Summary
Ce protocole décrit comment mesurer la contractilité dans les cardiomyocytes primaires humains adultes provenant de cœurs de donneurs avec le système MyoBLAZER, une plate-forme fiable pour évaluer les changements de contractilité induits par les médicaments au cours du développement préclinique.
Abstract
L’évaluation des changements dans la contractilité cardiaque est essentielle au cours du développement préclinique de nouveaux composés cardiaques et non cardiaques. Cet article décrit un protocole d’évaluation des changements de contractilité dans les cardiomyocytes ventriculaires primaires humains adultes à l’aide du MyoBLAZER, une méthode optique non invasive qui préserve la physiologie et la pharmacologie normales des cellules. Cette méthode d’enregistrement optique mesure en continu les transitoires de contractilité de plusieurs cellules en parallèle, fournissant à la fois un débit moyen et des informations précieuses pour chaque cellule individuelle dans le champ de vision, permettant le suivi en temps réel des effets des médicaments. Les contractions des cardiomyocytes sont induites par une stimulation de champ électrique rythmée, et les images acquises en fond clair sont transmises à un logiciel de traitement d’images qui mesure le raccourcissement du sarcomère à travers plusieurs cardiomyocytes. Cette méthode génère rapidement différents paramètres liés à la cinétique des phases de contraction et de relaxation, et les données résultantes peuvent ensuite être interprétées par rapport aux différentes concentrations d’un article d’essai. Cette méthode est également utilisée dans les derniers stades du développement préclinique pour effectuer des études mécanistiques de suivi afin de soutenir les études cliniques en cours. Ainsi, le modèle basé sur les cardiomyocytes primaires humains adultes combiné au système optique pour la surveillance continue de la contractilité a le potentiel de contribuer à une nouvelle ère de traduisibilité des données cardiaques in vitro dans le développement de thérapies médicales précliniques.
Introduction
La contractilité myocardique (inotropie), qui représente la capacité naturelle du muscle cardiaque à se contracter, est une propriété clé de la fonction cardiaque et dépend de la dynamique du couplage électromécanique. Les modifications de la contractilité myocardique induites par les médicaments sont souhaitées pour traiter les maladies cardiaques (p. ex., insuffisance cardiaque) et non recherchées dans le contexte de la cardiotoxicité (p. ex., réduction de la fraction d’éjection ventriculaire gauche). Par conséquent, les modèles de contractilité préclinique doivent être associés à une prédictivité précise pour s’assurer que les nouveaux médicaments peuvent réussir pendant le développement clinique. Cependant, les stratégies précliniques actuelles, qui reposent sur des modèles cellulaires artificiels réductionnistes (par exemple, des lignées cellulaires immortalisées génétiquement modifiées qui surexpriment des cibles cardiaques d’intérêt spécifiques) et des modèles animaux non humains, ont montré des limites importantes et se sont avérées associées à des taux élevés d’attrition des médicaments (c’est-à-dire un taux élevé de faux signaux)1,2,3,4 . Par conséquent, il est impératif d’établir de nouveaux modèles fiables de contractilité cardiaque cellulaire humaine associés à une puissance élevée (c’est-à-dire un taux élevé de signaux vrais) pour prédire les résultats des médicaments chez l’homme et, par conséquent, aider à accélérer le lancement de nouvelles thérapies5.
Les méthodes révolutionnaires récemment mises au point pour la récupération de cœurs de donneurs humains pour la recherche 6,7,8,9,10 et dans les techniques d’isolement des cardiomyocytes 11,12,13,14,15 ont fourni une occasion unique de mener des études sur l’homme au cours du développement préclinique. À cette fin, les cardiomyocytes primaires humains adultes ont déjà montré leur utilité dans l’évaluation des changements induits par les médicaments dans la contractilité cardiaque humaine11,12,13,14. Le présent article détaille le protocole d’étude des effets de contractilité de nouveaux composés dans les cardiomyocytes humains adultes.
Protocol
Toutes les méthodes ont été mises en œuvre conformément aux directives et réglementations en vigueur. Tous les cœurs humains utilisés pour les études n’étaient pas transplantables et ont été obtenus de manière éthique par consentement légal éclairé (première personne ou plus proche parent) de donneurs d’organes cadavériques aux États-Unis. Les protocoles de récupération et l’expérimentation in vitro ont été pré-approuvés par les comités d’examen institutionnels (IRB) des centres de transplantation au sein du réseau américain d’approvisionnement en transplantation d’organes (OPTN). De plus, tous les transferts de cœurs de donneurs sont entièrement traçables et examinés périodiquement par les autorités fédérales américaines.
REMARQUE : Appliquer toutes les procédures de sécurité nécessaires pendant l’exécution de ce protocole, y compris le port de l’équipement de protection individuelle approprié (p. ex., blouses de laboratoire, lunettes de sécurité, gants).
1. Isolement des cardiomyocytes (1 jour avant la mesure de la contractilité)
- Reperfuser les cœurs des donneurs dès leur arrivée au laboratoire avec une solution cardioplégique exclusive glacée6 et isoler enzymatiquement les myocytes primaires humains adultes des ventricules 11,12,13,14,15.
- Ensuite, maintenez les cardiomyocytes en suspension et conservez-les avec 10 mL de solution A (110 mM de saccharose, 0,005 mM de CaCl 2, 3 mM de MgCl 2, 70 mM de KOH, 60 mM d’acide lactobionique, 10 mM de KH 2 PO4, 20 mM de taurine, 20 mM de L-histidine, 20 mM de HEPES, 2 mM d’acide L-glutamique, 2 mM d’acide L-(-)-malique, pH 7,4 avec KOH) dans des flacons de Wheaton de 20 ml (tableau des matériaux) à une température réfrigérée jusqu’à ce qu’ils soient interrogés expérimentalement.
REMARQUE : Conservez 200 000 cellules par flacon.
2. Préparation de l’enrobage de laminine (1 jour avant la mesure de la contractilité)
- Placez une seule lamelle de verre (carré de 25 mm x 25 mm, tableau des matériaux) dans chaque puits d’une plaque de culture à huit puits (tableau des matériaux).
- Ensuite, enduisez les lamelles de laminine à une concentration de 5 μg/mL. Pour ce faire, ajouter 800 μL de laminine 521 recombinante humaine (Table des matériaux, stockée à −20 °C) à 7,2 mL de solution B (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11,1 mM de glucose et 10 mM HEPES, pH 7,4 avec NaOH) et bien mélanger.
- Déposez 200 μL de la solution de laminine diluée au centre de chaque lamelle. Ensuite, couvrez l’assiette et empilez-la au réfrigérateur à 4 °C.
REMARQUE : Préparez plusieurs plaques de culture à huit puits pour vous assurer qu’il y a suffisamment de lamelles recouvertes de laminin.
3. Préparation des cardiomyocytes tolérants au Ca2+ (le jour de la mesure de la contractilité)
- Sortez un flacon de cellules du réfrigérateur, aspirez la solution A du flacon et ajoutez 10 mL de solution B réfrigérée.
REMARQUE : Assurez-vous que les cellules ne sont pas aspirées et dispersez la solution B dans le flacon en plaçant la pipette à l’intérieur du haut de la paroi du flacon. - Fermez le flacon de cellules, puis remuez doucement pour vous assurer que les cellules sont dispersées dans la solution B. Enfin, laissez les cellules se déposer pendant 1 h à température ambiante (RT).
4. Préparation du système d’enregistrement (le jour de la mesure de la contractilité)
REMARQUE : Le système d’enregistrement comprend un boîtier de contrôle de la température, un stimulateur, une perfusion sous pression contrôlée par ordinateur, des bouteilles de perfusion sous pression, un logiciel d’acquisition interne permettant la sélection des régions d’intérêt (ROI) et l’affichage des transitoires de contractilité, un microscope inversé, une chambre cellulaire et une caméra (Figure 1).
- Allumez le système d’aspiration par aspiration. Ensuite, retirez le couvercle du microscope, allumez-le, connectez la caméra (Table des matériaux, Figure 1) et, enfin, vérifiez que le ventilateur est allumé pour vous assurer que la caméra ne surchauffe pas.
- Ensuite, allumez la plaque chauffante du microscope (Table des matériaux) et le boîtier de contrôle de la température (Table des matériaux, Figure 1) et réglez-les à la température de fonctionnement appropriée. Ensuite, allumez le stimulateur de champ (tableau des matériaux, Figure 1) et le système de pression. Enfin, connectez le tube de la solution (tableau des matériaux) à la chambre d’enregistrement (tableau des matériaux, Figure 1).
5. Préparation des composés d’essai (le jour de la mesure de la contractilité)
- Sulfoxyde de diméthyle dilué (DMSO ; Table des matériaux) 1 000 fois dans la solution C (145 mM de NaCl, 4 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl 2, 1 mM de MgCl2, 11,1 mM de glucose et 10 mM de HEPES, pH 7,4 avec NaOH) pour obtenir une solution de véhicule à 0,1 % de DMSO.
- Pour tester un composé à 1, 10 fois, 100 fois et 1000 fois de son exposition thérapeutique de 0,001 μM, dissoudre le composé d’essai dans du DMSO à une concentration de 1 mM.
- Diluer cette solution en série avec du DMSO pour produire trois autres stocks de DMSO (par exemple, 0,001 mM, 0,01 mM et 0,1 mM). Enfin, diluer 1 000 fois chaque composé d’essai dans 100 mL de solution C pour obtenir les concentrations d’essai finales (0,001 μM, 0,01 μM, 0,1 μM et 1 μM).
- Ajouter la solution du véhicule et les solutions des concentrations micromolaires finales du composé dans des flacons en verre de 100 ml (tableau des matériaux, figure 1), puis raccorder les flacons au système de perfusion sous pression (tableau des matériaux, figure 1).
- Ensuite, amorcez le système de perfusion à l’aide d’un programme informatisé (Table des matériaux) en utilisant une pression de 200 à 300 mbar pour fournir un débit de perfusion constant à un débit de 1,8 mL/min.
REMARQUE : Ne pas effectuer l’expérience si le composé d’essai est associé à un problème de solubilité. De plus, formuler les solutions d’essai composées à partir de solutions mères dans les 30 minutes précédant l’application expérimentale sur les cellules.
6. Placage des cardiomyocytes (le jour de la mesure de la contractilité)
- Sortez du réfrigérateur à 4 °C une plaque à huit puits contenant des lamelles recouvertes de pellicule et placez-en une avec précaution dans une chambre d’enregistrement très bien nettoyée (figure 1). Ensuite, remettez la plaque à huit puits au réfrigérateur à 4 °C jusqu’au prochain dressage.
REMARQUE : Utilisez une lingette non pelucheuse (Table des matériaux) pour essuyer la lamelle enduite tout en gardant la lamelle recouverte d’une fine couche de laminine. Assurez-vous également de jeter les lamelles usagées dans un contenant pour objets tranchants. - Ensuite, prenez un flacon de cellules (étape 3.2) et aspirez la solution B du flacon pour atteindre un volume aussi petit que possible sans perdre de cellules (~200 μL). Ensuite, distribuez les 200 μL de cellules dans la chambre du microscope enregistreur montée sur la platine d’un microscope inversé (Table des matériaux).
- Laissez les alvéoles se déposer sur la lamelle pendant 5 min. En attendant que les cellules se stabilisent complètement, ouvrez le champ de vision du microscope et déterminez si la densité cellulaire est adéquate (~70 %) pour le début de l’essai.
REMARQUE : Assurez-vous que l’aspiration n’aspire pas toutes les cellules si plus de 200 μL sont distribués.
7. Enregistrement de la contractilité des cardiomyocytes
- Une fois le placage terminé, équilibrez les cellules pendant 5 min en les perfusant continuellement avec la solution C à l’aide du système de perfusion sous pression (tableau des matériaux). Ajustez correctement l’aspiration, allumez le boîtier de contrôle de la température et la plaque chauffante et réglez-les pour qu’ils fournissent ~35 °C.
- Ensuite, stimulez les cellules avec une tension au-dessus du seuil à une fréquence de stimulation de 1 Hz (impulsion bipolaire d’une durée de 3 ms) sur un stimulateur de champ avec une paire de fils de platine placés sur les côtés opposés de la chambre connectés à un stimulateur de champ.
- Réglez l’amplitude de l’impulsion stimulante à 1 V, puis augmentez-la jusqu’à ce que les cardiomyocytes commencent à générer des cycles de contraction-relaxation. Utilisez une valeur de seuil de 1,5x tout au long de l’expérience.
REMARQUE : Sélectionnez des cellules saines avec une morphologie en forme de bâtonnet et des stries claires. Ensuite, ajustez le champ de vision et concentrez-vous sur le fait d’afficher autant de cellules en contraction que possible (Figure 2A). - Ensuite, affichez les images numérisées des cellules dans le logiciel d’acquisition du système d’enregistrement de la contractilité optique. Ce logiciel utilise une caméra haute résolution à fréquence d’images élevée avec une fréquence d’images de 150 FPS (Table of Materials, Figure 1) pour enregistrer un flux vidéo contenant plusieurs myocytes dans la même image.
REMARQUE : Cela fournit une résolution temporelle et spatiale suffisante pour capturer et mesurer la dynamique du sarcomère de plusieurs myocytes sains simultanément. Des processeurs modernes à grand nombre de cœurs sont utilisés pour permettre le calcul parallèle des changements de longueur du sarcomère à partir du flux vidéo en temps réel (les données de densité optique sont collectées à partir de régions d’intérêt définies par l’utilisateur [ROI] placées sur les images de cardiomyocytes sains et parallèles à l’axe de contraction, Figure 2B). Les données d’intensité optique montrent des bandes claires et sombres correspondant aux raies Z des cardiomyocytes (Figure 1, Figure 2C). Enfin, ces données sont affichées à l’utilisateur à des fins de surveillance et enregistrées sur un disque pour une analyse ultérieure (Figure 2C).- Évitez les zones des cellules qui ne sont pas nettes. De plus, ne placez pas les ROI près du bord des cellules, car les changements dans la contraction des cellules pendant l’application des médicaments peuvent empêcher les ROI de lire la contraction des cellules.
- Lorsque la sélection des ROI est terminée et que les contractions répondent aux normes d’utilisation nécessaires (p. ex., raccourcissement du sarcomère >1 % ; contraction rythmique lors de l’application d’une fréquence de stimulation de 1 Hz, absence d’événements arythmiques), commencer l’expérience pour évaluer les effets d’un composé. Le protocole de stimulation et la séquence d’application des concentrations d’essai du composé sont présentés dans le tableau 1. Le logiciel d’acquisition gérera, de manière automatisée, l’acquisition et l’affichage des données et l’étiquetage des concentrations d’essai et de la durée du traitement.
NOTA : Appliquer les concentrations d’essai si la contraction reste à une amplitude stable pendant toute la période de référence du véhicule. Disqualifiez les cellules affichant une liste ascendante ou descendante. Assurez-vous également que la perfusion est commutée sur les différentes concentrations d’essai tout au long de l’expérience.
- Une fois l’expérience terminée et le stockage des données sur le serveur, éteignez la perfusion et le chauffage, arrêtez la stimulation, nettoyez la chambre du microscope avec de l’eau distillée, puis retirez la lamelle en verre et séchez soigneusement la chambre.
REMARQUE : Nettoyez soigneusement la chambre car cela est essentiel pour éviter d’exposer prématurément le prochain ensemble de cellules à un composé, invalidant ainsi toutes les données collectées. - Ensuite, effectuez un nouveau placage de cardiomyocytes et effectuez une expérience supplémentaire pour obtenir suffisamment de données pour terminer le test du composé ou tester un nouveau composé.
8. Arrêt du système d’enregistrement de la contractilité optique
- Lorsque les tests quotidiens du ou des composés sont terminés, éteignez d’abord tous les équipements qui ne sont pas nécessaires pour nettoyer le système et copiez les données pour une analyse hors ligne.
- Ensuite, retirez les flacons en verre de 100 mL (tableau des matériaux) contenant les solutions des concentrations d’essai finales et remplacez-les par des flacons en verre remplis à moitié de solution concentrée RBS 25 (tableau des matériaux). Perfusez la solution RBS à travers la chambre du microscope pendant 5 minutes, puis débranchez la tubulure de perfusion de la chambre, nettoyez-la avec de l’eau distillée et enfin, séchez-la soigneusement.
REMARQUE : Assurez-vous que l’aspirateur fonctionne bien pour éviter toute inondation possible. - Ensuite, connectez la tubulure de perfusion à la tubulure de drainage. À l’aide du logiciel du système de perfusion sous pression (Table of Materials), faites fonctionner la solution RBS pendant 10 min tout en vous assurant que la pression et le débit sont correctement réglés. Ensuite, perfusez du DMSO à 1 % pendant 5 min, puis de l’eau distillée pendant 15 à 20 min pour terminer le nettoyage du système de perfusion.
- Éteignez la lumière du microscope et mettez son couvercle. Ensuite, débranchez les fils de la caméra du boîtier sur le côté du microscope et éteignez le ventilateur. Assurez-vous que toutes les bouteilles usagées sont envoyées pour le nettoyage et l’autoclave. Enfin, assurez-vous que tous les seaux de drainage sont remplis au 1/4 ou moins.
REMARQUE : Assurez-vous qu’il y a suffisamment de lamelles enduites de laminin pour une utilisation le lendemain. - Enfin, copiez les fichiers dans le dossier d’acquisition de toutes les expériences effectuées sur chaque système d’enregistrement et collez-les dans un serveur de sauvegarde sécurisé pour une analyse hors ligne supplémentaire. Ensuite, supprimez tous les fichiers de données du dossier d’acquisition.
9. Analyse des données de contractilité
- Effectuez une analyse hors ligne à l’aide du logiciel d’analyse et d’une macro personnalisée pour faire la moyenne des données. Le logiciel d’analyse calcule et rapporte diverses mesures à partir des données de dynamique du sarcomère produites par le logiciel d’acquisition. Une liste détaillée de ces paramètres est fournie à la figure 2D.
REMARQUE : L’application de techniques logicielles de bas niveau permet d’analyser de nombreux cycles d’enregistrements en 5 s. Le principal paramètre permettant d’évaluer les modifications de la contractilité induites par les médicaments est l’amplitude de la contractilité (% de raccourcissement du sarcomère = variation de la longueur du sarcomère). Elle est calculée comme la longueur du sarcomère au pic de contraction/longueur du sarcomère au repos et la moyenne sur les 20 derniers transitoires de contractilité pour chaque concentration d’essai. - Quantifier les effets du composé d’essai sur l’amplitude moyenne de la contractilité par rapport à la condition de contrôle de base spécifique du véhicule de chaque cardiomyocyte.
- Exprimez les résultats moyens sous forme de moyenne ± MEB et produisez un graphique représentant l’effet de la concentration du composé d’essai sur l’amplitude de la contractilité. Ensuite, ajustez la courbe concentration-réponse à l’équation de Hill à l’aide d’un logiciel d’analyse (Table des matériaux) pour dériver les valeurs IC50 (concentration produisant une inhibition de 50 % de l’amplitude de la contractilité) et EC50 (concentration produisant une augmentation de 50 % de l’amplitude de la contractilité).
- En plus de l’amplitude de contractilité, vous pouvez également calculer d’autres paramètres :
- Post-contraction : Identifiez la post-contraction comme une contraction secondaire spontanée transitoire du cardiomyocyte qui se produit avant la prochaine contraction régulière et produit une contraction anormale et non synchronisée.
- Échec de la contraction : Identifiez l’échec de la contraction comme l’incapacité du stimulus électrique à induire une contraction.
- Variabilité à court terme (VUT) et alternan : Visualisez ces deux paramètres dans des diagrammes de Poincaré de la variabilité de l’amplitude de contraction.
- Calculer le VUT (∑|CAn + 1 − CAn| (20 × √2) −1) avec les 20 derniers transitoires de chaque période de concentration de l’objet témoin et de l’article d’essai. Identifier les alternances comme des transitoires d’amplitude de contractilité alternée courte et longue répétitive.
- Pour calculer l’incidence de la pro-arythmie, normalisez les valeurs STV à la valeur de contrôle du véhicule de chaque cellule, tracez la postcontraction, l’échec de contraction, le STV et les alternants, et exprimez-les en % de l’incidence des cellules présentant chacun des signaux.
- Complétez le profilage mécanistique multiparamétrique avec le calcul du temps Ato pic, de la désintégration jusqu’à 30 % de relaxation (Decay 30), de la désintégration jusqu’à 90 % de relaxation (Decay 90), du temps jusqu’à 90 % de relaxation (TR90) (Figure 2D), de la longueur du sarcomère de base, du temps jusqu’à 50 % du pic, de la hauteur du pic, de la longueur du sarcomère à la contractilité maximale, de la vitesse de contraction maximale et de la vitesse de relaxation maximale12. Comme pour l’amplitude de la contractilité, exprimez ces paramètres par rapport à la condition de contrôle de base spécifique de chaque cardiomyocyte et représentez-les graphiquement dans des diagrammes concentration-réponse.
Representative Results
Ce protocole décrit une procédure permettant de mesurer la contractilité dans des cardiomyocytes primaires humains adultes isolés provenant de donneurs d’organes et d’évaluer les changements aigus des paramètres de contractilité induits par un composé d’essai. La mesure du transitoire de contractilité est réalisée à l’aide d’un système de géométrie cellulaire basé sur la vidéo, le MyoBLAZER, qui mesure la dynamique du sarcomère, et l’état cardiaque de l’adulte est émulé en induisant la contractilité avec une stimulation électrique à la fréquence de stimulation physiologique (1 Hz). La viabilité fonctionnelle des cardiomyocytes est confirmée par l’évaluation de leur couplage excitation-contraction (c’est-à-dire le traitement cellulaire liant l’excitation électrique [le potentiel d’action sarcoliemme] à la contraction). Il n’y a pas de transitoires de contractilité spontanée dans les cardiomyocytes humains, et les cardiomyocytes répondent à la stimulation électrique externe avec des cycles de contractilité/relaxation (Figure 2C, E), ainsi qu’à l’isoprotérénol, un agoniste β-adrénergique (Figure 2F, G). L’isoprotérénol provoque une augmentation de la contractilité en fonction de la concentration (Figure 2G), et ses effets sur la cinétique de la contractilité transitoire peuvent également être caractérisés (Figure 2D)12.
Figure 1 : Montage expérimental du système d’enregistrement de la contractilité optique. Les enregistrements de contractilité en fond clair sont effectués à partir de cardiomyocytes primaires humains adultes, comme décrit précédemment11,12,13,14. L’installation comprend un boîtier de contrôle de la température (A), un stimulateur de champ (B), un système de perfusion sous pression (C, D), un programme informatique basé sur la pression, des bouteilles à pression plus (F), un logiciel d’acquisition (G), une sélection des retours sur investissement avec un logiciel d’acquisition, (I) un affichage des transitoires de contractilité avec un logiciel d’acquisition, un microscope inversé (J), une chambre de microscope K et ( L) appareil photo. Toutes les caractéristiques de l’équipement sont données dans le tableau des matériaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Validation de la mesure de la contractilité des cardiomyocytes humains et effet de la stimulation β-adrénergique. (A) Image de microscopie à contraste de phase d’un cardiomyocyte primaire humain adulte représentatif, (B) régions d’intérêt (ROI) définies par l’utilisateur placées sur les images de cardiomyocytes sains et parallèles à l’axe de contraction, (C) affichage des transitoires de contractilité obtenus à partir des mêmes ROI dans (B) avec le logiciel d’acquisition, (D) paramètres liés au transitoire de contractilité mesuré avec le logiciel d’acquisition : amplitude de contractilité, temps jusqu’au pic, Decay 30, Decay 90, TR90. D’autres paramètres peuvent également être mesurés : la longueur du sarcomère de base, le temps jusqu’au pic de 50 %, la hauteur du pic, la longueur du sarcomère au pic de contractilité, la vitesse de contraction maximale et la vitesse de relaxation maximale. (E) Transitoires de contractilité typiques enregistrés à partir d’un myocyte ventriculaire primaire humain adulte à une fréquence de stimulation de 1 Hz en présence d’un véhicule témoin (F) et après exposition à 30 nM d’isoprotérénol, un agoniste β-adrénergique non sélectif. Les transitoires de contractilité démontrés dans les panels E et F ont été prélevés sur le même cardiomyocyte. L’isoprotérénol provenant de cardiomyocytes humains stimulés à une fréquence de stimulation de 1 Hz a été utilisé pour générer l’information sur la puissance. (G) Courbe concentration-réponse cumulative typique générée par la mesure de la contractilité des cardiomyocytes humains avec l’isoprotérénol (n = 8 cellules). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Séquence de perfusion | Solution pour véhicule | Concentration 1 (μM) | Concentration 2 (μM) | Concentration 3 (μM) | Concentration 4 (μM) | Laver |
| Temps de traitement | 120 s | 300 s | 300 s | 300 s | 300 s | 300 s |
| Fréquence de stimulation | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz |
Tableau 1 : Protocole de stimulation et séquence d’application du composé d’essai. La stabilité des transitoires de contractilité est évaluée par un enregistrement continu pendant 120 s dans la solution C, établissant le contrôle du véhicule (généralement dans du DMSO à 0,1 %). Par la suite, la concentration de l’objet d’essai est appliquée pendant au moins 300 s ou jusqu’à ce qu’un effet d’équilibre soit atteint. Quatre concentrations croissantes de l’objet d’essai sont utilisées, ce qui permet d’obtenir des courbes concentration cumulative-effet (C-E). À la fin des ajouts cumulés de l’article d’essai, une période de lavage de 300 s peut être mise en œuvre.
Discussion
Ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour le système optique basé sur la contractilité des cardiomyocytes humains adultes pour une méthode simplifiée à débit moyen qui permet de tester l’efficacité aiguë et la cardiotoxicité de nouveaux composés. Ce système d’enregistrement optique de la contractilité est facile à utiliser, permet des enregistrements de plusieurs cellules en parallèle, permet l’évaluation simultanée de la santé, de la physiologie et de la pharmacologie des cellules, est livré avec une analyse automatisée et rapide des données (une série de plusieurs cellules est analysée en 5 s) et permet une collecte rapide des données (courbe concentration-réponse toutes les 30 min/composé/dispositif). En tenant compte de ces attributs, le système d’enregistrement peut être utilisé non seulement pour détecter les effets des médicaments sur la contractilité des cardiomyocytes, mais aussi pour fournir des données sur les relations structure-activité afin de soutenir les efforts de chimie médicinale au cours des premières phases de la découverte de médicaments16. Étant donné que des dizaines de millions de cellules peuvent être obtenues à partir d’un protocole d’isolement des cardiomyocytes, l’application du système d’enregistrement optique de la contractilité et de la plate-forme cardiomyocytaire est actuellement à l’étude pour obtenir une capacité de test accrue (avec l’utilisation de plaques bien ancrées) à moindre coût. De plus, l’évaluation des effets des médicaments sur les paramètres systoliques et de relaxation mesurés avec le système d’enregistrement peut fournir un profilage mécanistique multiparamétrique des médicaments inotropes12. De plus, les données sur la contractilité des cardiomyocytes peuvent être utilisées pour classer les nouveaux médicaments du plus au moins cardiotoxique (p. ex., marge de sécurité) et du moins efficace au plus efficace (p. ex., marge de puissance). Des études de suivi de la contractilité des cardiomyocytes peuvent également être menées pour soutenir les programmes de développement qui ont été associés à une diminution clinique de la contractilité myocardique12.
Un autre avantage significatif de l’utilisation du système d’enregistrement optique de la contractilité des cardiomyocytes humains est son alignement avec le concept des 3R (remplacement, réduction et raffinement)17 puisqu’il peut être considéré comme une méthode alternative qui évite ou remplace l’utilisation d’animaux pour la génération de données dans l’industrie pharmaceutique. Cet avantage des 3R peut également être étendu à la recherche universitaire en cardiologie. L’ensemble des connaissances actuelles sur la physiologie et la pharmacologie des cardiomyocytes provient d’études de recherche universitaire menées sur des cellules isolées de cœurs d’animaux18. Ainsi, le modèle de contractilité optique des cardiomyocytes humains ouvre la possibilité de réaliser des études translationnelles critiques. Pour réaliser ces études, des protocoles de conservation et d’expédition des cardiomyocytes adultes humains doivent être développés (actuellement en cours d’évaluation dans le laboratoire d’AnaBios), et le système de contractilité doit avoir la capacité d’enregistrer les changements de longueur des sarcomères des cardiomyocytes non humains (c’est le cas du système d’enregistrement de la contractilité optique puisque les sarcomères sont bien conservés parmi les espèces).
Le système de contractilité des cardiomyocytes humains peut émuler plusieurs conditions physiologiques (p. ex., couplage électromécanique, fréquence de stimulation imitant la fréquence cardiaque, température corporelle, intégration de toutes les cibles cardiaques humaines) et a démontré sa valeur translationnelle en tant qu’élément clé dans la découverte de médicaments11,12,13,14, bien qu’il ne puisse pas imiter les changements de charge mécanique et de contrainte de cisaillement observés au cours du cycle contractile cardiaque. La structure et la fonction des matrices extracellulaires cardiaques sont maintenant mieux comprises19, le développement de telles matrices peut potentiellement aider à surmonter la limitation de la charge mécanique, et des matrices avec différentes rigidités cardiaques sont actuellement en cours d’évaluation dans le laboratoire d’AnaBios. Une autre limite du système de contractilité optique des cardiomyocytes humains est l’absence du réseau de nerfs qui alimente le cœur (par exemple, les fibres sympathiques et parasympathiques)20. Ce contact neuro-cardiaque peut être rétabli par l’application conjointe de neurotransmetteurs (par exemple, l’isoprotérénol, un agoniste des récepteurs β-adrénergiques ; l’acétylcholine, un agoniste des récepteurs muscariniques M2), le composé étant évalué pour ses effets potentiels sur la contractilité des cardiomyocytes. De plus, les transitoires de contractilité sont enregistrés sans mesures simultanées des potentiels d’action et des transitoires Ca 2+, qui sont également essentiels pour évaluer les effets du médicament sur l’électrocardiogramme et la manipulation du Ca2+. Bien que cette omission puisse être considérée comme une limitation du système, elle n’est pas trop critique car les enregistrements des signaux de potentiel d’action (avec la méthode de la pince de courant ou des colorants sensibles à la tension) et des transitoires de Ca 2+ (avec des indicateurs/colorants de Ca2+) peuvent être associés à la cytotoxicité. De tels effets cytotoxiques peuvent avoir un impact sur l’évaluation de nouveaux médicaments pour moduler la contractilité cardiaque. Au contraire, l’utilisation d’une méthode optique non invasive qui préserve la santé, la physiologie et la pharmacologie des cardiomyocytes, comme le système d’enregistrement décrit dans ce protocole, permettrait non seulement d’obtenir des données de contractilité de la plus haute qualité, mais aussi de bien prédire les effets contractiles des nouveaux médicaments chez l’homme.
Disclosures
Tous les auteurs sont des employés d’AnaBios Corporation et ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par AnaBios Corporation et une subvention du NIH Small Business Innovation Research (SBIR) (1R44TR003162-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100–1000 µL Filtered, Wide Orifice, Sterile tips | Pipette | UF-1000W | |
| 100 mL, Duran pressure plus bottles | DWK Life Sciences | 218102406 | |
| 1 L, 0.22 µm Vacuum Filter system | VWR | 567-0020 | |
| 290 mmol/kg Osmolarity Standard | Wescor | OA-029 | |
| Benchtop pH Meter | Mettler Toledo | https://www.mt.com/us/en/home/products/Laboratory_Analytics_Browse/pH-meter/pH-meters.html | |
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Optronis GmbH | Cyclone-25-150-M | https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/ |
| Corning 25 mm x25 mm Square #1 Cover Glass | Corning | 2845-25 | |
| Cyclone-25-150 | Optronis | https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/ | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Digital Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Eight-well rectangular polystyrene sterile culture plate | Thermo Fisher Scientific | 73521-426 | https://us.vwr.com/store/product/4679368/nunclontm-delta-rectangular-dishes-polystyrene-sterile-thermo-scientific |
| FHD Microscope Chamber System | IonOptix | ||
| Flow EZ, Modular pressure-based flow controller with a computer driven program version 1.1.0.0. | Fluigent OxyGEN | ||
| Heavy Duty Vacuum Bottles | VWR | 16211-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LM521-05 | |
| Idex Chromatography Tubing, Natural FEP, 1/16" OD x 0.030" ID | Cole-Palmer | 1520L | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | 112577 | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | 49449 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Microscope Temperature Control Stage Warmer | AmScope | TCS-100 | |
| MyoPacer Field Stimulator | IonOptix | ||
| Nunc Rectangular Dishes | Thermo Scientific | 267062 | |
| Olympus IX83P1ZF Ixplore Standard microscope | Olympus | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/inverted/ixplore-standard/?campaignid=657680540&adgroupid =116963199831&keyword=ix73%20 microscope&gclid=EAIaIQobChMIl qjyiMWP-AIVVx-tBh2JoQ85EAA YASAAEgLp3fD_BwE |
|
| pH 4.01, 7.00, and 10.01 Standards | Oakton | WD-05942-10 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P4494 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| Prism Software | GraphPad Software - Dotmatics | https://www.graphpad.com/ | |
| RBS 25 Liquid Detergent | Sigma-Aldrich | 83460 | |
| Sharps Container | Uline | S-15307 | |
| SigmaPlot analysis software | Systat Software Inc. | https://systatsoftware.com/ | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Temperature Control Box | Warner Insturments | TC-324C | |
| Vapor Pressure Osmometer | ELITechGroup | Model 5600 | |
| Wheaton 20 mL Vials | DWK Life Sciences | 225288 |
References
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