Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة لإجراء تجربة وضع العلامات على القرب (PL) في الخيار (Cucumis sativus L.) باستخدام بروتين AT4G18020 (APRR2) -AirID كنموذج. تصف الطريقة بناء ناقل ، وتحويل بنية من خلال التسلل الزراعي ، وتسلل البيوتين ، واستخراج البروتين ، وتنقية البروتينات التي تحمل علامة البيوتين من خلال تقنية تنقية التقارب.
Abstract
في خلايا ونباتات الثدييات ، أثبتت مناهج وضع العلامات على القرب (PL) باستخدام بيروكسيديز الأسكوربات المعدل (APEX) أو Escherichia coli biotin ligase BirA (المعروف باسم BioID) نجاحها في تحديد تفاعلات البروتين والبروتين (PPIs). APEX و BioID و TurboID ، نسخة منقحة من BioID لها بعض القيود بالإضافة إلى كونها تقنيات قيمة. وقد تغلبت AirID التي تم تطويرها مؤخرا، وهي نسخة جديدة من BioID لتحديد القرب في تفاعلات البروتين والبروتين، على هذه القيود. في السابق ، تم استخدام AirID في النماذج الحيوانية ، بينما توضح الدراسة الحالية استخدام AirID في النباتات ، وأكدت النتائج أن AirID يعمل بشكل أفضل في أنظمة النبات مقارنة بإنزيمات PL الأخرى مثل BioID و TurboID لوضع العلامات على البروتين القريبة من البروتينات المستهدفة. فيما يلي بروتوكول خطوة بخطوة لتحديد شركاء تفاعل البروتين باستخدام بروتين AT4G18020 (APRR2) كنموذج. تصف الطرق بناء الناقل ، وتحويل البناء من خلال التسلل الزراعي ، وتحويل البيوتين ، واستخراج البروتينات ، وإثراء البروتينات التي تحمل علامة البيوتين من خلال تقنية تنقية التقارب. وخلصت النتائج إلى أن AirID هو إنزيم جديد ومثالي لتحليل مثبطات مضخة البروتون في النباتات. يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة البروتينات الأخرى في النباتات.
Introduction
تعمل البروتينات الخلوية المختلفة في إطار النظام التنظيمي بيولوجيا ، وتفاعلات البروتين والبروتين (PPIs) هي جزء من هذا النظام وأساس العديد من العمليات الخلوية. إلى جانب PPIs ، يتم تعزيز وظيفة البروتينات الطبيعية بعد الترجمة من خلال تعديلات مختلفة مثل تكوين المعقد ، والوجود في كل مكان ، والفسفرة. لذلك ، فإن دراسة مثبطات مضخة البروتون مهمة لفهم الوظيفة المحتملة للبروتينات المستهدفة. تم تنفيذ PPIs باستخدام تقنيات مختلفة مثل تحليل قياس الطيف الكتلي بعد الترسيب المناعي (تحليل IP-MS) 1 ، ونظام الخميرة ثنائي الهجين (Y2H) 2 ، وكذلك المصفوفات القائمة على الخلاياالخالية من الخلايا 3. استكشفت هذه الأساليب العديد من النتائج الحيوية في مجال البحث. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب لها بعض العيوب. على سبيل المثال ، Y2H هي استراتيجية تستغرق وقتا طويلا ومكلفة وتتطلب بناء مكتبة Y2H للأنواع المستهدفة.
بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم تقنية Y2H الخميرة ، وهي كائن حقيقي النواة أحادي الخلية غير متجانس ، والذي لا يمكن أن يعكس بدقة الحالة الخلوية للخلايا حقيقية النواة العليا. IP-MS غير مناسب للبروتينات عالية الكارهة للماء ويظهر كفاءة منخفضة في التقاط PPIs الضعيفة. يتم التعبير عن البروتينات الأساسية المختلفة في النباتات مثل مجال ربط النيوكليوتيدات والبروتينات الغنية بالليوسين المحتوية على التكرار (NLR) والكينازات الشبيهة بالمستقبلات (RLKs) على مستوى منخفض وتتفاعل في الغالب مع البروتينات الأخرى بشكل عابر ؛ لذلك ، فإن استخدام هذه الطرق غير كاف لفهم الآليات الكامنة وراء تنظيم هذه البروتينات3.
تساعد تقنية جديدة تسمى البيوتينيل القريب (PB) الباحثين على تحديد مثبطات مضخة البروتون. يعتمد PB على إنزيمات PL ، التي ترتبط بالبروتين محل الاهتمام (POI) ، وعندما يقترب بروتين الشريك من POI ، يعلق PL علامة البيوتين الكيميائية على البروتين الشريك. علاوة على ذلك ، يمكن تحديد البروتين الموسوم ويمكنه معرفة البروتين الشريك الذي يرتبط بالبروتين المستهدف5 بسرعة. أثبتت الدراسات السابقة أن BioID و TurboID هما أداتان ناجحتان ل PPIs ، خاصة في النباتات ، لكن لهما قيود معينة4. يحتاج BioID إلى مستوى عال من البيوتين لوضع العلامات على البروتينات الشريكة ، والتي تستغرق أكثر من 16 ساعة. بالمقارنة مع BioID ، فإن TurboID أكثر فائدة لأنه يقوم بتسمية البروتين في 10 دقائق ويمكنه تسمية البروتين الشريك في درجة حرارة الغرفة (RT). كما أنه سام للخلايا في ظروف معينة ويضع علامات على تلك البروتينات التي لا تظهر تفاعلا مع البروتين محل الاهتمام.
للتغلب على هذه المشكلات ، يعد AirID ، الذي طوره Kido et al. ، أكثر كفاءة من بقية إنزيمات الملصقات ، على الرغم من أن تشابه التسلسل هو 82٪ بين BioID و AirID5. للتحقق من كفاءة AirID ، أجرينا تجربة باستخدام POI مع شركاء معروفين. أكدت هذه التجربة أن AirID يمكنه بلا شك تسمية البروتينات المرتبطة في الخلايا النباتية. AirID هو إنزيم قيم لتحليل مثبطات مضخة البروتون في المختبر وفي الخلايا. إنه يخلق سمية أقل وأقل خطأ في العمليات الزمنية المستغرقة من TurboID لوضع علامة على غير الشركاء ، مما يؤدي إلى قتل الخلية. يوضح أن AirID أكثر قدرة على المنافسة من إنزيمات وضع العلامات الأخرى للبتقريب من البيوتينيل. إنه أكثر دقة ، ولديه إمكانات أكبر في عمليات أخذ الوقت ، وأقل سمية في المختبر وفي الخلايا الحية. يصف البروتوكول الحالي تحديد البروتينات المتفاعلة ل APRR2 باستخدام AirID كإنزيم PL. علاوة على ذلك ، يمكن تطبيق الطريقة على البروتينات الأخرى للتحقيق في مثبطات مضخة البروتون في الأنواع النباتية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تحضير المواد النباتية
- يستخدم كوكوميس ساتيفوس (الخيار) للتحليل التجريبي. ضعي البذور في الماء ، واحتضنها على حرارة 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، ثم ضعي البذور على ورق ترشيح على طبق بتري لمدة 12-16 ساعة.
- بعد ذلك ، انقل البذور إلى أواني تحتوي على تربة (تم شراؤها تجاريا) وتنمو في غرفة مناخية عند درجة حرارة 23 درجة مئوية و 16 ساعة خفيفة و 8 ساعات من الفترة الضوئية الداكنة.
- حافظ على النباتات في غرفة المناخ لمدة 3-4 أسابيع حتى تصل النباتات إلى 3 أو 4 مراحل أوراق للتسلل الزراعي الناجح.
2. جعل بناء AirID
- استخدم APRR2 كبروتين مستهدف وقم ببناء APRR2-AirID تحت مروج فيروس موزاييك القرنبيط 35S (p35S: APRR2-AirID). أدخله في المتجه الثنائي المتوافق مع البوابة pEarleyGate1006 (مقدم من الدكتورة كاثرين شريك ، جامعة ولاية كانساس) ، وقم بتوليف إنزيم PL مباشرة وفقا للتسلسل الوارد في الملف التكميلي 1.
3. إعداد الخلايا المختصة
- تحضير الخلايا المختصة DH5α
- تلقيح 2 مل من LB (10 جم / لتر من التربتون ، 5 جم / لتر من مستخلص الخميرة ، و 10 جم / لتر من كلوريد الصوديوم ؛ درجة الحموضة = 7.0.) بخلايا E.Coli DH5α (مباشرة من المخزون المجمد دون إذابة) وتنمو بين عشية وضحاها (O / N) عند 37 درجة مئوية.
- تلقيح 0.1٪ -0.5٪ لقاح حديثا من مزرعة O / N إلى 100 مل من LB Medium وقم بتنمية الخلايا حتى يصل OD600 إلى ما بين 0.4-0.6 ، ثم احتضان المزرعة عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
- خذ الثقافة إلى أنبوبي طرد مركزي سعة 50 مل وقم بتدويرها عند 2500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من 0.1 متر من الثلج البارد CaCl2 ، وضعها على الثلج لمدة 15 دقيقة. قم بتجميع الخلايا ذات الدوران 2500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- أعد تعليق الخلايا في 1 مل من الثلج البارد 0.1 M CaCl2 + 20٪ جلسرين ، و aliquot 100 μL في كل أنبوب 1.5 مل ، وقم بتخزينها على الفور عند -80 درجة مئوية.
- تحضير الخلايا المختصة GV3101
- تلقيح 2 مل من LB (يحتوي على 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين و 25 ميكروغرام / مل ريفامبيسين) مع مستعمرة GV3101 واحدة. احتضان المزرعة O / N عند 28 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
- تلقيح 200 مل من LB مع 1 مل من ثقافة مشبعة بين عشية وضحاها. هز الثقافة عند 250 دورة في الدقيقة أثناء احتضانها عند 28 درجة مئوية حتى يصبح OD600 يساوي 0.5.
- انقل المزرعة إلى أربعة أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 50 مل مبردة مسبقا وضعها على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- حبيبات الخلايا في 2500 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وضع الكريات على الجليد.
- أعد تعليق الخلايا في 10 مل من محلول CaCl2 البارد 0.1 متر. قم بتجميع الخلايا معا في أنبوب أوكريدج واحد مبرد مسبقا سعة 50 مل.
- قم بتجميع الخلايا عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من محلول CaCl2 البارد المثلج. يوضع على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- قم بتجميع الخلايا عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من محلول CaCl2 البارد 0.1 متر.
- قم بتوزيع الخلايا في قسمة 50 ميكرولتر في أنابيب البولي بروبلين المعقمة المبردة مسبقا. قم بتخزين الخلايا في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
4. التسلل الزراعي
- أولا ، نقل البلازميد إلى agrobacterium
- نقل 2.5 ميكرولتر من البلازميد المتولد من الخطوة 2.1 إلى الخلايا المختصة من سلالة agrobacterium tumefaciens GV3101 واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- انقل الأنبوب الذي يحتوي على البلازميد والخلايا المختصة إلى النيتروجين السائل لمدة 3 دقائق.
- صدمة حرارية عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في حاضنة ، ثم ضع الأنبوب على الثلج لمدة 2 دقيقة.
- أضف 1000 ميكرولتر من وسط رطل (10 جم / لتر من التربتون ، و 5 جم / لتر من مستخلص الخميرة ، و 10 جم / لتر من كلوريد الصوديوم ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.0) إلى البكتيريا الزراعية واحتضانها عند 30 درجة مئوية و 118 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة.
- أجهزة الطرد المركزي عند 3000 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من 800 ميكرولتر العلوي من المحلول واخلط المحلول المتبقي. بعد ذلك ، قم بوضعه على LB (كما هو مذكور في الخطوة 4.1.4 مضافا مع أجار و 50 ميكروغرام / مل كاناميسين للبلازميد و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين و 25 ميكروغرام / مل ريفامبيسين للخلايا المختصة GV3010). احتضان الألواح عند 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
ملاحظة: من الأفضل اختيار بعض المستعمرات وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لتأكيد الجين محل الاهتمام7.
- التقط بعض المستعمرات البكتيرية من الألواح وضعها في وسط LB بالإضافة إلى المضادات الحيوية المناسبة (انظر الخطوة 4.1.6). احتضان عند 30 درجة مئوية و 218 دورة في الدقيقة لمدة 36-48 ساعة.
- أجهزة الطرد المركزي الخلايا عند 3000 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا إلى OD600 = 1.0 في المخزن المؤقت للتسلل الزراعي (10 mM MgCl2 ، 10 mM MES ، pH = 5.6 ، 250 μM acetosyringone).
- تسلل إلى اللقاح (الناتج عن الخطوة 4.3) في البشرة (المحورية) باستخدام حقنة عديمة الإبر سعة 1 مل.
ملاحظة: من الأفضل التسلل إلى الورقة بأكملها واختيار التكاثر. ل 4-5 نباتات ، استخدم بنية واحدة. لكل ورقة ، يكفي 1.5 مل من البكتيريا الزراعية المعلقة. - حافظ على النباتات لمدة 36 ساعة في غرفة المناخ مع ضوء 16 ساعة (حوالي 75 ميكرومول · م -2 · ث -1) و 8 ساعات من الفترة الضوئية المظلمة عند 23 درجة مئوية.
- بعد 36 ساعة من تسلل البناء ، تسلل 1 مل من 5 ميكرومتر من البيوتين (في محلول 10 mM MgCl2 ) إلى الأوراق المفلترة بالفعل للبناء.
- الحفاظ على النباتات المعالجة لمدة 4-12 ساعة إضافية قبل حصاد أنسجة الأوراق.
ملاحظة: وفقا للدراسة السابقة ، يبلغ البروتين المستهدف ذروته عند 36 ساعة ، لذا اختر 36 تسلل البيوتين hpi 4,6. تعتمد مدة حضانة البيوتين على الدراسة المستهدفة ، ولكن وفقا للتجربة الحالية ، فإن فترة الحضانة لمدة 8 ساعات أكثر ملاءمة لوضع العلامات على البروتينات.
5. جمع العينات
ملاحظة: يجب أن تكون جميع المواد اللازمة لجمع العينات معقمة لتجنب تلوث الكيراتين ، ويجب تنفيذ جميع خطوات البروتوكول في بيئة خالية من التلوث.
- قطع الأوراق المتسللة ونقلها بسرعة إلى النيتروجين السائل لتجنب تدهور البروتين.
- إجراء الكشف المسبق عن البروتين من خلال تحليلات اللطخة المناعية6 ؛ يوصى بشدة بهذا قبل الترسيب المناعي المشترك (Co-IP).
6. استخراج البروتين الكلي من الأوراق
- طحن الأوراق باستخدام مدقة وقذائف الهاون ، إضافة بسرعة 2 مل من 1x PBS-BSA PH 7.4 وطحن ببطء.
- خذ أنبوبا مخروطيا سعة 15 مل ، وضع مرشح مادة ترشيح سريع أعلى الأنبوب المخروطي ، وانقل مزيج العينة إلى الأنبوب من خلال مرشح مادة الترشيح السريع ، واحتفظ به على الجليد.
- انقل العينات إلى أنبوب سعة 2 مل وأضف كوكتيلا مثبطا للبروتين بنسبة 1٪.
- امزج المحتويات عن طريق الدوران لأعلى ولأسفل 7-8 مرات وأجهزة الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- انقل المذيب العلوي للعينات إلى أنابيب جديدة سعة 2 مل ، وأضف 10٪ β-D-maltoside (β-D.M) ، وضعه على الثلج لمدة 5 دقائق. أجهزة الطرد المركزي عند 20000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
7. موازنة عمود التحلية
- جهاز طرد مركزي العمود عند 1000 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: ضع علامة على جانب واحد من العمود وتأكد من أن الجانب المحدد متجها للخارج أثناء جميع عمليات الطرد المركزي. - قم بإزالة الغطاء العلوي والسفلي للعمود وأجهزة الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المحلول السائل من أنبوب التجميع في العمود وأضف 5 مل من 1x PBS buffer للغسيل.
- جهاز طرد مركزي العمود عند 1000 × جم لمدة 2 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- كرر الخطوتين 7.3 و 7.4 خمس مرات على الأقل.
8. غسل الخرز المغناطيسي
- خذ أنبوبا سعة 1.5 مل وأضف 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المترافق streptavidin-C1.
- أضف 1 مل من 1x PBS-BSA للغسيل ، واخلطه جيدا وضعه على حامل المغناطيس لمدة 3 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
- كرر الخطوة 8.2 ثلاث مرات على الأقل.
- بعد كل غسلة ، ضع الأنبوب على الرف المغناطيسي لامتصاص الخرزات باتجاه جانب واحد من الأنبوب لإزالة المخزن المؤقت للغسيل.
9. إثراء البروتينات البيوتينيلية
- أضف 2 مل من العينات إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي عند 1000 × جم لمدة 8 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- أضف 1 مل من مستخلص البروتين المحلى إلى 50 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية المترافقة بالستربتافيدين C1 لموازنتها.
- ضع الأنبوب على الدوار بالسرعة العادية حتى يمتزج المحلول جيدا ويحتضن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة.
- ضع الخرزات على الرف المغناطيسي لمدة 3 دقائق في RT ، أو حتى تتجمع على جانب واحد من الأنبوب ، لإزالة المادة الطافية برفق.
- أضف 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل I (2٪ SDS في الماء) ، وقم بالتدوير عند RT لمدة دقيقتين على الدوار وكرر الخطوة 9.4.
- ضع الأنبوب على الدوار عند RT لمدة دقيقتين بعد إضافة 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل II (50 mM HEPES: الرقم الهيدروجيني = 7.5 ، 500 mM NaCl ، 1 mM EDTA ، 0.1٪ حمض deoxycholic [w / v] ، و 1٪ Triton X-100). كرر الخطوة 9.4.
- أضف 1 مل من المخزن المؤقت للغسيل III (10 مللي متر Tris-HCl: الرقم الهيدروجيني = 7.4 ، 250 مللي مول LiCl ، 1 مللي مول EDTA ، 0.1٪ حمض الديوكسيكوليك [w / v] ، 1٪ NP40 [v / v]) ، وقم بالتدوير باستخدام شاكر لمدة دقيقتين في RT. ثم كرر الخطوة 9.4.
- لإزالة المنظف ، أضف 1.7 مل من 50 مللي متر Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 7.5) وكرر الخطوة 9.4. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
- اغسل الخرزات ست مرات لمدة 2 دقيقة لكل منها في 1 مل من 50 مللي متر من محلول بيكربونات الأمونيوم في RT وكرر الخطوة 9.4.
- أضف 50 ميكرولتر من مستخلص البروتين الذي يحتوي على 50 مللي متر Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0) ، 12٪ (وزن / حجم) سكروز (Suc) ، 2٪ (وزن / حجم) كبريتات لوريل الليثيوم ، و 1.5٪ (وزن / حجم) ديثيوثريتول إلى الخرز ، صدمة حرارية في الحاضنة عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق واتبع الخطوة 9.4. قم بتخزين المادة الطافية في درجة حرارة -80 درجة مئوية لتحليل LC-MS / MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وفقا لبحث سابق ، فإن جين الخيار APRR2 هو الجين المرشح الذي يتحكم في لون الفاكهة الأبيض غير الناضج8. هنا ، تم تطوير بروتوكول باستخدام AirID كإنزيم لتسمية القرب للعثور على البروتين الشريك المتفاعل ل APRR2 في الخيار. تم نقل البناء إلى أوراق الخيار ، وبعد 36 ساعة من التسلل ، تم نقل البيوتين. بعد 48 ساعة تم أخذ العينات لتحليل اللطخة الغربية لتأكيد التحول الناجح. تم استخراج البروتينات كما هو مذكور أعلاه في بروتوكول اللطخة الغربية. أشارت البيانات التمثيلية في الشكل 1 إلى تعبير البروتين والبيوتينيل في أوراق الخيار المتسللة ، والتي كانت النتائج المتوقعة بناء على التقنية المعدلة حديثا. أظهرت النتائج مستوى تعبير أعلى للبروتينات الموسومة والنطاقات الإضافية مقارنة بالمجموعة الضابطة. هذا يؤكد أن AirID نجحت في وضع علامة على البروتينات المستهدفة للجين محل الاهتمام (GOI). علاوة على ذلك ، تم تأكيد النتائج أيضا باستخدام الأجسام المضادة المضادة للعلم والمضادة للفأر ، والتي أظهرت بنجاح النطاق المستهدف بجسم مضاد للعلم (الشكل 2). بعد التأكيد من خلال تحليل اللطخة الغربية ، أجرينا أيضا Co-IP باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه ، وتم إثراء البروتينات الحيوية للأوراق المتسللة بنجاح لتحليل قياس الطيف الكتلي ، كما هو موضح في الشكل 3. بعد إثراء البروتينات البيوتينيل بالخرز المغناطيسي المترافق streptavidin C1 ، لوحظت بروتينات متعددة بأحجام مختلفة ، وكشف تحليل اللطخة الغربية عن عصابات ملطخة (الشكل 3).
الشكل 1: تحليل اللطخة الغربية للبروتينات بعد التحول إلى أوراق لتأكيد وظيفة AirID باستخدام streptavidin-HRP. يؤكد الشكل أن البروتينات البيوتينيلاتية لها أربع نسخ متماثلة مستقلة للعينات المحولة البني. تم استخدام الأوراق البرية كعنصر تحكم. لكل نسخة مكررة ، تم تحميل 10 ميكرولتر من العينات لتحليل اللطخة الغربية. تم استخدام Streptavidin-HRP (تخفيف 1: 6000) لتحليل البروتينات البيوتينيل في عينات مختلفة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل اللطخة الغربية للبروتينات بعد التحول إلى أوراق للكشف عن تتابع Taq. تم دمج تسلسل علامة 3x-Flag مع الجين محل الاهتمام لتأكيد التحول الناجح. تم تحديد تسلسل البقعة من خلال تحليل اللطخة الغربية في جميع العينات المحولة. تم استخدام عينات أوراق الخيار من النوع البري كعنصر تحكم. تم تحميل ما مجموعه 10 ميكرولتر من العينات لتحليل اللطخة الغربية ، وتم تأكيد النتائج باستخدام العلم المضاد كجسم مضاد أول عند التخفيف من 1: 3000 ومضاد الفأر كجسم مضاد ثان عند التخفيف 1: 10000. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل اللطخة المناعية لمستخلصات البروتين. بعد الترسيب المناعي المشترك (Co-IP) ، تم إجراء تحليل اللطخة الغربية للبروتينات البيوتينيلاتية في الأوراق الزراعية المتسللة من Cucumis sativus (الخيار) مع streptavidin-HRP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في التجربة الحالية ، تم استخدام AirID لوضع علامات القرب ، والتي طورها Kido et al. من خلال خوارزمية لإعادة بناء إنزيم الأجداد باستخدام مجموعة بيانات جينوم كبيرة وخمسة إنزيمات BirA تقليدية5. تم استخدام الطفرات العشوائية في هندسة البروتين التطورية التقليدية لتعزيز النشاط 9,10 حيث لا يمكن للطفرات العشوائية إنتاج تغييرات تسلسلية ديناميكية. بالمقارنة مع إنزيمات PL الأخرى ، تتمتع AirID بالعديد من المزايا. في السابق كانت طريقة PL هذه قابلة للتطبيق فقط على الأنظمة الحيوانية. في هذه الدراسة ، تم استخدامه للتحقيق في تفاعلات البروتين والبروتين في النباتات. يحدد البروتوكول كيفية إعداد PL القائم على AirID في النباتات خطوة بخطوة ، بما في ذلك تحضير عينات الأوراق ، وإزالة البيوتين الحر ، وتحديد البروتينات المستخرجة ، وإثراء البروتينات البيوتينيل.
باستخدام التعبير العابر بوساطة Agrobacterium الراسخ في الخيار ، يتم استخدام هذا النهج للعثور على PPIs للبروتين المستهدف محل الاهتمام في الخيار. قد يؤدي التعبير العابر إلى الإفراط في التعبير عن بروتينات الاندماج. يجب أيضا اختبار اندماج AirID للتأكد من أنه لا يتداخل مع وظيفة البروتين المستهدف محل الاهتمام ، وهو اعتبار حاسم آخر. ومع ذلك ، في حين أن PL يوفر العديد من المزايا على تقنيات IP-MS القياسية للكشف عن PPIs المؤقتة أو الضعيفة ، إلا أنه يحتوي أيضا على بعض القيود. أولا وقبل كل شيء ، لا يعني اكتشاف بروتين تفاعل مرشح تلقائيا تفاعلا مباشرا أو غير مباشر مع بروتين الطعم ، ولكنه يعكس بدلا من ذلك قربا من بروتينالطعم 9. يمكن التحقق من مثبطات مضخة البروتون بشكل أكبر في الجسم الحي باستخدام مقايسات مستقلة (على سبيل المثال ، الترسيب المناعي المشترك ، أو تكملة التألق ثنائي الجزيئات (BiFC) ، أو مقايسة سحب ضريبة السلع والخدمات في المختبر ، والتي يمكن إجراؤها للتحقق من مثبطات مضخة البروتون بشكل أكبر.
وجدت الدراسة أن نشاط البيوتينيل القريب ل AirID كان أقل بكثير من نشاط TurboID. في المختبر وفي الخلايا ، كان لدى TurboID أعلى نشاط حيوي قريب. يمكن استخدام هذا الإنزيم في غضون 10 دقائق للبيوتينيلات9،11. ومع ذلك ، في الخلايا المعالجة لحضانة طويلة تزيد عن 6 ساعات وتركيزات أعلى من البيوتين ، أدى أعلى نشاط TurboID إلى زيادة البيوتينيل على البروتينات غير المتوقعة ، مثل التوبولين و GFP (مثل 50 mM البيوتين). على عكس استخدامه كإنزيم حيوي قريب ل PPIs ، تم الإبلاغ عن TurboID لأول مرة كإنزيم وسم البيوتين4،6،5،7. إذا كان TurboID لتقييم PPIs ، فإنه سيعمل بشكل أفضل في ظل ظروف محدودة ، مثل المدة الزمنية قصيرة ، حوالي 1 ساعة في الخلايا. لم يتم العثور على AirID والبيوتينيل من توبولين و GFP في ظل نفس الظروف التي لوحظت ل TurboID biotinylation. تم العثور على بروتينات AirID-fusion لتكون قادرة على البيوتينيل لكل متفاعل معروف في كلا العابرين ، كما يتضح من مقايسة سحب الستربتافيدين وتحليل LC-MS /MS 5. في تركيزات ATP المنخفضة (1 mM) ، كان تكوين البيوتينويل -5-AMP أقوى ل AirID منه ل TurboID. إنه يفضل تركيزات أقل من البيوتين (مع 5 مللي متر من البيوتين أو بدون مكمل البيوتين) من TurboID ، الذي يفضل تركيزات أعلى. بالإضافة إلى ذلك ، كشف فحص مواقع البيوتينيل باستخدام LC-MS / MS أن البيوتينيل AirID حدث بدون تفضيل تسلسل فريد على بقايا Lys القريبة ، مما يشير إلى أن عملية البيوتينيل كانت غير تفضيلية5. على الرغم من أن تشابه التسلسل بين BioID و AirID هو 82٪ ، أظهر AirID نشاطا عاليا للبيوتينيل ضد البروتينات المتفاعلة. وجد Kido et al. ، 2020 أن AirID يمكنه تحليل تفاعلات البروتين والبروتين في المختبر وفي الخلايا. تشير النتائج التي توصلوا إليها إلى أن البيوتينيل الذي يعتمد على AirID قد يكون مفيدا لتحليل PPI للمركبات الكيميائية. يعد تحديد شركاء البروتينات المستهدفة في الجسم الحي أمرا بالغ الأهمية لفهم الوظائف البيولوجية12,13 ، وقد كشف عن مثبطات مضخة البروتون الجديدة ، لذلك تم استخدام البيوتينيل القريب في الجسم الحي باستخدام BioID في العديد من الدراسات. حتى عندما تم استكمال البيوتين ، لم يؤد التعبير المستقر ل AirID إلى تثبيط نمو الخلايا ، مما يشير إلى أن التعبير عن بروتينات اندماج AirID سيكون منخفض السميةللغاية 5. من المتوقع أن يحسن AirID دقة البيوتينيل المعتمدة على PPI مجتمعة ؛ باختصار ، استنتج أن AirID مثالي لتحليل PPI في النباتات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولم يعلن أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 32000197 إلى X.H.) ، والمنحة المالية الخاصة من مؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (المنحة رقم 2019T120467 إلى X.H.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | S1519 | |
| Acryl/Bis 30% solution | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | 1510KA4528 | |
| Agar | BioFroxx GmbH | D64683 | |
| Agarose | tsingke (Shanghai) Co.Ltd | TSJ001 | |
| Ammonium bicarbonate | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | G313BA0018 | |
| Biotin | BBI life Sciences | G908BA0012 | |
| CaCl2 | BBI life Sciences | E209BA0008 | |
| Competent cells GV3101 | Made in the current experiment | ||
| Desalting column | Thermo scientific | WC321753 | |
| Deoxycholic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | G818BA0029 | |
| DH5α competent cells | Made in the current experiment | E.coli DH5α | |
| β-D-maltoside | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S818 | |
| EDTA | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | E104BA0029 | |
| Glycine | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | 161BA0031 | |
| HEPES | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | H8090 | |
| LiCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | H209BA0003 | |
| MES | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | M8019 | |
| MiraCloth | EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay | 3429963 | Quick filtration material filter |
| MgCl2 | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | 20200819 | |
| NaCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | H324BA0003 | |
| NP40 | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | N8030 | |
| Protein inhibitor cocktail | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S3450 | |
| PVDF | BIO-RAD | 5820172 | |
| SDS | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S1015 | |
| Silwet | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | S9430 | |
| Streptavidin-C1-conjugated magnetic beads | Enriching Biotechnology | 7E511E1 | Magnetic beads |
| TEMED | Servicebio | G2056 | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | GB03BA007 | |
| Tris-HCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | F828BA0020 | |
| Tryptone | Thermo scientific | LP0042 |
References
- Han, J., et al. The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity. PloS One. 10 (6), 0129226 (2015).
- Zhao, S., et al. Screening and identification of host proteins interacting with Theileria annulata cysteine proteinase (TaCP) by yeast-two-hybrid system. Parasites & Vectors. 10 (1), 536 (2017).
- Zhang, Y., et al. A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species. Plant Communications. 1 (5), 100028 (2020).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments. (159), e60728 (2020).
- Kido, K., et al. AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein-protein interactions. eLife. 9, 54983 (2020).
- Hu, X., et al. Overexpressing 7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase alleviates non-programmed cell death during dark-induced senescence in intact Arabidopsis plants. Biomolecules. 11 (8), 1143 (2021).
- Ammiraju, J., et al. The Oryza bacterial artificial chromosome library resource: construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the 10 genome types of the genus Oryza. Genome Research. 16 (1), 140-147 (2006).
- Liu, C., et al. Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5339-5347 (2016).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Nakano, S., Niwa, M., Asano, Y., Ito, S. Following the evolutionary track of a highly specific l-Arginine oxidase by reconstruction and biochemical analysis of ancestral and native enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 85 (12), 00459 (2019).
- Gingras, A. -C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Odeh, H. M., Coyaud, E., Raught, B., Matunis, M. J. The SUMO-specific isopeptidase SENP2 is targeted to intracellular membranes via a predicted N-terminal amphipathic α-helix. Molecular Biology of the Cell. 29 (15), 1878-1890 (2018).
- Motani, K., Kosako, H. Activation of stimulator of interferon genes (STING) induces ADAM17-mediated shedding of the immune semaphorin SEMA4D. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7717-7726 (2018).
