | 1 هرتز |
الجدول 1: بروتوكول التحفيز وتسلسل تطبيق مركب الاختبار. يتم تقييم استقرار عابري الانقباض من خلال التسجيل المستمر لمدة 120 ثانية في الحل C ، مما يؤسس التحكم في السيارة (عادة في 0.1٪ DMSO). بعد ذلك ، يتم تطبيق تركيز مادة الاختبار لمدة لا تقل عن 300 ثانية أو حتى يتم تحقيق تأثير الحالة المستقرة. يتم استخدام أربعة تركيزات تصاعدية لمادة الاختبار ، مما يوفر منحنيات تأثير التركيز التراكمي (C-E). في نهاية الإضافات التراكمية لمقالة الاختبار ، يمكن تنفيذ فترة غسل 300 ثانية.
Discussion
توفر هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا للنظام البصري القائم على انقباض خلايا عضلة القلب البشرية البالغة لطريقة مبسطة متوسطة الإنتاجية تمكن من اختبار الفعالية الحادة والسمية القلبية للمركبات الجديدة. نظام تسجيل الانقباض البصري هذا سهل الاستخدام ، ويسمح بالتسجيلات من خلايا متعددة بالتوازي ، ويتيح التقييم المتزامن لصحة الخلية ، وعلم وظائف الأعضاء ، وعلم الصيدلة ، ويأتي مع تحليل آلي وسريع للبيانات (يتم تحليل مجموعة من الخلايا المتعددة في 5 ثوان) ، ويسمح بجمع البيانات بسرعة (منحنى التركيز والاستجابة كل 30 دقيقة / مركب / جهاز). مع الأخذ في الاعتبار هذه السمات ، يمكن استخدام نظام التسجيل ليس فقط للكشف عن آثار الأدوية على انقباض عضلة القلب ولكن أيضا لتوفير بيانات العلاقة بين الهيكل والنشاط لدعم جهود الكيمياء الطبية خلال المراحل المبكرة من اكتشاف الدواء16. نظرا لأنه يمكن الحصول على عشرات الملايين من الخلايا من بروتوكول عزل عضلة القلب ، يتم حاليا استكشاف تطبيق نظام تسجيل الانقباض البصري - منصة خلايا عضلة القلب لتحقيق قدرة اختبار متزايدة (باستخدام لوحات جيدة) بتكلفة منخفضة. علاوة على ذلك ، فإن تقييم تأثيرات الدواء على المعلمات الانقباضية والاسترخاء المقاسة بنظام التسجيل يمكن أن يوفر التنميط الميكانيكي متعدد المعلمات للعقاقير المؤثرة في التقلص العضلي12. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام بيانات انقباض عضلة القلب لتصنيف الأدوية الجديدة من الأكثر إلى الأقل سمية للقلب (على سبيل المثال ، هامش الأمان) ومن الأقل إلى الأكثر فعالية (على سبيل المثال ، هامش الفاعلية). يمكن أيضا إجراء دراسات متابعة انقباض عضلة القلب لدعم برامج التطوير التي ارتبطت بانخفاض سريري في انقباض عضلة القلب12.
ميزة أخرى مهمة لاستخدام نظام التسجيل البصري لانقباض عضلة القلب البشرية هي توافقه مع مفهوم 3Rs (الاستبدال والتقليل والصقل)17 حيث يمكن اعتباره طريقة بديلة تتجنب أو تحل محل استخدام الحيوانات لتوليد البيانات في صناعة الأدوية. يمكن أيضا توسيع ميزة 3Rs هذه لتشمل أبحاث القلب الأكاديمية. تأتي المعرفة الحالية الكاملة لفسيولوجيا عضلة القلب وعلم الأدوية من الدراسات البحثية الأكاديمية التي أجريت على خلايا معزولة من قلوب الحيوانات18. وبالتالي ، فإن نموذج انقباض عضلة القلب البشري يفتح إمكانية إجراء دراسات متعدية نقدية. لإجراء هذه الدراسات ، يجب تطوير بروتوكولات للحفاظ على خلايا عضلة القلب البالغة البشرية وشحنها (قيد التقييم حاليا في مختبر AnaBios) ، ويجب أن يكون لنظام الانقباض القدرة على تسجيل التغيرات في طول القطعة العضلية من خلايا عضلة القلب غير البشرية (هذا هو الحال مع نظام تسجيل الانقباض البصري لأن القطع العضلية محفوظة جيدا بين الأنواع).
يمكن لنظام انقباض عضلة القلب البشرية محاكاة العديد من الحالات الفسيولوجية (على سبيل المثال ، الاقتران الكهروميكانيكي ، وتردد السرعة الذي يحاكي معدل ضربات القلب ، ودرجة حرارة الجسم ، وتكامل جميع أهداف القلب البشري) وقد أظهر قيمة متعدية كمكون رئيسي في اكتشاف الأدوية11،12،13،14، على الرغم من أنه لا يمكن أن يحاكي التغيرات في الحمل الميكانيكي وإجهاد القص الذي شوهد أثناء دورة انقباض القلب. يتم الآن فهم بنية ووظيفة المصفوفات القلبية خارج الخلية بشكل أفضل19 ، ويمكن أن يساعد تطوير مثل هذه المصفوفات في التغلب على قيود الحمل الميكانيكي ، ويتم حاليا تقييم المصفوفات ذات الصلابة المختلفة الشبيهة بالقلب في مختبر AnaBios. هناك قيد آخر لنظام انقباض الخلايا العضلية القلبية البشرية وهو عدم وجود شبكة من الأعصاب التي تغذي القلب (على سبيل المثال ، الألياف الودية والسمبتاوي)20. يمكن إعادة إنشاء هذا الاتصال العصبي القلبي من خلال التطبيق المشترك للناقلات العصبية (على سبيل المثال ، الأيزوبروتيرينول ، ناهض مستقبلات مستقبلات β الأدرينالين ؛ أستيل كولين ، ناهض لمستقبلات M2 المسكارينية) ، مع تقييم المركب لآثاره المحتملة على انقباض عضلة القلب. علاوة على ذلك ، يتم تسجيل عابري الانقباض مع عدم وجود قياسات متزامنة لجهود الفعل وعابرات Ca 2+ ، والتي تعتبر ضرورية أيضا عند تقييم تأثيرات الدواء على مخطط كهربية القلب ومعالجة Ca2+. على الرغم من أن هذا الإغفال يمكن اعتباره قيدا على النظام ، إلا أنه ليس من الأهمية بمكان أن يكون هناك لأن تسجيلات إشارات جهد الفعل (مع طريقة المشبك الحالي أو الأصباغ الحساسة للجهد) وعابرات الكالسيوم 2+ (مع مؤشرات / أصباغ Ca2+) يمكن أن ترتبط بالسمية الخلوية. يمكن أن تؤثر هذه التأثيرات السامة للخلايا على تقييم الأدوية الجديدة لتعديل انقباض القلب. على العكس من ذلك ، فإن استخدام طريقة بصرية غير جراحية تحافظ على صحة وعلم وظائف الأعضاء وعلم الأدوية لخلايا عضلة القلب ، مثل نظام التسجيل الموصوف في هذا البروتوكول ، لن يضمن فقط الحصول على أعلى جودة من بيانات الانقباض ولكن أيضا توفير البيانات التي يمكن أن تتنبأ بشكل جيد بالآثار الانقباضية للأدوية الجديدة في البشر.
Disclosures
جميع المؤلفين هم موظفون في شركة AnaBios Corporation ولا يعلنون عن أي مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل شركة AnaBios ومنحة NIH لأبحاث ابتكار الأعمال الصغيرة (SBIR) (1R44TR003162-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100–1000 µL Filtered, Wide Orifice, Sterile tips | Pipette | UF-1000W | |
| 100 mL, Duran pressure plus bottles | DWK Life Sciences | 218102406 | |
| 1 L, 0.22 µm Vacuum Filter system | VWR | 567-0020 | |
| 290 mmol/kg Osmolarity Standard | Wescor | OA-029 | |
| Benchtop pH Meter | Mettler Toledo | https://www.mt.com/us/en/home/products/Laboratory_Analytics_Browse/pH-meter/pH-meters.html | |
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Optronis GmbH | Cyclone-25-150-M | https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/ |
| Corning 25 mm x25 mm Square #1 Cover Glass | Corning | 2845-25 | |
| Cyclone-25-150 | Optronis | https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/ | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Digital Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Eight-well rectangular polystyrene sterile culture plate | Thermo Fisher Scientific | 73521-426 | https://us.vwr.com/store/product/4679368/nunclontm-delta-rectangular-dishes-polystyrene-sterile-thermo-scientific |
| FHD Microscope Chamber System | IonOptix | ||
| Flow EZ, Modular pressure-based flow controller with a computer driven program version 1.1.0.0. | Fluigent OxyGEN | ||
| Heavy Duty Vacuum Bottles | VWR | 16211-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LM521-05 | |
| Idex Chromatography Tubing, Natural FEP, 1/16" OD x 0.030" ID | Cole-Palmer | 1520L | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | 112577 | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | 49449 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Microscope Temperature Control Stage Warmer | AmScope | TCS-100 | |
| MyoPacer Field Stimulator | IonOptix | ||
| Nunc Rectangular Dishes | Thermo Scientific | 267062 | |
| Olympus IX83P1ZF Ixplore Standard microscope | Olympus | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/inverted/ixplore-standard/?campaignid=657680540&adgroupid =116963199831&keyword=ix73%20 microscope&gclid=EAIaIQobChMIl qjyiMWP-AIVVx-tBh2JoQ85EAA YASAAEgLp3fD_BwE |
|
| pH 4.01, 7.00, and 10.01 Standards | Oakton | WD-05942-10 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P4494 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| Prism Software | GraphPad Software - Dotmatics | https://www.graphpad.com/ | |
| RBS 25 Liquid Detergent | Sigma-Aldrich | 83460 | |
| Sharps Container | Uline | S-15307 | |
| SigmaPlot analysis software | Systat Software Inc. | https://systatsoftware.com/ | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Temperature Control Box | Warner Insturments | TC-324C | |
| Vapor Pressure Osmometer | ELITechGroup | Model 5600 | |
| Wheaton 20 mL Vials | DWK Life Sciences | 225288 |
References
- Abi-Gerges, N., Miller, P. E., Ghetti, A. Human heart cardiomyocytes in drug discovery and research: new opportunities in translational sciences. Current Pharmaceutical Biotechnology. 21 (9), 787806 (2020).
- Cook, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five dimensional framework. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).
- Van Meer, B. J., Tertoolen, L. G. J., Mummery, C. L. Measuring physiological responses of human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes to drugs and disease. Stem Cell. 34 (8), 2008-2015 (2016).
- Piccini, J. P., et al. Current challenges in the evaluation of cardiac safety during drug development: translational medicine meets the critical path initiative. American Heart Journal. 158 (3), 317-326 (2009).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Page, G., et al. Human ex-vivo action potential model for pro-arrhythmia risk assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 183-195 (2016).
- Britton, O. J., et al. Quantitative comparison of effects of dofetilide, sotalol, quinidine, and verapamil between human ex vivo trabeculae and in silico ventricular models incorporating inter-individual action potential variability. Frontiers in Physiology. 8, 597 (2017).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 8, 1109 (2017).
- Trovato, C., et al. Human Purkinje in silico model enables mechanistic investigations into automaticity and pro-arrhythmic abnormalities. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 142, 24-38 (2020).
- Otsomaa, L., et al. Discovery and characterization of ORM-11372, a novel inhibitor of the sodium-calcium exchanger with positive inotropic activity. British Journal of Pharmacology. 177 (24), 5534-5554 (2020).
- Nguyen, N., et al. Adult human primary cardiomyocyte-based model for the simultaneous prediction of drug-induced inotropic and pro-arrhythmia risk. Frontiers in Physiology. 8, 1073 (2017).
- Abi-Gerges, N., et al. Multiparametric mechanistic profiling of inotropic drugs in adult human primary cardiomyocytes. Scientific Reports. 10, 7692 (2020).
- Jordaan, P., et al. Cardiotoxic potential of hydroxychloroquine, chloroquine and azithromycin in adult human primary cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 180 (2), 356-368 (2021).
- Ton, A. T., et al. Arrhythmogenic and antiarrhythmic actions of late sustained sodium current in the adult human heart. Scientific Reports. 11, 12014 (2021).
- Schmid, C., Abi-Gerges, N., Leither, M. G., Zellner, D., Rast, G. Ion channel expression and electrophysiology of singular human (primary and induced pluripotent stem cell-derived) cardiomyocytes. Cells. 10 (12), 3370 (2021).
- Guha, R. On exploring structure activity relationships. Methods in Molecular Biology. 993, 81-94 (2013).
- Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Ra then and now: The need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
- Ruiz-Meana, M., Martinson, E. A., Garcia-Dorado, D., Piper, H. M.
- Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S.
- Zaglia, T., Mongillo, M. Cardiac sympathetic innervation, from a different point of (re)view. Journal of Physiology. 595 (12), 3919-3930 (2017).
