Summary
Bu yazıda, organoidlerin yüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak kültürlenebildiği ve gözlemlenebildiğimm2 başına yüzlerce mikro konteynere sahip yeni bir kültür substratı türü için bir üretim protokolü sunulmaktadır. Hücre tohumlama ve immün boyama protokolleri de detaylandırılmıştır.
Abstract
Çok sayıda üç boyutlu (3D) organotipik kültürün (organoid) farklı çözünürlük ölçeklerinde karakterizasyonu günümüzde standart görüntüleme yaklaşımları ile sınırlıdır. Bu protokol, minimum manipülasyon gerektiren ve 300 organoid / s'ye kadar görüntüleme verimi yapabilen kullanıcı dostu bir cihazda çok ölçekli, 3D canlı görüntülemeye olanak tanıyan mikrofabrikasyonlu organoid kültür çipleri hazırlamanın bir yolunu açıklar. Bu kültür çipleri hem hava hem de daldırma hedefleriyle (hava, su, yağ ve silikon) ve çok çeşitli yaygın mikroskoplarla (örneğin, dönen disk, nokta tarayıcı konfokal, geniş alan ve parlak alan) uyumludur. Ayrıca, tek amaçlı, tek düzlemli aydınlatma mikroskobu (SPIM) teknolojisi (soSPIM) gibi ışık tabakası modaliteleri ile kullanılabilirler.
Burada açıklanan protokol, mikrofabrikasyon kültür çiplerinin hazırlanması ve organoidlerin kültürü ve boyanması için ayrıntılı adımlar vermektedir. Aşina olmak için sadece kısa bir süre gerekir ve sarf malzemeleri ve ekipmanlar normal biyolablarda kolayca bulunabilir. Burada, 3D görüntüleme yetenekleri yalnızca ticari standart mikroskoplarla gösterilecektir (örneğin, 3D rekonstrüksiyon için dönen disk ve rutin izleme için geniş alan mikroskobu).
Introduction
Bundan böyle organoidler olarak adlandırılacak olan organotipik 3B hücre kültürlerinde, kök hücreler farklılaşır ve gerçek organlarla güçlü morfolojik ve fonksiyonel benzerlikler paylaşan mekansal yapılara kendi kendini organize eder. Organoidler, insan biyolojisini ve vücut dışındaki gelişimini incelemek için değerli modeller sunar 1,2,3. Karaciğeri, beyni, böbreği, akciğeri ve diğer birçok organı taklit eden giderek artan sayıda model geliştirilmektedir 2,4,5. Organoidlerde farklılaşma, çözünür büyüme faktörlerinin ve hücre dışı bir matrisin kesin bir zaman dizisine eklenmesiyle yönlendirilir. Bununla birlikte, organların belirgin aksine, organoidlerin gelişimi oldukça heterojendir.
Çok sayıdabiyolojik zorluğun 6,7 ötesinde, organoid kültürler hücre kültürü yöntemleri, transkriptomiklerin karakterizasyonu ve görüntüleme açısından teknolojik zorluklar da ortaya koymaktadır. İn vivo organ gelişimi, hücre düzenlemelerinin oldukça basmakalıp bir şekilde kendi kendine organizasyonu ile sonuçlanan biyolojik bir ortamda meydana gelir. Herhangi bir fenotipik değişiklik, hastalıklı bir durumu teşhis etmek için bir vekil olarak kullanılabilir. Buna karşılık, organoidler, hücre kültürü koşullarıyla uyumlu, minimal kontrollü mikro ortamlarda in vitro olarak gelişir ve bu da her bir organoid için gelişim yolunda ve şekil oluşumunda büyük değişkenliğe neden olur.
Yakın zamanda yapılan bir çalışma8, organoid şeklin (fenotip tanımlayıcıları) kantitatif görüntülenmesinin, birkaç genetik belirtecin değerlendirilmesine bağlı olarak, fenotipik gelişim manzaralarının tanımlanmasına izin verdiğini göstermiştir. Muhtemelen, organoidlerdeki genomik ekspresyon çeşitliliğini fenotipik davranışlarıyla ilişkilendirme yeteneği, organotipik kültürlerin tüm potansiyelini açığa çıkarmaya yönelik önemli bir adımdır. Bu nedenle, 3D 9,10'da hücre altı, çok hücreli ve tüm organoid ölçeklerde organoid özelliklerin karakterizasyonuna izin veren özel, yüksek içerikli görüntüleme yaklaşımlarının geliştirilmesi için yalvarmaktadır.
Aerodinamik organoid kültürüne (izole insan embriyonik kök hücrelerinden [hESC'ler], insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden [hIPSC'ler] veya birincil hücrelerden 3D, çok hücreli, farklılaştırılmış organoidlere) ve hızlı, invaziv olmayan 3D görüntülemeye izin veren çok yönlü bir yüksek içerikli tarama (HCS) platformu geliştirdik. JeWells çipi (bundan böyle çip olarak anılacaktır) adı verilen yeni nesil, minyatürleştirilmiş, 3D hücre kültürü cihazını entegre eder ve tek nesneli ışık tabakası mikroskobu11 ile hızlı, 3D, yüksek çözünürlüklü görüntülemeye izin veren 45 ° aynalarla çevrili binlerce iyi dizilmiş mikro kuyu içerir. Herhangi bir standart, ticari, ters çevrilmiş mikroskopla uyumlu olan bu sistem, 300 organoidin <1 saatte hücre altı çözünürlükle 3D olarak görüntülenmesini sağlar.
Hücre kültürü cihazının mikrofabrikasyonu, tabana göre kare tabanlı ve 45 ° 'de yan duvarlara sahip yüzlerce mikropiramit (Şekil 1A) içeren mevcut bir mikro yapılandırılmış kalıptan başlar. Şekil 1C, bu tür yapıların elektron mikroskobu (EM) görüntülerini göstermektedir. Kalıbın kendisi poli(dimetilsiloksan) (PDMS) 'den yapılmıştır ve standart yumuşak-litografik prosedürler kullanılarak karşılık gelen özelliklere (boşluklar olarak) sahip bir birincil kalıbın (burada gösterilmeyen) bir kopyası olarak yapılabilir. Birincil kalıp farklı prosedürlerle üretilebilir. Bu protokol için kullanılan, Galland ve ark.'da bildirildiği gibi silikon ıslak aşındırma kullanılarak yapılmıştır. 11; birincil kalıbın imalat prosedürü bu protokol için kritik değildir. Piramitler, X ve Y yönleri için aynı perdeye sahip kare bir dizide düzenlenmiştir (bu durumda perde 350 μm'dir).
Örnek olarak, çipin kuyulardaki ilk hücrelerin sayısını tam olarak tanımlarken uzun vadeli kültür (aylar) ve farklılaşma protokollerine izin verdiğini göstermek için kavram kanıtı deneyleri12 yayınlandı. Çok sayıda organoidin bireysel gelişimi, standart parlak alan ve 3D ışık tabakası floresan mikroskopları kullanılarak canlı olarak otomatik olarak izlenebilir. Ayrıca, organoidler daha ileri biyolojik araştırmalar yapmak için alınabilir (örneğin, transkriptomik analiz). Bu makale, hücre kültürü kapaklarının üretimi, floresan mikroskobu için tohumlama ve boyama prosedürü ve organoidlerin geri alınması için ayrıntılı protokolleri özetlemektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokolün ilk kısmı, hücre kültürü cihazının mikrofabrikasyonunu detaylandırır. Piramidal boşluklara sahip orijinal bir birincil kalıp, mikro üretim tesisleri mevcutsa şirket içinde üretilebilir veya dış şirketlere dış kaynak olarak sağlanabilir. Bu işte kullanılan birincil kalıp, başka bir yerde11,13 olarak açıklanan imalat süreci adımları ile şirket içinde üretilmektedir. Kalıbın mikrofabrikasyonu için temel bir protokol Ek Dosya 1'de mevcuttur. KRİT: 1'den 6'ya kadar olan adımlardaki işlemlerin tozsuz bir ortamda yapılması gerekir. Laminer davlumbaz veya varsa temiz oda tercih edilir. Tüm bu adımlar boyunca, eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlükleri gibi kişisel koruyucu ekipmanların (KKD) kullanılması gerekir.
1. PDMS kalıbının doğranması
- PDMS kalıbının küçük kısımlarını son cihaz için gereken boyuta kadar kesin (örneğin, 1 cm x 1 cm [Şekil 1B]). Bunları dizinin XY yönlerine paralel olarak kesin.
KRİT: PDMS kalıbını 1 cm x 1 cm zarlarla keserken, kesimleri tek adımda uygulayın; tek taraflı bir tıraş bıçağı kullanarak, basınç uygulayın ve PDMS'yi tek bir adımda kesin. Bu, kalıbın yüzeyinde birikebilecek ve replika adımlarının kalitesini etkileyebilecek küçük PDMS parçacıklarının oluşumunu önlemek içindir (adım 3).
2. Düz PDMS substratlarının hazırlanması
- ~ 15-20 g PDMS baz reçinesini ve 1.5-2 g retikülasyon ajanını (yani, 10: 1 oranında) tartın, dikkatlice karıştırın ve ~ 20 dakika boyunca bir vakum kavanozunda gazdan arındırın.
- Gazdan arındırılmış PDMS'yi yavaşça plastik, 15 cm genişliğinde (çaplı) bir Petri kabına dökün.
- Petri kabını 2 saat boyunca 65 ° C'de ayarlanmış bir fırında tutarak PDMS'yi iyileştirin. Kürlemenin tamamlanmasını bekledikten sonra, ~ 1,5 mm kalınlığında (Petri kabında bulunan) düz bir PDMS filmi kullanıma hazırdır (Şekil 2A).
- Keskin bir bıçak kullanarak, PDMS'den 2 cm x 2 cm'lik parçalar kesin (Şekil 2B-D).
NOT: Bu PDMS sayfasının tam kalınlığı kritik değildir; ~1-2 mm uygun bir aralıktır. Kesimin boyutu, dokulu kalıptan daha büyük olmalı, ancak çok daha büyük olmamalıdır, bu da malzemenin boşa harcanmasına neden olur.
3. UV kürlenebilir yapıştırıcıdan yapılmış dokulu tabakanın üretimi
- Bir PDMS kalıp zarını (adım 1'de hazırlandığı gibi) düz PDMS kesiminin üzerine (adım 2'de hazırlandığı gibi) yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin (Şekil 3A, B).
NOT: Kalıptaki piramidal çıkıntıların düz PDMS substratına doğru yönlendirildiğinden ve kesilmiş piramitlerin yalnızca üst yüzeyinin temas halinde olduğundan emin olun. Doğru yerleşimi optik mikroskopla değerlendirin (Şekil 3C,D). - Kalıbın bir tarafına, bir pipet kullanarak, az miktarda (iki damla, yaklaşık 0.1-0.2 mL) UV kürlenebilir yapıştırıcı bırakın (Şekil 4A).
NOT: Sıvı kalıbın kenarı ile temas ettiğinde, kapillarite, kalıbın kendisi ile substrat olarak kullanılan PDMS'nin düz kesimi arasındaki boşluğu doldurmak için sıvıyı tahrik edecektir.- Sıvının boşluk içindeki ilerlemesini takip edin, örneğin, 10x büyütme hedefine sahip ters çevrilmiş bir optik mikroskop kullanarak (Şekil 4B, C).
- UV ile kürlenebilen yapıştırıcıyı kürlemek için UV ışığına maruz bırakın. Kullanılan UV kaynağının güç yoğunluğuna bağlı olarak maruz kalma süresini ayarlayın (örneğin, 35 mW /cm2 güç yoğunluğuna sahip bir UV-LED kutusu; yapıştırıcıyı tamamen iyileştirmek için bu protokolde% 50 güçte 2 dakika).
- Bir kenardaki fazla miktarda yapıştırıcıyı kullanarak, kürlenmiş yapıştırıcıyı düz PDMS substratı üzerinde parmağınızla hafifçe bastırarak tutun (Şekil 5A, B). Bu arada, kalıbın bir köşesini tutulan aynı kenarın yanına sıkıştırmak için cımbız kullanın ve dokulu filmin de yukarı kaldırılmadığından emin olurken yavaşça soyun.
NOT: Şekil 5C, uygun bir kalıp çıkarma prosedürünün sonucunu göstermektedir; Şekil 5E-G yanlış prosedürü göstermektedir. - Kürlenmiş, dokulu, yapışkan tabakayı PDMS üzerinde düz bırakmak için fazla yapıştırıcıyı ve fazla PDMS substratını bir tıraş bıçağı kullanarak kesin ve yalnızca bir kenarda fazla PDMS (Şekil 5D), bu da adım 5'te gerekli olacaktır.
4. Coverslip substrat hazırlığı
NOT: Son cihaz için bir alt tabaka olarak, 25 mm çapında standart yuvarlak 1,5H kapak kayışları kullanılır. Kullanılmadan önce, yüzeylerinden toz ve / veya organik kalıntıları gidermek için temizlenmeleri gerekir.
- Kapak kapağı temizliği
- Ultrason uygulanırken kapakları 5 dakika sabunlu suya batırın (40 kHz, 110 W sonik güç).
- Kapak kapaklarını temiz deiyonize (DI) suda, önce daldırarak ve son olarak bir musluktan akan DI suyuyla yıkayın. Kapak kapaklarını bir N2 gaz üfleme tabancası ile kurulayın.
- Kapak kapaklarını 5 dakika boyunca bir aseton banyosuna batırın; hemen 5 dakika daha 2 propanol (IPA) banyosuna geçin.
- Bir sıkma şişesi kullanarak kapakları temiz IPA ile durulayın. Kapak kapaklarını N2 gaz üfleme tabancası ile kurulayın.
NOT: Bu prosedür kullanılarak temizlenen kapaklar, ihtiyaç duyulana kadar kapalı bir kapta saklanabilir. Yüzeylerinde nem birikmesini önlemek için kuru bir dolapta tutun.
- Kullanıma hazır olduğunda, temiz bir kapak kapağını hidrofilikliğini iyileştirmek için kısa birO2 plazma işlemiyle işlemden geçirin: O2 20 sccm, 3 mbar basınç, RF güç jeneratöründe 60 W ve 60 s süre.
- Plazma aktivasyonundan hemen sonra, kapak kaymasını standart bir spin-coater'ın vakum mandren üzerine yerleştirerek ve kapak kapağının ortasına küçük bir yapıştırıcı damlası dökerek ince UV kürlenebilir yapıştırıcı tabakasını spin kaplamaya devam edin (Şekil 6). Spin kaplama işlemini çalıştırın: 500 rpm'de 5 sn yayma, 45 s için 3.000 rpm'de kaplama (hızlanma ve yavaşlama 100 rpm / s'de ayarlanmışken).
- Spin kaplama mevcut değilse, kapak kapaklarında ince bir UV yapıştırıcı filmi üretmek için aşağıdaki alternatif yolu kullanın:
- Temiz bir kapak kapağı üzerine, bir pipet kullanarak ~ 0,1 mL UV kürlenebilir yapıştırıcı bırakın (Şekil 7A).
- İkinci bir kapak kapağı alın ve sıvı yapıştırıcının iki kapak kapağı arasında eşit olarak yayılmasını sağlamak için birincisinin üzerine yerleştirin (Şekil 7B-D).
- Yayılan yapıştırıcı kapak kapaklarının kenarlarına ulaştığında, birbiri üzerine kaydırarak yavaşça ayırın. Ayrıldıktan sonra, her iki kapak kapağı da ince bir sıvı yapıştırıcı tabakası ile tamamen kaplanır (Şekil 7E).
NOT: Kaplama, yalnızca ayırma düzgün ve sürekli bir hareketle yapılmazsa düzgün ve pürüzsüz olmayabilir.
- Spin kaplama mevcut değilse, kapak kapaklarında ince bir UV yapıştırıcı filmi üretmek için aşağıdaki alternatif yolu kullanın:
- UV ile kürlenebilir yapıştırıcının kürlenmesi
- Spin kaplamadan sonra, yapıştırıcıyı UV'ye maruz bırakarak önceden kürleyin. Kullanılan UV kaynağının güç yoğunluğuna bağlı olarak maruz kalma süresini ayarlayın (burada, %50 güçte 1 dakika boyunca 35 mW/cm2 güç yoğunluğuna sahip bir UV-LED kutusu kullanılmıştır).
KRİT: Burada kullanılan yapıştırıcı optik bir yapıştırıcıdır. Tedavisi için enerji dozlarıyla ilgili kilit noktalar için tartışmaya bakın.
- Spin kaplamadan sonra, yapıştırıcıyı UV'ye maruz bırakarak önceden kürleyin. Kullanılan UV kaynağının güç yoğunluğuna bağlı olarak maruz kalma süresini ayarlayın (burada, %50 güçte 1 dakika boyunca 35 mW/cm2 güç yoğunluğuna sahip bir UV-LED kutusu kullanılmıştır).
5. Dokulu filmin son substrata aktarılması
- Dokulu filmlerden birini alın (adım 3'te hazırlanmış) ve yapışkan kaplı kapak kapağı ile temas ettirin (adım 4'te hazırlanmıştır). Kapak kapağı üzerindeki kısmen kürlenmiş yapıştırıcı ile dokulu film arasındaki temasın mümkün olduğunca homojen olduğundan emin olun (Şekil 8A-C).
KRİT: Bu aşamada, kapak kayması üzerindeki yapıştırıcı, temas ettiğinde dokulu filmin piramidal boşluklarını dolduracak şekilde yeniden akmayı önleyecek kadar sağlam olmalı, aynı zamanda dokulu filme hafifçe bastırılarak temasın optimize edilebileceği kadar plastik ve yapışkan olmalıdır. - Kapak kapağı üzerindeki yapışkan tabaka tamamen kürlenene kadar kapak kaymalarını UV ışığına maruz bırakın. Bu, dokulu filmi kapak kayması üzerinde kapatacak ve piramidal boşluklar arasında sızdırmaz izolasyon sağlayacaktır.
- Son olarak, PDMS düz substratını soyun (Şekil 8D-F). Cımbız kullanarak, PDMS'yi kırpmadan sonra fazla malzemenin bırakıldığı kenardaki bir köşeye sıkıştırın (adım 3.5). Bu şekilde, dokulu film tabakası, hücre tohumlaması için üstte açık erişimli kapak kapağına yapışkan olarak bırakılır. KRİT: Düz PDMS'yi soyarken, dokulu film kapak kaymasına iyi tutturulmuş kalmalıdır. Dokulu film, UV'ye son kez maruz kaldıktan sonra herhangi bir çaba sarf etmeden kapak kapağından soyulabiliyorsa, yapışma hataları kolayca doğrulanır.
6. Hücre kültürü kapağının hücre kültürü için uzun süreli pasivasyonu
NOT: Pasivasyon, hücre zarındaki polar fosfolipit grubuna benzer bir yapıya sahip bir biyomimetik kopolimerin konformal ve sürekli bir kaplamasının üretilmesiyle elde edilir. Bu konformal kaplama, hücrelerin hücre kültürü cihazına yapışmasını önler
- Saf etanol içinde çözünmüş biyomimetik kopolimerin% 0.5'i (w / v) ile bir çözelti hazırlayın. Çözeltiyi ileride kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.
- Hücre kültürü kapağını 35 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin ve biyomimetik kopolimer çözeltisi ile tamamen örtün.
- 5 dakika sonra, hücre kültürü kapağını biyomimetik kopolimer çözeltisi ile kaptan çıkarın ve bir biyogüvenlik başlığında (>1 saat) son kabın içindeki oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
NOT: Kaplama çözeltisindeki biyomimetik kopolimerin konsantrasyonu artırılarak daha kalın bir kaplama üretilebilir; daha kalın bir kaplamanın sonuçları parlak alan mikroskobu altında görülebilir (Şekil 9A).
7. Hücre tohumlama
- Gaz giderme ve sterilizasyon
- Hücre tohumlamadan hemen önce, steril fosfat tamponlu salin (PBS) hücre kültürü kaplarına (tipik olarak 35 mm'lik bir Petri kabı için 1 mL) dağıtın. Kabı steril PBS ile ~ 10 dakika boyunca ultrasonik bir cihaz kullanarak gazdan arındırın, ardından tüm kabarcıkları çıkarmak için birkaç tur pipetleme yapın.
KRİT: Hava piramidal boşlukların içinde sıkışırsa, hücrelerin onlara girmesini önleyecektir. Hücre tohumlamadan önce piramitte sıkışmış hava olmadığından emin olmak için, bu boşluklarda hava bulunmadığından görsel olarak (10x veya 20x büyütmede bir tezgah üstü parlak alan mikroskobu altında) emin olmanız önerilir (Şekil 10). - PBS'yi steril kültür ortamı ile değiştirin ve plakayı bir hücre kültürü başlığı altında 30 dakika boyunca UV ışığıyla sterilize edin.
NOT: Bu adımdan itibaren, çanak steril olarak kabul edilmeli ve steril teknikler kullanılarak manipüle edilmelidir. Hücre kültürü cihazından sıkışmış havayı çıkarmanın alternatif bir yolu, vakum pompalı bir vakum kavanozu kullanmaktır.
- Hücre tohumlamadan hemen önce, steril fosfat tamponlu salin (PBS) hücre kültürü kaplarına (tipik olarak 35 mm'lik bir Petri kabı için 1 mL) dağıtın. Kabı steril PBS ile ~ 10 dakika boyunca ultrasonik bir cihaz kullanarak gazdan arındırın, ardından tüm kabarcıkları çıkarmak için birkaç tur pipetleme yapın.
- Hücre süspansiyonu hazırlığı
NOT: Hücreler tek veya küçük hücre agregaları olarak tohumlanabilir ve numune kuyucuklarına üst açıklıktan girilebilir. Zamanla, yerleştirilen hücreler toplanır ve numune kuyucuklarının içinde büyür ve açıklığın boyutundan daha büyük bir boyuttaki sferoidlere dönüşür. Doğrulanmış hücre hattı modelleri olarak, önerilen kültür ortamında (ATCC kılavuzları) tutulan HCT116 (CCL-247 ATCC) veya MCF7 (HTB-22 ATCC) kanser hücrelerini kullanın.- Bir hücre süspansiyonu hazırlayın (örneğin, ATCC yönergelerini izleyerek bir tripsinizasyon işlemi kullanarak). İlgilenilen hücreler için tripsinizasyon/hücre süspansiyonu hazırlama önerilerini takip edin.
- Önerilen kültür ortamında hücre konsantrasyonunu 0,5 × 106 hücre / mL'ye sayın ve ayarlayın.
- Hücre dağıtımı
- PBS arabelleğini 35 mm'lik hücre kültürü kabından çıkarın ve ardından ayarlanmış hücre süspansiyonunun 1 mL'sini dağıtın. Yeterli hücre yoğunluğu ve homojenliğine sahip bir hücre tohumlama prosedürünün optik mikroskop görüntüsü için Şekil 11A'ya bakınız.
- Hücre kültürü kabını 10 dakika boyunca hücre inkübatörüne (37 ° C,% 5 CO2 ve% 100 nem) geri yerleştirin. Her piramidal boşluğa yaklaşık 80-100 hücre girecektir.
NOT: Hücre kültürü kabı başına düşen hücre sayısını, hücre konsantrasyonunu veya hücre süspansiyonunun çıkarılmasından önce harcanan süreyi artırarak artırmak mümkündür. Tipik olarak, sferoid oluşumu hücre tohumlamasından sonra birkaç saat sürer (hücre tipine bağlı olarak) ve parlak alan mikroskobu ile takip edilebilir (4x ila 40x hedefler; Şekil 11). Buradan, kültür ortamı, hücre dışı matrisler ve farklılaşma büyüme faktörleri, birkaç gün, hafta veya ay sürebilen tipik farklılaşma protokollerine uygun olarak sferoidleri içeren hücre kültürü kabına değiştirilebilir veya eklenebilir. - 10 dakikalık inkübasyondan sonra, hücre kültürü çanağını inkübatörden geri kazanın ve sıkışmamış hücreleri çıkarmak için hücresel süspansiyonu yavaşça aspire edin. 35 mm'lik bir kaba 1 mL kültür ortamı ekleyin ve tekrar hücre inkübatörüne yerleştirin.
KRİT: Bu aşamada, sferoidler henüz oluşmadığından, hücrelerin kaybına neden olacak güçlü aspirasyon veya dağıtımdan kaçınmak çok önemlidir. Masaüstü parlak alan mikroskobu kullanarak görsel kontrol bu adımda şiddetle tavsiye edilir.
8. İmmün boyama ve görüntüleme
- Fiksasyon ve boyama
NOT: Farklı klasik fiksasyon ve immün boyama prosedürleri, hücre kültürü kabı ile tamamen uyumludur. Burada tipik bir protokol açıklanmaktadır.- Hücre kültürü kabındaki organoidleri / sferoidleri oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit içinde 20 dakika boyunca sabitleyin.
- Organoidleri, bir orbital çalkalayıcı üzerinde 4 °C'de steril PBS'de% 1 sürfaktan çözeltisinde% 1 yüzey aktif madde çözeltisinde 24 saat boyunca geçirgenleştirin ve bir orbital çalkalayıcı üzerinde 4 °C'de bloke edici tamponda (% 2 sığır serum albümini [BSA] ve% 1 yüzey aktif madde) 24 saat boyunca inkübe edin.
- 1/50 ile 1/200 arasında (veya üreticinin tavsiyelerine göre) antikor seyreltme tamponunda (steril PBS'de% 2 BSA ve% 0.2 yüzey aktif madde) 48 saat boyunca 4 °C'de seyreltmede ilgilenilen birincil antikorlara sahip numuneleri inkübe edin.
- Numuneleri bir orbital çalkalayıcı üzerinde yıkama tamponu ile 3 kat durulayın (steril PBS'de% 3 NaCl ve% 0.2 yüzey aktif madde) ve antikor seyreltme tamponunda karşılık gelen ikincil antikorlarla inkübe edin (1/100 ila 1/300 arasında veya üreticinin tavsiyelerine göre seyreltme), 0.5 μg / mL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ve 0.2 μg / mL Alexa Fluor 647 veya 488 Phalloidin 4 °C'de orbital çalkalayıcıda 24 saat boyunca, PBS ile beş durulama adımını takip eder. İsteğe bağlı olarak, numuneleri 37 °C'ye kadar önceden ısıtılmış suda çözünür bir temizleme maddesi kullanarak monte edin.
- Görüntüleme
NOT: Bu aşamada, mikrowell plakasındaki organoidler, görüntüleme için sabit ve lekeli numuneler içeren normal bir kültür kabı olarak düşünülebilir: herhangi bir standart görüntüleme prosedürü, adaptasyon veya modifikasyon gerektirmeden kullanılabilir. Şekil 12 , dönen disk konfokal mikroskop kullanılarak elde edilen görüntülerin ve 3D rekonstrüksiyonun, 40x hava hedefi (sayısal diyafram açıklığı 0.75) ile temsili bir sonucunu göstermektedir.- Aşağıdaki ayarlarla otomatik görüntü alma işlemi için oluşturucu yazılımı kullanın: pozlama süresi = 50 ms, bir z-yığını elde etmek için z motorlu bir aşama ile (toplam 70 μm yükseklik için 1 μm Z-adımı).
- Görüntü analiz yazılımını kullanarak 3D rekonstrüksiyon gerçekleştirin.
9. Organoidlerin serbest bırakılması ve toplanması
NOT: Hücre kültürü çanağının dokulu yapışkan tabakası, RNA dizilimi, -omik yaklaşımlar, in vitro deneyler ve in vivo transplantasyon gibi diğer prosedürlerle hücrelerin analizi için piramidal boşlukların içinde bulunan canlı sferoidleri / organoidleri (fiksasyondan önce) serbest bırakmak için kapak kaymasından ayrılabilir.
- Numune hala Petri kabında ve biyogüvenlik başlığındayken, dokulu yapışkan tabakanın bir köşesini kesmek için neşter gibi bir bıçak kullanın.
- Cımbızla, dokulu yapışkan tabakayı kesilmiş kenara sıkıştırın ve cam kapak kaymasından yavaşça soyun, ancak ortama batırılmış halde tutun (bazı organoidler yapışkan tabaka ile kalıyor olabilir, Şekil 13).
- Kültür ortamı ile 3x durulayın ve pipetleme yaparak organoidleri toplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 8F, başarılı bir imalattan sonra bir hücre kültürü kapağının tipik yönünü göstermektedir. UV ile kürlenebilir yapışkan tabaka düz görünür ve kapak kaymasına iyi yapışır. Kapak kayması üzerindeki tabaka aşırı kürlenirse veya düz PDMS substratının çıkarılması yanlış yapılırsa (Şekil 8G, H'de gösterildiği gibi) yapışkan tabakanın kapak kayması üzerindeki transferi başarısız olabilir. Her iki durumda da, kapak kapağına dokulu bir film aktarılmadığı için arıza belirgindir.
Mikrokuyucukların çalışması için, üretilen dokulu filmin (protokol adım 3'te açıklandığı gibi), adım 7'deki tohumlama sırasındaki hücrelerin boşluklara girebilmesini ve organoidler oluşmaya başladığında içeride kalmasını sağlamak için piramitlerin hem üst hem de alt taraflarının açık olması gerekir. Şekil 9, kaplama çözeltisindeki biyomimetik kopolimerin konsantrasyonunu artırarak kaplamanın kalınlığındaki artışı göstermektedir. Şekil 10, piramidal boşluklarda hava sıkışmadığından emin olmak için hücre kültürü kaplarının gazdan arındırılmasının sonuçlarını göstermektedir. Şekil 10A,B tam gaz gidermeyi gösterirken, Şekil 10C,D piramidal boşluklardaki hava kabarcıklarını göstermektedir.
Şekil 11'de, hücreler piramitlerin içinde sıkışıp kalır ve karşılık gelen organoidler kültürleşmenin 2. ve 15. günlerinden sonra oluşur. Bunun yerine mikro kuyucukların üst açıklığı kapatılırsa (yanlış adım 3'ün bir sonucu olarak), hücre tohumlamasından sonra numune durulandıktan sonra hiçbir hücre kalmaz. Şekil 12, organoidlerin temsili görüntülerini ve 40x hava hedefine sahip (sayısal diyafram açıklığı 0.75) dönen disk konfokal mikroskop kullanılarak elde edilen bir 3D rekonstrüksiyonu göstermektedir. Serbest bırakıldıktan ve toplandıktan sonra, organoidler küçük bir şişede saklanabilir ve daha fazla analiz için kullanılabilir (örneğin, RNA dizilimi). Şekil 13B, tarif edildiği gibi toplanan organoidlerin bir örneğini göstermektedir.
Resim 1: Poli(dimetilsiloksan) kalıp. (A) 4" dokulu gofretin döküm kopyası olarak elde edilen başlangıç PDMS kalıbı (bakınız Ek Dosya 1). (B) Başlangıç PDMS kalıbının 1 cm x 1 cm genişliğinde kesimi. (C) Kalıbın yüzeyini dolduran kare şeklinde düzenlenmiş yamuk sütunların elektron mikroskobu görüntülerinin taranması. Ölçek çubukları = 1 cm (A), 100 μm ve 200 μm (sırasıyla C üst ve alt). Kısaltma: PDMS = poli(dimetisiloksan). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Düz PDMS substratı . (A) Standart 15 cm genişliğinde Petri kabında ~1 mm kalınlığında bir PDMS tabakası hazırlanır. (B) Yeni bir PDMS kesiminden soyulması. (C) Petri kabında kalan PDMS, daha fazla kullanım için daha fazla parçaya bölünebilir. (D) Düz PDMS kesimi ve PDMS kalıbı yan yana; düz PDMS kalıptan daha büyüktür. Kısaltma: PDMS = poli(dimetisiloksan). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Kalıbın substrat üzerine yerleştirilmesi. (A) Kalıp, piramitler aşağı bakacak şekilde düz substrat üzerine yerleştirilir. (B) Kalıp ve PDMS substratı arasında zayıf temasın (üstte) ve iyi temasın (altta) farklı görünümü. (C) Teması zayıf olan bir alanın optik mikroskop görüntüsü; kırmızı daireler, alt tabaka ile temas etmeyen sütunları vurgular - aynı görüntüde temas halinde olanlardan daha parlak bir renkte görünürler. (D) Tüm sütunları iyi temas halinde olan bir alanın optik görüntüsü. Ölçek çubukları = 200 μm (C,D). Kısaltma: PDMS = poli(dimetisiloksan). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: UV ile kürlenebilir yapıştırıcının kılcal dolgusu . (A) Bu görüntü dizisi (soldan sağa) bir kenara az miktarda yapıştırıcının dökülmesini ve sıvı yapıştırıcının kalıp ile substrat arasındaki boşlukta ilerlemesini gösterir. Sarı oklar sıvı akışının yönünü gösterir. (B) Hareket eden sıvı ön yüzün optik görüntülerinin sırası (40x büyütme); İyi temas halindeyken, sıvının önü piramitlerin kenarlarında sızıntı olmadan hareket eder. Sarı oklar akış yönünü, kırmızı oklar ise temas kenarları etrafında hareket eden sıvı ön tarafın ön kenarını işaret eder. (C) Temas zayıf olduğunda hareket eden sıvı ön kısmın optik görüntülerinin (40x) sırası; kırmızı oklar, kalıp ile substrat arasına sızan sıvının ön kenarını işaret eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Yapışkan kürlemeden sonra kalıbın çıkarılması. (A-C) Kalıbın soyulması için doğru prosedür: sol kenarlardaki yapıştırıcı fazlalığına cımbızla hafifçe bastırılırken, kalıp aynı kenara yakın bir yere sıkıştırılır ve soyulması için yavaşça bükülür. (D) Doğru prosedürün sonucu; fazlalık üç kenarda kesilirken, dördüncü tarafta küçük bir PDMS fazlalığı bırakılır (sarı ok). (E-G) Kalıbı çıkarmak için yanlış bir prosedür örneği: kalıp, karşı kenardan cımbızla sıkıştırılır, bu da yapışkan filmin düz substratından kalıpla birlikte soyulmasına neden olur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Cam örtü kaymasının kaplanması. (A,B) İyi bir kaplama prosedürüne örnek: cam örtü kayması, bir spin-coater'ın vakum mandren üzerine yerleştirilir ve merkeze yeterli yapıştırıcı dağıtılır ve kapak kaymasının homojen bir kaplamasını verir. (C,D) Kötü bir kaplama prosedürüne örnek: yeterli yapıştırıcı dağıtılmaz, bu da kapak kaymasının düzgün olmayan bir şekilde kaplanmasına neden olur. (E) Soldan sağa, iyi, kabul edilebilir ve kötü kaplama örnekleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Alternatif kaplama işlemi . (A) Kapak kapağının ortasına küçük bir damla sıvı yapıştırıcı yerleştirilir. (B) İkinci bir kapak fişi, birincisinin üzerine nazikçe yerleştirilir. (C,D) Sıvı, iki kapak arasında yayılır ve eşit olarak dağıtılır. (E) Kapak fişlerinin doğru şekilde ayrılmasından (solda) veya yanlış ayrılmasından (sağda) sonraki sonuçlara örnekler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Kapak kapağına transfer. (A) Kürlenmiş ve kesilmiş yapışkan film (Şekil 5D), kısmen kürlenmiş yapıştırıcı ile kapak kapağı üzerine yerleştirilir. (B) Dokulu film ile kapak kayması arasındaki iyi temas örneği. İç kısım, yamuk boşluklar arasındaki alanların homojen temasını gösteren optik bir görüntüdür (koyu düzgün renk). (C) Dokulu film ile kapak kayması arasındaki zayıf temas örneği. Daha parlak alanlar temas halinde değildir, kırmızı oklar bu alanları işaret eder. İç kısım, iyi temasın (solda iki) ve zayıf temasın (sağda iki) farklı görünümünü gösteren optik bir görüntüdür. Ölçek çubukları (sarı, B,C) = 200 μm. (D,E) PDMS düz substratını çıkarmak için doğru prosedür: cımbız, PDMS'yi kenarda PDMS fazlalığı ile sıkıştırmak ve hafifçe soyulmak için bükülmek için kullanılır. (F) UV yapışkan dokulu filmin kapak kapağına başarıyla aktarılmasıyla elde edilen sonuç. (G,H) Yanlış soyma prosedürü örneği: cımbız, düz PDMS'yi fazla malzemenin kesildiği kenarlardan birine sıkıştırmak için kullanılır; Böylece, film düz PDMS ile birlikte çıkarılır. Kısaltma: PDMS = poli(dimetisiloksan). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: Biyomimetik kopolimer ile kaplama. (A) Saf etanolde% 0.5 (sol) veya (B) % 1 (sağ) (w / v) çözeltisi kullanılarak biyomimetik kopolimer ile kaplanmış hücre kültürü cihazı. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Hücre kültürü cihazının gazdan arındırılması. (A) Tam gaz giderme işleminden önce hücre kültürü cihazı. (B) Tam gaz giderme işleminden sonra hücre kültürü cihazı; (C,D) hava kabarcıklarının piramitlerde sıkıştığı yerlerde sadece kısmi gaz giderme özelliğine sahip hücre kültürü cihazı. Ölçek çubukları = 200 μm (A-D). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11: Hücre tohumlaması ve organoidlerin büyümesinin temsili parlak alan görüntüleri . (A) Hücreler üstte yüzerken görülebilir. (B) Hücre süspansiyonunu duruladıktan sonra piramidal boşluklarda sıkışan hücreler. Yalnızca sıkışmış hücreler gösterildiği gibi korunur. (C) Hücreler her boşlukta sferoidler oluşturmak üzere toplanır (hücre tohumlamasından sonraki 2. gün). (D) Piramidal boşlukta büyümüş bir organoidin hücre tohumlamasından sonraki 15. gündeki görüntü. Ölçek çubukları = 200 μm (A B), 120 μm (C) ve 150 μm (D). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 12: Organoidlerin 3D görüntülenmesi. (A) Nöroektoderm farklılaşması altında (hücre tohumlamasından sonraki 7. gün) bir organoidin dönen disk konfokali (lens 40x, hava, sayısal açıklık: 0.75) kullanılarak elde edilen üç farklı Z planı. Turuncuda falloidin (Alexa Fluor 647) ve mavide N-kadherin immün boyama (Alexa Fluor 561) kullanılarak aktin boyama. (B) İlgili organoidlerin görüntü analiz yazılımını kullanan bir 3D rekonstrüksiyon (80 Z planları, toplam yükseklik 100 μm). Beyaz oklar: Yüksek düzeyde aktin ekspresyonuna sahip bir çizgi etrafındaki hücre kümeleri. Mavi oklar: N-kadherin protein ekspresyonu için pozitif hücre kümeleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 13: Organoidlerin salınması. (A) Dokulu yapışkan tabakanın cımbızla çıkarılması; (B) Çıkarıldıktan sonra elde edilen bir organoid süspansiyonun parlak alan görüntüsü. Ölçek çubuğu = 200 μm (B). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Piramidal mikro boşluklara sahip bir Si kalıbının mikrofabrikasyonu için adım adım bir protokol sunulmaktadır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yüksek yoğunluklu organoid kültür ve farklılaşmaya izin veren mikrowell kültür kabının üretim prosedürü bu makalede açıklanmıştır. Mikro boşlukların geometrisi ve düzenlenmesi sayesinde, binlerce sferoid, neredeyse hiç malzeme kaybı olmadan uzun süre (birkaç hafta veya daha fazla) tek bir plakada kültürlenebilir ve boyanabilir. Bir karşılaştırma olarak, hücre kültürü plakasındaki 4 mm x 2 mm'lik bir alan, 12 cm x 8 cm'lik bir alana sahip tek bir 384 kuyucuklu plaka kadar sferoid içerebilir.
Mikro boşlukların düzenli dağılımı ve substrat olarak kullanılan düz standart kapak kayması, kültürleme kapları ve görüntüleme destekleri arasında karmaşık ve zaman alıcı numune manipülasyonuna gerek kalmadan binlerce canlı veya sabit organoidin 3D olarak izlenmesini sağlar. Tabandan daha küçük bir tepeye sahip piramit şekli nedeniyle, orta değişim sırasında pipetleme adımları, hücre dışı matrislerin dağıtılması veya boyama prosedürleri nedeniyle organoid kaybı olmaz. Tüm bu adımlar, klasik organoid üretim tekniklerinin (örneğin, asılı damlacıklar, düşük bağlantı plakaları, Aggrewell) aksine, herhangi bir ekstra önlem almadan 2D hücre tek katmanında olduğu gibi doğrudan gerçekleştirilebilir.
Dahası, bu mevcut tekniklerle karşılaştırıldığında, mikro kuyucuklar her türlü daldırma lensiyle (hava, su, yağ ve silikon) uyumlu yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme için tasarlanmıştır. Düz cam bir kapak kapağına kapalı organoidlerin uzun süreli bakımı, hücre kültürü kapak kapağını yüksek çözünürlüklü ışık mikroskoplarıyla uyumlu hale getirir; bu, karmaşık kullanım ve titiz organoid transferi olmadan mevcut yöntemlerle imkansızdır. Ayrıca, optimize edilmiş bir pasivasyon prosedürü, uzun süreli kültür için hücrelerin / organoidlerin herhangi bir yapışmasını önler, böylece 3D kültürün farklılaşmasını kontrol eder Son olarak, dokulu yapışkan tabaka çıkarılabilir olduğundan, canlı organoidler -omik tahliller veya in vivo transplantasyon gibi diğer deney türlerini gerçekleştirmek için alınabilir.
Bu protokol için kullanılan mikro boşlukların piramidal şekli ve dizi düzenlemesinin, ayna benzeri kaplamaya sahip yüzeylere ve tek nesneli ışık tabakası mikroskobuna izin vermek için 45 ° eğim sağlamak için silikon ıslak aşındırma yoluyla imal edilen birincil kalıptan türetildiği belirtilmelidir (soSPIM11). Bu gereksinimlerin tartışılması ve bu tür kalıpların nasıl üretileceğine dair tam bir açıklama12,13'ün başka bir yerinde bulunabilirken, Ek Dosya 1'de basit bir protokol de verilmiştir. Bu protokoldeki çiplerin imalatı ile tamamen uyumlu olan birincil kalıp üretmenin farklı yolları mevcuttur. Örneğin, camın lazerle aşındırılması ve yüksek çözünürlüklü 3D baskı, organoidlerin tutulması için uygun boşluklara sahip birincil bir kalıp üretmek için kullanılabilir, ancak soSPIM görüntüleme için uygun değildir.
Burada açıklanan üretim protokolü, herhangi bir standart biyolojik laboratuvarda kullanılmak üzere uyarlanabilir, çünkü özel, gelişmiş mikrofabrikasyon araçları gerekli değildir. Mikro kuyucukların imalatının bazı kritik adımları, dokulu yapışkan filmin kılcal dolgusu ve cam substrata aktarılması yoluyla üretimdir. Bununla birlikte, deneyimlerimize göre, kısa sürede yüksek tekrarlanabilirlik ile ustalaşabilirler. Piramitler arasındaki mesafe, organoidlerin büyümesi için boşlukların yoğunluğunu arttırmak için mümkün olduğunca küçük olmalıdır, ancak aynı zamanda boşlukların substrat üzerinde herhangi bir sızıntı veya sızdırmazlık eksikliği olmadan kapatılabilmesi için yeterince büyük olması gerekir. 50 μm'lik bir mesafenin bu durum için iyi bir uzlaşma olduğunu bulduk.
Hücre tohumlama sırasında, kritik bir husus, hücre girişini sağlamak için boşlukların içinde sıkışmış hava kabarcıklarının çıkarılmasıdır. Burada sadece klasik laboratuvar ekipmanlarını (örneğin, ultrasonik homojenizatör veya vakum kavanozu) kullanan doğrulanmış bir çözelti tarif ediyoruz. Hücre kültürü çanağı başına hücre sayısının daha iyi homojenleştirilmesine izin vermek için, hücre süspansiyonunun doğrudan kapak kapağının üzerinde değil, çanağın yanından dağıtılması önerilir. Nazik manuel ajitasyon, hücresel çözeltinin homojenize edilmesine de yardımcı olabilir.
Hücrelerin tohumlanmasından sonra, organoidli hücre kültürü kabı diğer klasik kültür destekleri gibi tedavi edilebilir; belirli bir manipülasyon veya kritik adımlar gerekmez. Microwell cihazlarıyla kullanılan tüm protokoller, U-alt plakalar gibi düşük bağlantılı tabaklarda kullanılanlarla pratik olarak aynıdır. Bu nedenle, bu mikro kuyucuklardaki organoid kültür, diğer standartlara kıyasla kültür koşullarında herhangi bir değişiklik gerektirmez.
Bir diğer kritik faktör, burada kullanılan yapıştırıcının optik bir yapıştırıcı olmasıdır. Önerilen en iyi kullanımında (ayrıca satıcının uygulama notlarına da bakın), yapıştırılacak iki optik eleman hizalanır ve arayüze UV kürlenebilir yapıştırıcı uygulanır. Tam polimerizasyona neden olmak için yetersiz bir enerjinin UV'ye ilk maruz kalması, yapıştırıcı özelliklerini korurken yapıştırıcıyı katılaştırmak için kullanılır. Optik bileşenler optimum hizalama elde etmek için hareket ettirilebilir ve daha sonra yapıştırıcı, kalıcı yapışma sağlamak için UV'ye ikinci bir maruz kalma ile son durumuna tamamen kürlenir. Birinci ve ikinci maruz kalma enerji dozları (yani, bilinen ve sabit enerji yoğunluğuna sahip bir kaynak kullanılıyorsa maruz kalma süreleri), kullanılan UV kaynağının enerji yoğunluğuna, tutkal tabakasının kalınlığına, UV'nin optik elemanlardan iletilmesine ve yapıştırılacak yüzeyin yüzey dokulanmasına (veya eksikliğine) bağlı olarak optimize edilmelidir.
Dokulu film ile yapışkan kaplı kapak kayması arasındaki yapışmanın, sızdırmaz sızdırmazlık sağlayacak kadar güçlü olması gerekirken, genotipik profilleme gibi daha fazla analiz gerekirse, görüntülemeden sonra organoidleri almak için dokulu filmi çıkarmak da mümkün olmalıdır. Burada açıklanan protokol ile sızdırmaz sızdırmazlık ve dokulu filmi soyma kabiliyeti arasında doğru bir uzlaşma sağlanmıştır, ancak UV'ye maruz kalma sistemine ve kullanılan film kalınlığına bağlı olarak, kapak kapağı üzerindeki yapışkan ince tabaka için ön kürleme ve son kürleme sürelerinin daha fazla optimizasyonu gerekebilir.
Mevcut mikro kuyucuk versiyonundaki bir sınırlama, tohumlama prosedüründedir; hücreler, piramidin çevresine girmelerine izin vermek için ECM bileşenlerinden önce tohumlanmalıdır. İlk adım olarak mikro kuyucukların hücre dışı matris bileşenleriyle kaplanması için iyileştirmeler devam etmektedir. Boşluklardaki sabit organoidler üzerinde henüz herhangi bir elektron mikroskobu (EM) yapmadık. Mikro kuyucuklardaki organoidlerin EM ile görüntülenmesi uygun bir seçenek haline gelmeden önce bu imalat ve hücre kültürü protokollerinde bazı değişiklikler yapılması gerekecektir.
Bu yöntemin gelecekteki doğal bir uzantısı, tek bir iş akışında (çok kuyulu plaka) çok koşullu testlere izin vermek için yüksek içerikli tarama kapasiteleri sağlamaktır. Bu hücre kültürü cihazı, mevcut organoid tekniklere benzersiz bir alternatif sunarak, eşsiz kültürleme ve görüntüleme verimi sunar ve biyomedikal uygulama ve ilaç keşfi için organoid araştırma alanında yeni perspektifler açar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
WO 2021/167535 A1 Yayın Numarası ile uluslararası patent başvurusu yayınlanmıştır.
Acknowledgments
Araştırma, Ulusal Araştırma Vakfı, Başbakanlık Ofisi, Singapur tarafından desteklenen CALIPSO projesi tarafından, Araştırma Mükemmelliği ve Teknolojik Girişim Kampüsü (CREATE) programı kapsamında desteklenmektedir. V.V., NMK araştırmacısı NRF-NRFI2018-07, MOE Tier 3 MOE2016-T3-1-005, MBI tohum finansmanı ve ANR ADGastrulo'nun desteğini kabul eder. A.B. ve G.G., MBI'nın çekirdek finansmanından gelen desteği kabul ediyor. A.B., Andor Technologies'i BC43 mikroskobunun ödünç verilmesi için kabul etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | Thermofisher scientific | AA19397K7 | |
| Acetone | Thermofisher scientific | AA19392K7 | |
| BC43 Benchtop Confocal Microscope | Andor Technology | spinning disk confocal microscope | |
| bovine serum albumin | Thermofisher scientific | 37525 | |
| Buffered oxide etching solution | Merck | 901621-1L | |
| CEE Spin Coater | Brewer Science | 200X | |
| DAPI | Thermofisher scientific | 62248 | |
| Developer AZ400K | Merck | 18441223164 | |
| DI Milliq water | Millipore | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10082147 | |
| Glass coverslips | Marienfled | 117650 | 1.5H, round 25 mm diameter |
| Hepes | Invitrogen | 15630080 | |
| Imaris software | BitPlane | image analysis software | |
| Inverted Transmission optical microscope | Nikon | TSF100-F | |
| Labsonic M | Sartorius Stedium Biotech | Ultrasonic homogenizer | |
| Lipidure | NOF America | CM5206 | bio-mimetic copolymer |
| NOA73 | Norland Products | 17-345 | UV curable adhesive |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070063 | |
| Phalloidin | Thermofisher scientific | A12379 | Alexa Fluor |
| Phosphate Buffer Solution | Thermofisher scientific | 10010023 | |
| Photo Resist AZ5214E | Merck | 14744719710 | |
| Pico Plasma tool | Diener Electronic GmbH + Co. KG | Pico Plasma | For O2 plasma treatment |
| RapiClear 1.52 | Sunjin lab | RC 152001 | water-soluble clearing agent |
| RCT Hot Plate/Stirrer | IKA (MY) | ||
| Reactive Ion Etching tool | Samco Inc. (JPN) | RIE-10NR | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875093 | culture medium for HCT116 cells |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane or in short, PDMS |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | surfactant |
| Trypsin EDTA | Thermofisher scientific | 15400054 | |
| Ultrasonic Cleaner | Bransonic | CPX2800 | |
| UV-KUB 2 | KLOE | UV-LED light source, 365 nm wavelength, 35 mW/cm2 power density | |
| UV mask aligner | SUSS Microtec Semiconductor (DE) | MJB4 |
References
- Kim, J., Koo, B. -K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Takebe, T., Wells James, M.
- Kratochvil, M. J., et al. Engineered materials for organoid systems. Nature Reviews Materials. 4 (9), 606-622 (2019).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- O'Connell, L., Winter, D. C. Organoids: past learning and future directions. Stem Cells and Development. 29 (5), 281-289 (2020).
- Vives, J., Batlle-Morera, L. The challenge of developing human 3D organoids into medicines. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 72 (2020).
- Busslinger, G. A., et al. The potential and challenges of patient-derived organoids in guiding the multimodality treatment of upper gastrointestinal malignancies. Open Biology. 10 (4), 190274 (2020).
- Lukonin, I., et al. Phenotypic landscape of intestinal organoid regeneration. Nature. 586 (7828), 275-280 (2020).
- Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- Galland, R., et al. 3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nature Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
- Beghin, A., et al. High content 3D imaging method for quantitative characterization of organoid development and phenotype. bioRxiv. , (2021).
- Beghin, A., et al. Automated high-speed 3D imaging of organoid cultures with multi-scale phenotypic quantification. Nature Methods. 19 (7), 881-892 (2022).
