Summary
Denne protokollen beskriver hvordan kontraktilitet i primære kardiomyocytter hos voksne mennesker fra donorhjerter måles med MyoBLAZER-systemet, en pålitelig plattform for vurdering av legemiddelinduserte endringer i kontraktilitet under preklinisk utvikling.
Abstract
Evaluering av endringer i hjertets kontraktilitet er viktig under preklinisk utvikling for nye hjerte- og ikke-kardiale målrettede forbindelser. Denne artikkelen beskriver en protokoll for vurdering av endringer i kontraktilitet hos voksne humane primære ventrikulære kardiomyocytter ved bruk av MyoBLAZER, en ikke-invasiv optisk metode som bevarer cellens normale fysiologi og farmakologi. Denne optiske opptaksmetoden måler kontinuerlig kontraktilitetstransienter fra flere celler parallelt, og gir både middels gjennomstrømning og verdifull informasjon for hver enkelt celle i synsfeltet, noe som muliggjør sanntidssporing av legemiddeleffekter. Kardiomyocyttkontraksjonene induseres av tempo elektrisk feltstimulering, og de oppkjøpte lyse feltbildene blir matet til en bildebehandlingsprogramvare som måler sarkomerforkortelsen over flere kardiomyocytter. Denne metoden genererer raskt forskjellige endepunkter relatert til kinetikken til kontraksjons- og relaksasjonsfaser, og de resulterende dataene kan deretter tolkes i forhold til forskjellige konsentrasjoner av en testartikkel. Denne metoden brukes også i de sene stadiene av preklinisk utvikling for å utføre oppfølgingsmekanistiske studier for å støtte pågående kliniske studier. Dermed har den voksne humane primære kardiomyocyttbaserte modellen kombinert med det optiske systemet for kontinuerlig kontraktilitetsovervåking potensial til å bidra til en ny æra av in vitro hjertedataoversettbarhet i preklinisk medisinsk terapiutvikling.
Introduction
Myokardkontraktilitet (inotropi), som representerer den naturlige kapasiteten til hjertemuskelen til å trekke seg sammen, er en nøkkelegenskap for hjertefunksjonen og avhenger av dynamikken i den elektromekaniske koblingen. Legemiddelinduserte endringer i myokardial kontraktilitet er ønsket for å behandle hjertesykdom (f.eks. hjertesvikt) og uoppsøkt i forbindelse med kardiotoksisitet (f.eks. reduksjon i venstre ventrikkels ejeksjonsfraksjon). Derfor må prekliniske kontraktilitetsmodeller assosieres med nøyaktig prediktivitet for å sikre at nye legemidler kan lykkes under klinisk utvikling. Imidlertid har nåværende prekliniske strategier, som er avhengige av reduksjonistiske kunstige cellulære modeller (f.eks. genetisk konstruerte udødeliggjorte cellelinjer som overuttrykker spesifikke hjertemål av interesse) og ikke-menneskelige dyremodeller, vist betydelige begrensninger og har vist seg å være forbundet med høye legemiddelutmattelsesrater (dvs. en høy frekvens av falske signaler)1,2,3,4 . Følgelig er det viktig å etablere nye og pålitelige humane cellulære hjertekontraktilitetsmodeller som er forbundet med høy effekt (dvs. høy grad av sanne signaler) for å forutsi legemiddelutfall hos mennesker og dermed bidra til å akselerere lanseringen av nye terapier5.
De banebrytende metodene som nylig ble etablert for gjenoppretting av humane donorhjerter for forskning 6,7,8,9,10 og i kardiomyocyttisolasjonsteknikker 11,12,13,14,15 har gitt en unik mulighet til å gjennomføre humanbaserte studier under preklinisk utvikling. For dette formål har voksne humane primære kardiomyocytter allerede vist nytte ved vurdering av legemiddelinduserte endringer i human hjertekontraktilitet11,12,13,14. Den nåværende artikkelen beskriver protokollen for å undersøke kontraktilitetseffektene av nye forbindelser i voksne humane kardiomyocytter.
Protocol
Alle metodene ble utført i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter. Alle menneskelige hjerter som ble brukt i studiene var ikke-transplanterbare og etisk oppnådd ved informert juridisk samtykke (første person eller nærmeste pårørende) fra kadaveriske organdonorer i USA (USA). Gjenopprettingsprotokollene og in vitro-eksperimenteringen ble forhåndsgodkjent av Institutional Review Boards (IRB) ved transplantasjonssentre i US Organ Procurement Transplant Network (OPTN). Videre er alle overføringer av donorhjertene fullt sporbare og periodisk gjennomgått av amerikanske føderale myndigheter.
MERK: Bruk alle nødvendige sikkerhetsprosedyrer under gjennomføringen av denne protokollen, inkludert bruk av egnet personlig verneutstyr (f.eks. laboratoriefrakker, vernebriller, hansker).
1. Isolering av kardiomyocytter (1 dag før måling av kontraktilitet)
- Re-perfusere donorhjerter umiddelbart etter ankomst til laboratoriet med iskald proprietær kardioplegisk løsning6 og isolere enzymatisk voksne humane primære myocytter fra ventriklene 11,12,13,14,15.
- Oppretthold deretter kardiomyocyttene i suspensjon og oppbevar dem med 10 ml oppløsning A (110 mM sukrose, 0,005 mM CaCl 2, 3 mM MgCl 2, 70 mM KOH, 60 mM laktobionsyre, 10 mM KH 2 PO4, 20 mM taurin, 20 mM L-histidin, 20 mM HEPES, 2 mM L-glutaminsyre, 2 mM L-(-)-eplesyre, pH 7,4 med KOH) i 20 ml Wheaton hetteglass (Table of Materials) ved nedkjølt temperatur til de blir eksperimentelt undersøkt.
MERK: Oppbevar 200 000 celler per hetteglass.
2. Klargjøring av laminbelegg (1 dag før måling av kontraktilitet)
- Plasser et enkelt glassdeksel (25 mm x 25 mm kvadratisk, materialfortegnelse) i hver brønn på en kulturplate med åtte brønner (materialfortegnelse).
- Deretter belegger du dekslene med laminin i en konsentrasjon på 5 μg/ml. For å gjøre dette, tilsett 800 μL av den humane rekombinante Laminin 521-stammen (materialfortegnelse, lagret ved -20 °C) til 7,2 ml oppløsning B (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11,1 mM glukose og 10 mM HEPES, pH 7,4 med NaOH) og bland godt.
- Slipp 200 μl av den fortynnede lamininoppløsningen inn i midten av hver dekkslip. Dekk deretter til tallerkenen og ha den i et kjøleskap på 4 °C.
MERK: Forbered flere kulturplater med åtte brønner for å sikre at det er nok lamininbelagte deksler.
3. Fremstilling av Ca2+-tolerante kardiomyocytter (på dagen for måling av kontraktilitet)
- Fjern et hetteglass med celler fra kjøleskapet, aspirasjonsoppløsning A fra hetteglasset og tilsett en avkjølt 10 ml oppløsning B.
MERK: Forsikre deg om at cellene ikke suges og spre oppløsning B inn i hetteglasset ved å plassere pipetten på innsiden av toppen av hetteglassveggen. - Sett lokk på hetteglasset med celler og roter deretter forsiktig for å sikre at cellene er spredt gjennom oppløsning B. Til slutt, la cellene slå seg ned i 1 time ved romtemperatur (RT).
4. Klargjøring av opptakssystemet (på dagen for måling av kontraktilitet)
MERK: Opptakssystemet inkluderer en temperaturkontrollboks, stimulator, datastyrt trykkdrevet perfusjon, trykkdrevne perfusjonsflasker, intern innsamlingsprogramvare som tillater valg av interesseområder (ROI) og visning av kontraktilitetstransienter, invertert mikroskop, cellekammer og kamera (figur 1).
- Slå på sugevakuumsystemet. Fjern deretter mikroskopdekselet, slå det på, koble til kameraet (materialfortegnelse, figur 1), og til slutt bekrefter du at viften er slått på for å sikre at kameraet ikke overopphetes.
- Slå deretter på mikroskopvarmeplaten (materialfortegnelse) og temperaturkontrollboksen (materialfortegnelse, figur 1), og sett dem til riktig driftstemperatur. Deretter slår du på feltstimulatoren (materialfortegnelse, figur 1) og trykksystemet. Til slutt kobler du oppløsningens slange (materialfortegnelse) til opptakskammeret (materialfortegnelse, figur 1).
5. Fremstilling av testforbindelser (på dagen for måling av kontraktilitet)
- Fortynnet dimetylsulfoksid (DMSO; Tabell over materialer) 1000 ganger i løsning C (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11,1 mM glukose og 10 mM HEPES, pH 7,4 med NaOH) for å lage en 0,1 % DMSO kjøretøyløsning.
- For å teste en forbindelse ved 1 gang, 10 ganger, 100 ganger og 1000 ganger av sin terapeutiske eksponering på 0,001 μM, oppløs testforbindelsen i DMSO i en konsentrasjon på 1 mM.
- Fortynn denne løsningen serielt med DMSO for å produsere ytterligere tre DMSO-lagre (f.eks. 0,001 mM, 0,01 mM og 0,1 mM). Til slutt fortynnes hver testforbindelse 1000 ganger i 100 ml oppløsning C for å oppnå endelige testkonsentrasjoner (0,001 μM, 0,01 μM, 0,1 μM og 1 μM).
- Tilsett kjøretøyets løsning og løsninger av endelige mikromolare konsentrasjoner av forbindelsen til 100 ml glassflasker (materialfortegnelse, figur 1) og koble deretter flaskene til det trykkdrevne perfusjonssystemet (materialfortegnelse, figur 1).
- Deretter fyller du perfusjonssystemet med et datadrevet program (materialfortegnelse) ved hjelp av et trykk på 200-300 mbar for å levere en konstant perfusjonsstrøm med en hastighet på 1,8 ml / min.
MERK: Ikke utfør eksperimentet hvis testforbindelsen viser seg å være forbundet med et løselighetsproblem. Formuler også de sammensatte testløsningene fra stamløsninger innen 30 minutter før eksperimentell påføring på cellene.
6. Plating av kardiomyocytter (på dagen for måling av kontraktilitet)
- Ta en åtte-brønns plate med lamininbelagte deksler ut av kjøleskapet på 4 °C og legg forsiktig en dekkseddel i et svært godt rengjort opptakskammer (figur 1). Sett deretter tallerkenen med åtte brønner tilbake i kjøleskapet på 4 °C til neste plettering.
NOTAT: Bruk en lofri våtserviett (materialfortegnelse) til å tørke opp det belagte dekselet mens du holder dekselet belagt med et tynt lag laminin. Sørg også for å kaste brukte deksler i en beholder for skarpe gjenstander. - Ta deretter et eskalert hetteglass med celler (trinn 3.2) og aspirer oppløsning B fra hetteglasset for å nå så lite volum som mulig uten å miste celler (~200 μL). Deretter dispenserer du 200 μL celler inn i opptaksmikroskopkammeret montert på scenen til et invertert mikroskop (materialfortegnelse).
- La cellene slå seg ned på dekselet i 5 min. Mens du venter på at cellene skal slå seg helt opp, åpner du synsfeltet på mikroskopet og bestemmer om celletettheten er tilstrekkelig (~ 70%) for at eksperimentell kjøring skal begynne.
MERK: Pass på at suget ikke aspirerer bort alle cellene hvis mer enn 200 μL dispenseres.
7. Registrering av kardiomyocyttens kontraktilitet
- Etter at pletteringen er fullført, balanserer cellene i 5 minutter ved kontinuerlig å perfusere dem med løsning C ved hjelp av det trykkdrevne perfusjonssystemet (materialfortegnelse). Juster suget riktig, slå på både temperaturkontrollboksen og varmeplaten, og still dem inn til å levere ~35 °C.
- Stimuler deretter cellene med supra-terskelspenning ved en 1 Hz pacingfrekvens (bipolar puls av 3 ms varighet) på en feltstimulator med et par platinatråder plassert på motsatte sider av kammeret koblet til en feltstimulator.
- Sett amplituden til den stimulerende pulsen til 1 V, og øk den deretter til kardiomyocyttene begynner å generere sammentreknings-avslapningssykluser. Bruk en verdi på 1,5x terskel gjennom hele eksperimentet.
MERK: Velg friske celler med stavformet morfologi og klare striper. Deretter justerer du synsfeltet og fokuserer på å bringe så mange kontraherende celler som mulig til syne (figur 2A). - Deretter viser du de digitaliserte bildene av cellene i innsamlingsprogramvaren til det optiske kontraktilitetsopptakssystemet. Denne programvaren bruker et høyoppløselig, høybildefrekvenskamera med en hastighet på 150 FPS (materialfortegnelse, figur 1) for å ta opp en videostrøm som inneholder flere myocytter i samme ramme.
MERK: Dette gir tilstrekkelig tidsmessig og romlig oppløsning til å fange og måle sarkomerdynamikken til flere friske myocytter samtidig. Moderne høykjernetellingsprosessorer utnyttes for å muliggjøre parallell beregning av endringer i sarkomerlengde fra videostrømmen i sanntid (optiske tetthetsdata samles inn fra brukerdefinerte interesseområder [ROI] plassert over bildene av friske kardiomyocytter og parallelt med sammentrekningsaksen, figur 2B). De optiske intensitetsdataene viser lyse og mørke bånd svarende til kardiomyocyttenes Z-linjer (figur 1, figur 2C). Til slutt vises disse dataene for brukeren for overvåkingsformål og lagres på en disk for senere analyse (figur 2C).- Unngå områder av cellene som ikke er i fokus. Plasser heller ikke avkastningen nær kanten av cellene, da endringene i cellenes sammentrekning under bruk av legemidler kan føre til at avkastningen ikke kan lese cellenes sammentrekning.
- Når valget av ROI er fullført og sammentrekningene oppfyller de nødvendige bruksstandardene (f.eks. sarkomerforkortelse >1%; rytmisk sammentrekning ved påføring av en 1 Hz pacingfrekvens, fravær av arytmiske hendelser), start eksperimentet for å vurdere effekten av en forbindelse. Stimuleringsprotokollen og sekvensen av forbindelsens anvendelse av testkonsentrasjoner er vist i tabell 1. Anskaffelsesprogramvaren vil administrere, på en automatisert måte, innsamling og visning av data og merking av testkonsentrasjoner og behandlingstid.
MERK: Bruk testkonsentrasjoner hvis sammentrekningen holder seg på en stabil amplitude gjennom hele basiskjøretøyperioden. Diskvalifisere celler som viser enten en oppkjøring eller nedkjøring. Sørg også for at perfusjon byttes til de forskjellige testkonsentrasjonene gjennom hele eksperimentet.
- Når eksperimentet og datalagringen er fullført på serveren, må du slå av perfusjonen og varmeren, stoppe stimuleringen, rengjøre mikroskopkammeret med destillert vann, fjern deretter glassdekselet og tørk kammeret grundig.
MERK: Rengjør kammeret grundig, da dette er avgjørende for å unngå å utsette det neste settet med celler for en forbindelse for tidlig, og dermed ugyldiggjøre alle innsamlede data. - Deretter utfører du en ny plating av kardiomyocytter og utfører et ekstra eksperiment for å oppnå nok data for å fullføre testingen av forbindelsen eller teste en ny forbindelse.
8. Slå av det optiske kontraktilitetsregistreringssystemet
- Når daglig testing av forbindelsen (e) er fullført, må du først slå av alt utstyr som ikke er nødvendig for å rengjøre systemet og kopiere dataene for offline analyse.
- Fjern deretter 100 ml glassflasker (materialfortegnelse) som inneholder oppløsninger med endelige testkonsentrasjoner og erstatt dem med glassflasker halvveis fylt med RBS 25 konsentratløsning (materialfortegnelse). Perfuse RBS-oppløsning gjennom mikroskopkammeret i 5 minutter, koble deretter perfusjonsslangen fra kammeret, rengjør den med destillert vann og tørk den til slutt grundig.
MERK: Forsikre deg om at vakuumet fungerer bra for å forhindre mulig flom. - Deretter kobler du perfusjonsslangen til dreneringsslangen. Bruk programvaren til det trykkdrevne perfusjonssystemet (Table of Materials), kjør RBS-løsningen i 10 minutter samtidig som du sikrer at trykket og strømningshastigheten er tilstrekkelig innstilt. Deretter perfiserer du 1% DMSO i 5 minutter og destillerer deretter vann i 15-20 minutter for å fullføre rengjøringen av perfusjonssystemet.
- Slå av mikroskoplyset og sett dekselet. Koble deretter kameraledningene fra boksen på siden av mikroskopet og slå av viften. Sørg for at alle brukte flasker sendes til rengjøring og autoklav. Til slutt, sørg for at alle dreneringsbøtter er 1/4 fulle eller mindre.
MERK: Forsikre deg om at det er nok lamininbelagte deksler til bruk neste dag. - Til slutt kopierer du filene i oppkjøpsmappen for alle eksperimentene som er gjort på hvert opptakssystem, og limer dem inn i en sikker sikkerhetskopiserver for ytterligere offline analyse. Deretter sletter du alle datafilene fra oppkjøpsmappen.
9. Analyse av kontraktilitetsdata
- Utfør frakoblet analyse ved hjelp av analyseprogramvaren og en skreddersydd makro for å gjennomsnitt av dataene. Analyseprogramvaren beregner og rapporterer ulike beregninger fra sarkomerdynamikkdataene produsert av oppkjøpsprogramvaren. En detaljert liste over disse parametrene er gitt i figur 2D.
MERK: Anvendelsen av programvareteknikker på lavt nivå gjør at mange kjøringer av opptak kan analyseres på 5 s. Hovedparameteren for å vurdere legemiddelinduserte endringer i kontraktilitet er kontraktilitetsamplituden (sarkomerforkortelse % = endring i sarkomerlengde). Den beregnes som sarkomerlengden ved maksimal kontraksjon/hvilende sarkomerlengde og gjennomsnittet over de siste 20 kontraktilitetstransientene for hver testkonsentrasjon. - Kvantifiser testforbindelsens effekter på gjennomsnittlig kontraktilitetsamplitude i forhold til hver kardiomyocytts spesifikke baseline kjøretøykontrolltilstand.
- Uttrykk de gjennomsnittlige resultatene som gjennomsnitt ± SEM og produser en graf som plotter konsentrasjonseffekten av testforbindelsen på kontraktilitetsamplituden. Deretter tilpasser du konsentrasjon-responskurven til Hill-ligningen ved hjelp av analyseprogramvare (materialfortegnelse) for å utlede IC50 (konsentrasjon som gir en 50% hemming av kontraktilitetsamplitude) og EC50 (konsentrasjon som gir en 50% økning i kontraktilitetsamplitude) verdier.
- I tillegg til kontraktilitetsamplituden kan du også beregne andre parametere:
- Etterkontraksjon: Identifiser etterkontraksjon som en spontan sekundær sammentrekning forbigående av kardiomyocytten som oppstår før neste regelmessige sammentrekning og gir en unormal og usynkronisert sammentrekning.
- Sammentrekningssvikt: Identifiser sammentrekningssvikt som manglende evne til den elektriske stimulansen til å indusere en sammentrekning.
- Kortvariabilitet (STV) og alternans: Visualiser disse to parametrene i Poincaré-plott av kontraksjonsamplitudevariabilitet.
- Beregn STV (∑|CAn + 1 − CAn | (20 × √2) -1) med de siste 20 transientene i hver kontroll- og testartikkelkonsentrasjonsperiode. Identifiser alternans som repeterende vekslende korte og lange kontraktilitetsamplitudetransienter.
- For å beregne forekomsten av proarytmi, normaliser STV-verdiene til kjøretøyets kontrollverdi for hver celle, plott etterkontraksjon, kontraksjonssvikt, STV og alternans, og uttrykk dem som% av forekomsten av celler som viser hvert av signalene.
- Fullfør den multiparametriske mekanistiske profileringen med beregning av tid Ato peak, decay til 30% avslapning (Decay 30), henfall til 90% avslapning (Decay 90), tid til 90% avslapning (TR90) (figur 2D), baseline sarkomerlengde, tid til 50% topp, topphøyde, sarkomerlengde ved maksimal kontraktilitet, maksimal kontraksjonshastighet og maksimal relaksasjonshastighet12. I likhet med kontraktilitetsamplituden, uttrykk disse parametrene i forhold til hver kardiomyocytts spesifikke baseline kontrolltilstand og graf dem i konsentrasjon-respons plott.
Representative Results
Beskrevet i denne protokollen er en prosedyre for måling av kontraktilitet i isolerte voksne humane primære kardiomyocytter fra organdonorer og evaluering av akutte endringer i kontraktilitetsparametere indusert av en testforbindelse. Målingen av kontraktilitetstransienten utføres ved hjelp av et videobasert cellegeometrisystem, MyoBLAZER, som måler sarkomerdynamikk, og den voksne hjertesykdommen emuleres ved å indusere kontraktilitet med elektrisk stimulering ved den fysiologiske pacingfrekvensen (1 Hz). Den funksjonelle levedyktigheten til kardiomyocyttene bekreftes ved å vurdere deres eksitasjons-kontraksjonskobling (dvs. cellulær prosessering som forbinder elektrisk eksitasjon [det sarkolemmale aksjonspotensialet] med sammentrekning). Det er ingen spontane kontraktilitetstransienter i humane kardiomyocytter, og kardiomyocyttene responderer på ekstern elektrisk stimulering med kontraktilitets-/relaksasjonssykluser (figur 2C, E), samt isoproterenol, en β-adrenerg agonist (figur 2F,G). Isoproterenol forårsaker en konsentrasjonsavhengig økning i kontraktilitet (figur 2G), og dens effekter på kinetikken til kontraktilitetstransient kan også karakteriseres (figur 2D)12.
Figur 1: Eksperimentelt oppsett av det optiske kontraktilitetsregistreringssystemet. Registrering av kontraktilitet i lysfelt gjøres fra voksne humane primære kardiomyocytter som tidligere beskrevet11,12,13,14. Oppsettet inkluderer en (A) temperaturkontrollboks, (B) feltstimulator, (C, D) trykkdrevet perfusjonssystem, (E) datatrykkdrevet program, (F) trykk pluss flasker, (G) innsamlingsprogramvare, (H) valg av avkastning med anskaffelsesprogramvare, (I) visning av kontraktilitetstransienter med oppkjøpsprogramvare, (J) invertert mikroskop, (K) mikroskopkammer og ( L) kamera. Alle funksjoner i utstyret er gitt i materialfortegnelsen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Validering av kontraktilitetsmåling av humant kardiomyositt og effekten av β-adrenerg stimulering. (A) Fasekontrastmikroskopibilde av en representativ voksen human primær kardiomyocytt, (B) brukerdefinerte interesseområder (ROI) plassert over bildene av friske kardiomyocytter og parallelt med sammentrekningsaksen, (C) visning av kontraktilitetstransienter oppnådd fra de samme avkastningene i (B) med anskaffelsesprogramvaren, (D) parametere relatert til kontraktilitetstransienten målt med anskaffelsesprogramvaren: kontraktilitetsamplitude, tid til topp, Decay 30, Decay 90, TR90. Ytterligere parametere kan også måles: baseline sarkomerlengde, tid til 50% topp, topphøyde, sarkomerlengde ved maksimal kontraktilitet, maksimal kontraksjonshastighet og maksimal relaksasjonshastighet. (E) Typiske kontraktilitetstransienter registrert fra en voksen human primær ventrikkelmyositt med en tempofrekvens på 1 Hz i nærvær av vehikkelkontroll (F) og etter eksponering for 30 nM isoproterenol, en ikke-selektiv β-adrenerg agonist. Kontraktilitetstransientene vist i panel E og F ble samlet fra samme kardiomyocytt. Isoproterenol fra humane kardiomyocytter med tempofrekvens på 1 Hz ble brukt til å generere potensinformasjon. (G) Typisk kumulativ konsentrasjon-responskurve generert ved kontraktilitetsmåling av humant kardiomyositt med isoproterenol (n = 8 celler). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Perfusjonssekvens | Løsning for kjøretøy | Konsentrasjon 1 (μM) | Konsentrasjon 2 (μM) | Konsentrasjon 3 (μM) | Konsentrasjon 4 (μM) | Vaske |
| Behandlingstid | 120 s | 300 s | 300 s | 300 s | 300 s | 300 s |
| Stimuleringsfrekvens | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz |
Tabell 1: Stimuleringsprotokoll og testsammensatt applikasjonssekvens. Stabiliteten til kontraktilitetstransienter vurderes ved kontinuerlig registrering i 120 s i løsning C, etablering av kjøretøyets kontroll (vanligvis i 0,1 % DMSO). Deretter påføres testartikkelkonsentrasjonen i minimum 300 s eller til en steady state-effekt oppnås. Fire stigende testartikkelkonsentrasjoner brukes, noe som gir kumulative konsentrasjon-effekt (C-E) kurver. På slutten av de kumulative tilleggene til testartikkelen kan en utvaskingsperiode på 300 s implementeres.
Discussion
Dette manuskriptet gir en detaljert protokoll for det voksne humane kardiomyocyttkontraktilitetsbaserte optiske systemet for en forenklet medium-gjennomstrømningsmetode som muliggjør testing av akutt effekt og kardiotoksisitet av nye forbindelser. Dette optiske kontraktilitetsopptakssystemet er enkelt å bruke, tillater opptak fra flere celler parallelt, muliggjør samtidig vurdering av cellehelse, fysiologi og farmakologi, leveres med automatisert og rask dataanalyse (en kjøring av flere celler analyseres i 5 s), og tillater rask datainnsamling (konsentrasjon-responskurve hvert 30. minutt / forbindelse / enhet). Tatt i betraktning disse egenskapene, kan opptakssystemet brukes ikke bare til å oppdage effekten av legemidler på kardiomyocyttens kontraktilitet, men også for å gi struktur-aktivitetsforholdsdata for å støtte medisinsk kjemi innsats i de tidlige faser av legemiddeloppdagelsen16. Siden titalls millioner celler kan fås fra en kardiomyocyttisolasjonsprotokoll, blir anvendelsen av det optiske kontraktilitetsopptakssystemet-kardiomyocyttplattformen for tiden undersøkt for å oppnå økt testkapasitet (ved bruk av brønnbaserte plater) med reduserte kostnader. Videre kan vurdering av legemiddeleffekter på systoliske og relaksasjonsparametre målt med registreringssystemet gi multiparametrisk mekanistisk profilering av inotrope legemidler12. I tillegg kan kardiomyocyttens kontraktilitetsdata brukes til å rangere nye legemidler fra mest til minst kardiotoksiske (f.eks. sikkerhetsmargin) og fra minst til mest effektive (f.eks. potensmargin). Oppfølgingskardiomyocyttens kontraktilitetsstudier kan også utføres for å støtte utviklingsprogrammer som har vært assosiert med en klinisk reduksjon i myokardial kontraktilitet12.
En annen betydelig fordel ved å bruke det optiske registreringssystemet for humant kardiomyocyttkontraktilitet er tilpasningen til 3Rs-konseptet (erstatning, reduksjon og forfining)17 siden det kan betraktes som en alternativ metode som unngår eller erstatter bruk av dyr for datagenerering innen farmasøytisk industri. Denne 3Rs-fordelen kan også utvides til akademisk hjerteforskning. Hele dagens kunnskap om kardiomyocytfysiologi og farmakologi kommer fra akademiske forskningsstudier utført med celler isolert fra dyrehjerter18. Dermed åpner den optiske kontraktilitetsmodellen for humant kardiomyositt muligheten for at kritiske translasjonsstudier kan utføres. For å utføre disse studiene må det utvikles protokoller for bevaring og forsendelse av humane voksne kardiomyocytter (for tiden under evaluering i AnaBios' laboratorium), og kontraktilitetssystemet må ha evnen til å registrere endringer i sarkomerlengde fra ikke-humane kardiomyocytter (dette er tilfellet med det optiske kontraktilitetsregistreringssystemet siden sarkomerer er godt bevart blant arter).
Det humane kardiomyocyttkontraktilitetssystemet kan etterligne flere fysiologiske forhold (f.eks. elektromekanisk kobling, pacingfrekvens som etterligner hjertefrekvens, kroppstemperatur, integrering av alle menneskelige hjertemål) og har vist translasjonsverdi som en nøkkelkomponent i legemiddeloppdagelse11,12,13,14, selv om den ikke kan etterligne endringene i mekanisk belastning og skjærspenning sett under hjertekontraktilsyklusen. Strukturen og funksjonen til ekstracellulære hjertematriser er nå bedre forstått19, utviklingen av slike matriser kan potensielt bidra til å overvinne den mekaniske belastningsbegrensningen, og matriser med forskjellige hjertelignende stivheter blir for tiden evaluert i AnaBios laboratorium. En annen begrensning av det optiske kontraktilitetssystemet for humane kardiomyocytter er fraværet av nettverket av nerver som forsyner hjertet (f.eks. sympatiske og parasympatiske fibre)20. Denne nevrokardiale kontakten kan gjenopprettes ved samtidig bruk av nevrotransmittere (f.eks. isoproterenol, en agonist av β-adrenoceptorreseptorer, acetylkolin, en agonist av M2 muskarinerge reseptorer), med forbindelsen vurdert for potensielle effekter på kardiomyocyttens kontraktilitet. Videre registreres kontraktilitetstransientene uten samtidige målinger av aksjonspotensialer og Ca 2+-transienter, noe som også er avgjørende ved evaluering av medikamenteffekter på elektrokardiogrammet og Ca2+-håndtering. Selv om denne utelatelsen kan betraktes som en begrensning av systemet, er det ikke så kritisk å ha siden opptak av aksjonspotensielle signaler (med strømklemmemetoden eller spenningsfølsomme fargestoffer) og Ca 2+ transienter (med Ca2+ indikatorer / fargestoffer) kan være assosiert med cytotoksisitet. Slike cytotoksiske effekter kan påvirke vurderingen av nye legemidler for å modulere hjertets kontraktilitet. Tvert imot vil bruken av en ikke-invasiv optisk metode som bevarer helsen, fysiologien og farmakologien til kardiomyocyttene, som opptakssystemet beskrevet i denne protokollen, ikke bare sikre at den høyeste kvaliteten på kontraktilitetsdata oppnås, men også gi data som godt kan forutsi kontraktile effekter av nye legemidler hos mennesker.
Disclosures
Alle forfattere er ansatte i AnaBios Corporation og oppgir ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av AnaBios Corporation og et NIH Small Business Innovation Research (SBIR) stipend (1R44TR003162-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100–1000 µL Filtered, Wide Orifice, Sterile tips | Pipette | UF-1000W | |
| 100 mL, Duran pressure plus bottles | DWK Life Sciences | 218102406 | |
| 1 L, 0.22 µm Vacuum Filter system | VWR | 567-0020 | |
| 290 mmol/kg Osmolarity Standard | Wescor | OA-029 | |
| Benchtop pH Meter | Mettler Toledo | https://www.mt.com/us/en/home/products/Laboratory_Analytics_Browse/pH-meter/pH-meters.html | |
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Optronis GmbH | Cyclone-25-150-M | https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/ |
| Corning 25 mm x25 mm Square #1 Cover Glass | Corning | 2845-25 | |
| Cyclone-25-150 | Optronis | https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/ | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Digital Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Eight-well rectangular polystyrene sterile culture plate | Thermo Fisher Scientific | 73521-426 | https://us.vwr.com/store/product/4679368/nunclontm-delta-rectangular-dishes-polystyrene-sterile-thermo-scientific |
| FHD Microscope Chamber System | IonOptix | ||
| Flow EZ, Modular pressure-based flow controller with a computer driven program version 1.1.0.0. | Fluigent OxyGEN | ||
| Heavy Duty Vacuum Bottles | VWR | 16211-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LM521-05 | |
| Idex Chromatography Tubing, Natural FEP, 1/16" OD x 0.030" ID | Cole-Palmer | 1520L | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | 112577 | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | 49449 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Microscope Temperature Control Stage Warmer | AmScope | TCS-100 | |
| MyoPacer Field Stimulator | IonOptix | ||
| Nunc Rectangular Dishes | Thermo Scientific | 267062 | |
| Olympus IX83P1ZF Ixplore Standard microscope | Olympus | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/inverted/ixplore-standard/?campaignid=657680540&adgroupid =116963199831&keyword=ix73%20 microscope&gclid=EAIaIQobChMIl qjyiMWP-AIVVx-tBh2JoQ85EAA YASAAEgLp3fD_BwE |
|
| pH 4.01, 7.00, and 10.01 Standards | Oakton | WD-05942-10 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P4494 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| Prism Software | GraphPad Software - Dotmatics | https://www.graphpad.com/ | |
| RBS 25 Liquid Detergent | Sigma-Aldrich | 83460 | |
| Sharps Container | Uline | S-15307 | |
| SigmaPlot analysis software | Systat Software Inc. | https://systatsoftware.com/ | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Temperature Control Box | Warner Insturments | TC-324C | |
| Vapor Pressure Osmometer | ELITechGroup | Model 5600 | |
| Wheaton 20 mL Vials | DWK Life Sciences | 225288 |
References
- Abi-Gerges, N., Miller, P. E., Ghetti, A. Human heart cardiomyocytes in drug discovery and research: new opportunities in translational sciences. Current Pharmaceutical Biotechnology. 21 (9), 787806 (2020).
- Cook, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five dimensional framework. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).
- Van Meer, B. J., Tertoolen, L. G. J., Mummery, C. L. Measuring physiological responses of human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes to drugs and disease. Stem Cell. 34 (8), 2008-2015 (2016).
- Piccini, J. P., et al. Current challenges in the evaluation of cardiac safety during drug development: translational medicine meets the critical path initiative. American Heart Journal. 158 (3), 317-326 (2009).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Page, G., et al. Human ex-vivo action potential model for pro-arrhythmia risk assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 183-195 (2016).
- Britton, O. J., et al. Quantitative comparison of effects of dofetilide, sotalol, quinidine, and verapamil between human ex vivo trabeculae and in silico ventricular models incorporating inter-individual action potential variability. Frontiers in Physiology. 8, 597 (2017).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 8, 1109 (2017).
- Trovato, C., et al. Human Purkinje in silico model enables mechanistic investigations into automaticity and pro-arrhythmic abnormalities. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 142, 24-38 (2020).
- Otsomaa, L., et al. Discovery and characterization of ORM-11372, a novel inhibitor of the sodium-calcium exchanger with positive inotropic activity. British Journal of Pharmacology. 177 (24), 5534-5554 (2020).
- Nguyen, N., et al. Adult human primary cardiomyocyte-based model for the simultaneous prediction of drug-induced inotropic and pro-arrhythmia risk. Frontiers in Physiology. 8, 1073 (2017).
- Abi-Gerges, N., et al. Multiparametric mechanistic profiling of inotropic drugs in adult human primary cardiomyocytes. Scientific Reports. 10, 7692 (2020).
- Jordaan, P., et al. Cardiotoxic potential of hydroxychloroquine, chloroquine and azithromycin in adult human primary cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 180 (2), 356-368 (2021).
- Ton, A. T., et al. Arrhythmogenic and antiarrhythmic actions of late sustained sodium current in the adult human heart. Scientific Reports. 11, 12014 (2021).
- Schmid, C., Abi-Gerges, N., Leither, M. G., Zellner, D., Rast, G. Ion channel expression and electrophysiology of singular human (primary and induced pluripotent stem cell-derived) cardiomyocytes. Cells. 10 (12), 3370 (2021).
- Guha, R. On exploring structure activity relationships. Methods in Molecular Biology. 993, 81-94 (2013).
- Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Ra then and now: The need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
- Ruiz-Meana, M., Martinson, E. A., Garcia-Dorado, D., Piper, H. M.
- Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S.
- Zaglia, T., Mongillo, M. Cardiac sympathetic innervation, from a different point of (re)view. Journal of Physiology. 595 (12), 3919-3930 (2017).
