Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול ייצור לסוג חדש של מצע תרבית עם מאות מיקרו-מיכלים למ"מ2, שבו ניתן לגדל אורגנואידים בתרבית ולצפות בהם באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. פרוטוקולי זריעת התאים ומערכת החיסון מפורטים גם הם.
Abstract
אפיון מספר רב של תרביות אורגנוטיפיות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) בסקאלות רזולוציה שונות מוגבל כיום על ידי גישות הדמיה סטנדרטיות. פרוטוקול זה מתאר דרך להכין שבבי תרבית אורגנואידים מיקרו-מפוברקים, המאפשרים הדמיה חיה תלת-ממדית בקנה מידה רב-ממדי במכשיר ידידותי למשתמש הדורש מניפולציות מינימליות ומסוגל לתפוקת הדמיה של עד 300 אורגנואידים/שעה. שבבי תרבית אלה תואמים הן למטרות אוויר והן למטרות טבילה (אוויר, מים, שמן וסיליקון) ולמגוון רחב של מיקרוסקופים נפוצים (למשל, דיסק מסתובב, סורק נקודתי קונפוקלי, שדה רחב ושדה בהיר). יתר על כן, ניתן להשתמש בהם עם שיטות גיליון אור כגון טכנולוגיית מיקרוסקופ הארה חד-אובייקטיבי וחד-מישורי (SPIM) (soSPIM).
הפרוטוקול המתואר כאן נותן צעדים מפורטים להכנת שבבי התרבית המיקרו-מפוברקים ולתרבית והצביעה של אורגנואידים. רק פרק זמן קצר נדרש כדי להכיר, וניתן למצוא בקלות חומרים מתכלים וציוד במעבדות ביולוגיות רגילות. כאן, יכולות ההדמיה התלת-ממדית יודגמו רק באמצעות מיקרוסקופים סטנדרטיים מסחריים (למשל, דיסק מסתובב לשחזור תלת-ממדי ומיקרוסקופ שדה רחב לניטור שגרתי).
Introduction
בתרביות תאים תלת-ממדיות אורגנוטיפיות, המכונות להלן אורגנואידים, תאי גזע מתמיינים ומתארגנים בעצמם למבנים מרחביים החולקים דמיון מורפולוגי ותפקודי חזק עם איברים אמיתיים. אורגנואידים מציעים מודלים יקרי ערך לחקר הביולוגיה האנושית והתפתחות מחוץ לגוף 1,2,3. מספר גדל והולך של מודלים מפותחים המחקים את הכבד, המוח, הכליות, הריאות ואיברים רבים אחרים 2,4,5. התמיינות באורגנואידים מכוונת על ידי תוספת של גורמי גדילה מסיסים ומטריצת חוץ תאיים ברצף זמן מדויק. עם זאת, בניגוד בולט לאיברים, התפתחות אורגנואידים היא הטרוגנית למדי.
מעבר לאתגרים ביולוגיים רבים6,7, תרביות אורגנואידים מציבות אתגרים טכנולוגיים גם מבחינת שיטות תרביות תאים, אפיון שעתוק והדמיה. התפתחות איברים In vivo מתרחשת בסביבה ביולוגית הגורמת לארגון עצמי סטריאוטיפי ביותר של סידורי תאים. כל שינוי פנוטיפי יכול לשמש כפרוקסי לאבחון מצב חולה. לעומת זאת, אורגנואידים מתפתחים במבחנה במיקרו-סביבות מבוקרות מינימליות התואמות לתנאי תרבית תאים, וכתוצאה מכך נוצרת שונות גדולה בנתיב ההתפתחות ובהיווצרות הצורה עבור כל אורגנואיד בודד.
מחקר8 שנערך לאחרונה הראה כי הדמיה כמותית של צורת אורגנואידים (מתארי פנוטיפ) בשילוב עם הערכה של כמה סמנים גנטיים מאפשרים הגדרה של נופי התפתחות פנוטיפיים. ניתן לטעון כי היכולת לקשר בין מגוון הביטוי הגנומי באורגנואידים לבין התנהגותם הפנוטיפית היא צעד חשוב לקראת שחרור מלוא הפוטנציאל של תרבויות אורגנוטיפיות. לפיכך, היא מבקשת לפתח גישות הדמיה ייעודיות בעלות תוכן גבוה המאפשרות אפיון תכונות אורגנואידים בקנה מידה תת-תאי, רב-תאי ואורגנואיד שלם בתלת-ממד 9,10.
פיתחנו פלטפורמה רב-תכליתית לסינון תוכן גבוה (HCS) המאפשרת תרבית אורגנואידים יעילה (החל מתאי גזע עובריים אנושיים מבודדים [hESCs], תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם [hIPSCs], או תאים ראשוניים ועד אורגנואידים תלת-ממדיים, רב-תאיים ומובחנים) והדמיה תלת-ממדית מהירה ולא פולשנית. הוא משלב מכשיר תרבית תאים תלת-ממדי ממוזער מהדור הבא, הנקרא שבב JeWells ( השבב להלן), המכיל אלפי מיקרו-בארות ערוכות היטב ומשני צדיהן מראות 45° המאפשרות הדמיה מהירה, תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ אור11 חד-אובייקטיבי. מערכת זו, התואמת לכל מיקרוסקופ הפוך מסחרי סטנדרטי, מאפשרת הדמיה של 300 אורגנואידים בתלת-ממד ברזולוציה תת-תאית תוך <1 שעות.
המיקרו-ייצור של התקן תרבית התאים מתחיל מתבנית מיקרו-מובנית קיימת, שמכילה מאות מיקרו-פירמידות (איור 1A) עם בסיס מרובע ודפנות צדדיות ב-45° ביחס לבסיס. איור 1C מראה תמונות של מבנים כאלה במיקרוסקופ אלקטרונים (EM). התבנית עצמה עשויה פולי(דימתילסילוקסן) (PDMS) וניתן ליצור אותה כהעתק של תבנית ראשונית (לא מוצגת כאן) עם תכונות מתאימות (כחללים) באמצעות הליכים ליתוגרפיים רכים סטנדרטיים. התבנית העיקרית יכולה להיות מיוצרת על ידי הליכים שונים. זה ששימש לפרוטוקול זה נעשה באמצעות תחריט רטוב סיליקון כפי שדווח Galland et al. 11; הליך ייצור התבנית הראשונית אינו קריטי לפרוטוקול זה. הפירמידות מסודרות במערך בריבוע, עם אותו גובה עבור כיווני X ו- Y (במקרה זה המגרש הוא 350 מיקרומטר).
לשם המחשה, פורסמו ניסויי הוכחת היתכנות12 כדי להדגים כי השבב מאפשר תרבית ארוכת טווח (חודשים) ופרוטוקולי התמיינות תוך הגדרה מדויקת של מספר התאים הראשוניים בבארות. פיתוח אישי של מספר רב של אורגנואידים יכול להיות מנוטר באופן אוטומטי בשידור חי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי של שדה בהיר וגיליון אור תלת-ממדי. יתר על כן, ניתן לאחזר אורגנואידים כדי לבצע חקירות ביולוגיות נוספות (למשל, אנליזה תעתיקית). מאמר זה מתאר פרוטוקולים מפורטים לייצור כיסויי תרבית תאים, הליך הזריעה והצביעה במיקרוסקופ פלואורסצנטי, כמו גם שליפת האורגנואידים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: החלק הראשון של פרוטוקול זה מפרט את המיקרו-פבריקציה של התקן תרבית התא. עובש ראשוני מקורי עם חללים פירמידליים יכול להיות מיוצר בבית - אם מתקני מיקרו ייצור זמינים - או במיקור חוץ לחברות חיצוניות. התבנית העיקרית המשמשת בעבודה זו מיוצרת בתוך הבית, עם שלבי תהליך הייצור המתוארים במקום אחר11,13. פרוטוקול בסיסי למיקרו-פבריקציה של התבנית זמין בקובץ משלים 1. קריטי: הפעולות בשלבים 1 עד 6 צריכות להתבצע בסביבה נטולת אבק. עדיף מכסה מנוע זרימה למינרי או חדר נקי, אם יש. לאורך כל השלבים הללו, יש להשתמש בציוד מגן אישי (PPE), כגון כפפות, מעיל מעבדה ומשקפי בטיחות.
1. חיתוך תבנית PDMS
- חתכו חלקים קטנים של תבנית PDMS לממד הדרוש להתקן הסופי (למשל, 1 ס"מ x 1 ס"מ [איור 1B]). חותכים אותם במקביל לכיווני XY של המערך.
קריטי: בעת חיתוך תבנית PDMS בקוביות בגודל 1 ס"מ x 1 ס"מ, בצע את החתכים בצעדים בודדים; באמצעות סכין גילוח חד-צדדי, הפעילו לחץ וחתכו את ה-PDMS בצעד אחד. זאת כדי למנוע היווצרות של חלקיקים קטנים של PDMS, אשר יכולים להפקיד על פני השטח של התבנית ולהשפיע על איכות שלבי העתק (שלב 3).
2. הכנת מצעי PDMS שטוחים
- שוקלים ~ 15-20 גרם של שרף בסיס PDMS ו 1.5-2 גרם של סוכן reticulation שלה (כלומר, יחס של 10: 1), לערבב אותם בזהירות, ו degas בצנצנת ואקום במשך ~ 20 דקות.
- שפכו באיטיות את ה-PDMS נטול הגז על צלחת פטרי מפלסטיק ברוחב 15 ס"מ (קוטר).
- לרפא את PDMS על ידי שמירת צלחת פטרי בתנור להגדיר על 65 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות. לאחר המתנה להשלמת הריפוי, סרט PDMS שטוח בעובי ~1.5 מ"מ (הכלול בצלחת פטרי) מוכן לשימוש (איור 2A).
- בעזרת להב חד, חתכו חתיכות בגודל 2X2 ס"מ מתוך ה-PDMS (איור 2B-D).
הערה: העובי המדויק של יריעת PDMS זו אינו קריטי; ~ 1-2 מ"מ הוא טווח מתאים. ממד החיתוך צריך להיות גדול יותר מהתבנית בעלת הטקסטורה אך לא גדול בהרבה, מה שיגרום לבזבוז חומר.
3. ייצור שכבת מרקם העשויה מדבק הניתן לריפוי UV
- הניחו קוביית תבנית PDMS אחת (כפי שהוכנה בשלב 1) עם הפנים כלפי מטה על גבי חתך PDMS שטוח (כפי שהוכן בשלב 2) (איור 3A,B).
הערה: ודא שהבליטות הפירמידליות בתבנית מכוונות לכיוון מצע PDMS השטוח ושרק המשטח העליון של הפירמידות הקטועות נמצא במגע. העריכו את המיקום הנכון בעזרת מיקרוסקופ אופטי (איור 3C,D). - לצד אחד של התבנית, באמצעות פיפטה, שחררו כמות קטנה (שתי טיפות, בערך 0.1-0.2 מ"ל) של דבק הניתן לריפוי UV (איור 4A).
הערה: כאשר הנוזל בא במגע עם קצה התבנית, הנימיות תניע את הנוזל למלא את החלל שבין התבנית עצמה לבין החתך השטוח של PDMS המשמש כמצע.- עקבו אחר התקדמות הנוזל בתוך החלל, לדוגמה, באמצעות מיקרוסקופ אופטי הפוך עם יעד הגדלה פי 10 (איור 4B,C).
- חשוף את הדבק הניתן לריפוי UV לאור UV כדי לרפא אותו. התאם את זמן החשיפה בהתאם לצפיפות ההספק של מקור ה- UV המשמש (למשל, קופסת UV-LED עם צפיפות הספק של 35 mW / cm 2;2 דקות בהספק של 50% בפרוטוקול זה כדי לרפא את הדבק לחלוטין).
- בעזרת הכמות העודפת של הדבק בקצה אחד, החזיקו את הדבק שנרפא על מצע PDMS השטוח על-ידי לחיצה עדינה עם אצבע (איור 5A,B). בינתיים, השתמשו בפינצטה כדי לצבוט פינה אחת של התבנית ליד אותו קצה שמוחזק כלפי מטה ולקלף אותה לאט תוך כדי שאתם מוודאים שהסרט בעל המרקם לא מורם גם כן.
הערה: איור 5C מציג את התוצאה של הליך הסרת עובש תקין; איור 5E-G מראה הליך שגוי. - חתכו את עודפי הדבק ואת מצע ה-PDMS העודף באמצעות סכין גילוח כדי להשאיר את שכבת הדבק המרוסנת, בעלת המרקם והדבק שטוחה על ה-PDMS עם עודפי PDMS בקצה אחד בלבד (איור 5D), שיהיה צורך בשלב 5.
4. הכנת מצע כיסוי
הערה: כמצע למכשיר הסופי, נעשה שימוש בכיסויי 1.5H מעוגלים סטנדרטיים בקוטר 25 מ"מ. לפני שניתן להשתמש בהם, יש לנקות אותם כדי להסיר אבק ו / או שאריות אורגניות מפני השטח שלהם.
- ניקוי שפתיים בכיסויים
- יש לטבול את הכיסויים במי סבון למשך 5 דקות בזמן הפעלת האולטרסאונד (40 קילוהרץ, הספק קולי של 110 ואט).
- שטפו את הכיסויים במים נקיים שעברו דה-יוניזציה (DI), תחילה על ידי טבילה ולבסוף עם מי DI זורמים מברז. יבשו את הכיסויים עם אקדח ניפוח גז N2 .
- לטבול את הכיסויים באמבט אצטון במשך 5 דקות; עברו מיד לאמבט עם 2 פרופנולים (IPA) למשך 5 דקות נוספות.
- שטפו את הכיסויים עם IPA נקי באמצעות בקבוק לחיצה. יבש את הכיסויים עם אקדח ניפוח גז N2 .
הערה: ניתן לאחסן כיסויים שנוקו באמצעות הליך זה במיכל סגור עד לצורך. שמור אותם בארון יבש כדי למנוע שקיעת לחות על פני השטח שלהם.
- כאשר הוא מוכן לשימוש, טפל בכיסוי נקי בתהליך פלזמה O 2 קצר כדי לשפר את ההידרופיליות שלו: O2 20 sccm, לחץ 3 mbar, 60 W בגנרטור כוח RF, ומשך 60 שניות.
- מיד לאחר הפעלת הפלזמה, המשיכו בציפוי הסחרור של השכבה הדקה של דבק הניתן לריפוי UV על-ידי הנחת המכסה על צ'אק הוואקום של ציפוי ספין סטנדרטי ושפכו טיפה קטנה של דבק במרכז הכיסוי (איור 6). הפעל את תהליך ציפוי הסחרור: התפשטות במשך 5 שניות ב-500 סל"ד, ציפוי ב-3,000 סל"ד במשך 45 שניות (כאשר התאוצה וההאטה נקבעות ל-100 סל"ד לשנייה).
- אם ציפוי מסתובב אינו זמין, השתמש בדרך החלופית הבאה כדי לייצר סרט דק של דבק UV על הכיסויים:
- על כיסוי נקי, יש לטפטף ~0.1 מ"ל של דבק הניתן לריפוי UV באמצעות פיפטה (איור 7A).
- קחו מכסה שני והניחו אותו על גבי הראשון כדי שהדבק הנוזלי יתפזר באופן שווה בין שני הכיסויים (איור 7B-D).
- לאחר שהדבק המתפשט הגיע לקצוות הכיסויים, הפרידו ביניהם בעדינות על ידי החלקה אחד על השני. לאחר ההפרדה, שתי הכיסויים מצופות במלואן בשכבה דקה של דבק נוזלי (איור 7E).
הערה: ייתכן שהציפוי לא יהיה אחיד וחלק רק אם ההפרדה לא נעשית בתנועה חלקה ורציפה.
- אם ציפוי מסתובב אינו זמין, השתמש בדרך החלופית הבאה כדי לייצר סרט דק של דבק UV על הכיסויים:
- הכנה מוקדמת של דבק הניתן לריפוי UV
- לאחר ציפוי סחרור, יש להקדים את הדבק על ידי חשיפה לקרינת UV. התאם את זמן החשיפה בהתאם לצפיפות ההספק של מקור ה- UV המשמש (כאן, תיבת UV-LED עם צפיפות הספק של 35 mW / cm2 שימשה במשך דקה אחת בהספק של 50%).
קריטי: הדבק המשמש כאן הוא דבק אופטי. ראה בדיון נקודות מפתח הקשורות למינוני האנרגיה לריפויו.
- לאחר ציפוי סחרור, יש להקדים את הדבק על ידי חשיפה לקרינת UV. התאם את זמן החשיפה בהתאם לצפיפות ההספק של מקור ה- UV המשמש (כאן, תיבת UV-LED עם צפיפות הספק של 35 mW / cm2 שימשה במשך דקה אחת בהספק של 50%).
5. העברת סרט המרקם למצע הסופי
- קחו את אחת היריעות בעלות המרקם (שהוכנה בשלב 3) והניחו אותה במגע עם הכיסוי המצופה בדבק (שהוכן בשלב 4). יש לוודא שהמגע בין הדבק שנרפא חלקית על הכיסוי לבין הסרט בעל המרקם אחיד ככל האפשר (איור 8A-C).
קריטי: בשלב זה, הדבק על הכיסוי צריך להיות מוצק מספיק כדי למנוע זרימה מחדש, אשר ימלא את החללים הפירמידליים של הסרט בעל המרקם כאשר הוא מונח במגע, אך גם יהיה פלסטיק ודבק מספיק כדי שניתן יהיה לייעל מגע על ידי לחיצה עדינה על הסרט בעל המרקם. - יש לחשוף את הכיסויים לאור UV עד לריפוי מלא של שכבת הדבק המצופה על הכיסוי. פעולה זו תאטום את היריעה בעלת המרקם על הכיסוי ותספק בידוד חסין דליפה בין חללי הפירמידה.
- לבסוף, קלפו את המצע השטוח PDMS (איור 8D-F). בעזרת פינצטה, צבטו את ה-PDMS בפינה אחת בקצה שבו נותר חומר עודף לאחר החיתוך (שלב 3.5). בדרך זו, שכבת הסרט בעלת המרקם נשארת דבוקה לכיסוי עם גישה פתוחה בחלק העליון לזריעת תאים. קריטי: בעת קילוף PDMS שטוח, הסרט בעל המרקם צריך להישאר מחובר היטב לכיסוי. כשלים בהידבקות מאושרים בקלות אם ניתן לקלף את היריעה בעלת המרקם מהכיסוי לאחר חשיפה סופית לקרינת UV ללא כל מאמץ.
6. פסיבציה ארוכת טווח של כיסוי תרבית התא לתרבית תאים
הערה: פסיבציה מושגת על ידי יצירת ציפוי קונפורמי ורציף של קופולימר ביומימטי בעל מבנה דומה לקבוצת הפוספוליפידים הקוטבית בקרום התא. ציפוי קונפורמי זה מונע היצמדות תאים למכשיר תרבית התא
- הכינו תמיסה עם 0.5% (w/v) של קופולימר ביומימטי מומס באתנול טהור. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C לשימוש עתידי.
- הניחו את כיסוי תרבית התאים בצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ וכסו אותה במלואה בתמיסת קופולימר ביומימטית.
- לאחר 5 דקות, הסר את כיסוי תרבית התאים מהמיכל עם תמיסת הקופולימר הביומימטי והשאר אותו להתייבש בטמפרטורת החדר בתוך הצלחת הסופית במכסה מנוע בטיחות ביולוגית (>1 שעות).
הערה: ניתן לייצר ציפוי עבה יותר על ידי הגדלת ריכוז הקופולימר הביומימטי בתמיסת הציפוי; התוצאות של ציפוי עבה יותר נראות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 9A).
7. זריעת תאים
- פירוק גזים ועיקור
- ממש לפני זריעת תאים, יש לפזר מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) לתוך צלחות תרבית התאים (בדרך כלל 1 מ"ל עבור צלחת פטרי 35 מ"מ). דגה את המנה עם PBS סטרילי באמצעות מכשיר קולי במשך ~ 10 דקות, ואחריו כמה סיבובים של pipetting כדי להסיר את כל הבועות.
קריטי: אם אוויר נלכד בתוך חללי הפירמידה, הוא ימנע מהתאים להיכנס אליהם. כדי לוודא שאין אוויר כלוא בפירמידה לפני זריעת תאים, מומלץ לוודא חזותית (תחת מיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה של פי 10 או 20) היעדר אוויר בחללים האלה (איור 10). - החליפו את PBS במדיום תרבית סטרילי ועיקרו את הצלחת באור UV למשך 30 דקות מתחת למכסה מנוע של תרבית תאים.
הערה: משלב זה ואילך, יש להתייחס למנה כסטרילית ולמניפולציה באמצעות טכניקות סטריליות. דרך חלופית להסיר אוויר כלוא ממכשיר תרבית התאים היא להשתמש בצנצנת ואקום עם משאבת ואקום.
- ממש לפני זריעת תאים, יש לפזר מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) לתוך צלחות תרבית התאים (בדרך כלל 1 מ"ל עבור צלחת פטרי 35 מ"מ). דגה את המנה עם PBS סטרילי באמצעות מכשיר קולי במשך ~ 10 דקות, ואחריו כמה סיבובים של pipetting כדי להסיר את כל הבועות.
- הכנת תרחיף תאים
הערה: ניתן לזרוע תאים כאגרגטים של תאים בודדים או קטנים ולהזין את בארות הדגימה דרך הצמצם העליון. עם הזמן, התאים המוחדרים מצטברים וגדלים בתוך בארות הדגימה לכדורידים בגודל גדול מגודל הצמצם. כמודלים מאומתים של קו תאים, השתמשו בתאי סרטן HCT116 (CCL-247 ATCC) או MCF7 (HTB-22 ATCC) הנשמרים בתווך תרבית מומלץ (הנחיות ATCC).- הכינו תרחיף תאים (למשל, באמצעות תהליך טריפסיניזציה בהתאם להנחיות ATCC). עקוב אחר המלצות להכנת טריפסיניזציה/תרחיף תאים עבור תאי העניין.
- ספרו והתאימו את ריכוז התאים ל-0.5 × 106 תאים/מ"ל במדיום התרבית המומלץ.
- חלוקת תאים
- הסר את מאגר PBS מצלחת תרבית התאים בקוטר 35 מ"מ ולאחר מכן הוצא 1 מ"ל של מתלה התא המותאם. ראו איור 11A לתמונה במיקרוסקופ אופטי של תהליך זריעת תאים עם צפיפות תאים והומוגניות נאותות.
- החזירו את צלחת תרבית התאים לאינקובטור התא (37°C, 5%CO2 ו-100% לחות) למשך 10 דקות. כ-80-100 תאים ייכנסו לכל חלל פירמידלי.
הערה: ניתן להגדיל את מספר התאים בכל צלחת תרבית תאים על ידי הגדלת ריכוז התא או הזמן המושקע לפני הסרת תרחיף התא. בדרך כלל, היווצרות ספרואידים אורכת מספר שעות (תלוי בסוג התא) לאחר זריעת התא וניתן לעקוב אחריה באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (מטרות 4x עד 40x; איור 11). מכאן, ניתן לשנות או להוסיף מדיום תרבית, מטריצות חוץ-תאיות וגורמי גדילה התמיינות לצלחת תרבית התאים המכילה את הספרואידים בהתאם לפרוטוקולי התמיינות אופייניים שיכולים להימשך מספר ימים, שבועות או חודשים. - לאחר הדגירה של 10 דקות, לשחזר את צלחת תרבית התא מן האינקובטור ולשאוף בעדינות את התרחיף התאי כדי להסיר תאים לא לכודים. מוסיפים 1 מ"ל מדיום תרבית לצלחת בקוטר 35 מ"מ ומחזירים אותה לאינקובטור התא.
קריטי: בשלב זה, מכיוון שהספרואידים עדיין לא נוצרו, חשוב מאוד להימנע משאיפה חזקה או ניפוק שיגרום לאובדן התאים. שליטה חזותית באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד מומלצת מאוד בשלב זה.
8. אימונוסטיין והדמיה
- קיבוע והכתמה
הערה: הליכים קלאסיים שונים של קיבוע ו immunostaining תואמים לחלוטין את צלחת תרבית התא. פרוטוקול טיפוסי אחד מתואר כאן.- מקבעים את האורגנואידים/ספרואידים בצלחת תרבית התאים למשך 20 דקות בפרפורמלדהיד 4% בטמפרטורת החדר.
- חדרו את האורגנואידים למשך 24 שעות בתמיסת 1% פעילי שטח ב-PBS סטרילי ב-4°C בשייקר אורביטלי ודגרו במשך 24 שעות בחיץ חוסם (אלבומין בסרום בקר 2% [BSA] ו-1% פעילי שטח ב-PBS סטרילי) ב-4°C בשייקר מסלולי.
- יש לדגור על הדגימות עם נוגדנים ראשוניים בעלי עניין בדילול בין 1/50 ל-1/200 (או לפי המלצות היצרן) במאגר דילול נוגדנים (2% BSA ו-0.2% חומרים פעילי שטח ב-PBS סטרילי) בטמפרטורה של 4°C למשך 48 שעות.
- יש לשטוף את הדגימות 3x עם חיץ כביסה על שייקר אורביטלי (3% NaCl ו-0.2% פעילי שטח ב-PBS סטרילי) ולדגור עם נוגדנים משניים מתאימים במאגר דילול נוגדנים (דילול בין 1/100 ל-1/300 או לפי המלצות היצרן), 0.5 מיקרוגרם/מ"ל 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI), ו-0.2 מיקרוגרם/מ"ל אלקסה פלואור 647 או 488 פלואידין ב-4°C למשך 24 שעות על שייקר מסלולי, ולאחר מכן חמישה שלבי שטיפה עם PBS. לחלופין, הרכיבו את הדגימות באמצעות חומר ניקוי מסיס במים שחומם מראש ל-37°C.
- דימות
הערה: בשלב זה, האורגנואידים בצלחת המיקרווול יכולים להיחשב כצלחת תרבית רגילה המכילה דגימות קבועות ומוכתמות להדמיה: ניתן להשתמש בכל הליך הדמיה סטנדרטי ללא צורך בהתאמה או שינוי. איור 12 מדגים תוצאה מייצגת של תמונות ושחזור תלת-ממדי שהתקבלו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב, עם מטרת אוויר של פי 40 (צמצם מספרי 0.75).- השתמש בתוכנת בנאי לתהליך אוטומטי של רכישת תמונה עם ההגדרות הבאות: זמן חשיפה = 50 אלפיות השנייה, עם שלב ממונע Z לקבלת מחסנית Z (1 מיקרומטר Z-step, לגובה כולל של 70 מיקרומטר).
- בצע שחזור תלת מימד באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.
9. שחרור ואיסוף של אורגנואידים
הערה: ניתן לנתק את שכבת ההדבקה בעלת המרקם של צלחת תרבית התא מתלוש הכיסוי כדי לשחרר את הספרואידים/אורגנואידים החיים (לפני הקיבוע) הכלולים בתוך החללים הפירמידליים לצורך ניתוח התאים עם הליכים אחרים כגון ריצוף RNA, גישות אומיות, ניסויים במבחנה והשתלת in vivo .
- כאשר הדגימה עדיין בצלחת הפטרי ובמכסה מנוע בטיחות ביולוגית, השתמש בלהב כגון אזמל כדי לחתוך פינה של שכבת הדבק בעלת המרקם.
- בעזרת פינצטה, צבטו את שכבת הדבק בעלת המרקם בקצה החתוך וקילפו אותה בעדינות מכיסוי הזכוכית, אך השאירו אותה שקועה בתווך (ייתכן שחלק מהאורגנואידים נשארים עם שכבת הדבק, איור 13).
- יש לשטוף 3 פעמים במדיום תרבית ולאסוף את האורגנואידים על ידי פיפט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 8F מראה את ההיבט הטיפוסי של כיסוי תרבית תאים לאחר ייצור מוצלח. שכבת הדבק הניתנת לריפוי UV נראית שטוחה ונדבקת היטב לכיסוי. העברת שכבת הדבק על תלוש הכיסוי עלולה להיכשל אם השכבה שעל הכיסוי מרומרת יתר על המידה, או אם הסרת מצע ה-PDMS השטוח נעשית באופן שגוי (כפי שמוצג באיור 8G,H). בשני המקרים, הכשל ניכר מכיוון שלא מועבר סרט בעל מרקם לתלוש הכיסוי.
כדי שהמיקרו-בארות יפעלו, הסרט בעל המרקם המיוצר (כמתואר בפרוטוקול שלב 3) צריך להיות פתוח גם בצד העליון וגם בצד התחתון של הפירמידות כדי להבטיח שתאים במהלך הזריעה בשלב 7 יוכלו להיכנס לחללים ולהישאר מוכלים ברגע שהאורגנואידים יתחילו להיווצר. איור 9 מראה את הגידול בעובי הציפוי על-ידי הגדלת הריכוז של הקופולימר הביומימטי בתמיסת הציפוי. איור 10 מראה את התוצאות של פירוק גזים של צלחות תרבית תאים כדי להבטיח שלא יילכד אוויר בחללים הפירמידליים. איור 10A,B מראה פירוק גזים מלא, ואילו איור 10C,D מראה בועות אוויר בחללים הפירמידליים.
באיור 11, תאים לכודים בתוך הפירמידות, והאורגנואידים המתאימים נוצרים לאחר ימים 2 ו-15 של תרבית. אם הפתח העליון של המיקרו-בארות סגור במקום זאת (כתוצאה משלב 3 שגוי), לא יישארו תאים לאחר שטיפת הדגימה לאחר זריעת תאים. איור 12 מראה תמונות מייצגות של האורגנואידים ושחזור תלת-ממדי שהתקבל באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב עם מטרת אוויר פי 40 (צמצם מספרי 0.75). לאחר שחרור ואיסוף, ניתן לאחסן את האורגנואידים בבקבוקון קטן ולהשתמש בהם לניתוח נוסף (למשל, ריצוף RNA). איור 13B מציג דוגמה של דגימה של אורגנואידים שנאספו כמתואר.
איור 1: תבנית Poly(dimethylsiloxane). (A) תבנית PDMS התחלתית המתקבלת כהעתק יצוק של רקיק במרקם 4 אינץ' (ראה קובץ משלים 1). (B) חתך ברוחב 1 ס"מ על 1 ס"מ של תבנית PDMS ההתחלתית. (C) סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של עמודי הטרפז המסודרים במערך ריבועי, המאכלסים את פני השטח של התבנית. מוטות קנה מידה = 1 ס"מ (A), 100 מיקרומטר ו- 200 מיקרומטר (C עליון ותחתון, בהתאמה). קיצור: PDMS = poly(dimethysiloxane). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מצע PDMS שטוח. (A) שכבה של PDMS, בעובי ~1 מ"מ, מוכנה בכלי פטרי סטנדרטי ברוחב 15 ס"מ. (B) קילוף מתוך חתך טרי של PDMS. (C) את ה-PDMS הנותרים על צלחת הפטרי ניתן לחתוך לחתיכות נוספות לשימוש נוסף. (D) חיתוך PDMS שטוח ותבנית PDMS זה לצד זה; PDMS שטוח גדול יותר מאשר תבנית. קיצור: PDMS = poly(dimethysiloxane). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הנחת התבנית על המצע. (A) התבנית מונחת על המצע השטוח כשהפירמידות פונות כלפי מטה. (B) מראה שונה של מגע גרוע (למעלה) ומגע טוב (למטה) בין העובש למצע PDMS. (C) תמונת מיקרוסקופ אופטי של אזור עם מגע לקוי; העיגולים האדומים מדגישים את העמודים שאינם באים במגע עם המצע - הם נראים בצבע בהיר יותר מאלה שבמגע באותה תמונה. (D) תמונה אופטית של אזור שכל העמודים נמצאים במגע טוב. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר (C,D). קיצור: PDMS = poly(dimethysiloxane). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מילוי נימי של דבק הניתן לריפוי UV . (A) רצף תמונות זה מראה (משמאל לימין) את יציקת כמות קטנה של דבק על קצה אחד ואת התקדמות הדבק הנוזלי בחלל שבין התבנית למצע. החיצים הצהובים מצביעים על כיוון זרימת הנוזל. (B) רצף של תמונות אופטיות (הגדלה של פי 40) של חזית הנוזל הנעה; כאשר במגע טוב, החלק הקדמי של הנוזל נע סביב קצוות הפירמידות ללא דליפות. החצים הצהובים מצביעים על כיוון הזרימה והחצים האדומים מצביעים על הקצה המוביל של חזית הנוזל הנע סביב קצוות המגע. (C) רצף של תמונות אופטיות (40x) של חזית הנוזל הנעה כאשר המגע גרוע; החיצים האדומים מצביעים על הקצה המוביל של הנוזל החודר בין התבנית למצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הסרת התבנית לאחר ריפוי דבק. (A-C) הליך נכון לקילוף התבנית: תוך כדי לחיצה עדינה על עודפי הדבק בקצוות השמאליים בפינצטה, צובטים את התבנית קרוב לאותו קצה ומכופפים אותה לאט לאט כדי להתקלף. (D) התוצאה של ההליך הנכון; העודף נחתך בשלושה קצוות, בעוד עודף קטן של PDMS נשאר בצד הרביעי (חץ צהוב). (ה-ג) דוגמה להליך שגוי להסרת התבנית: התבנית נצבטת בפינצטה מהקצה הנגדי, וכתוצאה מכך מתקלפים מהמצע השטוח של סרט ההדבקה יחד עם התבנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ציפוי של חיפוי הזכוכית. (A,B) דוגמה להליך ציפוי טוב: מכסה הזכוכית מונח על צ'אק הוואקום של ציפוי-ספין, ומספיק דבק מופץ במרכז, מה שנותן ציפוי הומוגני של הכיסוי. (ג,ד) דוגמה להליך ציפוי גרוע: לא מוותרים מספיק דבק, וכתוצאה מכך ציפוי לא אחיד של הכיסוי. (ה) משמאל לימין, דוגמאות לציפוי טוב, מקובל ורע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: תהליך ציפוי חלופי . (A) טיפה קטנה של דבק נוזלי מונחת במרכז הכיסוי. (B) מכסה שני מונח בעדינות על גבי הראשון. (ג,ד) הנוזל מתפשט בין שתי הכיסויים ומפוזר באופן שווה. (ה) דוגמאות לתוצאות לאחר הפרדה נכונה של הכיסויים (משמאל) או הפרדה שגויה (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: העברה לתלוש הכיסוי. (A) סרט ההדבקה המעובד והגזוז (איור 5D) מונח על תלוש הכיסוי עם דבק שנרפא חלקית. (B) דוגמה למגע טוב בין סרט הצילום בעל המרקם לבין הכיסוי. הכניסה היא תמונה אופטית המראה מגע אחיד של האזורים בין חללי הטרפז (צבע אחיד כהה). (C) דוגמה למגע לקוי בין סרט הצילום בעל המרקם לבין הכיסוי. האזורים הבהירים יותר אינם במגע, החצים האדומים מצביעים על אזורים אלה. הכניסה היא תמונה אופטית המציגה את המראה השונה של מגע טוב (שניים משמאל) ומגע גרוע (שניים מימין). פסי קנה מידה (צהוב, B,C) = 200 מיקרומטר. (D,E) הליך נכון להסרת המצע השטוח PDMS: פינצטה משמשת לצבוט את PDMS בקצה עם עודף PDMS ולהתכופף כדי לקלף בעדינות. (F) התוצאה עם סרט במרקם דבק UV הועברה בהצלחה לכיסוי. (ז,ח) דוגמה להליך קילוף שגוי: פינצטה משמשת לצביטה של PDMS שטוח על אחד הקצוות שבהם החומר העודף נחתך; לפיכך, הסרט מוסר יחד עם PDMS שטוח. קיצור: PDMS = poly(dimethysiloxane). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: ציפוי בקופולימר ביומימטי. (A) התקן תרבית תאים המצופה בקופולימר ביומימטי באמצעות תמיסה של 0.5% (משמאל) או (B) 1% (מימין) (w/v) באתנול טהור. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: פירוק גזים של מכשיר תרבית תאים. (A) מכשיר תרבית תאים לפני פירוק מלא של גזים. (ב) מכשיר לתרבית תאים לאחר פירוק מלא של גזים; (C,D) מתקן תרבית תאים עם פירוק גז חלקי בלבד שבו בועות אוויר לכודות בפירמידות. מוטות קנה מידה = 200 מיקרומטר (A-D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11: תמונות מייצגות של שדה בהיר של זריעת תאים וגדילה של אורגנואידים . (A) תאים נראים צפים למעלה. (B) תאים שנלכדו בחללים הפירמידליים לאחר שטיפת תרחיף התא. רק תאים לכודים יישמרו כפי שמוצג. (C) תאים מצטברים ליצירת ספרואידים בכל חלל (יום 2 לאחר זריעת התא). (D) תמונה ביום ה-15 לאחר זריעת תאים של אורגנואיד שגדל בחלל פירמידלי. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר (A B), 120 מיקרומטר (C) ו- 150 מיקרומטר (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 12: הדמיה תלת-ממדית של אורגנואידים. (A) שלוש תוכניות Z שונות שנרכשו באמצעות קונפוקל דיסק מסתובב (עדשה 40x, אוויר, צמצם מספרי: 0.75) של אורגנואיד תחת התמיינות נוירואקטודרם (יום 7 לאחר זריעת תאים). צביעת אקטין באמצעות פלואידין (Alexa Fluor 647) בכתום ו-N-cadherin immunostaining (Alexa Fluor 561) בכחול. (B) שחזור תלת-ממדי באמצעות תוכנת ניתוח תמונה של האורגנואידים המתאימים (תוכניות 80 Z, גובה כולל של 100 מיקרומטר). חיצים לבנים: אשכולות של תאים סביב פס עם רמה גבוהה של ביטוי אקטין . חיצים כחולים: אשכולות תאים חיוביים לביטוי חלבון N-cadherin. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 13: שחרור אורגנואידים. (A) הסרת שכבת הדבק בעלת המרקם בפינצטה; (B) תמונת שדה בהיר של תרחיף אורגנואיד שהתקבל לאחר ההסרה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1: מוצג פרוטוקול שלב אחר שלב למיקרו-ייצור של תבנית Si עם מיקרו-חללים פירמידליים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליך לייצור צלחת תרבית המיקרווול, המאפשרת תרבית אורגנואידים בצפיפות גבוהה והתמיינות, תואר במאמר זה. בשל הגיאומטריה והסידור של המיקרו-חללים, אלפי ספרואידים ניתנים לתרבית ולהכתמה בצלחת אחת לפרקי זמן ארוכים (מספר שבועות או יותר) כמעט ללא אובדן חומר. לשם השוואה, שטח של 4 מ"מ x 2 מ"מ על צלחת תרבית התא יכול להכיל ספרואידים רבים כמו צלחת אחת של 384 בארות עם שטח של 12 ס"מ x 8 ס"מ.
הפיזור הסדיר של המיקרו-חללים והכיסוי הסטנדרטי השטוח המשמש כמצע מאפשרים ניטור של אלפי אורגנואידים חיים או קבועים בתלת ממד, ללא צורך במניפולציה דגמית מורכבת וגוזלת זמן בין כלי הרבייה ותומכי ההדמיה. בשל צורת הפירמידה עם חלק עליון קטן יותר מהבסיס, אין אובדן של אורגנואידים עקב צעדי צנרת במהלך חילופי המדיום, ניפוק מטריצות חוץ-תאיות או הליכי צביעה. כל השלבים הללו יכולים להתבצע ישירות, כמו עבור חד-שכבה דו-ממדית של תאים ללא אמצעי זהירות נוספים, בניגוד לטכניקות ייצור אורגנואידים קלאסיות (למשל, טיפות תלויות, לוחות חיבור נמוכים, אגרוול).
יתר על כן, בהשוואה לטכניקות קיימות אלה, המיקרו-בארות תוכננו עבור הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה התואמת לכל סוגי עדשות הטבילה (אוויר, מים, שמן וסיליקון). תחזוקה ארוכת טווח של אורגנואידים סגורים לכיסוי זכוכית שטוח הופכת את כיסוי תרבית התא לתואם למיקרוסקופ אור ברזולוציה גבוהה, דבר שאינו אפשרי בשיטות הקיימות ללא טיפול מורכב והעברת אורגנואידים מהירה. יתר על כן, הליך פסיבציה אופטימלי מונע כל הידבקות של תאים/אורגנואידים לתרבית ארוכת טווח, ובכך שולט בהתמיינות של התרבית התלת-ממדית לבסוף, מכיוון ששכבת הדבק בעלת המרקם ניתנת להסרה, ניתן לשלוף אורגנואידים חיים כדי לבצע סוגים אחרים של ניסויים כגון בדיקות -omics או השתלת in vivo .
יש לציין כי הצורה הפירמידלית וסידור המערך של המיקרו-חללים המשמשים לפרוטוקול זה נגזרים מהתבנית הראשונית, אשר יוצרה באמצעות תחריט רטוב סיליקון כדי לספק למשטחים גימור דמוי מראה ונטייה של 45° כדי לאפשר מיקרוסקופ יריעות אור חד-תכליתי (soSPIM11). בעוד דיון בדרישות אלה ותיאור מלא כיצד לייצר תבניות כאלה ניתן למצוא במקומות אחרים12,13, פרוטוקול פשוט ניתן גם בקובץ משלים 1. קיימות דרכים שונות לייצור תבנית ראשונית, התואמות באופן מלא את ייצור השבבים בפרוטוקול זה. תחריט לייזר של זכוכית והדפסה תלת ממדית ברזולוציה גבוהה, למשל, יכולים לשמש לייצור תבנית ראשונית עם חללים מתאימים להכלת האורגנואידים, אך אינם מתאימים להדמיית soSPIM.
פרוטוקול הייצור שנחשף כאן יכול להיות מותאם לשימוש בכל מעבדה ביולוגית סטנדרטית, מכיוון שאין צורך בכלי מיקרו-פבריקציה ייעודיים ומתקדמים. כמה שלבים קריטיים בייצור המיקרו-בארות הם הייצור באמצעות מילוי נימי של סרט הדבק בעל המרקם והעברתו למצע הזכוכית. עם זאת, מניסיוננו, הם יכולים להיות שולטים עם שחזור גבוה בתקופה קצרה של זמן. המרחק בין הפירמידות צריך להיות קטן ככל האפשר כדי להגדיל את צפיפות החללים לצמיחת אורגנואידים, אך הוא גם צריך להיות גדול מספיק כדי שניתן יהיה לאטום את החללים על המצע ללא כל דליפה או חוסר איטום ביניהם. מצאנו כי מרחק של 50 מיקרומטר הוא פשרה טובה עבור מקרה זה.
במהלך זריעת תאים, היבט קריטי הוא הסרת כל בועות האוויר הכלואות בתוך החללים כדי להבטיח כניסה לתאים. אנו מתארים כאן פתרון מאומת, המשתמש רק בציוד מעבדה קלאסי (למשל, הומוגנייזר קולי או צנצנת ואקום). כדי לאפשר הומוגניזציה טובה יותר של מספר התאים בכל צלחת תרבית תאים, מומלץ להוציא את תרחיף התא מהצד של הצלחת ולא ישירות מעל הכיסוי. תסיסה ידנית עדינה יכולה גם לסייע להומוגניזציה של התמיסה התאית.
לאחר זריעת תאים, צלחת תרבית התא עם אורגנואידים ניתן לטפל כמו כל תמיכה תרבית קלאסית אחרת; אין צורך במניפולציה ספציפית או בצעדים קריטיים. כל הפרוטוקולים שנעשה בהם שימוש עם מכשירי המיקרווול זהים כמעט לאלה המשמשים בצלחות בעלות חיבור נמוך כגון צלחות U-bottom. לפיכך, תרבית אורגנואידים במיקרו-בארות אלה אינה דורשת כל שינוי בתנאי התרבית בהשוואה לתקנים אחרים.
גורם קריטי נוסף הוא שהדבק המשמש כאן הוא דבק אופטי. בשימוש הטוב ביותר המוצע (עיין גם בהערות יישום מהספק), שני אלמנטים אופטיים שיש להדביק מיושרים ודבק הניתן לריפוי UV מוחל בממשק. חשיפה ראשונה לקרינת UV של אנרגיה שאינה מספיקה כדי לגרום לפילמור מלא משמשת למיצוק הדבק תוך שמירה על תכונות הדבק. ניתן להזיז את הרכיבים האופטיים כדי להשיג יישור אופטימלי, ואז הדבק נרפא במלואו למצבו הסופי עם חשיפה שנייה ל- UV כדי לספק הדבקה קבועה. מנות אנרגיית החשיפה הראשונה והשנייה (כלומר, זמני חשיפה אם נעשה שימוש במקור של צפיפות אנרגיה ידועה וקבועה) חייבות להיות אופטימליות בהתאם לצפיפות האנרגיה של מקור ה- UV בו נעשה שימוש, עובי שכבת הדבק, העברת UV דרך האלמנטים האופטיים, ומרקם פני השטח (או היעדרו) של המשטח שיש להדביק.
בעוד שההדבקה בין סרט המרקם לבין הכיסוי המצופה בדבק נדרשת להיות חזקה מספיק כדי לספק איטום חסין נזילות, יש גם לאפשר להסיר את סרט הצילום בעל המרקם כדי לאחזר את האורגנואידים לאחר ההדמיה, אם נדרש ניתוח נוסף, כגון פרופיל גנוטיפי. פשרה נכונה בין איטום חסין נזילות לבין היכולת לקלף את היריעה בעלת המרקם הושגה באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, אך ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה נוספת של זמני הריפוי המקדימים והסופיים של שכבת הדבק הדקה על הכיסוי מכיוון שהיא תלויה במערכת החשיפה לקרינת UV ובעובי הסרט בו נעשה שימוש.
מגבלה אחת בגרסת המיקרו-בארות הנוכחית היא בהליך הזריעה; יש לזרוע תאים לפני רכיבי ECM כדי לאפשר להם להיכנס לקרבת הפירמידה. שיפורים נמשכים כדי לצפות את המיקרו-בארות ברכיבי מטריצה חוץ-תאיים, כצעד ראשון. עדיין לא ביצענו מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) על האורגנואידים הקבועים בתוך החללים. יידרש שינוי מסוים בפרוטוקולי הייצור ותרביות התאים הללו לפני שהדמיית אורגנואידים במיקרו-בארות עם EM תהפוך לאפשרות מעשית.
הרחבה עתידית טבעית של שיטה זו היא לספק יכולות סינון תוכן גבוהות כדי לאפשר בדיקה מרובת תנאים בזרימת עבודה אחת (צלחת multiwell). מכשיר תרבית תאים זה מספק חלופה ייחודית לטכניקות אורגנואידים קיימות, מציע תפוקת תרבית והדמיה ללא תחרות ופותח נקודות מבט חדשות בתחום מחקר האורגנואידים ליישום ביו-רפואי וגילוי תרופות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
בקשת פטנט בינלאומית פורסמה עם מספר הפרסום WO 2021/167535 A1.
Acknowledgments
המחקר נתמך על ידי פרויקט CALIPSO הנתמך על ידי קרן המחקר הלאומית, משרד ראש הממשלה, סינגפור, במסגרת תוכנית קמפוס למצוינות במחקר ויזמות טכנולוגית (CREATE). V.V. מודה על תמיכתם של חוקר NRF NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, מימון סיד MBI ו- ANR ADGastrulo. א.ב. וג.ג. מודים על התמיכה ממימון הליבה של MBI. א.ב. מודה לאנדור טכנולוגיות על השאלת המיקרוסקופ BC43.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
- Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Takebe, T., Wells James, M.
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- O'Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
- Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
- Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
- Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
- Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).
