Summary
Un microscope à feuille de lumière a été développé pour imager et numériser la cochlée entière.
Abstract
La surdité est la déficience sensorielle la plus courante, affectant environ 5% ou 430 millions de personnes dans le monde selon l’Organisation mondiale de la santé1. Le vieillissement ou la presbyacousie est une cause primaire de perte auditive neurosensorielle et se caractérise par des dommages aux cellules ciliées, aux neurones ganglionnaires en spirale (SGN) et à la strie vasculaire. Ces structures résident dans la cochlée, qui a une anatomie complexe en forme de spirale de tissus membraneux suspendus dans un liquide et entourés d’os. Ces propriétés rendent techniquement difficile l’étude et la quantification des changements histopathologiques. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé un microscope à feuille de lumière (TSLIM) qui peut imager et numériser l’ensemble de la cochlée pour faciliter l’étude des relations structure-fonction dans l’oreille interne. Des sections en série bien alignées de l’ensemble de la cochlée donnent une pile d’images pour le rendu de volume tridimensionnel (3D) et la segmentation de structures individuelles pour la visualisation 3D et l’analyse quantitative (c’est-à-dire la longueur, la largeur, la surface, le volume et le nombre). Les cochlées nécessitent des étapes de traitement minimales (fixation, décalcification, déshydratation, coloration et effacement optique), qui sont toutes compatibles avec l’imagerie à haute résolution ultérieure par microscopie électronique à balayage et à transmission. Étant donné que tous les tissus sont présents dans les piles, chaque structure peut être évaluée individuellement ou par rapport à d’autres structures. De plus, comme l’imagerie utilise des sondes fluorescentes, l’immunohistochimie et la liaison aux ligands peuvent être utilisées pour identifier des structures spécifiques et leur volume 3D ou leur distribution dans la cochlée. Ici, nous avons utilisé TSLIM pour examiner les cochlées de souris âgées afin de quantifier la perte de cellules ciliées et de neurones ganglionnaires en spirale. De plus, des analyses avancées (par exemple, l’analyse en grappes) ont été utilisées pour visualiser les réductions locales des neurones ganglionnaires en spirale dans le canal de Rosenthal le long de son volume 3D. Ces approches démontrent la capacité de la microscopie TSLIM à quantifier les relations structure-fonction au sein et entre les cochlées.
Introduction
La cochlée est l’organe sensoriel périphérique pour l’audition chez les mammifères. Il a une anatomie en spirale complexe de cellules sensorielles et de soutien répétitives qui sont anatomiquement spécialisées pour détecter les vibrations sonores et les transmettre au cerveau pour la perception de l’audition. Les principaux éléments sensoriels sont les cellules ciliées internes et externes et leurs fibres nerveuses innervantes dont les corps cellulaires composent le ganglion en spirale, qui réside dans le canal de Rosenthal (Figure 1). Ces structures sensorielles et neuronales sont disposées de manière tonotopique de telle sorte que les sons à haute fréquence sont transduits dans la base cochléaire et les sons à basse fréquence dans l’apex2 de la cochlée. Une carte anatomique de cette distribution cellulaire sensorielle le long de la longueur en spirale de la membrane basilaire de soutien est appelée cytocochléogramme3 et peut être comparée à la perte auditive en fonction de la fréquence représentée dans un audiogramme.
Le labyrinthe membraneux de la cochlée, qui est entouré d’os dense, rend techniquement difficile l’examen de plus d’une structure cochléaire à la fois. Par conséquent, la raison d’être du développement d’un microscope à feuille de lumière est de produire des sections en série bien alignées de la cochlée complète afin que toutes les structures cochléaires puissent être examinées les unes par rapport aux autres dans des reconstructions 3D. Voie et al.4 et Voie et Spelman5 ont conçu le premier microscope à feuille de lumière, appelé microscope à section optique à fluorescence plane orthogonale (OPFOS), pour sectionner optiquement toute la cochlée. Cependant, ce microscope n’a jamais été développé commercialement; notre objectif était donc de construire un microscope à feuille de lumière appelé microscope d’imagerie laser à feuille mince (TSLIM; Graphique 2). Les détails de conception et de construction de TSLIM ont déjà été publiés8. TSLIM a apporté plusieurs améliorations par rapport à l’OPFOS, notamment l’utilisation d’un appareil photo numérique à faible luminosité par rapport à une caméra CCD pour la collecte d’images, des micropositionneurs codés optiquement pour un mouvement précis et reproductible de l’échantillon à travers la feuille de lumière, l’utilisation d’une chambre d’échantillon optiquement claire disponible dans le commerce et la coloration à la rhodamine dans l’éthanol plutôt que dans la solution de nettoyage pour empêcher la précipitation des taches dans le tissu. Le développement commercial de microscopes à feuille de lumière tels que SPIM6 s’est concentré sur l’imagerie à haute résolution de petits échantillons transparents vivants, mais ne convient pas à l’imagerie cochléaire entière car ils manquent de distance de travail adéquate. Une revue du développement d’autres microscopes à feuille de lumière a été publiée par Santi7. Le principal avantage de TSLIM par rapport aux autres méthodes histologiques pour examiner la cochlée est de sectionner optiquement les tissus pour la reconstruction 3D tout en préservant l’intégrité du spécimen afin qu’il puisse être utilisé par d’autres méthodes histologiques. Un autre avantage de l’imagerie TSLIM est que seule une mince feuille de lumière produite par un laser est exposée au tissu, par rapport à l’exposition de l’épaisseur du tissu entier au laser comme en microscopie confocale. L’élimination des tissus pour minimiser la diffusion de la lumière et le fait que seule une petite partie du tissu est exposée au laser entraînent une décoloration minimale du fluorochrome (photoblanchiment) avec l’imagerie laser à feuille de lumière. Cependant, le processus de fixation, de déshydratation et de nettoyage modifie la morphologie des structures cochléaires et entraîne un rétrécissement des tissus par rapport aux tissus vivants. La quantité réelle de rétrécissement tissulaire qui se produit n’a pas été déterminée.
TSLIM a été développé par Shane Johnson et huit étudiants allemands en génie optique (voir Remerciements). Les détails de construction de TSLIM ont été fournis par Santi et al.8 et une version de numérisation (sTSLIM) par Schröter et al.9. TSLIM fonctionne comme un microtome non destructif pour sectionner optiquement des échantillons et comme un microscope pour collecter des coupes en série 2D sur toute la largeur et l’épaisseur de la cochlée. TSLIM peut imager à la fois des spécimens petits (mm) et grands (cm) et épais. Les lentilles sont montées à air pour permettre de longues distances de travail avec des objectifs de collecte de 1x et 2x sur un microscope à dissection. Le microscope à dissection dispose également d’une optique de zoom qui permet à TSLIM de résoudre les structures subcellulaires et synaptiques sur les cellules. TSLIM est équipé d’un laser bleu (473 nm) et vert (532 nm) pour l’éclairage qui permet d’utiliser une variété de sondes fluorescentes pour l’imagerie. L’objectif de TSLIM est de produire des coupes optiques 2D bien alignées à travers une cochlée entière pour une reconstruction numérique complète des tissus cochléaires. Comme il s’agit d’une méthode fluorescente, les ligands et l’immunohistochimie peuvent également être utilisés pour identifier des structures cochléaires spécifiques.
Initialement, une lentille cylindrique a été utilisée pour produire deux feuilles de lumière gaussiennes opposées, mais elle a produit des artefacts d’imagerie par absorption. Grâce aux travaux de Keller et al.10, la lentille cylindrique fixe a été remplacée par un miroir galvanomètre à balayage pour produire la feuille de lumière9. De plus, comme le centre de la feuille lumineuse est le plus mince à la taille du faisceau, les images 2D sTSLIM sont produites en collectant un composite de colonnes de données sur l’axe X sur toute la largeur de l’échantillon (Figure 3). Cette méthode a été décrite pour la première fois par Buytaert et Dircks11. Le logiciel personnalisé TSLIM pour piloter et collecter des images a été développé à l’aide d’un programme graphique pour le contrôle des instruments. La feuille de lumière traverse l’échantillon et illumine un plan fluorescent à l’intérieur du tissu. Ce plan fluorescent est projeté orthogonalement à travers l’échantillon transparent et est recueilli par un microscope à dissection. Les micropositionneurs codés optiquement permettent de balayer à travers la taille du faisceau dans l’axe X pour collecter une seule image 2D composite et, par la suite, le micropositionneur de l’axe Z déplace l’échantillon vers un plan plus profond dans le tissu pour obtenir une pile d’images 2D en série sectionnées (vidéo 1, figure 4). Une pile d’images translationnelles est collectée sur toute la largeur, l’épaisseur et la longueur de la cochlée, et l’assemblage des images n’est pas nécessaire (vidéo 2). La pile d’images est transférée sur un autre ordinateur et chargée dans un programme de rendu 3D pour la reconstruction et la quantification 3D. Les piles d’images contiennent toutes les informations numériques sur la morphologie d’une cochlée à la résolution du microscope. Cependant, si une résolution plus élevée est requise, la cochlée intacte peut être traitée par des méthodes histologiques destructrices telles que la section microtome, le balayage et la microscopie électronique à transmission.
Le programme de rendu 3D est utilisé pour segmenter différentes structures cochléaires pour le rendu 3D et l’analyse quantitative. Pour la segmentation, chaque structure de chaque image 2D de la pile est tracée à l’aide d’une couleur différente à l’aide d’une tablette graphique et d’un stylet (Figure 5). À ce jour, 20 structures cochléaires différentes ont été segmentées (Figure 6). Après segmentation, diverses analyses 3D peuvent être effectuées. Par exemple, un logiciel de rendu 3D peut pratiquement résectionner la cochlée dans n’importe quel plan le long du centroïde de la structure. La vidéo 3 montre une section tangentielle à l’organe de Corti, qui révèle les cellules ciliées le long de la membrane basilaire. Ce processus nécessite d’abord une segmentation manuelle de la structure d’intérêt. Ensuite, le centroïde de la structure est calculé sur la base de l’ajustement des moindres carrés des points spline placés le long du centre de la structure de sa base à son sommet, permettant ainsi une approximation de la longueur de la structure (vidéo 4). Un processus similaire appelé squelettisation peut être utilisé pour visualiser la largeur radiale de la structure sur toute sa longueur à l’aide d’une carte de couleurs (vidéo 4). Le volume total de chaque structure est calculé par le programme après segmentation, mais les distances relatives peuvent également être quantifiées et visualisées avec des cartes de couleurs dans un logiciel de rendu 3D (Figure 7). Les structures segmentées peuvent également être exportées pour produire des rendus de modèles en plastique solide agrandis (Figure 8). En outre, le comptage semi-automatisé des cellules peut également être effectué à l’aide d’un logiciel de rendu 3D (Figure 9). L’immunohistochimie et la liaison aux ligands peuvent être utilisées pour colorer des structures cochléaires spécifiques et ces structures peuvent être isolées d’autres structures cochléaires pour une évaluation morphométrique telle que la production d’un cytocochléogramme (Figure 10). La longueur, la largeur, la surface, le volume et le nombre de toutes les structures cochléaires peuvent être déterminés à partir des modèles 3D, ce qui rend cette approche idéale pour cartographier les dommages cochléaires aux déficiences fonctionnelles. Plus précisément, les dommages cochléaires dus au vieillissement, aux traumatismes induits par le bruit ou à d’autres insultes peuvent être montrés et quantifiés dans des reconstructions cochléaires 3D à partir de coupes optiques 2D. Une fois qu’une cochlée a été numérisée, il existe de nombreux algorithmes d’imagerie qui peuvent être utilisés pour évaluer les dommages cochléaires de tout tissu de la cochlée dans le registre anatomique à d’autres tissus cochléaires.
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Protocol
Toutes les procédures et l’utilisation d’animaux vivants ont été examinées et approuvées (Protocol ID #2010-38573A) par le Comité de soin et d’utilisation des établissements de l’Université du Minnesota (IACUC) et les enquêteurs qui utilisent ces animaux ont été soigneusement formés et testés par les vétérinaires des ressources animales de recherche (RAR) avant d’avoir accès aux installations animalières. Des souris mâles et femelles ont été utilisées dans cette étude.
1. Enlèvement de la cochlée pour la fixation et traitement des tissus pour l’imagerie
- Euthanasier une souris par inhalation de CO2 . Décapitaisez la souris avec des ciseaux et faites une incision dorso-ventrale à travers le cerveau pour hémisecter le crâne. Retirez le cerveau, identifiez la bulle ronde dans la partie baso-ventrale du crâne, ouvrez la bulle avec des rongeurs, visualisez et retirez la cochlée.
- Fixation: Effectuez cette procédure sous une hotte et à l’aide d’un microscope à dissection à grossissement 5x. Portez des gants et des vêtements de protection. Percez la fenêtre ovale et retirez les étriers avec un pic tranchant. Insérez un pic dans la fenêtre ronde pour percer la membrane.
- Couvrir la fenêtre ronde ouverte avec l’embout coupé d’un kit de perfusion attaché à une seringue de 1 mL remplie de 2 mL de formol. Infuser lentement le formol à travers les espaces périlymphatiques de la cochlée sur une période de 2 minutes, en notant que le formol sort de la cochlée par la fenêtre ovale ouverte. Couper l’excès de tissu de la cochlée et plonger dans un flacon contenant 10% de formol, et placer sur un rotateur pendant la nuit.
- Décalcification: Rincer la cochlée dans PBS 3x pendant 5 min chacun et plonger dans un flacon contenant une solution à 10% d’acide éthylènediaminetétraacétique disodique (EDTA) avec rotation pendant 4 jours, en changeant la solution quotidiennement.
- Déshydratation: Perfuser la cochlée avec PBS 3x et immerger pendant 15 minutes entre les changements. Déshydrater la cochlée avec des concentrations croissantes d’éthanol 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%; pendant 30 min à chaque concentration.
REMARQUE: Il est important d’éliminer tout l’EDTA avant la déshydratation car l’EDTA précipite dans l’éthanol. En outre, les cochlées peuvent être laissées dans n’importe quelle concentration d’éthanol supérieure à 70% pendant la nuit. - Coloration : Colorer toute la cochlée par immersion dans une solution d’isothiocynate de rhodamine B (5 μg/mL dans de l’éthanol à 100 %) pendant une nuit avec rotation. Enlevez l’excès de colorant de la cochlée avec deux changements d’éthanol à 100%, 5 min chaque changement.
- Dégagement: Transférer la cochlée colorée dans deux changements de solution Spalteholz12 (salicylate de méthyle 5:3:benzoate de benzyle), 30 min chaque changement et laisser toute la nuit dans la solution de clairage avec rotation. Les cochlées peuvent être laissées indéfiniment dans la solution Spalteholz.
2. Imagerie des cochlées
- Fixez les cochlées à une tige d’échantillon à l’extrémité ovale et ronde de la membrane de la fenêtre de manière à ce que la solution de dégagement reste à l’intérieur de la cochlée et que des bulles ne se forment pas (figure 2). Il faut veiller à ne pas laisser les bulles se former dans la cochlée car elles sont difficiles à enlever et si elles sont laissées dans le tissu, elles provoqueront des artefacts d’imagerie.
- Utilisez une colle activatrice UV pour fixer la cochlée humide à la tige sèche de l’échantillon (figure 2). Fixez la cochlée aux extrémités ovales et rondes des fenêtres. Faites durcir la colle UV pendant 10 s en vous déplaçant autour de la cochlée avec la lumière UV.
REMARQUE: Une fixation desserrée de la cochlée à la tige de l’échantillon entraînera des défauts d’imagerie. Cette tige est spécialement fabriquée pour ce protocole (voir Santi et al.8 pour plus de détails) et est spécifique à notre microscope à feuille de lumière. - Suspendre la cochlée dans la chambre d’imagerie remplie de solution Spalteholz pour l’imagerie. La chambre d’échantillonnage est une cellule fluorométrique à quartz optiquement claire (vidéo 1).
- Fixez la tige d’échantillon à un support rotatif qui est également fixé à l’étage de translation XZ. La plupart des piles sont obtenues en traduisant l’échantillon dans les plans XZ, mais des piles rotatives peuvent également être obtenues.
- Sectionnement optique TSLIM: Utilisez un laser bleu ou vert pour l’excitation en fonction du type de coloration fluorochrome. Positionnez la feuille lumineuse au milieu du tissu pour la mise au point et déterminez le grossissement qui sera utilisé pour éclairer toute la largeur de la cochlée. Ensuite, utilisez un programme conçu sur mesure pour déplacer l’échantillon à travers la feuille de lumière à travers l’échantillon sur l’axe X (assemblage de l’image) et par étapes Z pour créer une pile d’images 2D dans toute la cochlée.
- Pour la première image, la taille du faisceau de la feuille lumineuse est positionnée au bord de l’échantillon et le programme balaye toute la largeur de l’échantillon en collectant des colonnes de données (voir assemblage de l’image; Santi et coll.8) qui correspondent à la largeur du paramètre confocal (figure 3) pour produire une image 2D composite de résolution maximale sur toute la largeur de l’échantillon. Le programme automatise l’assemblage de l’image pour chaque étape Z jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement imagé.
- Traitement d’image: Transférez la pile d’images sur un autre ordinateur et chargez-la dans un programme de rendu 3D pour la reconstruction et la quantification 3D.
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Representative Results
Puisque le thème de ce numéro spécial est l’imagerie des effets du vieillissement chez la cochlée, une jeune cochlée (HS2479, souche CBA) et âgée (23 mois, souris souche HS2521, C57) sera utilisée comme exemples. Il convient de noter que TSLIM est capable d’imager une variété de spécimens, y compris des cochlées d’humains, de mammifères, d’autres rongeurs et de poissons, ainsi que d’autres organes tels que le cerveau.
Johnson et al. 13 ont publié un article sur les SGN chez de jeunes souris CBA (âgées de 3 semaines) utilisant TSLIM. Tous les SGN ont été comptés chez cinq souris et il y avait une gamme de 8 408 à 8 912 SGN avec une longueur moyenne de Rosenthal de 2,0 mm. Dans la présente étude, nous avons compté les SGN chez une souris CBA âgée de 3 mois qui contenait 7 913 SGN dans une longueur de canal de Rosenthal de 2,0 mm. La souris C57BL6 âgée de 23 mois contenait 6 521 SGN avec une longueur de Rosenthal de 2,11 mm. Un rendu de volume montre tous les SGN dans les deux cochlées, mais la perte de SGN n’a pas été révélée dans l’ancienne souris. Cependant, le nombre de cellules SGN en fonction de la distance du canal de Rosenthal, représenté dans un graphique linéaire, a montré des SGN plus importants chez le jeune animal aux extrémités médiane et apicale de la cochlée par rapport à l’animal plus âgé (Figure 11). Cette perte apparente de SGN a été visualisée en utilisant l’analyse de cluster dans un logiciel de rendu 3D. Ici, les différences de densité SGN ont été représentées sur une échelle de couleurs où les grappes à haute densité sont jaunes et le bleu représente les régions de densité plus faible (Figure 12). Bien qu’il ne soit pas possible d’identifier des cellules spécifiques qui ont été perdues, l’analyse en grappes permet de visualiser clairement les régions de densité cellulaire plus faible le long du canal de Rosenthal (Figure 12).
Figure 1 : Rendu volumique direct d’une cochlée. Une figure composite à partir d’un rendu de volume d’une cochlée de souris montrant les fenêtres ovales (O) et rondes (R), l’organe de Corti avec les cellules ciliées (ligne bleue, OC) et le canal de Rosenthal qui a été segmenté et rendu de volume qui contient des neurones ganglionnaires en spirale (SGN). Bar = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Porte-échantillon. Un prototype en bois d’un porte-échantillon personnalisé pour la fixation de la cochlée (pointe de flèche) à une tige d’échantillon (flèche) en utilisant de la colle activée par UV tout en gardant la solution de nettoyage dans la cochlée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Coupe transversale de la feuille lumineuse. Coupe transversale à travers une feuille lumineuse balayée sur l’axe X montrant la taille du faisceau au milieu de la feuille lumineuse et le paramètre confocal (CP), qui est une région où l’épaisseur du faisceau est relativement constante. Le rendu solide supérieur montre la largeur du faisceau sans balayage et le rendu solide inférieur montre la largeur du faisceau balayé qui reste mince sur toute la largeur de la cochlée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Coupe transversale 2D mi-modiolaire à travers une cochlée de souris. Quatre tours cochléaires sont sectionnés. Le tour basal du canal de Rosenthal peut être vu contenant des neurones ganglionnaires en spirale de forme sphérique. Bar = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Deux coupes transversales de la cochlée. Sur la gauche se trouve une coupe transversale 2D et sur la droite se trouve la même section avec plusieurs structures qui ont été segmentées à l’aide de tracés de différentes couleurs. Bar = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Structures cochléaires segmentées. (A) Cette figure montre une cochlée segmentée avec la capsule otique environnante. (B-K) Ceux-ci montrent plusieurs structures cochléaires différentes qui ont été segmentées et les centroïdes (ligne blanche) sont déterminés pour la plupart des structures. Les structures cochléaires ont été segmentées avec différentes couleurs pour leur identification: (A) figure composite avec os (blanc), (B) turquoise (ligament spiralé), (C) marron (strie vasculaire), (D) jaune (membrane basilaire), (E) rouge (organe de Corti), (F) jaune-vert (canal de Rosenthal), (G) bleu (scala tympanique), or (plaque plantaire de l’étrier), (H) blanc (scala media), vert (ductus reuniens), (I) rouge (scala vestibuli), violet (membrane ronde de la fenêtre), or (aqueduc cochléaire), (J) vert (membrane tectoriale), (K) violet (limbe spiralé). Bar = 400 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Comparaison de la même structure cochléaire dans deux cochlées différentes. En utilisant la méthode Procrustus dans un logiciel de rendu 3D, les médias Scala de deux souris différentes ont été comparés. Le panneau de gauche montre l’ajustement d’un ajustement des moindres carrés de deux structures et le panneau de droite montre leurs différences quantitatives à l’aide d’une carte de couleurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Modèle plastique 3D solide de la cochlée. Le panneau de gauche montre la Scala tympani d’une cochlée de souris avec la membrane basilaire, l’organe de Corti et l’hélicotrème segmentés. Le panneau de droite montre un modèle en plastique solide des structures à gauche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Comptage des neurones ganglionnaires en spirale. Les SGN ont été identifiés et marqués par le logiciel de rendu 3D sur une coupe transversale du support Scala de la cochlée de souris. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : Marquage immunohistochimique des cellules ciliées externes. Les anticorps anti-prestine et les anticorps secondaires fluorescents qui ont été perfusés à travers la scala péri lymphatique d’une cochlée de souris ont marqué toutes les cellules ciliées externes qui ont été rendues en volume à l’aide d’un logiciel de rendu 3D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 11 : Densité des SGN le long du canal de Rosenthal. La plus grande perte de SGN semble se situer aux extrémités médianes et apicales du canal de Rosenthal chez la souris âgée de 23 mois. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 12 : Analyse en grappes de la densité cellulaire SGN. Le panneau de gauche montre une analyse en grappes de SGN chez une souris auditive normale de 3 mois. Une carte de couleurs montre que la plus grande densité de cellules au sein d’un amas d’une taille donnée se trouve dans le canal de Rosenthal moyen, où les seuils d’audition des souris sont les plus bas. Le panneau de droite montre la perte de SGN dans tout le canal de Rosenthal avec la plus grande perte de SGN au milieu du canal de Rosenthal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1: Vidéo de balayage de l’axe X de la cochlée. Balayage de l’échantillon sur l’axe X à travers la feuille lumineuse montrant la cochlée suspendue par la tige de l’échantillon dans la solution de nettoyage contenue dans une chambre en verre. Une coupe transversale fluorescente 2D orthogonale de la cochlée est représentée en raison de l’éclairage par la feuille de lumière. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 2: Pile de sections sérielles de la cochlée. Un petit empilement de sections transversales 2D est obtenu par balayage de l’axe X et par pas Z de 10 μm à travers la cochlée. Remarquez la présence de lignes horizontales dans toute la pile, qui sont des artefacts d’absorption dus à l’utilisation d’une lentille cylindrique pour produire la feuille de lumière. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 3 : Résection d’une cochlée dans un plan différent. Une pile chargée dans le logiciel de rendu 3D et une résection virtuelle dans un plan tangentiel à l’organe de Corti montrant les cellules ciliées le long de la membrane basilaire. Cette vidéo a été modifiée à partir de8. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 4 : Squelettisation du média Scala. Le panneau de gauche montre le calcul du centroïde dans le milieu Scala d’une cochlée de souris. Le panneau de droite montre une carte en couleurs des dimensions radiales du média Scala sur toute sa longueur. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
La coupe optique par microscopie à feuille de lumière pour l’examen des structures cochléaires n’est pas mécaniquement destructrice comme d’autres méthodes histologiques plus traditionnelles, et elle fournit une vue numérique complète des structures cochléaires les unes par rapport aux autres. Des méthodes antérieures telles que les préparations de surface de l’organe de Corti14 ont fourni une carte de la perte de cellules ciliées le long de la membrane basilaire, mais la perte de SGN n’a pas pu être évaluée car le tissu avait été disséqué pour révéler l’organe de Corti. Alternativement, les sections microtomes mi-modoilaires de la cochlée ne fournissent qu’un très petit échantillon de l’état des SGN sur toute la longueur du canal de Rosenthal. Avec TSLIM, toutes les structures cochléaires sont numérisées au niveau de la résolution de l’instrument (c’est-à-dire sous-cellulaire). Des piles d’images complètes de la cochlée permettent de quantifier et de visualiser plusieurs structures cochléaires, qui sont montrées ici, qui ne pourraient pas être obtenues par les méthodes histologiques traditionnelles. Par exemple, à l’aide d’un algorithme de clustering, la présente étude a montré une toute nouvelle façon de visualiser et de quantifier la densité cellulaire SGN dans le canal de Rosenthal et de caractériser la perte cellulaire due au vieillissement (Figure 12).
TSLIM est un développement précoce8 d’un microscope à feuille de lumière qui a été inspiré par le travail de Voie et de ses collègues 4,5. Les spécifications pour la construction de TSLIM ont été incluses dans le document de Santi et al.8. En fait, Brown et al.15 ont déclaré qu’ils avaient construit un microscope à feuille de lumière similaire pour l’imagerie de la cochlée basé sur la conception de TSLIM. Comme mentionné dans l’introduction et examiné par Santi7, le développement d’autres microscopes à feuille de lumière (par exemple, SPIM) visait à étudier le développement de cellules vivantes et a obtenu une meilleure résolution par immersion d’objectifs N.A. élevés dans la chambre d’échantillonnage, ce qui nécessitait de petites distances de travail et ne convient pas à l’imagerie de cochlées entières. Le développement commercial des microscopes à feuille de lumière se poursuit, et ce type d’imagerie est extrêmement utile pour préparer des coupes en série bien alignées de tissus et d’animaux rendus transparents par des méthodes de nettoyage chimique.
Pour toute application de microscope à feuille de lumière, il est essentiel que l’échantillon soit rendu transparent pour empêcher la diffusion et l’absorption de la lumière. La décalcification est la première étape du processus d’élimination du calcium de la cochlée pour la transparence. Si l’EDTA n’est pas complètement rincé du tissu avant la déshydratation, il précipitera dans le tissu et une bonne imagerie ne sera pas possible. La déshydratation à l’éthanol est nécessaire pour l’infiltration de la solution de dégagement Spalteholz. Si un échantillon est fortement pigmenté, le blanchiment du pigment peut aider à rendre l’échantillon plus transparent. Il existe de nombreux autres produits chimiques et méthodes qui peuvent être utilisés pour rendre un échantillon transparent et les utilisateurs peuvent vouloir essayer différentes méthodes pour déterminer quelle méthode convient le mieux à leur échantillon. Bien que la microscopie à feuille de lumière produise des images 2D des tissus, sa résolution n’est pas aussi grande que celle obtenue à partir de fines sections mécaniques de tissu (en particulier les sections en plastique) et de la microscopie à fond clair. Son principal avantage est de produire des sections de tissu en série bien alignées pour la reconstruction 3D des structures.
Les deux souris cochlées que nous montrons comme exemples de perte de SGN due au vieillissement révèlent une perte de neurones due au vieillissement. Une découverte inattendue était la perte de SGN dans les extrémités médiane et apicale de la cochlée plutôt qu’une perte basale qui correspondrait à une perte de cellules ciliées dans la base. Cependant, nous n’avons pas évalué la perte de cellules ciliées dans ces cochlées et les deux échantillons ne sont que des exemples plutôt qu’une enquête sur les effets du vieillissement sur les SGN. Dans un article de White et al.16, ils ont décrit la perte de SGN chez des souris C57 âgées de 18 mois, mais n’ont pas déterminé la distribution de la perte le long du canal de Rosenthal. Dans un autre article de Grierson et al.17, en utilisant des souris âgées de 24 à 28 mois, ils ont décrit une dégénérescence massive des efférents OHC, en particulier dans la moitié apicale de la cochlée, où il y avait aussi une perte significative d’OHC. En effet, l’avenir offre de nombreuses possibilités pour extraire de nouvelles données et mieux comprendre les processus pathologiques au sein de la cochlée dus au vieillissement et autres insultes. De plus, des piles d’images cochléaires ont été fournies à de nombreux autres chercheurs et il sera intéressant de voir comment ces chercheurs exploitent les données pour répondre à leurs questions de recherche.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par des subventions du National Institute on Deafness and Other Communication Disorders des National Institutes of Health, de la Kellogg Foundation et des dons privés de Bridget Sperl et John McCormick. TSLIM a été développé avec l’excellente assistance de Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg et Julian Wuester de l’Université technique d’Illmenau, en Allemagne, sous la supervision de leurs mentors (Stefan Sinzinger et René Theska) et James Leger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira 3D Rendering Software | ThermoFisher Scientific | Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzyl benzoate (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% and 100% | University of Minnesota | Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW graphical program and Vision | National Instruments | Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 dissection microscope | Olympus Corp | Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
References
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