Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man måler kontraktilitet i voksne humane primære kardiomyocytter fra donorhjerter med MyoBLAZER-systemet, en pålidelig platform til vurdering af lægemiddelinducerede ændringer i kontraktilitet under præklinisk udvikling.
Abstract
Evalueringen af ændringer i hjertets kontraktilitet er afgørende under præklinisk udvikling af nye hjerte- og ikke-hjertemålrettede forbindelser. Dette papir beskriver en protokol til vurdering af ændringer i kontraktilitet hos voksne humane primære ventrikulære kardiomyocytter ved hjælp af MyoBLAZER, en ikke-invasiv optisk metode, der bevarer cellernes normale fysiologi og farmakologi. Denne optiske optagelsesmetode måler kontinuerligt kontraktilitetstransienter fra flere celler parallelt, hvilket giver både medium gennemstrømning og værdifuld information for hver enkelt celle i synsfeltet, hvilket muliggør realtidssporing af lægemiddeleffekter. Kardiomyocytkontraktionerne induceres af tempostimulering af elektrisk felt, og de erhvervede lyse feltbilleder føres til en billedbehandlingssoftware, der måler sarkomerforkortelsen på tværs af flere kardiomyocytter. Denne metode genererer hurtigt forskellige endepunkter relateret til kinetikken af sammentræknings- og afslapningsfaser, og de resulterende data kan derefter fortolkes i forhold til forskellige koncentrationer af en testartikel. Denne metode anvendes også i de sene stadier af præklinisk udvikling til at udføre opfølgende mekanistiske undersøgelser til støtte for igangværende kliniske undersøgelser. Således har den voksne humane primære kardiomyocytbaserede model kombineret med det optiske system til kontinuerlig kontraktilitetsovervågning potentialet til at bidrage til en ny æra af in vitro hjertedataoversættelighed i præklinisk medicinsk terapiudvikling.
Introduction
Myokardiekontraktilitet (inotropi), som repræsenterer hjertemuskulaturens naturlige kapacitet til at indgå kontrakt, er en nøgleegenskab ved hjertefunktionen og afhænger af dynamikken i den elektromekaniske kobling. Lægemiddelinducerede ændringer i myokardiekontraktilitet ønskes til behandling af hjertesygdomme (f.eks. Hjertesvigt) og usøgte i forbindelse med kardiotoksicitet (f.eks. Reduktion i venstre ventrikels uddrivningsfraktion). Derfor skal prækliniske kontraktilitetsmodeller forbindes med nøjagtig prædiktivitet for at sikre, at nye lægemidler kan lykkes under klinisk udvikling. Imidlertid har nuværende prækliniske strategier, der er afhængige af reduktionistiske kunstige cellulære modeller (f.eks. Gensplejsede udødeliggjorte cellelinjer, der overudtrykker specifikke hjertemål af interesse) og ikke-menneskelige dyremodeller, vist betydelige begrænsninger og har vist sig at være forbundet med høje lægemiddelnedslidningsrater (dvs. en høj grad af falske signaler)1,2,3,4 . Derfor er det bydende nødvendigt at etablere nye og pålidelige humane cellulære hjertekontraktilitetsmodeller, der er forbundet med høj effekt (dvs. høj hastighed af sande signaler) for at forudsige lægemiddelresultater hos mennesker og dermed bidrage til at fremskynde lanceringen af nye terapier5.
De banebrydende metoder, der for nylig blev etableret til genopretning af menneskelige donorhjerter til forskning 6,7,8,9,10 og i kardiomyocytisolationsteknikker 11,12,13,14,15 har givet en unik mulighed for at gennemføre menneskebaserede undersøgelser under præklinisk udvikling. Til dette formål har voksne humane primære kardiomyocytter allerede vist nytte til vurdering af lægemiddelinducerede ændringer i humant hjertekontraktilitet11,12,13,14. Den nuværende artikel beskriver protokollen til undersøgelse af kontraktilitetsvirkningerne af nye forbindelser i voksne humane kardiomyocytter.
Protocol
Alle metoder blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og regler. Alle menneskelige hjerter, der blev brugt til undersøgelserne, var ikke-transplanterelige og etisk opnået ved informeret juridisk samtykke (første person eller pårørende) fra kadaveriske organdonorer i USA (USA). Genopretningsprotokollerne og in vitro-eksperimenterne blev forhåndsgodkendt af Institutional Review Boards (IRB'er) på transplantationscentre inden for US Organ Procurement Transplant Network (OPTN). Desuden er alle overførsler af donorhjerter fuldt sporbare og gennemgås regelmæssigt af amerikanske føderale myndigheder.
BEMÆRK: Anvend alle nødvendige sikkerhedsprocedurer under udførelsen af denne protokol, herunder brug af passende personlige værnemidler (f.eks. Laboratoriefrakker, sikkerhedsbriller, handsker).
1. Dyrkning af kardiomyocytter (1 dag før måling af kontraktilitet)
- Donorhjerter perfuseres straks ved ankomsten til laboratoriet med iskold proprietær kardioplegisk opløsning6 og isoleres enzymatisk voksne humane primære myocytter fra ventriklerne 11,12,13,14,15.
- Derefter opretholdes kardiomyocytterne i suspension og opbevares med 10 ml opløsning A (110 mM saccharose, 0,005 mM CaCl 2, 3 mM MgCl 2, 70 mM KOH, 60 mM lactobionsyre, 10 mM KH 2 PO4, 20 mM taurin, 20 mM L-histidin, 20 mM HEPES, 2 mM L-glutaminsyre, 2 mM L-(-)-æblesyre, pH 7,4 med KOH) i 20 ml Wheaton hætteglas (Table of Materials) ved en køletemperatur, indtil de er eksperimentelt forhørt.
BEMÆRK: Opbevar 200.000 celler pr. hætteglas.
2. Præparat af lamininbelægning (1 dag før måling af kontraktilitet)
- Anbring et enkelt glasdæksel (25 mm x 25 mm firkantet, materialebord) i hver brønd på en kulturplade med otte brønde (materialetabel).
- Overtræk derefter dæksedlerne med laminin ved en koncentration på 5 μg/ml. For at gøre dette tilsættes 800 μL af den humane rekombinante Laminin 521-stamme (materialetabel, opbevaret ved -20 °C) til 7,2 ml opløsning B (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1 mMMgCl2, 11,1 mM glucose og 10 mM HEPES, pH 7,4 med NaOH) og blandes godt.
- Dråbe 200 μL af den fortyndede lamininopløsning i midten af hver dæksel. Dæk derefter pladen til og stak den i et køleskab på 4 °C.
BEMÆRK: Forbered flere kulturplader med otte brønde for at sikre, at der er nok lamininbelagte dæksedler.
3. Fremstilling af Ca2+-tolerante kardiomyocytter (på dagen for måling af kontraktilitet)
- Fjern et hætteglas med celler fra køleskabet, aspirer opløsning A fra hætteglasset og tilsæt en nedkølet 10 ml opløsning B.
BEMÆRK: Sørg for, at cellerne ikke suges, og spred opløsning B i hætteglasset ved at placere pipetten på indersiden af toppen af hætteglassets væg. - Sæt hætteglasset med celler på, og hvirvl derefter forsigtigt rundt for at sikre, at cellerne spredes i opløsning B. Lad til sidst cellerne sætte sig i 1 time ved stuetemperatur (RT).
4. Forberedelse af registreringssystemet (på dagen for måling af kontraktilitet)
BEMÆRK: Registreringssystemet inkluderer en temperaturkontrolboks, stimulator, computerstyret trykdrevet perfusion, trykdrevne perfusionsflasker, intern erhvervelsessoftware, der muliggør valg af interesseområder (ROI'er) og visning af kontraktilitetstransienter, inverteret mikroskop, cellekammer og kamera (figur 1).
- Tænd sugevakuumsystemet. Fjern derefter mikroskopdækslet, tænd det, tilslut kameraet (materialetabel, figur 1), og bekræft til sidst, at blæseren er tændt for at sikre, at kameraet ikke overophedes.
- Tænd derefter mikroskopets varmeplade (materialetabel) og temperaturkontrolboks (materialetabel, figur 1), og indstil dem til den korrekte driftstemperatur. Tænd derefter feltstimulatoren (materialetabel, figur 1) og tryksystemet. Tilslut til sidst opløsningens slange (materialetabel) til optagekammeret (materialetabel, figur 1).
5. Fremstilling af teststoffer (på dagen for måling af kontraktilitet)
- Fortyndet dimethylsulfoxid (DMSO; Tabel over materialer) 1.000 gange i opløsning C (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11,1 mM glucose og 10 mM HEPES, pH 7,4 med NaOH) for at fremstille en 0,1 % DMSO-køretøjsopløsning.
- For at teste en forbindelse ved 1 gange, 10 gange, 100 gange og 1000 gange af dens terapeutiske eksponering på 0,001 μM opløses testforbindelsen i DMSO i en koncentration på 1 mM.
- Denne opløsning fortyndes serielt med DMSO for at producere yderligere tre DMSO-lagre (f.eks. 0,001 mM, 0,01 mM og 0,1 mM). Til sidst fortyndes hver testblanding 1.000 gange i 100 ml opløsning C for at opnå endelige testkoncentrationer (0,001 μM, 0,01 μM, 0,1 μM og 1 μM).
- Tilsæt køretøjsopløsningen og opløsningerne af de endelige mikromolære koncentrationer af forbindelsen til 100 ml glasflasker (materialetabel, figur 1), og tilslut derefter flaskerne til det trykdrevne perfusionssystem (materialetabel, figur 1).
- Derefter primer perfusionssystemet med et computerdrevet program (materialetabel) ved hjælp af et tryk på 200-300 mbar for at levere et konstant perfusionsflow med en hastighed på 1,8 ml / min.
BEMÆRK: Udfør ikke forsøget, hvis teststoffet viser sig at være forbundet med et opløselighedsproblem. Formuler også de sammensatte testopløsninger fra stamopløsninger inden for 30 minutter før eksperimentel applikation på cellerne.
6. Plating af kardiomyocytter (på dagen for måling af kontraktilitet)
- En plade med otte huller indeholdende lamininbelagte dæksedler tages ud af køleskabet ved 4 °C, og en dæksel anbringes forsigtigt i et meget rengjort optagekammer (figur 1). Derefter sættes tallerkenen med otte brønde tilbage i køleskabet med 4 °C indtil næste plettering.
BEMÆRK: Brug en fnugfri aftørring (materialetabel) til at tørre den coatede dæksel op, mens du holder dækslet belagt med et tyndt lag laminin. Sørg også for at bortskaffe brugte dæksedler i en skarp beholder. - Derefter tages et eskaleret hætteglas med celler (trin 3.2) og aspirationsopløsning B fra hætteglasset for at nå så lille et volumen som muligt uden at miste celler (~200 μL). Derefter dispenseres de 200 μL celler i optagemikroskopkammeret monteret på scenen i et omvendt mikroskop (materialetabel).
- Lad cellerne sætte sig på dæksedlen i 5 min. Mens du venter på, at cellerne er helt afgjort, skal du åbne synsfeltet på mikroskopet og afgøre, om celletætheden er tilstrækkelig (~ 70%) til, at den eksperimentelle kørsel kan begynde.
BEMÆRK: Sørg for, at sugningen ikke suger alle cellerne væk, hvis der dispenseres mere end 200 μL.
7. Registrering af kardiomyocytkontraktilitet
- Når pletteringen er afsluttet, ligevægtes cellerne i 5 minutter ved kontinuerligt at perfusere dem med opløsning C ved hjælp af det trykdrevne perfusionssystem (materialetabel). Juster sugningen korrekt, tænd både temperaturkontrolboksen og varmepladen, og indstil dem til at levere ~ 35 ° C.
- Derefter stimuleres cellerne med supratærskelspænding ved en 1 Hz pacingfrekvens (bipolær puls af 3 ms varighed) på en feltstimulator med et par platintråde placeret på modsatte sider af kammeret forbundet til en feltstimulator.
- Indstil amplituden af den stimulerende puls ved 1 V, og øg den derefter, indtil kardiomyocytterne begynder at generere sammentrækningsafslapningscyklusser. Brug en værdi på 1,5x grænsen i hele eksperimentet.
BEMÆRK: Vælg sunde celler med stavformet morfologi og klare striber. Juster derefter synsfeltet og fokuser på at bringe så mange kontraherende celler som muligt til syne (figur 2A). - Vis derefter de digitaliserede billeder af cellerne i erhvervelsessoftwaren til det optiske kontraktilitetsoptagelsessystem. Denne software bruger et kamera med høj opløsning og høj billedhastighed med en hastighed på 150 FPS (materialetabel, figur 1) til at optage en videostream, der indeholder flere myocytter i samme ramme.
BEMÆRK: Dette giver tilstrækkelig tidsmæssig og rumlig opløsning til at fange og måle sarkomerdynamikken i flere sunde myocytter samtidigt. Moderne processorer med højt kerneantal udnyttes til at muliggøre parallel beregning af ændringer i sarkomerlængde fra videostrømmen i realtid (optiske densitetsdata indsamles fra brugerdefinerede interesseområder [ROI] placeret over billederne af sunde kardiomyocytter og parallelt med sammentrækningsaksen, figur 2B). De optiske intensitetsdata viser lyse og mørke bånd svarende til Z-linjerne i kardiomyocytterne (figur 1, figur 2C). Endelig vises disse data for brugeren til overvågningsformål og gemmes på en disk til senere analyse (figur 2C).- Undgå områder af cellerne, der ikke er i fokus. Placer heller ikke ROI'erne tæt på kanten af cellerne, da ændringerne i cellernes sammentrækning under anvendelse af lægemidler kan medføre, at ROI'erne ikke er i stand til at læse cellernes sammentrækning.
- Når udvælgelsen af ROI'er er afsluttet, og sammentrækningerne opfylder de nødvendige standarder for brug (f.eks. Sarkomerforkortelse >1%; rytmisk sammentrækning ved anvendelse af en 1 Hz pacingfrekvens, fravær af arytmiske begivenheder), start eksperimentet for at vurdere virkningerne af en forbindelse. Stimuleringsprotokollen og sekvensen af forbindelsens anvendelse af testkoncentrationer er vist i tabel 1. Anskaffelsessoftwaren styrer på en automatiseret måde indsamling og visning af data og mærkning af testkoncentrationer og behandlingstid.
BEMÆRK: Anvend testkoncentrationer, hvis sammentrækningen forbliver på en stabil amplitude i hele basiskøretøjsperioden. Diskvalificere celler, der viser enten en optakt eller en nedslidt. Sørg også for, at perfusion skiftes til de forskellige testkoncentrationer under hele eksperimentet.
- Når eksperimentet og datalagringen er afsluttet på serveren, skal du slukke for perfusionen og varmeapparatet, stoppe stimuleringen, rengøre mikroskopkammeret med destilleret vand, derefter fjerne glasdækslet og tørre kammeret grundigt.
BEMÆRK: Rengør kammeret grundigt, da dette er afgørende for at undgå at udsætte det næste sæt celler for enhver forbindelse for tidligt og dermed ugyldiggøre alle indsamlede data. - Udfør derefter en ny plettering af kardiomyocytter og udfør et yderligere eksperiment for at opnå tilstrækkelige data til at fuldføre testningen af forbindelsen eller teste en ny forbindelse.
8. Slukning af det optiske kontraktilitetsoptagelsessystem
- Når den daglige test af forbindelsen (forbindelserne) er afsluttet, skal du først slukke for alt udstyr, der ikke er nødvendigt for at rengøre systemet, og kopiere dataene til offline analyse.
- Fjern derefter de 100 ml glasflasker (materialetabel), der indeholder opløsninger af endelige testkoncentrationer, og erstat dem med glasflasker halvvejs fyldt med RBS 25-koncentratopløsning (materialetabel). Perfus RBS-opløsning gennem mikroskopkammeret i 5 minutter, frakobl derefter perfusionsslangen fra kammeret, rengør den med destilleret vand, og tør den til sidst grundigt.
BEMÆRK: Sørg for, at vakuumet fungerer godt for at forhindre eventuel oversvømmelse. - Tilslut derefter perfusionsslangen til drænslangen. Brug softwaren i det trykdrevne perfusionssystem (materialetabel) til at køre RBS-løsningen i 10 minutter, samtidig med at det sikres, at tryk og strømningshastighed er tilstrækkeligt indstillet. Derefter perfuseres 1% DMSO i 5 minutter og destilleres derefter vand i 15-20 minutter for at afslutte rengøringen af perfusionssystemet.
- Sluk mikroskoplyset og læg dækslet. Tag derefter kameraledningerne ud af kassen på siden af mikroskopet, og sluk for blæseren. Sørg for, at alle brugte flasker sendes til rengøring og autoklave. Endelig skal du sikre dig, at alle drænspande er 1/4 fulde eller mindre.
BEMÆRK: Sørg for, at der er nok lamininbelagte dæksedler til brug den følgende dag. - Til sidst skal du kopiere filerne i anskaffelsesmappen for alle de eksperimenter, der er udført på hvert optagesystem, og indsætte dem på en sikker backupserver til yderligere offlineanalyse. Slet derefter alle datafiler fra anskaffelsesmappen.
9. Analyse af kontraktilitetsdata
- Udfør offlineanalyse ved hjælp af analysesoftwaren og en brugerdefineret makro til gennemsnit af dataene. Analysesoftwaren beregner og rapporterer forskellige målinger fra sarkomerdynamikdataene produceret af anskaffelsessoftwaren. En detaljeret liste over disse parametre findes i figur 2D.
BEMÆRK: Anvendelsen af softwareteknikker på lavt niveau gør det muligt at analysere mange kørsler af optagelser på 5 s. Den vigtigste parameter til vurdering af lægemiddelinducerede ændringer i kontraktilitet er kontraktilitetsamplituden (sarkomerforkortelse % = ændring i sarkomerlængde). Den beregnes som sarkomerlængden ved maksimal kontraktion/hvilende sarkomerlængde og beregnes som gennemsnit over de sidste 20 kontraktilitetstransienter for hver testkoncentration. - Kvantificer testblandingens virkninger på den gennemsnitlige kontraktilitetsamplitude i forhold til hver kardiomyocyts specifikke baseline køretøjskontroltilstand.
- Gennemsnitsresultaterne udtrykkes som gennemsnit ± SEM, og der opstilles en graf, der viser teststoffets koncentrationseffekt på kontraktilitetsamplituden. Derefter tilpasses koncentrationsresponskurven til Hill-ligningen ved hjælp af analysesoftware (materialetabel) for at udlede IC50 (koncentration, der producerer en 50% hæmning af kontraktilitetsamplitude) og EC50 (koncentration, der producerer en 50% stigning i kontraktilitetsamplitude) værdier.
- Ud over kontraktilitetsamplituden kan du også beregne andre parametre:
- Efterkontraktion: Identificer efterkontraktion som en spontan sekundær sammentrækning forbigående af kardiomyocytten, der opstår før den næste regelmæssige sammentrækning og producerer en unormal og usynkroniseret sammentrækning.
- Sammentrækningsfejl: Identificer sammentrækningsfejl som manglende evne til den elektriske stimulus til at fremkalde en sammentrækning.
- Kortsigtet variabilitet (STV) og alternener: Visualiser disse to parametre i Poincaré-plots af variationi i sammentrækningsamplitude.
- Beregn STV (∑|CAn + 1 − CAn| (20 × √2) −1) med de sidste 20 transienter i hver kontrol- og testartikelkoncentrationsperiode. Identificer alternere som gentagne vekslende korte og lange kontraktilitetsamplitudetransienter.
- For at beregne forekomsten af proarytmi skal du normalisere STV-værdierne til køretøjets kontrolværdi for hver celle, plot efter kontraktion, sammentrækningsfejl, STV og alternans og udtrykke dem som % af forekomsten af celler, der udviser hvert af signalerne.
- Afslut den multiparametriske mekanistiske profilering med beregningen af tid Ato peak, henfald til 30% afslapning (henfald 30), henfald til 90% afslapning (forfald 90), tid til 90% afslapning (TR90) (figur 2D), baseline sarkomerlængde, tid til 50% top, tophøjde, sarkomerlængde ved maksimal kontraktilitet, maksimal sammentrækningshastighed og maksimal afslapningshastighed12. Ligesom kontraktilitetsamplituden udtrykkes disse parametre i forhold til hver kardiomyocyts specifikke baseline-kontroltilstand og grafer dem i koncentrationsresponsplot.
Representative Results
Beskrevet i denne protokol er en procedure til måling af kontraktilitet i isolerede voksne humane primære kardiomyocytter fra organdonorer og evaluering af akutte ændringer i kontraktilitetsparametre induceret af en testforbindelse. Målingen af kontraktilitetstransienten opnås ved hjælp af et videobaseret cellegeometrisystem, MyoBLAZER, der måler sarkomerdynamik, og den voksne hjertetilstand emuleres ved at inducere kontraktilitet med elektrisk stimulering ved den fysiologiske pacingfrekvens (1 Hz). Den funktionelle levedygtighed af kardiomyocytterne bekræftes ved at vurdere deres excitations-kontraktionskobling (dvs. cellulær behandling, der forbinder elektrisk excitation [sarcolemmal aktionspotentiale] med sammentrækning). Der er ingen spontane kontraktilitetstransienter i humane kardiomyocytter, og kardiomyocytterne reagerer på ekstern elektrisk stimulering med kontraktilitets-/afslapningscyklusser (figur 2C, E) såvel som på isoproterenol, en β-adrenerg agonist (figur 2F, G). Isoproterenol forårsager en koncentrationsafhængig stigning i kontraktilitet (figur 2G), og dens virkninger på kinetikken af kontraktilitet forbigående kan også karakteriseres (figur 2D)12.
Figur 1: Eksperimentel opsætning af det optiske kontraktilitetsregistreringssystem. Bright-field kontraktilitetsoptagelser er lavet fra voksne humane primære kardiomyocytter som tidligere beskrevet11,12,13,14. Opsætningen omfatter en (A) temperaturkontrolboks, (B) feltstimulator, (C, D) trykdrevet perfusionssystem, (E) computertrykdrevet program, (F) tryk plus flasker, (G) anskaffelsessoftware, (H) valg af ROI'er med anskaffelsessoftware, (I) visning af kontraktilitetstransienter med anskaffelsessoftware, (J) inverteret mikroskop, (K) mikroskopkammer og ( L) kamera. Alle funktioner i udstyret er angivet i materialetabellen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Validering af human kardiomyocytkontraktilitetsmåling og effekten af β-adrenerg stimulering. (A) Fasekontrastmikroskopibillede af en repræsentativ voksen human primær kardiomyocyt, (B) brugerdefinerede interesseområder (ROI) placeret over billederne af sunde kardiomyocytter og parallelt med sammentrækningsaksen, (C) visning af kontraktilitetstransienter opnået fra de samme ROI'er i (B)) med anskaffelsessoftwaren, (D) parametre relateret til kontraktilitetstransienten målt med anskaffelsessoftwaren: kontraktilitetsamplitude, tid til spidsbelastning, henfald 30, henfald 90, TR90. Yderligere parametre kan også måles: baseline sarkomerlængde, tid til 50% top, tophøjde, sarkomerlængde ved maksimal kontraktilitet, maksimal sammentrækningshastighed og maksimal afslapningshastighed. E) Typiske kontraktilitetstransienter registreret fra en voksen human primær ventrikulær myocyt ved en pacingfrekvens på 1 Hz under tilstedeværelse af køretøjskontrol (F) og efter eksponering for 30 nM isoproterenol, en ikke-selektiv β-adrenerg agonist. De kontraktilitetstransienter, der blev demonstreret i panelerne E og F, blev indsamlet fra den samme kardiomyocyt. Isoproterenol fra humane kardiomyocytter paced ved 1 Hz pacing frekvens blev anvendt til at generere styrken oplysninger. G) Typisk kumulativ koncentrations-responskurve genereret ved human kardiomyocytkontraktilitetsmåling med isoproterenol (n = 8 celler). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Perfusion sekvens | Køretøjsløsning | Koncentration 1 (μM) | Koncentration 2 (μM) | Koncentration 3 (μM) | Koncentration 4 (μM) | Vaske |
| Behandlingstid | 120 sek | 300 s | 300 s | 300 s | 300 s | 300 s |
| Stimuleringsfrekvens | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz |
Tabel 1: Stimuleringsprotokol og teststofpåføringssekvens. Stabiliteten af kontraktilitetstransienter vurderes ved kontinuerlig registrering i 120 s i opløsning C, hvorved køretøjets kontrol etableres (typisk i 0,1 % DMSO). Derefter påføres testartikelkoncentrationen i mindst 300 s, eller indtil der opnås en stationær effekt. Der anvendes fire stigende testartikelkoncentrationer, hvilket giver kumulative koncentrationseffektkurver (C-E). I slutningen af de kumulative tilføjelser af testartiklen kan en udvaskningsperiode på 300 s implementeres.
Discussion
Dette manuskript giver en detaljeret protokol for det voksne humane kardiomyocytkontraktilitetsbaserede optiske system til en forenklet medium-throughput metode, der muliggør test af den akutte effekt og kardiotoksicitet af nye forbindelser. Dette optiske kontraktilitetsregistreringssystem er let at bruge, tillader optagelser fra flere celler parallelt, muliggør samtidig vurdering af cellesundhed, fysiologi og farmakologi, leveres med automatiseret og hurtig dataanalyse (en kørsel af flere celler analyseres på 5 s) og tillader hurtig dataindsamling (koncentrationsresponskurve hvert 30. minut / forbindelse / enhed). Under hensyntagen til disse egenskaber kan registreringssystemet ikke kun bruges til at detektere virkningerne af lægemidler på kardiomyocytkontraktilitet, men også til at tilvejebringe struktur-aktivitetsforholdsdata til støtte for medicinalkemiske bestræbelser i de tidlige faser af lægemiddelopdagelse16. Da titusinder af celler kan opnås fra en kardiomyocytisoleringsprotokol, undersøges anvendelsen af det optiske kontraktilitetsregistreringssystem-kardiomyocytplatform i øjeblikket for at opnå øget testkapacitet (ved brug af velbaserede plader) med reducerede omkostninger. Desuden kan vurderingen af lægemiddeleffekter på de systoliske parametre og afslapningsparametrene målt med registreringssystemet tilvejebringe multiparametrisk mekanistisk profilering af inotrope lægemidler12. Derudover kan kardiomyocytkontraktilitetsdata bruges til at rangere nye lægemidler fra de fleste til mindst kardiotoksiske (f.eks. Sikkerhedsmargen) og fra mindst til mest effektive (f.eks. Styrkemargen). Opfølgningskardiomyocytkontraktilitetsundersøgelser kan også udføres for at understøtte udviklingsprogrammer, der har været forbundet med et klinisk fald i myokardiekontraktilitet12.
En anden væsentlig fordel ved at anvende det optiske optagelsessystem for human kardiomyocytkontraktilitet er dets tilpasning til 3R-konceptet (udskiftning, reduktion og forfining)17 , da det kan betragtes som en alternativ metode, der undgår eller erstatter brugen af dyr til datagenerering inden for medicinalindustrien. Denne 3R-fordel kan også udvides til akademisk hjerteforskning. Hele den nuværende viden om kardiomyocytfysiologi og farmakologi kommer fra akademiske forskningsundersøgelser udført med celler isoleret fra dyrehjerter18. Således åbner den humane kardiomyocyt optiske kontraktilitetsmodel muligheden for kritiske translationelle undersøgelser, der skal udføres. For at udføre disse undersøgelser skal der udvikles protokoller for konservering og forsendelse af humane voksne kardiomyocytter (i øjeblikket under evaluering i AnaBios 'laboratorium), og kontraktilitetssystemet skal have evnen til at registrere ændringer i sarkomerlængde fra ikke-humane kardiomyocytter (dette er tilfældet med det optiske kontraktilitetsregistreringssystem, da sarkomerer er godt bevaret blandt arter).
Det humane kardiomyocytkontraktilitetssystem kan efterligne flere fysiologiske tilstande (f.eks. elektromekanisk kobling, pacingfrekvens, der efterligner puls, kropstemperatur, integration af alle menneskelige hjertemål) og har vist translationel værdi som en nøglekomponent i lægemiddelopdagelse11,12,13,14, selvom det ikke kan efterligne ændringerne i mekanisk belastning og forskydningsspænding, der ses under hjertekontraktilcyklussen. Strukturen og funktionen af hjerteekstracellulære matricer forstås nu bedre19, udviklingen af sådanne matricer kan potentielt hjælpe med at overvinde den mekaniske belastningsbegrænsning, og matricer med forskellige hjertelignende stivheder evalueres i øjeblikket i AnaBios 'laboratorium. En anden begrænsning af det humane kardiomyocyt optiske kontraktilitetssystem er fraværet af netværket af nerver, der forsyner hjertet (f.eks. sympatiske og parasympatiske fibre)20. Denne neuro-kardiale kontakt kan genetableres ved samtidig anvendelse af neurotransmittere (fx isoproterenol, en agonist af β-adrenoceptorreceptorer; acetylcholin, en agonist af M2 muskarine receptorer), hvor forbindelsen vurderes for dens potentielle virkninger på kardiomyocytkontraktilitet. Desuden registreres kontraktilitetstransienterne uden samtidige målinger af aktionspotentialer og Ca 2+ transienter, som også er afgørende for evaluering af lægemiddeleffekter på elektrokardiogrammet og Ca2+ håndtering. Selvom denne udeladelse kan betragtes som en begrænsning af systemet, er det ikke for kritisk at have, da optagelserne af handlingspotentialesignaler (med strømklemmemetoden eller spændingsfølsomme farvestoffer) og Ca 2+ transienter (med Ca2+ indikatorer / farvestoffer) kan være forbundet med cytotoksicitet. Sådanne cytotoksiske virkninger kan påvirke vurderingen af nye lægemidler til modulering af hjertets kontraktilitet. Tværtimod vil brugen af en ikke-invasiv optisk metode, der bevarer kardiomyocytternes sundhed, fysiologi og farmakologi, ligesom registreringssystemet beskrevet i denne protokol, ikke kun sikre, at den højeste kvalitet af kontraktilitetsdata opnås, men også give data, der godt kan forudsige de kontraktile virkninger af nye lægemidler hos mennesker.
Disclosures
Alle forfattere er ansatte i AnaBios Corporation og erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af AnaBios Corporation og et NIH Small Business Innovation Research (SBIR) tilskud (1R44TR003162-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100–1000 µL Filtered, Wide Orifice, Sterile tips | Pipette | UF-1000W | |
| 100 mL, Duran pressure plus bottles | DWK Life Sciences | 218102406 | |
| 1 L, 0.22 µm Vacuum Filter system | VWR | 567-0020 | |
| 290 mmol/kg Osmolarity Standard | Wescor | OA-029 | |
| Benchtop pH Meter | Mettler Toledo | https://www.mt.com/us/en/home/products/Laboratory_Analytics_Browse/pH-meter/pH-meters.html | |
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Optronis GmbH | Cyclone-25-150-M | https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/ |
| Corning 25 mm x25 mm Square #1 Cover Glass | Corning | 2845-25 | |
| Cyclone-25-150 | Optronis | https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/ | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Digital Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Eight-well rectangular polystyrene sterile culture plate | Thermo Fisher Scientific | 73521-426 | https://us.vwr.com/store/product/4679368/nunclontm-delta-rectangular-dishes-polystyrene-sterile-thermo-scientific |
| FHD Microscope Chamber System | IonOptix | ||
| Flow EZ, Modular pressure-based flow controller with a computer driven program version 1.1.0.0. | Fluigent OxyGEN | ||
| Heavy Duty Vacuum Bottles | VWR | 16211-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LM521-05 | |
| Idex Chromatography Tubing, Natural FEP, 1/16" OD x 0.030" ID | Cole-Palmer | 1520L | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | 112577 | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | 49449 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Microscope Temperature Control Stage Warmer | AmScope | TCS-100 | |
| MyoPacer Field Stimulator | IonOptix | ||
| Nunc Rectangular Dishes | Thermo Scientific | 267062 | |
| Olympus IX83P1ZF Ixplore Standard microscope | Olympus | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/inverted/ixplore-standard/?campaignid=657680540&adgroupid =116963199831&keyword=ix73%20 microscope&gclid=EAIaIQobChMIl qjyiMWP-AIVVx-tBh2JoQ85EAA YASAAEgLp3fD_BwE |
|
| pH 4.01, 7.00, and 10.01 Standards | Oakton | WD-05942-10 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P4494 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| Prism Software | GraphPad Software - Dotmatics | https://www.graphpad.com/ | |
| RBS 25 Liquid Detergent | Sigma-Aldrich | 83460 | |
| Sharps Container | Uline | S-15307 | |
| SigmaPlot analysis software | Systat Software Inc. | https://systatsoftware.com/ | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Temperature Control Box | Warner Insturments | TC-324C | |
| Vapor Pressure Osmometer | ELITechGroup | Model 5600 | |
| Wheaton 20 mL Vials | DWK Life Sciences | 225288 |
References
- Abi-Gerges, N., Miller, P. E., Ghetti, A. Human heart cardiomyocytes in drug discovery and research: new opportunities in translational sciences. Current Pharmaceutical Biotechnology. 21 (9), 787806 (2020).
- Cook, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five dimensional framework. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).
- Van Meer, B. J., Tertoolen, L. G. J., Mummery, C. L. Measuring physiological responses of human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes to drugs and disease. Stem Cell. 34 (8), 2008-2015 (2016).
- Piccini, J. P., et al. Current challenges in the evaluation of cardiac safety during drug development: translational medicine meets the critical path initiative. American Heart Journal. 158 (3), 317-326 (2009).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Page, G., et al. Human ex-vivo action potential model for pro-arrhythmia risk assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 183-195 (2016).
- Britton, O. J., et al. Quantitative comparison of effects of dofetilide, sotalol, quinidine, and verapamil between human ex vivo trabeculae and in silico ventricular models incorporating inter-individual action potential variability. Frontiers in Physiology. 8, 597 (2017).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 8, 1109 (2017).
- Trovato, C., et al. Human Purkinje in silico model enables mechanistic investigations into automaticity and pro-arrhythmic abnormalities. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 142, 24-38 (2020).
- Otsomaa, L., et al. Discovery and characterization of ORM-11372, a novel inhibitor of the sodium-calcium exchanger with positive inotropic activity. British Journal of Pharmacology. 177 (24), 5534-5554 (2020).
- Nguyen, N., et al. Adult human primary cardiomyocyte-based model for the simultaneous prediction of drug-induced inotropic and pro-arrhythmia risk. Frontiers in Physiology. 8, 1073 (2017).
- Abi-Gerges, N., et al. Multiparametric mechanistic profiling of inotropic drugs in adult human primary cardiomyocytes. Scientific Reports. 10, 7692 (2020).
- Jordaan, P., et al. Cardiotoxic potential of hydroxychloroquine, chloroquine and azithromycin in adult human primary cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 180 (2), 356-368 (2021).
- Ton, A. T., et al. Arrhythmogenic and antiarrhythmic actions of late sustained sodium current in the adult human heart. Scientific Reports. 11, 12014 (2021).
- Schmid, C., Abi-Gerges, N., Leither, M. G., Zellner, D., Rast, G. Ion channel expression and electrophysiology of singular human (primary and induced pluripotent stem cell-derived) cardiomyocytes. Cells. 10 (12), 3370 (2021).
- Guha, R. On exploring structure activity relationships. Methods in Molecular Biology. 993, 81-94 (2013).
- Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Ra then and now: The need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
- Ruiz-Meana, M., Martinson, E. A., Garcia-Dorado, D., Piper, H. M.
- Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S.
- Zaglia, T., Mongillo, M. Cardiac sympathetic innervation, from a different point of (re)view. Journal of Physiology. 595 (12), 3919-3930 (2017).
