Summary
Hier presenteren we een stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van het proximity-labeling (PL)-experiment in komkommer (Cucumis sativus L.) met behulp van AT4G18020 (APRR2)-AirID-eiwit als model. De methode beschrijft de constructie van een vector, de transformatie van een construct door agro-infiltratie, biotine-infiltratie, eiwitextractie en zuivering van biotine-gelabelde eiwitten door middel van affiniteitszuiveringstechniek.
Abstract
In zoogdiercellen en -planten zijn benaderingen van nabijheidsetikettering (PL) met behulp van gemodificeerd ascorbaatperoxidase (APEX) of de Escherichia coli-biotineligase BirA (bekend als BioID) succesvol gebleken bij het identificeren van eiwit-eiwitinteracties (PPI's). APEX, BioID en TurboID, een herziene versie van BioID, hebben naast waardevolle technologieën ook enkele beperkingen. De recent ontwikkelde AirID, een nieuwe versie van BioID voor nabijheidsidentificatie in eiwit-eiwitinteracties, heeft deze beperkingen overwonnen. Eerder werd AirID gebruikt in diermodellen, terwijl de huidige studie het gebruik van AirID in planten aantoont, en de resultaten bevestigden dat AirID beter presteert in plantsystemen in vergelijking met andere PL-enzymen zoals BioID en TurboID voor eiwitetikettering die proximaal zijn van de doeleiwitten. Hier is een stapsgewijs protocol voor het identificeren van eiwitinteractiepartners met behulp van AT4G18020 (APRR2) eiwit als model. De methoden beschrijven de constructie van vector, de transformatie van construct door agro-infiltratie, biotinetransformatie, extractie van eiwitten en verrijking van biotine-gelabelde eiwitten door middel van affiniteitszuiveringstechniek. De resultaten concluderen dat AirID een nieuw en ideaal enzym is voor het analyseren van PPI's in planten. De methode kan worden toegepast om andere eiwitten in planten te bestuderen.
Introduction
Verschillende cellulaire eiwitten werken onder het biologisch regulerende systeem, en eiwit-eiwitinteracties (PPI's) maken deel uit van dit systeem en vormen de basis van veel cellulaire processen. Naast PPI's wordt de functie van natuurlijke eiwitten posttranslationeel bevorderd via verschillende modificaties, zoals de vorming van complex, ubiquitinatie en fosforylering. Daarom is het bestuderen van PPI's belangrijk voor het begrijpen van de mogelijke functie van doeleiwitten. PPI's zijn uitgevoerd met behulp van verschillende technologieën, zoals massaspectrometrie-analyse na immunoprecipitatie (IP-MS-analyse)1, gist-twee-hybride systeem (Y2H)2, ook celvrije arrays3. Deze methoden onderzochten verschillende essentiële bevindingen op het gebied van onderzoek. Deze methoden hebben echter enkele nadelen; Y2H is bijvoorbeeld een tijdrovende, dure strategie die het noodzakelijk maakt om de Y2H-bibliotheek van de doelsoort op te bouwen.
Bovendien maakt de Y2H-techniek gebruik van gist, een heteroloog eencellig eukaryoot organisme, dat de cellulaire toestand van hogere eukaryote cellen niet nauwkeurig kan weergeven. De IP-MS is ongeschikt voor eiwitten met een hoge hydrofobiciteit en vertoont een lage efficiëntie bij het opvangen van zwakke PPI's. Verschillende essentiële eiwitten in planten, zoals nucleotide-bindende domein en leucine-rijke repeat-bevattende (NLR) eiwitten en receptorachtige kinasen (RLK's) worden op een laag niveau tot expressie gebracht en interageren meestal tijdelijk met andere eiwitten; Daarom is het gebruik van deze methoden onvoldoende om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de regulatie van deze eiwitten3.
Een nieuwe techniek genaamd proximity-biotinylatie (PB) helpt onderzoekers bij het identificeren van PPI's. PB is afhankelijk van PL-enzymen, die zich hechten aan het eiwit van belang (POI), en wanneer partnereiwit in de buurt van POI komt, hecht de PL een chemisch biotinelabel aan het partnereiwit. Verder kan het gelabelde eiwit worden geïdentificeerd en kan het snel weten welk partnereiwit zich hecht aan het doeleiwit5. Eerdere studies hebben aangetoond dat BioID en TurboID succesvolle hulpmiddelen zijn voor PPI's, vooral in planten, maar ze hebben bepaalde beperkingen4. BioID heeft een hoog gehalte aan biotine nodig voor het labelen van partnereiwitten, wat meer dan 16 uur duurt. In vergelijking met BioID is de TurboID voordeliger omdat het eiwit in 10 minuten labelt en het partnereiwit bij kamertemperatuur (RT) kan labelen. Het is onder bepaalde omstandigheden ook giftig voor cellen en labelt die eiwitten die geen interactie vertonen met het eiwit van belang.
Om deze problemen op te lossen, is AirID, ontwikkeld door Kido et al., efficiënter dan de rest van de etiketteringsenzymen, hoewel de sequentieovereenkomst 82% is tussen BioID en AirID5. Om de efficiëntie van AirID te controleren, voerden we een experiment uit door gebruik te maken van een POI met bekende medewerkers. Dit experiment bevestigde dat AirID ongetwijfeld geassocieerde eiwitten in plantencellen kon labelen. AirID is een waardevol enzym voor het analyseren van PPI's in vitro en in cellen. Het creëert minder toxiciteit en is minder foutief in tijdrovende processen dan TurboID om niet-partners te taggen, wat leidt tot het doden van de cel. Het toont aan dat AirID concurrerender is dan andere etiketteringsenzymen voor nabijheidsbiotinylering. Het is nauwkeuriger, heeft meer potentieel in tijdrovende processen en is minder toxisch in vitro en in levende cellen. Het huidige protocol beschrijft de identificatie van interagerende eiwitten van APRR2 met behulp van AirID als PL-enzym; bovendien kan de methode worden toegepast op andere eiwitten om PPI's in plantensoorten te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van plantmateriaal
- Cucumis sativus (komkommer) wordt gebruikt voor experimentele analyse. Leg de zaden in water, incubeer ze gedurende 20 minuten bij 50 °C en leg de zaden vervolgens 12-16 uur op filtreerpapier op een petrischaal.
- Breng de zaden daarna over naar potten met aarde (commercieel gekocht) en kweek ze in een klimaatkamer bij een temperatuur van 23 °C en 16 uur licht en 8 uur donkere fotoperiode.
- Houd de planten 3-4 weken in de klimaatkamer totdat de planten 3 of 4 bladstadia hebben bereikt voor een succesvolle agro-infiltratie.
2. AirID construeren
- Gebruik APRR2 als doeleiwit en construeer APRR2-AirID onder de Bloemkoolmozaïekvirus 35S-promotor (p35S: APRR2-AirID). Introduceer het in de Gateway-compatibele binaire vector pEarleyGate1006 (geleverd door Dr. Kathrin Schrick, Kansas State University), en synthetiseer het PL-enzym rechtstreeks volgens de volgorde in aanvullend bestand 1.
3. Bereiding van competente cellen
- Bereiding van DH5α-competente cellen
- Inoculeer de 2 ml LB (10 g/l trypton, 5 g/l gistextract en 10 g/l NaCl; pH = 7,0.) met E.Coli DH5α-cellen (rechtstreeks uit de bevroren bouillon zonder te ontdooien) en laat ze een nacht groeien (O/N) bij 37 °C.
- Inoculeer vers 0,1%-0,5% inoculum van de O/N-cultuur in 100 ml LB Medium en kweek de cellen tot OD600 tussen 0,4-0,6 bereikt en incubeer de cultuur vervolgens bij 4 °C gedurende 30 minuten.
- Neem de cultuur in twee centrifugebuisjes van 50 ml en draai ze gedurende 5 minuten bij 4 °C rond op 2500 x g.
- Gooi het supernatant weg, resuspendeer de cellen in 10 ml 0,1 M ijskoud CaCl2 en zet ze 15 minuten op ijs. Pelleteer de cellen met een centrifuge van 2500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Resuspendeer de cellen in 1 ml ijskoude 0,1 M CaCl2 + 20% glycerol, aliquot 100 μL in elk buisje van 1,5 ml en bewaar ze onmiddellijk bij -80 °C.
- Bereiding van GV3101 competente cellen
- Inoculeer 2 ml LB (met 50 μg/ml gentamycine en 25 μg/ml rifampicine) met een enkele GV3101-kolonie. Incubeer de cultuur O/N bij 28 °C en schud bij 250 omw/min.
- Inoculeer 200 ml LB met 1 ml verzadigde nachtcultuur. Schud de cultuur bij 250 omw/min en incubeer bij 28 °C tot de OD600 gelijk is aan 0,5.
- Breng de cultuur over in vier voorgekoelde steriele centrifugebuisjes van 50 ml en zet deze 30 minuten op ijs.
- Pellet de cellen op 2500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en leg de pellets op ijs.
- Resuspendeer de cellen in 10 ml 0,1 M ijskoude CaCl2-oplossing . Bundel de cellen samen in een voorgekoelde Oakridge-buis van 50 ml.
- Pellet de cellen op 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in 10 ml ijskoude CaCl2-oplossing . Zet 30 minuten op ijs.
- Pellet de cellen op 1.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in 2 ml 0,1 M ijskoude CaCl2-oplossing .
- doseer de cellen in een aliquot van 50 μl in voorgekoelde steriele polypropyleen buisjes. Bewaar de cellen bij -80 °C.
4. Agro-infiltratie
- Breng eerst het plasmide over naar agrobacterium
- Breng 2,5 μl van het plasmide dat is gegenereerd uit stap 2.1 over naar de competente cellen van de agrobacterium tumefaciens GV3101-stam en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
- Breng de buis met het plasmide en de competente cellen gedurende 3 minuten over in vloeibare stikstof.
- Hitteschok bij 37 °C gedurende 5 minuten in een incubator en leg de buis vervolgens 2 minuten op ijs.
- Voeg 1.000 μL LB-medium (10 g/l trypton, 5 g/l gistextract en 10 g/l NaCl; pH = 7,0) toe aan de agrobacterie en incubeer gedurende 1 uur bij 30 °C en 118 rpm.
- Centrifugeer op 3.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
- Gooi de bovenste 800 μL van de oplossing weg en meng de resterende oplossing. Plak het vervolgens op LB (zoals vermeld in stap 4.1.4 toegevoegd met agar en 50 μg/ml kanamycine voor plasmide en 50 μg/ml gentamycine en 25 μg/ml rifampicine voor GV3010-competente cellen). Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 30 °C.
OPMERKING: Het is beter om enkele kolonies te kiezen en PCR uit te voeren om het gen van belang te bevestigen7.
- Pak enkele bacteriekolonies van de platen en doe ze in LB-media plus geschikte antibiotica (zie stap 4.1.6). Incubeer bij 30 °C en 218 tpm gedurende 36-48 uur.
- Centrifugeer de cellen bij 3.000 x g gedurende 2 minat 4 °C. Resuspendeer de cellen tot OD600 = 1,0 in agro-infiltratiebuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES, pH = 5,6, 250 μM acetosyringon).
- Infiltreer het entmateriaal (gegenereerd uit stap 4.3) in de (abaxiale) epidermis met behulp van een naaldloze spuit van 1 ml.
OPMERKING: Het is beter om het hele blad te infiltreren en ervoor te kiezen om te repliceren. Gebruik voor 4-5 planten één constructie. Voor elk blad is 1,5 ml geresuspendeerde agrobacteriën voldoende. - Houd de planten gedurende 36 uur in de klimaatkamer met een 16 uur licht (ongeveer 75 μmol·m-2·s-1) en 8 uur donkere fotoperiode bij 23 °C.
- Infiltreer na 36 uur constructinfiltratie 1 ml 5 μM biotine (in 10 mM MgCl2-oplossing ) in de reeds geïnfiltreerde bladeren van het construct.
- Onderhoud de behandelde planten nog 4-12 uur voordat u het bladweefsel oogst.
OPMERKING: Volgens de vorige studie piekt het doeleiwit na 36 uur, dus kies 36 hpi-biotine-infiltraties 4,6. De incubatietijd voor biotine hangt af van het doelonderzoek, maar volgens het huidige experiment is een incubatietijd van 8 uur geschikter voor het labelen van eiwitten.
5. Monsterneming
NOTITIE: Alle materialen voor monsterafname moeten steriel zijn om keratinebesmetting te voorkomen, en alle protocolstappen moeten worden uitgevoerd in een contaminatievrije omgeving.
- Snijd de geïnfiltreerde bladeren en breng ze snel over naar vloeibare stikstof om eiwitafbraak te voorkomen.
- Voer de pre-detectie van eiwit uit door middel van immunoblotanalyses6; dit wordt ten zeerste aanbevolen vóór co-immunoprecipitatie (Co-IP).
6. Totale eiwitextractie uit blad
- Maal de bladeren fijn met een vijzel, voeg snel 2 ml 1x PBS-BSA PH 7.4 toe en maal langzaam.
- Neem een conische buis van 15 ml, plaats een filter voor snelfiltratiemateriaal bovenop de conische buis, breng het monstermengsel over naar de buis via het filter voor snelfiltratiemateriaal en bewaar het op ijs.
- Breng de monsters over in een buisje van 2 ml en voeg een cocktail van 1% eiwitremmers toe.
- Meng de inhoud door 7-8 keer naar boven en naar beneden te draaien en centrifugeer op 1.000 x g gedurende 2 min bij 4 °C.
- Breng het bovenste oplosmiddel van de monsters over in nieuwe buisjes van 2 ml, voeg 10% β-D-maltoside (β-D.M.) toe en plaats ze 5 minuten op ijs. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
7. Breng de ontziltingskolom in evenwicht
- Centrifugeer de kolom bij 1.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C.
NOTITIE: Markeer één kant van de kolom en zorg ervoor dat de gemarkeerde kant naar buiten wijst tijdens alle centrifugeerprocessen. - Verwijder de boven- en onderklep van de kolom en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 4 °C bij 1.000 x g .
- Gooi de vloeibare oplossing uit de opvangbuis van de kolom en voeg 5 ml 1x PBS-buffer toe om te wassen.
- Centrifugeer de kolom bij 1.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.
- Herhaal de stappen 7.3 en 7.4 minstens vijf keer.
8. Magnetische kralen wassen
- Neem een buisje van 1,5 ml en voeg 50 μL streptavidine-C1-geconjugeerde magnetische kralen toe.
- Voeg 1 ml 1x PBS-BSA toe om te wassen, meng grondig en plaats gedurende 3 minuten op de magneetstandaard. Gooi de supernatant weg.
- Herhaal stap 8.2 minstens drie keer.
- Plaats na elke wasbeurt de buis op het magnetische rek om de kralen naar één kant van de buis te adsorberen om de wasbuffer te verwijderen.
9. Verrijking van gebiotinyleerde eiwitten
- Voeg 2 ml van de monsters toe aan de kolom en centrifugeer gedurende 8 minuten bij 4 °C bij 1.000 x g .
- Voeg 1 ml van het ontzoute eiwitextract toe aan 50 μL streptavidine-C1-geconjugeerde magnetische kralen om ze in evenwicht te brengen.
- Plaats de buis op de rotator op normale snelheid zodat de oplossing grondig mengt en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) incubeert.
- Plaats de kralen 3 minuten op het magnetische rek bij RT, of totdat ze zich aan één kant van de buis verzamelen, om het supernatant voorzichtig te verwijderen.
- Voeg 1 ml wasbuffer I (2% SDS in water) toe, draai 2 minuten op RT op een rotator en herhaal stap 9.4.
- Plaats de buis op de rotator op RT gedurende 2 minuten na het toevoegen van 1 ml wasbuffer II (50 mM HEPES: pH = 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% deoxycholzuur [w/v] en 1% Triton X-100). Herhaal stap 9.4.
- Voeg 1 ml wasbuffer III toe (10 mM Tris-HCl: pH = 7,4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% deoxycholzuur [w/v], 1% NP40 [v/v]) en draai met een shaker gedurende 2 minuten op RT. Herhaal vervolgens stap 9.4.
- Om het wasmiddel te verwijderen, voegt u 1,7 ml 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5) toe en herhaalt u stap 9.4. Herhaal deze stap nog een keer.
- Was de parels zes keer gedurende 2 minuten in 1 ml ammoniumbicarbonaatbuffer van 50 mM bij RT en herhaal stap 9.4.
- Voeg 50 μL van het eiwitextract met 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 12% (m/v) sucrose (Suc), 2% (w/v) lithiumlaurylsulfaat en 1,5% (w/v) dithiothreitol toe aan de korrels, hitteschok in de incubator bij 100 °C gedurende 5 minuten en volg stap 9.4. Bewaar het supernatans bij -80 °C voor LC-MS/MS-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens eerder onderzoek is het komkommergen APRR2 het kandidaat-gen dat de kleur van witte onrijpe vruchten regelt8. Hier werd een protocol ontwikkeld met behulp van AirID als een nabijheidslabelenzym om het interagerende partnereiwit van APRR2 in komkommer te vinden. Het construct werd overgebracht naar de komkommerbladeren en na 36 uur na infiltratie werd biotine overgebracht. Na 48 uur werden de monsters genomen voor western blot-analyse om de succesvolle transformatie te bevestigen. De eiwitten werden geëxtraheerd zoals hierboven vermeld in het protocol voor western blot. De representatieve gegevens in figuur 1 gaven de eiwitexpressie en biotinylering in de geïnfiltreerde komkommerbladeren aan, wat de verwachte bevindingen waren op basis van de nieuw gemodificeerde techniek. De resultaten toonden een hoger expressieniveau van gelabelde eiwitten en extra banden in vergelijking met de controlegroep. Dit bevestigt dat AirID met succes de doeleiwitten van het gen van belang (Indonesische overheid) heeft gelabeld. Verder werden de resultaten ook bevestigd met behulp van anti-vlag- en antimuisantilichamen, die met succes de doelband met antivlagantilichamen aantoonden (Figuur 2). Na bevestiging door middel van western blot-analyse, voerden we verder Co-IP uit met behulp van het bovengenoemde protocol, en de gebiotinyleerde eiwitten van de infiltrerende bladeren werden met succes verrijkt voor massaspectrometrie-analyse, zoals weergegeven in figuur 3. Na het verrijken van gebiotinyleerde eiwitten met streptavidine C1 geconjugeerde magnetische kralen, werden meerdere eiwitten van verschillende groottes waargenomen en western blot-analyse onthulde uitgesmeerde banden (Figuur 3).
Figuur 1: Western blot-analyse van eiwitten na transformatie tot bladeren om de functie van AirID te bevestigen met behulp van streptavidin-HRP. De figuur bevestigt dat gebiotinyleerde eiwitten vier onafhankelijke replicaten hebben voor de constructgetransformeerde monsters. Wildtype bladeren werden gebruikt als bestrijding. Voor elke replicaat werd 10 μL van de monsters geladen voor western blot-analyse. Streptavidin-HRP (1:6000 verdunning) werd gebruikt om gebiotinyleerde eiwitten in verschillende monsters te analyseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Western blot-analyse van eiwitten na transformatie naar bladeren om de Taq-sequentie te detecteren. De 3x-Flag-tagsequentie werd gefuseerd met het gen van belang om de succesvolle transformatie te bevestigen. De taq-sequentie werd geïdentificeerd door middel van western blot-analyse in alle getransformeerde monsters. Wildtype komkommerbladmonsters werden gebruikt als controle. In totaal werd 10 μL van de monsters geladen voor western blot-analyse, en de resultaten werden bevestigd met behulp van anti-vlag als eerste antilichaam bij verdunning van 1:3000 en anti-muis als tweede antilichaam bij verdunning 1:10000. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Immunoblot-analyse van eiwitextracten. Na co-immunoprecipitatie (Co-IP) werd Western blot-analyse van gebiotinyleerde eiwitten in de agro-geïnfiltreerde bladeren van Cucumis sativus (komkommer) met streptavidine-HRP uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het huidige experiment werd AirID gebruikt voor nabijheidslabeling, die Kido et al. ontwikkelden door middel van een algoritme van voorouderlijke enzymreconstructie met behulp van een grote genoomdataset en vijf conventionele BirA-enzymen5. Willekeurige mutaties werden gebruikt in traditionele evolutionaire eiwitengineering om de activiteit te verbeteren 9,10 omdat willekeurige mutaties geen dynamische sequentieveranderingen kunnen veroorzaken. In vergelijking met andere PL-enzymen heeft AirID verschillende voordelen. Voorheen was deze PL-methode alleen toepasbaar op diersystemen. In deze studie werd het gebruikt om eiwit-eiwitinteracties in planten te onderzoeken. Het protocol schetst stap voor stap hoe de op AirID gebaseerde PL in planten kan worden opgezet, inclusief het voorbereiden van bladmonsters, het verwijderen van vrije biotine, het kwantificeren van geëxtraheerde eiwitten en het verrijken van gebiotinyleerde eiwitten.
Met behulp van de gevestigde Agrobacterium-gemedieerde voorbijgaande expressie in de komkommer, wordt deze benadering gebruikt om PPI's te vinden van het doeleiwit dat van belang is in komkommer. De voorbijgaande expressie kan leiden tot overexpressie van de fusie-eiwitten. De AirID-fusie moet ook worden getest om er zeker van te zijn dat deze de functie van het doeleiwit van belang niet verstoort, wat een andere cruciale overweging is. Hoewel PL verschillende voordelen biedt ten opzichte van standaard IP-MS-technieken voor het detecteren van tijdelijke of zwakke PPI's, heeft het ook enkele beperkingen. Eerst en vooral impliceert het ontdekken van een kandidaat-interactie-eiwit niet automatisch een directe of indirecte interactie met het aaseiwit, maar weerspiegelt het in plaats daarvan de nabijheid van het aaseiwit9. PPI's kunnen verder in vivo worden geverifieerd met behulp van onafhankelijke assays (bijv. co-immunoprecipitatie, bimoleculaire fluorescentiecomplementatie (BiFC) of in vitro GST-pull-down-assay, die kan worden uitgevoerd om PPI's verder te verifiëren.
Uit de studie bleek dat de proximale biotinyleringsactiviteit van AirID significant lager was dan die van TurboID. In vitro en in cellen had TurboID de hoogste proximale biotinyleringsactiviteit. Dit enzym kan binnen 10 minuten worden gebruikt om 9,11 te biotinyleren. In cellen die werden behandeld voor een langdurige incubatie van meer dan 6 uur en hogere biotineconcentraties, leidde de hoogste TurboID-activiteit echter tot extra biotinylering op onverwachte eiwitten, zoals tubuline en GFP (zoals 50 mM biotine). In tegenstelling tot het gebruik als proximaal biotinylatie-enzym voor PPI's, werd TurboID voor het eerst gerapporteerd als een biotine-labelend enzym 4,6,5,7. Als TurboID PPI's zou evalueren, zou het het beste functioneren onder beperkende omstandigheden, zoals een korte tijdsduur, ongeveer 1 uur in cellen. De AirID, biotinylering van tubuline en GFP werden niet gevonden onder dezelfde omstandigheden als die waargenomen voor TurboID-biotinylering. AirID-fusie-eiwitten bleken in staat te zijn tot biotinylering van elke bekende interactor in beide transiënten, zoals aangetoond door de streptavidin-pull-down-test en de LC-MS/MS-analyse5. Bij lage ATP-concentraties (1 mM) was de vorming van biotinoyl-5-AMP sterker voor AirID dan voor TurboID. Het geeft de voorkeur aan lagere concentraties biotine (met 5 mM biotine of zonder biotinesupplement) dan TurboID, dat de voorkeur geeft aan hogere concentraties. Bovendien bleek uit een onderzoek van biotinylatieplaatsen met behulp van LC-MS/MS dat AirID-biotinylering plaatsvond zonder unieke sequentievoorkeur op een nabijgelegen Lys-residu, wat aangeeft dat het biotinyleringsproces niet-preferentia5 was. Hoewel de sequentieovereenkomst tussen BioID en AirID 82% is, vertoonde AirID een hoge biotinyleringsactiviteit tegen op elkaar inwerkende eiwitten. Kido et al., 2020 ontdekten dat AirID eiwit-eiwitinteracties in vitro en in cellen kan analyseren. Hun bevindingen suggereren dat biotinylatie afhankelijk van AirID nuttig kan zijn voor PPI-analyse van chemische verbindingen. De identificatie van in vivo partners van doeleiwitten is cruciaal voor het begrijpen van biologische functies12,13, en het heeft nieuwe PPI's aan het licht gebracht, dus in vivo proximity-biotinylering met behulp van BioID is in tal van onderzoeken gebruikt. Zelfs wanneer biotine werd aangevuld, resulteerde stabiele expressie van AirID niet in remming van de celgroei, wat aangeeft dat de expressie van AirID-fusie-eiwitten zeerlaag toxisch zou zijn. AirID zal naar verwachting de PPI-afhankelijke biotinylatienauwkeurigheid in combinatie verbeteren; Samenvattend wordt geconcludeerd dat AirID ideaal is voor PPI-analyse in planten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaarden dat er geen sprake was van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32000197 to X.H.), de Special Financial Grant van de China Postdoctoral Science Foundation (Grant No. 2019T120467 to X.H.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetosyringone | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | S1519 | |
| Acryl/Bis 30% solution | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | 1510KA4528 | |
| Agar | BioFroxx GmbH | D64683 | |
| Agarose | tsingke (Shanghai) Co.Ltd | TSJ001 | |
| Ammonium bicarbonate | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | G313BA0018 | |
| Biotin | BBI life Sciences | G908BA0012 | |
| CaCl2 | BBI life Sciences | E209BA0008 | |
| Competent cells GV3101 | Made in the current experiment | ||
| Desalting column | Thermo scientific | WC321753 | |
| Deoxycholic acid | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | G818BA0029 | |
| DH5α competent cells | Made in the current experiment | E.coli DH5α | |
| β-D-maltoside | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S818 | |
| EDTA | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | E104BA0029 | |
| Glycine | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | 161BA0031 | |
| HEPES | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | H8090 | |
| LiCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | H209BA0003 | |
| MES | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | M8019 | |
| MiraCloth | EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay | 3429963 | Quick filtration material filter |
| MgCl2 | Beijing solaribo science and technology Co.Ltd | 20200819 | |
| NaCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | H324BA0003 | |
| NP40 | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | N8030 | |
| Protein inhibitor cocktail | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S3450 | |
| PVDF | BIO-RAD | 5820172 | |
| SDS | Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd | S1015 | |
| Silwet | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | S9430 | |
| Streptavidin-C1-conjugated magnetic beads | Enriching Biotechnology | 7E511E1 | Magnetic beads |
| TEMED | Servicebio | G2056 | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | GB03BA007 | |
| Tris-HCl | Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd | F828BA0020 | |
| Tryptone | Thermo scientific | LP0042 |
References
- Han, J., et al. The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity. PloS One. 10 (6), 0129226 (2015).
- Zhao, S., et al. Screening and identification of host proteins interacting with Theileria annulata cysteine proteinase (TaCP) by yeast-two-hybrid system. Parasites & Vectors. 10 (1), 536 (2017).
- Zhang, Y., et al. A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species. Plant Communications. 1 (5), 100028 (2020).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments. (159), e60728 (2020).
- Kido, K., et al. AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein-protein interactions. eLife. 9, 54983 (2020).
- Hu, X., et al. Overexpressing 7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase alleviates non-programmed cell death during dark-induced senescence in intact Arabidopsis plants. Biomolecules. 11 (8), 1143 (2021).
- Ammiraju, J., et al. The Oryza bacterial artificial chromosome library resource: construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the 10 genome types of the genus Oryza. Genome Research. 16 (1), 140-147 (2006).
- Liu, C., et al. Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5339-5347 (2016).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Nakano, S., Niwa, M., Asano, Y., Ito, S. Following the evolutionary track of a highly specific l-Arginine oxidase by reconstruction and biochemical analysis of ancestral and native enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 85 (12), 00459 (2019).
- Gingras, A. -C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Odeh, H. M., Coyaud, E., Raught, B., Matunis, M. J. The SUMO-specific isopeptidase SENP2 is targeted to intracellular membranes via a predicted N-terminal amphipathic α-helix. Molecular Biology of the Cell. 29 (15), 1878-1890 (2018).
- Motani, K., Kosako, H. Activation of stimulator of interferon genes (STING) induces ADAM17-mediated shedding of the immune semaphorin SEMA4D. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7717-7726 (2018).
