Summary
Detta protokoll beskriver hur man mäter kontraktilitet i vuxna humana primära kardiomyocyter från donatorhjärtan med MyoBLAZER-systemet, en tillförlitlig plattform för att bedöma läkemedelsinducerade förändringar i kontraktilitet under preklinisk utveckling.
Abstract
Utvärdering av förändringar i hjärtats kontraktilitet är avgörande under den prekliniska utvecklingen av nya hjärt- och icke-hjärtriktade substanser. Denna artikel beskriver ett protokoll för att bedöma förändringar i kontraktilitet i vuxna humana primära ventrikulära kardiomyocyter med hjälp av MyoBLAZER, en icke-invasiv optisk metod som bevarar cellernas normala fysiologi och farmakologi. Denna optiska inspelningsmetod mäter kontinuerligt kontraktilitetstransienter från flera celler parallellt, vilket ger både medelhög genomströmning och värdefull information för varje enskild cell i synfältet, vilket möjliggör spårning av läkemedelseffekter i realtid. Kardiomyocytsammandragningarna induceras av stimulering av det elektriska fältet, och de insamlade ljusfältsbilderna matas till ett bildbehandlingsprogram som mäter sarkomerförkortningen över flera kardiomyocyter. Denna metod genererar snabbt olika effektmått relaterade till kinetiken för kontraktions- och relaxationsfaser, och de resulterande data kan sedan tolkas i förhållande till olika koncentrationer av en testartikel. Denna metod används också i de sena stadierna av preklinisk utveckling för att utföra uppföljande mekanistiska studier för att stödja pågående kliniska studier. Således har den primära kardiomyocytbaserade modellen för vuxna människor i kombination med det optiska systemet för kontinuerlig kontraktilitetsövervakning potential att bidra till en ny era av översättbarhet av hjärtdata in vitro inom preklinisk medicinsk terapiutveckling.
Introduction
Myokardkontraktilitet (inotropi), som representerar hjärtmuskelns naturliga förmåga att dra ihop sig, är en viktig egenskap hos hjärtfunktionen och beror på dynamiken i den elektromekaniska kopplingen. Läkemedelsinducerade förändringar i myokardkontraktilitet är önskvärda för att behandla hjärtsjukdom (t.ex. hjärtsvikt) och oönskade i samband med kardiotoxicitet (t.ex. minskning av ejektionsfraktion i vänster kammare). Därför måste prekliniska kontraktilitetsmodeller associeras med korrekt prediktivitet för att säkerställa att nya läkemedel kan lyckas under klinisk utveckling. Nuvarande prekliniska strategier, som bygger på reduktionistiska artificiella cellulära modeller (t.ex. genetiskt modifierade immortaliserade cellinjer som överuttrycker specifika hjärtmål av intresse) och icke-humana djurmodeller, har dock visat signifikanta begränsningar och har visat sig vara associerade med höga läkemedelsbortfall (dvs. en hög frekvens av falska signaler)1,2,3,4 . Följaktligen är det absolut nödvändigt att etablera nya och tillförlitliga humana cellulära hjärtkontraktilitetsmodeller som är associerade med hög effekt (dvs. hög frekvens av sanna signaler) för att förutsäga läkemedelsresultat hos människor och därmed bidra till att påskynda lanseringen av nya terapier5.
De banbrytande metoder som nyligen etablerats för tillvaratagande av humana donatorhjärtan för forskning 6,7,8,9,10 och inom kardiomyocytisoleringstekniker 11,12,13,14,15 har gett en unik möjlighet att genomföra humanbaserade studier under preklinisk utveckling. För detta ändamål har vuxna humana primära kardiomyocyter redan visat sig vara användbara vid bedömning av läkemedelsinducerade förändringar i hjärtkontraktilitethos människa 11,12,13,14. Den aktuella artikeln beskriver protokollet för att undersöka kontraktilitetseffekterna av nya föreningar i vuxna humana kardiomyocyter.
Protocol
Alla metoder utfördes i enlighet med relevanta riktlinjer och föreskrifter. Alla mänskliga hjärtan som användes för studierna var icke-transplanterbara och etiskt erhållna genom informerat juridiskt samtycke (första person eller närmast anhörig) från organdonatorer i USA (USA). Återhämtningsprotokollen och in vitro-experimenten godkändes i förväg av Institutional Review Boards (IRB) vid transplantationscentra inom US Organ Procurement Transplant Network (OPTN). Dessutom är alla överföringar av donatorhjärtan fullt spårbara och granskas regelbundet av amerikanska federala myndigheter.
OBS: Tillämpa alla nödvändiga säkerhetsprocedurer under utförandet av detta protokoll, inklusive att bära lämplig personlig skyddsutrustning (t.ex. laboratorierockar, skyddsglasögon, handskar).
1. Isolering av kardiomyocyter (1 dag före mätning av kontraktilitet)
- Ge donatorhjärtan en ny injektion omedelbart efter ankomst till laboratoriet med iskall kardioplegisk lösning6 och isolera enzymatiskt vuxna humana primära myocyter från ventriklarna 11,12,13,14,15.
- Håll sedan kardiomyocyterna i suspension och förvara dem med 10 ml lösning A (110 mM sackaros, 0,005 mM CaCl 2, 3 mM MgCl 2, 70 mM KOH, 60 mM laktobionsyra, 10 mM KH 2 PO4, 20 mM taurin, 20 mM L-histidin, 20 mM HEPES, 2 mM L-glutaminsyra, 2 mM L-(-)-äppelsyra, pH 7,4 med KOH) i 20 ml Wheaton-ampuller (materialtabell) vid en kyld temperatur tills de har undersökts experimentellt.
OBS: Förvara 200 000 celler per injektionsflaska.
2. Beredning av lamininbeläggning (1 dag före mätning av kontraktilitet)
- Placera ett enda glastäcke (25 mm x 25 mm kvadratiskt, Materialtabell) i varje brunn på en odlingsplatta med åtta brunnar (Materialtabell).
- Täckglasen beläggs sedan med laminin med en koncentration på 5 μg/ml. Tillsätt 800 μl humant rekombinant Laminin 521-stam (Materialförteckning, förvarad vid −20 °C) till 7,2 ml lösning B (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11,1 mM glukos och 10 mM HEPES, pH 7,4 med NaOH) och blanda väl.
- Släpp 200 μl av den utspädda lamininlösningen i mitten av varje täckglas. Täck sedan över tallriken och stapla den i en 4 °C kyl.
OBS: Förbered flera odlingsplattor med åtta brunnar för att säkerställa att det finns tillräckligt med lamininbelagda täckglas.
3. Beredning av Ca2+-toleranta kardiomyocyter (på dagen för mätning av kontraktilitet)
- Ta ut en injektionsflaska med celler ur kylskåpet, aspirera lösning A från injektionsflaskan och tillsätt 10 ml lösning B i kylskåp.
OBS: Se till att cellerna inte sugs och dispergera lösning B i injektionsflaskan genom att placera pipetten på insidan av toppen av injektionsflaskans vägg. - Täck injektionsflaskan med celler och snurra sedan försiktigt för att säkerställa att cellerna är dispergerade i lösning B. Låt slutligen cellerna sätta sig i 1 timme vid rumstemperatur (RT).
4. Förberedelse av registreringssystemet (på dagen för mätning av kontraktiliteten)
OBS: Registreringssystemet inkluderar en temperaturkontrollbox, stimulator, datorstyrd tryckdriven perfusion, tryckdrivna perfusionsflaskor, intern förvärvsprogramvara som möjliggör val av intresseområden (ROI) och visning av kontraktilitetstransienter, inverterat mikroskop, cellkammare och kamera (figur 1).
- Slå på sugvakuumsystemet. Ta sedan bort mikroskopkåpan, slå på den, anslut kameran (Materialtabell, figur 1) och bekräfta slutligen att fläkten är påslagen för att säkerställa att kameran inte överhettas.
- Slå sedan på mikroskopets värmeplatta (materialtabell) och temperaturkontrollbox (materialtabell, figur 1) och ställ in dem på rätt driftstemperatur. Slå sedan på fältstimulatorn (materialtabell, figur 1) och trycksystemet. Anslut slutligen lösningens slang (Materialförteckning) till inspelningskammaren (Materialförteckning, figur 1).
5. Beredning av testföreningar (på dagen för mätning av kontraktilitet)
- Utspädd dimetylsulfoxid (DMSO; Materialförteckning) 1 000 gånger i lösning C (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11,1 mM glukos och 10 mM HEPES, pH 7,4 med NaOH) för att göra en 0,1 % DMSO-vehikellösning.
- För att testa en förening vid 1-faldig, 10-faldig, 100-faldig och 1000-faldig av dess terapeutiska exponering på 0,001 μM, lös upp testföreningen i DMSO vid en koncentration av 1 mM.
- Späd denna lösning seriellt med DMSO för att producera ytterligare tre DMSO-lager (t.ex. 0,001 mM, 0,01 mM och 0,1 mM). Späd slutligen varje testföreningsstam 1 000 gånger i 100 ml lösning C för att erhålla slutliga testkoncentrationer (0,001 μM, 0,01 μM, 0,1 μM och 1 μM).
- Tillsätt vehikellösningen och lösningarna med slutliga mikromolära koncentrationer av föreningen till 100 ml glasflaskor (Materialtabell, figur 1) och anslut sedan flaskorna till det tryckdrivna perfusionssystemet (Materialtabell, figur 1).
- Förbered sedan perfusionssystemet med ett datordrivet program (Table of Materials) med ett tryck på 200-300 mbar för att leverera ett konstant perfusionsflöde med en hastighet av 1,8 ml/min.
OBS: Utför inte experimentet om testföreningen visar sig vara förknippad med ett löslighetsproblem. Formulera också de sammansatta testlösningarna från stamlösningar inom 30 minuter före experimentell applicering på cellerna.
6. Plätering av kardiomyocyter (på dagen för mätning av kontraktilitet)
- Ta ut en åttahålsplatta med lamininbelagda täckglas ur kylskåpet med 4 °C och placera försiktigt ett täckglas i en mycket väl rengjord inspelningskammare (figur 1). Ställ sedan tillbaka åttahålsplattan i kylskåpet med 4 °C tills nästa plätering.
OBS: Använd en luddfri våtservett (Materialförteckning) för att torka upp den belagda täckhalen samtidigt som täckglaset är belagt med ett tunt lager laminin. Se också till att slänga använda täckglas i en behållare för vassa föremål. - Ta sedan en upptrappad injektionsflaska med celler (steg 3.2) och aspirera lösning B från injektionsflaskan för att nå en så liten volym som möjligt utan att förlora celler (~200 μL). Dispensera sedan 200 μL celler i inspelningsmikroskopkammaren monterad på scenen i ett inverterat mikroskop (Materialtabell).
- Låt cellerna lägga sig på täckglaset i 5 min. Medan du väntar på att cellerna ska sätta sig helt, öppna synfältet på mikroskopet och bestäm om celldensiteten är tillräcklig (~70%) för att experimentkörningen ska börja.
OBS: Se till att suget inte suger bort alla celler om mer än 200 μL dispenseras.
7. Registrering av kardiomyocytkontraktilitet
- Efter att pläteringen är klar, jämvikt cellerna i 5 minuter genom att kontinuerligt perfusionera dem med lösning C med hjälp av det tryckdrivna perfusionssystemet (Materialtabell). Justera suget korrekt, slå på både temperaturkontrollboxen och värmeplattan och ställ in dem så att de levererar ~35 °C.
- Stimulera sedan cellerna med supratröskelspänning vid en stimuleringsfrekvens på 1 Hz (bipolär puls med 3 ms varaktighet) på en fältstimulator med ett par platinatrådar placerade på motsatta sidor av kammaren anslutna till en fältstimulator.
- Ställ in amplituden för den stimulerande pulsen till 1 V och öka den sedan tills kardiomyocyterna börjar generera kontraktionsavslappningscykler. Använd ett värde på 1,5x tröskelvärdet under hela experimentet.
OBS: Välj friska celler med stavformad morfologi och tydliga strimmor. Justera sedan synfältet och fokusera på att få så många sammandragande celler som möjligt i sikte (Figur 2A). - Visa sedan de digitaliserade bilderna av cellerna i insamlingsprogramvaran för det optiska kontraktilitetsinspelningssystemet. Denna programvara använder en högupplöst kamera med hög bildhastighet med en hastighet på 150 FPS (Materialförteckning, figur 1) för att spela in en videoström som innehåller flera myocyter i samma bildruta.
OBS: Detta ger tillräcklig tidsmässig och rumslig upplösning för att fånga och mäta sarkomerdynamiken hos flera friska myocyter samtidigt. Moderna processorer med högt antal kärnor används för att möjliggöra parallell beräkning av förändringar i sarkomerlängd från videoströmmen i realtid (optiska densitetsdata samlas in från användardefinierade intresseområden [ROI] placerade över bilderna av friska kardiomyocyter och parallellt med kontraktionsaxeln, figur 2B). De optiska intensitetsdata visar ljusa och mörka band som motsvarar Z-linjerna i kardiomyocyterna (Figur 1, Figur 2C). Slutligen visas dessa data för användaren i övervakningssyfte och sparas på en disk för senare analys (figur 2C).- Undvik områden i cellerna som inte är i fokus. Placera inte heller ROI:erna nära cellernas kant, eftersom förändringarna i cellernas sammandragning under appliceringen av läkemedel kan göra att ROI:erna inte kan läsa av cellernas sammandragning.
- När valet av ROI är klart och kontraktionerna uppfyller de nödvändiga standarderna för användning (t.ex. sarkomerförkortning >1 %; rytmisk sammandragning vid applicering av en stimuleringsfrekvens på 1 Hz, frånvaro av arytmiska händelser), starta experimentet för att bedöma effekterna av en förening. Stimuleringsprotokollet och sekvensen för föreningens applicering av testkoncentrationer visas i tabell 1. Programvaran för insamling kommer att på ett automatiserat sätt hantera insamling och visning av data och märkning av testkoncentrationer och behandlingstid.
ANM.: Tillämpa testkoncentrationer om sammandragningen förblir vid en stabil amplitud under hela baslinjeperioden. Diskvalificera celler som visar antingen en upp- eller nedkörning. Se också till att perfusionen växlas till de olika testkoncentrationerna under hela experimentet.
- När experimentet är klart och datalagringen på servern, stäng av perfusionen och värmaren, stoppa stimuleringen, rengör mikroskopkammaren med destillerat vatten, ta sedan bort glaset och torka kammaren noggrant.
OBS: Rengör kammaren noggrant eftersom detta är avgörande för att undvika att utsätta nästa uppsättning celler för någon förening i förtid, vilket ogiltigförklarar all insamlad data. - Utför sedan en ny plätering av kardiomyocyter och utför ytterligare ett experiment för att få tillräckligt med data för att slutföra testningen av föreningen eller testa en ny förening.
8. Stänga av det optiska kontraktilitetsregistreringssystemet
- När den dagliga testningen av föreningen/föreningarna är klar, stäng först av all utrustning som inte är nödvändig för att rengöra systemet och kopiera data för offlineanalys.
- Ta sedan bort de 100 ml glasflaskorna (materialtabell) som innehåller lösningar med slutliga testkoncentrationer och ersätt dem med glasflaskor som är halvvägs fyllda med RBS 25-koncentratlösning (materialförteckning). Genomborra RBS-lösningen genom mikroskopkammaren i 5 minuter, koppla sedan bort perfusionsslangen från kammaren, rengör den med destillerat vatten och torka den slutligen noggrant.
OBS: Se till att vakuumet fungerar bra för att förhindra eventuell översvämning. - Anslut sedan perfusionsslangen till dräneringsslangen. Använd programvaran för det tryckdrivna perfusionssystemet (Materialtabell), kör RBS-lösningen i 10 minuter samtidigt som du säkerställer att trycket och flödeshastigheten är korrekt inställda. Perfuse sedan 1% DMSO i 5 minuter och sedan destillerat vatten i 15-20 minuter för att slutföra rengöringen av perfusionssystemet.
- Stäng av mikroskoplampan och sätt på locket. Koppla sedan ur kamerakablarna från lådan på sidan av mikroskopet och stäng av fläkten. Se till att alla använda flaskor skickas för rengöring och autoklav. Slutligen, se till att alla dräneringshinkar är 1/4 fulla eller mindre.
OBS: Se till att det finns tillräckligt med lamininbelagda täckglas för användning följande dag. - Slutligen, kopiera filerna i förvärvsmappen för alla experiment som gjorts på varje inspelningssystem och klistra in dem i en säker säkerhetskopieringsserver för ytterligare offlineanalys. Ta sedan bort alla datafiler från förvärvsmappen.
9. Analys av kontraktilitetsdata
- Utför offlineanalys med hjälp av analysprogramvaran och ett skräddarsytt makro för att beräkna medelvärdet av data. Analysprogramvaran beräknar och rapporterar olika mätvärden från sarkomerdynamikdata som produceras av förvärvsprogramvaran. En detaljerad förteckning över dessa parametrar finns i figur 2D.
OBS: Tillämpningen av programvarutekniker på låg nivå gör att många inspelningar kan analyseras på 5 sekunder. Den huvudsakliga parametern för att bedöma läkemedelsinducerade förändringar i kontraktilitet är kontraktilitetsamplituden (sarkomerförkortning % = förändring i sarkomerlängd). Den beräknas som sarkomerlängden vid maximal kontraktion/vilande sarkomerlängd och beräknas som medelvärde över de senaste 20 kontraktilitetstransienterna för varje testkoncentration. - Kvantifiera testsubstansens effekter på den genomsnittliga kontraktilitetsamplituden i förhållande till varje kardiomyocyts specifika baslinjekontrolltillstånd.
- Uttryck medelvärdet ± SEM och rita en graf som visar testämnets koncentrationseffekt på kontraktilitetsamplituden. Anpassa sedan koncentration-responskurvan till Hill-ekvationen med hjälp av analysprogramvara (Table of Materials) för att härleda värdena IC50 (koncentration som ger en 50 % hämning av kontraktilitetsamplitude) och EC50 (koncentration som ger en 50 % ökning av kontraktilitetsamplituden).
- Förutom kontraktilitetsamplituden kan du även beräkna andra parametrar:
- Efterkontraktion: Identifiera efterkontraktion som en spontan sekundär sammandragning av kardiomyocyten som inträffar före nästa regelbundna sammandragning och ger en onormal och osynkroniserad sammandragning.
- Kontraktionsfel: Identifiera kontraktionsfel som oförmågan hos den elektriska stimulansen att inducera en kontraktion.
- Korttidsvariabilitet (STV) och alternans: Visualisera dessa två parametrar i Poincaré-diagram över kontraktionsamplitudvariabilitet.
- Beräkna STV (∑|CAn + 1 − CAn| (20 × √2) −1) med de sista 20 transienterna i varje kontroll- och testartikelkoncentrationsperiod. Identifiera alternans som repetitiva alternerande korta och långa kontraktilitetsamplitudtransienter.
- För att beräkna incidensen av proarytmi, normalisera STV-värdena till vehikelkontrollvärdet för varje cell, plotta efterkontraktion, kontraktionsfel, STV och alternans, och uttrycka dem i % av incidensen av celler som uppvisar var och en av signalerna.
- Slutför den multiparametriska mekanistiska profileringen med beräkning av tid Ato topp, sönderfall till 30 % relaxation (sönderfall 30), sönderfall till 90 % relaxation (sönderfall 90), tid till 90 % relaxation (TR90) (figur 2D), baslinje sarkomerlängd, tid till 50 % topp, topphöjd, sarkomerlängd vid maximal kontraktilitet, maximal kontraktionshastighet och maximal relaxationshastighet12. Liksom kontraktilitetsamplituden, uttryck dessa parametrar i förhållande till varje kardiomyocyts specifika kontrolltillstånd vid baslinjen och rita upp dem i koncentrations-responsdiagram.
Representative Results
I detta protokoll beskrivs en procedur för att mäta kontraktiliteten i isolerade primära kardiomyocyter hos vuxna människor från organdonatorer och utvärdera akuta förändringar i kontraktilitetsparametrar som inducerats av en testsubstans. Mätningen av kontraktilitetstransienten åstadkoms med hjälp av ett videobaserat cellgeometrisystem, MyoBLAZER, som mäter sarkomerdynamik, och det vuxna hjärttillståndet emuleras genom att inducera kontraktilitet med elektrisk stimulering vid den fysiologiska stimuleringsfrekvensen (1 Hz). Kardiomyocyternas funktionella livskraft bekräftas genom att bedöma deras excitation-kontraktionskoppling (dvs. cellulär bearbetning som kopplar elektrisk excitation [den sarkolemmala aktionspotentialen] med kontraktion). Det finns inga spontana kontraktilitetstransienter i humana kardiomyocyter, och kardiomyocyterna svarar på extern elektrisk stimulering med kontraktilitets-/relaxationscykler (Figur 2C, E), liksom på isoproterenol, en β-adrenerg agonist (Figur 2F,G). Isoproterenol orsakar en koncentrationsberoende ökning av kontraktiliteten (Figur 2G), och dess effekter på kinetiken för kontraktilitet kan också karakteriseras (Figur 2D)12.
Figur 1: Experimentell uppställning av registreringssystemet för optisk kontraktilitet. Ljusfältskontraktilitetsregistreringar görs från vuxna humana primära kardiomyocyter som tidigare beskrivits11,12,13,14. Installationen inkluderar en (A) temperaturkontrollbox, (B) fältstimulator, (C,D) tryckdrivet perfusionssystem, (E) datortryckdrivet program, (F) tryck plusflaskor, (G) insamlingsprogramvara, (H) val av ROI med insamlingsprogramvara, (I) visning av kontraktilitetstransienter med insamlingsprogramvara, (J) inverterat mikroskop, (K) mikroskopkammare och ( L) kamera. Alla utrustningens funktioner anges i materialförteckningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Validering av mätning av kontraktilitet hos humana kardiomyocyter och effekten av β-adrenerg stimulering. (A) Faskontrastmikroskopibild av en representativ vuxen human primär kardiomyocyt, (B) användardefinierade intresseområden (ROI) placerade över bilderna av friska kardiomyocyter och parallellt med kontraktionsaxeln, (C) Visning av kontraktilitetstransienter erhållna från samma ROI i (B) med insamlingsprogramvaran, (D) Parametrar relaterade till kontraktilitetstransienten mätt med insamlingsprogramvaran: kontraktilitetsamplitude, tid till topp, Decay 30, Decay 90, TR90. Ytterligare parametrar kan också mätas: sarkomerlängd vid baslinjen, tid till 50 % topp, topphöjd, sarkomerlängd vid maximal kontraktilitet, maximal kontraktionshastighet och maximal relaxationshastighet. E) Typiska kontraktilitetstransienter registrerade från en vuxen människa primär ventrikuär myocyt vid en stimuleringsfrekvens på 1 Hz i närvaro av vehikelkontroll (F) och efter exponering för 30 nM isoproterenol, en icke-selektiv β-adrenerg agonist. Kontraktilitetstransienterna som påvisades i panelerna E och F samlades in från samma kardiomyocyt. Isoproterenol från humana kardiomyocyter med en stimuleringsfrekvens på 1 Hz användes för att generera potensinformationen. G) Typisk kumulativ koncentration-responskurva genererad genom mätning av kontraktilitet hos humana kardiomyocyter med isoproterenol (n = 8 celler). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Perfusionssekvens | Lösning för fordon | Koncentration 1 (μM) | Koncentration 2 (μM) | Koncentration 3 (μM) | Koncentration 4 (μM) | Tvätta |
| Behandlingstid | 120 sek | 300-talet | 300-talet | 300-talet | 300-talet | 300-talet |
| Stimulering frekvens | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz |
Tabell 1: Stimuleringsprotokoll och appliceringssekvens för testsubstansen. Kontraktilitetstransienternas stabilitet bedöms genom kontinuerlig registrering under 120 s i lösning C, varvid vehikelkontrollen fastställs (vanligtvis i 0,1 % DMSO). Därefter appliceras testartikelns koncentration i minst 300 s eller tills en steady-state-effekt uppnås. Fyra stigande koncentrationer av testartiklar används, vilket ger kumulativa koncentrationseffektkurvor (C-E). I slutet av de kumulativa tilläggen av testartikeln kan en 300-s wash-out-period implementeras.
Discussion
Detta manuskript ger ett detaljerat protokoll för det vuxna humana kardiomyocytkontraktilitetsbaserade optiska systemet för en förenklad medium-throughput-metod som möjliggör testning av den akuta effekten och kardiotoxiciteten hos nya föreningar. Detta optiska kontraktilitetsregistreringssystem är lätt att använda, tillåter inspelningar från flera celler parallellt, möjliggör samtidig bedömning av cellhälsa, fysiologi och farmakologi, levereras med automatiserad och snabb dataanalys (en körning av flera celler analyseras på 5 s) och möjliggör snabb datainsamling (koncentration-responskurva var 30:e minut/förening/enhet). Med hänsyn till dessa egenskaper kan registreringssystemet användas inte bara för att detektera effekterna av läkemedel på kardiomyocytkontraktilitet utan också för att tillhandahålla struktur-aktivitetsrelationsdata för att stödja läkemedelskemiinsatser under de tidiga faserna av läkemedelsupptäckt16. Eftersom tiotals miljoner celler kan erhållas från ett protokoll för isolering av kardiomyocyter, undersöks för närvarande tillämpningen av det optiska kontraktilitetsregistreringssystemet-kardiomyocytplattformen för att uppnå ökad testkapacitet (med användning av välbaserade plattor) till reducerad kostnad. Dessutom kan bedömningen av läkemedelseffekter på de systoliska och relaxationsparametrarna som mäts med registreringssystemet ge multiparametrisk mekanistisk profilering av inotropa läkemedel12. Dessutom kan data om kardiomyocytkontraktilitet användas för att rangordna nya läkemedel från mest till minst kardiotoxisk (t.ex. säkerhetsmarginal) och från minst till mest effektiv (t.ex. potensmarginal). Uppföljande studier av kardiomyocytkontraktilitet kan också utföras för att stödja utvecklingsprogram som har associerats med en klinisk minskning av myokardiell kontraktilitet12.
En annan betydande fördel med att använda det optiska registreringssystemet för humana kardiomyocytkontraktiliteter är dess anpassning till 3R-konceptet (ersättning, reduktion och förfining)17 eftersom det kan betraktas som en alternativ metod som undviker eller ersätter användningen av djur för datagenerering inom läkemedelsindustrin. Denna 3R-fördel kan också utvidgas till akademisk hjärtforskning. All aktuell kunskap om kardiomyocytfysiologi och farmakologi kommer från akademiska forskningsstudier utförda med celler isolerade från djurhjärtan18. Således öppnar den humana kardiomyocytens optiska kontraktilitetsmodell möjligheten för kritiska translationella studier att utföras. För att utföra dessa studier måste protokoll för bevarande och transport av humana vuxna kardiomyocyter utvecklas (för närvarande under utvärdering i AnaBios laboratorium), och kontraktilitetssystemet måste ha förmågan att registrera förändringar i sarkomerlängd från icke-humana kardiomyocyter (detta är fallet med det optiska kontraktilitetsregistreringssystemet eftersom sarkomerer är väl bevarade bland arter).
Det humana kardiomyocytkontraktilitetssystemet kan efterlikna flera fysiologiska tillstånd (t.ex. elektromekanisk koppling, stimuleringsfrekvens som efterliknar hjärtfrekvens, kroppstemperatur, integration av alla mänskliga hjärtmål) och har visat translationellt värde som en nyckelkomponent i läkemedelsutveckling11,12,13,14, även om den inte kan efterlikna de förändringar i mekanisk belastning och skjuvspänning som ses under hjärtats kontraktila cykel. Strukturen och funktionen hos extracellulära matriser i hjärtat är nu bättre förstådda19, utvecklingen av sådana matriser kan potentiellt hjälpa till att övervinna den mekaniska belastningsbegränsningen, och matriser med olika hjärtliknande styvheter utvärderas för närvarande i AnaBios laboratorium. En annan begränsning i det mänskliga kardiomyocytoptiska kontraktilitetssystemet är frånvaron av det nätverk av nerver som försörjer hjärtat (t.ex. sympatiska och parasympatiska fibrer)20. Denna neuro-hjärtkontakt kan återupprättas med samtidig applicering av neurotransmittorer (t.ex. isoproterenol, en agonist för β-adrenoceptorreceptorer; acetylkolin, en agonist för M2-muskarinreceptorer), där föreningen utvärderas för dess potentiella effekter på kardiomyocytkontraktilitet. Dessutom registreras kontraktilitetstransienter utan samtidiga mätningar av aktionspotentialer och Ca 2+-transienter, vilket också är viktigt vid utvärdering av läkemedelseffekter på elektrokardiogrammet och Ca2+-hanteringen. Även om detta utelämnande kan betraktas som en begränsning av systemet, är det inte alltför kritiskt att ha eftersom registreringarna av aktionspotentialsignaler (med strömklämsmetoden eller spänningskänsliga färgämnen) och Ca 2+-transienter (med Ca2+-indikatorer/färgämnen) kan associeras med cytotoxicitet. Sådana cytotoxiska effekter kan påverka bedömningen av nya läkemedel för att modulera hjärtats kontraktilitet. Tvärtom skulle användningen av en icke-invasiv optisk metod som bevarar kardiomyocyternas hälsa, fysiologi och farmakologi, som det registreringssystem som beskrivs i detta protokoll, inte bara säkerställa att kontraktilitetsdata av högsta kvalitet erhålls utan också ge data som väl kan förutsäga de kontraktila effekterna av nya läkemedel hos människor.
Disclosures
Samtliga författare är anställda av AnaBios Corporation och uppger inga motstridiga intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av AnaBios Corporation och ett anslag från NIH Small Business Innovation Research (SBIR) (1R44TR003162-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100–1000 µL Filtered, Wide Orifice, Sterile tips | Pipette | UF-1000W | |
| 100 mL, Duran pressure plus bottles | DWK Life Sciences | 218102406 | |
| 1 L, 0.22 µm Vacuum Filter system | VWR | 567-0020 | |
| 290 mmol/kg Osmolarity Standard | Wescor | OA-029 | |
| Benchtop pH Meter | Mettler Toledo | https://www.mt.com/us/en/home/products/Laboratory_Analytics_Browse/pH-meter/pH-meters.html | |
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Optronis GmbH | Cyclone-25-150-M | https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/ |
| Corning 25 mm x25 mm Square #1 Cover Glass | Corning | 2845-25 | |
| Cyclone-25-150 | Optronis | https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/ | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Digital Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Eight-well rectangular polystyrene sterile culture plate | Thermo Fisher Scientific | 73521-426 | https://us.vwr.com/store/product/4679368/nunclontm-delta-rectangular-dishes-polystyrene-sterile-thermo-scientific |
| FHD Microscope Chamber System | IonOptix | ||
| Flow EZ, Modular pressure-based flow controller with a computer driven program version 1.1.0.0. | Fluigent OxyGEN | ||
| Heavy Duty Vacuum Bottles | VWR | 16211-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LM521-05 | |
| Idex Chromatography Tubing, Natural FEP, 1/16" OD x 0.030" ID | Cole-Palmer | 1520L | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | 112577 | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | 49449 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Microscope Temperature Control Stage Warmer | AmScope | TCS-100 | |
| MyoPacer Field Stimulator | IonOptix | ||
| Nunc Rectangular Dishes | Thermo Scientific | 267062 | |
| Olympus IX83P1ZF Ixplore Standard microscope | Olympus | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/inverted/ixplore-standard/?campaignid=657680540&adgroupid =116963199831&keyword=ix73%20 microscope&gclid=EAIaIQobChMIl qjyiMWP-AIVVx-tBh2JoQ85EAA YASAAEgLp3fD_BwE |
|
| pH 4.01, 7.00, and 10.01 Standards | Oakton | WD-05942-10 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P4494 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| Prism Software | GraphPad Software - Dotmatics | https://www.graphpad.com/ | |
| RBS 25 Liquid Detergent | Sigma-Aldrich | 83460 | |
| Sharps Container | Uline | S-15307 | |
| SigmaPlot analysis software | Systat Software Inc. | https://systatsoftware.com/ | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Temperature Control Box | Warner Insturments | TC-324C | |
| Vapor Pressure Osmometer | ELITechGroup | Model 5600 | |
| Wheaton 20 mL Vials | DWK Life Sciences | 225288 |
References
- Abi-Gerges, N., Miller, P. E., Ghetti, A. Human heart cardiomyocytes in drug discovery and research: new opportunities in translational sciences. Current Pharmaceutical Biotechnology. 21 (9), 787806 (2020).
- Cook, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five dimensional framework. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).
- Van Meer, B. J., Tertoolen, L. G. J., Mummery, C. L. Measuring physiological responses of human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes to drugs and disease. Stem Cell. 34 (8), 2008-2015 (2016).
- Piccini, J. P., et al. Current challenges in the evaluation of cardiac safety during drug development: translational medicine meets the critical path initiative. American Heart Journal. 158 (3), 317-326 (2009).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Page, G., et al. Human ex-vivo action potential model for pro-arrhythmia risk assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 183-195 (2016).
- Britton, O. J., et al. Quantitative comparison of effects of dofetilide, sotalol, quinidine, and verapamil between human ex vivo trabeculae and in silico ventricular models incorporating inter-individual action potential variability. Frontiers in Physiology. 8, 597 (2017).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 8, 1109 (2017).
- Trovato, C., et al. Human Purkinje in silico model enables mechanistic investigations into automaticity and pro-arrhythmic abnormalities. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 142, 24-38 (2020).
- Otsomaa, L., et al. Discovery and characterization of ORM-11372, a novel inhibitor of the sodium-calcium exchanger with positive inotropic activity. British Journal of Pharmacology. 177 (24), 5534-5554 (2020).
- Nguyen, N., et al. Adult human primary cardiomyocyte-based model for the simultaneous prediction of drug-induced inotropic and pro-arrhythmia risk. Frontiers in Physiology. 8, 1073 (2017).
- Abi-Gerges, N., et al. Multiparametric mechanistic profiling of inotropic drugs in adult human primary cardiomyocytes. Scientific Reports. 10, 7692 (2020).
- Jordaan, P., et al. Cardiotoxic potential of hydroxychloroquine, chloroquine and azithromycin in adult human primary cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 180 (2), 356-368 (2021).
- Ton, A. T., et al. Arrhythmogenic and antiarrhythmic actions of late sustained sodium current in the adult human heart. Scientific Reports. 11, 12014 (2021).
- Schmid, C., Abi-Gerges, N., Leither, M. G., Zellner, D., Rast, G. Ion channel expression and electrophysiology of singular human (primary and induced pluripotent stem cell-derived) cardiomyocytes. Cells. 10 (12), 3370 (2021).
- Guha, R. On exploring structure activity relationships. Methods in Molecular Biology. 993, 81-94 (2013).
- Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Ra then and now: The need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
- Ruiz-Meana, M., Martinson, E. A., Garcia-Dorado, D., Piper, H. M.
- Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S.
- Zaglia, T., Mongillo, M. Cardiac sympathetic innervation, from a different point of (re)view. Journal of Physiology. 595 (12), 3919-3930 (2017).
