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Biology

पौधों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए AirID- आधारित निकटता लेबलिंग

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64428
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक मॉडल के रूप में AT4G18020 (एपीआरआर 2) -एयरआईडी प्रोटीन का उपयोग करके ककड़ी (कुकुमिस सैटिवस एल) में निकटता लेबलिंग (पीएल) प्रयोग करने के लिए चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। विधि एक वेक्टर के निर्माण, एग्रोइन्फिल्ट्रेशन, बायोटिन घुसपैठ, प्रोटीन निष्कर्षण, और आत्मीयता शुद्धि तकनीक के माध्यम से बायोटिन-लेबल प्रोटीन की शुद्धि के माध्यम से एक निर्माण के परिवर्तन का वर्णन करती है।

Abstract

स्तनधारी कोशिकाओं और पौधों में, संशोधित एस्कॉर्बेट पेरोक्सीडेज (एपेक्स) या एस्चेरिचिया कोलाई बायोटिन लिगेज बीरा (बायोआईडी के रूप में जाना जाता है) का उपयोग करके निकटता लेबलिंग (पीएल) दृष्टिकोण प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) की पहचान करने में सफल साबित हुए हैं। एपेक्स, बायोआईडी और टर्बोआईडी, बायोआईडी के संशोधित संस्करण में मूल्यवान प्रौद्योगिकियां होने के अलावा कुछ प्रतिबंध हैं। हाल ही में विकसित AirID, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन में निकटता की पहचान के लिए BioID का एक उपन्यास संस्करण, इन प्रतिबंधों को पार कर गया। इससे पहले, AirID का उपयोग पशु मॉडल में किया गया है, जबकि वर्तमान अध्ययन पौधों में AirID के उपयोग को प्रदर्शित करता है, और परिणामों ने पुष्टि की कि AirID प्रोटीन लेबलिंग के लिए BioID और TurboID जैसे अन्य PL एंजाइमों की तुलना में प्लांट सिस्टम में बेहतर प्रदर्शन करता है जो लक्ष्य प्रोटीन के समीपस्थ हैं। यहाँ एक मॉडल के रूप में AT4G18020 (APRR2) प्रोटीन का उपयोग प्रोटीन बातचीत भागीदारों की पहचान करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल है. विधियों में वेक्टर के निर्माण, एग्रोइन्फिल्ट्रेशन के माध्यम से निर्माण का परिवर्तन, बायोटिन परिवर्तन, प्रोटीन का निष्कर्षण और आत्मीयता शुद्धि तकनीक के माध्यम से बायोटिन-लेबल प्रोटीन का संवर्धन शामिल है। परिणाम यह निष्कर्ष निकालते हैं कि AirID पौधों में PPI का विश्लेषण करने के लिए एक उपन्यास और आदर्श एंजाइम है। पौधों में अन्य प्रोटीनों का अध्ययन करने के लिए विधि लागू की जा सकती है।

Introduction

विभिन्न सेलुलर प्रोटीन जैविक रूप से नियामक प्रणाली के तहत काम करते हैं, और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) इस प्रणाली का एक हिस्सा हैं और कई सेलुलर प्रक्रियाओं का आधार हैं। पीपीआई के अलावा, प्राकृतिक प्रोटीन के कार्य को विभिन्न संशोधनों के माध्यम से पोस्ट-ट्रांसलेशनल रूप से बढ़ावा दिया जाता है जैसे कि जटिल, सर्वव्यापकता और फॉस्फोराइलेशन का गठन। इसलिए, लक्ष्य प्रोटीन के संभावित कार्य को समझने के लिए पीपीआई का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है। पीपीआई को विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके किया गया है जैसे कि इम्यूनोप्रिपिटेशन (आईपी-एमएस विश्लेषण) 1, खमीर दो-संकर प्रणाली (वाई 2 एच) 2, सेल-मुक्त आधारित सरणियों3 के बाद मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण। इन विधियों ने अनुसंधान के क्षेत्र में विभिन्न महत्वपूर्ण निष्कर्षों का पता लगाया। हालाँकि, इन विधियों में कुछ कमियाँ हैं; उदाहरण के लिए, Y2H एक समय लेने वाली, महंगी रणनीति है जिसके लिए लक्ष्य प्रजातियों की Y2H लाइब्रेरी बनाने की आवश्यकता होती है।

इसके अतिरिक्त, Y2H तकनीक खमीर का उपयोग करती है, एक विषम एकल-कोशिका यूकेरियोटिक जीव, जो उच्च यूकेरियोटिक कोशिकाओं की सेलुलर स्थिति को सटीक रूप से प्रतिबिंबित नहीं कर सकता है। आईपी-एमएस उच्च हाइड्रोफोबिसिटी प्रोटीन के लिए अनुपयुक्त है और कमजोर पीपीआई को पकड़ने में कम दक्षता दिखाता है। पौधों में विभिन्न आवश्यक प्रोटीन जैसे न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग डोमेन और ल्यूसीन-समृद्ध दोहराव युक्त (एनएलआर) प्रोटीन और रिसेप्टर-जैसे किनेसेस (आरएलके) निम्न स्तर पर व्यक्त किए जाते हैं और ज्यादातर अन्य प्रोटीनों के साथ क्षणिक रूप से बातचीत करते हैं; इसलिए, इन तरीकों का उपयोग इन प्रोटीनों के विनियमन अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए अपर्याप्त है3.

प्रॉक्सिमिटी बायोटिनाइलेशन (पीबी) नामक एक नई तकनीक शोधकर्ताओं को पीपीआई की पहचान करने में मदद करती है। पीबी पीएल एंजाइमों पर निर्भर करता है, जो ब्याज के प्रोटीन (पीओआई) से जुड़ते हैं, और जब साथी प्रोटीन पीओआई के पास आता है, तो पीएल साथी प्रोटीन को एक रासायनिक बायोटिन टैग संलग्न करता है। इसके अलावा, टैग किए गए प्रोटीन की पहचान की जा सकती है और जल्दी से पता चल सकता है कि कौन सा साथी प्रोटीन लक्ष्य प्रोटीन से जुड़ता है5. पिछले अध्ययनों ने साबित कर दिया कि बायोआईडी और टर्बोआईडी पीपीआई के लिए सफल उपकरण हैं, खासकर पौधों में, लेकिन उनकी कुछ सीमाएं हैं4. बायोआईडी को पार्टनर प्रोटीन को लेबल करने के लिए उच्च स्तर के बायोटिन की आवश्यकता होती है, जिसमें 16 घंटे से अधिक समय लगता है। बायोआईडी की तुलना में, टर्बोआईडी अधिक फायदेमंद है क्योंकि यह 10 मिनट में प्रोटीन को लेबल करता है और कमरे के तापमान (आरटी) पर साथी प्रोटीन को लेबल कर सकता है। यह कुछ स्थितियों में कोशिकाओं के लिए भी विषाक्त है और उन प्रोटीनों को टैग करता है जो ब्याज की प्रोटीन के साथ बातचीत नहीं दिखाते हैं।

इन मुद्दों को दूर करने के लिए, किडो एट अल द्वारा विकसित AirID, बाकी लेबलिंग एंजाइमों की तुलना में अधिक कुशल है, हालांकि बायोआईडी और AirID82 के बीच अनुक्रम समानता 5% है। AirID की दक्षता की जांच करने के लिए, हमने ज्ञात सहयोगियों के साथ POI का उपयोग करके एक प्रयोग किया। इस प्रयोग ने पुष्टि की कि AirID निस्संदेह पौधों की कोशिकाओं में संबंधित प्रोटीन को लेबल कर सकता है। AirID इन विट्रो और कोशिकाओं में PPI का विश्लेषण करने के लिए एक मूल्यवान एंजाइम है। यह कम विषाक्तता पैदा करता है और गैर-भागीदारों को टैग करने के लिए टर्बोआईडी की तुलना में समय लेने वाली प्रक्रियाओं में कम गलत है, जिससे सेल को मार दिया जाता है। यह दर्शाता है कि AirID निकटता बायोटिनाइलेशन के लिए अन्य लेबलिंग एंजाइमों की तुलना में अधिक प्रतिस्पर्धी है। यह अधिक सटीक है, समय लेने वाली प्रक्रियाओं में अधिक क्षमता है, और इन विट्रो और जीवित कोशिकाओं में कम विषाक्त है। वर्तमान प्रोटोकॉल PL एंजाइम के रूप में AirID का उपयोग करके APRR2 के इंटरैक्टिंग प्रोटीन की पहचान का वर्णन करता है; इसके अलावा, पौधों की प्रजातियों में पीपीआई की जांच के लिए विधि को अन्य प्रोटीनों पर लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1. संयंत्र सामग्री की तैयारी

  1. Cucumis sativus (ककड़ी) प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए कार्यरत है. बीज को पानी में डालें, 20 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, और फिर 12-16 घंटे के लिए पेट्री प्लेट पर फिल्टर पेपर पर बीज रखें।
  2. बाद में, बीजों को मिट्टी वाले बर्तनों में स्थानांतरित करें (व्यावसायिक रूप से खरीदे गए) और 23 डिग्री सेल्सियस तापमान और 16 घंटे प्रकाश और 8 घंटे अंधेरे फोटोपेरियोड पर एक जलवायु कक्ष में बढ़ें।
  3. पौधों को 3-4 सप्ताह तक जलवायु कक्ष में बनाए रखें जब तक कि पौधे सफल कृषि घुसपैठ के लिए 3 या 4 पत्ती चरणों तक नहीं पहुंच जाते।

2. AirID निर्माण करना

  1. APRR2 को लक्ष्य प्रोटीन के रूप में उपयोग करें और फूलगोभी मोज़ेक वायरस 35S प्रमोटर (p35S: APRR2-AirID) के तहत APRR2-AirID का निर्माण करें। इसे गेटवे-संगत बाइनरी वेक्टर pEarleyGate1006 (डॉ कैथरीन श्रेक, कैनसस स्टेट यूनिवर्सिटी द्वारा प्रदान किया गया) में पेश करें, और पूरक फ़ाइल 1 में प्रदान किए गए अनुक्रम के अनुसार सीधे पीएल एंजाइम को संश्लेषित करें।

3. सक्षम कोशिकाओं की तैयारी

  1. DH5α सक्षम कोशिकाओं की तैयारी
    1. एलबी के 2 एमएल (ट्रिप्टोन के 10 ग्राम/एल, खमीर निकालने के 5 ग्राम/एल, और एनएसीएल के 10 ग्राम/एल; पीएच = 7.0.) को ई.कोलाई डीएच5α कोशिकाओं (सीधे विगलन के बिना जमे हुए स्टॉक से) के साथ टीका लगाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (ओ/एन) बढ़ें।
    2. हौसले से एलबी माध्यम के 100 एमएल में ओ / एन संस्कृति से 0.1% -0.5% इनोकुलम टीका लगाना और कोशिकाओं को तब तक विकसित करें जब तक कि आयुध डिपो600 0.4-0.6 के बीच नहीं पहुंच जाता, और फिर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
    3. संस्कृति को दो 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में ले जाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 2500 x ग्राम पर स्पिन करें।
    4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें, 0.1 एम बर्फ ठंडा CaCl2 के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और 15 मिनट के लिए बर्फ पर सेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 2500 x जी स्पिन के साथ कोशिकाओं को गोली दें।
    5. प्रत्येक 1.5 एमएल ट्यूब में बर्फ-ठंडा 0.1 एम सीएसीएल2 + 20% ग्लिसरॉल, विभाज्य 100 माइक्रोन के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और उन्हें तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. GV3101 सक्षम कोशिकाओं की तैयारी
    1. एकल GV3101 कॉलोनी के साथ LB के 2 एमएल (50 μg/mL gentamycin और 25 μg/mL रिफैम्पिसिन युक्त) टीका लगाएं। 250 आरपीएम पर मिलाते हुए 28 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति ओ / एन सेते हैं.
    2. एक संतृप्त रातोंरात संस्कृति के 1 एमएल के साथ एलबी के 200 एमएल टीका लगाना। 250 आरपीएम पर संस्कृति को हिलाएं, जबकि इसे 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि आयुध डिपो600 0.5 के बराबर न हो।
    3. संस्कृति को चार पूर्व ठंडा बाँझ 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेट करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2500 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली मारो। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बर्फ पर छर्रों जगह.
    5. 0.1 एम बर्फ ठंडा CaCl2 समाधान के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को एक साथ एक पूर्व-ठंडा 50 एमएल ओक्रिज ट्यूब में पूल करें।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 1,000 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली मारें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बर्फ ठंड CaCl2 समाधान के 10 एमएल में कोशिकाओं resuspend. 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेट करें।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 1,000 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली मारें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 0.1 एम बर्फ ठंड CaCl2 समाधान के 2 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    8. पूर्व ठंडा बाँझ polypropylene ट्यूबों में एक 50 μL विभाज्य में कोशिकाओं बांटना. कोशिकाओं को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. एग्रोघुसपैठ

  1. सबसे पहले, प्लास्मिड को एग्रोबैक्टीरियम में स्थानांतरित करें
    1. चरण 2.1 से उत्पन्न प्लाज्मिड के 2.5 माइक्रोन को एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियन्स जीवी 3101 तनाव की सक्षम कोशिकाओं में स्थानांतरित करें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
    2. 3 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन के लिए प्लाज्मिड और सक्षम कोशिकाओं युक्त ट्यूब स्थानांतरण.
    3. एक इनक्यूबेटर में 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी सदमे, और फिर 2 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब डाल दिया.
    4. एग्रोबैक्टीरियम में 1,000 माइक्रोन एलबी माध्यम (ट्रिप्टोन का 10 ग्राम/एल, खमीर निकालने का 5 ग्राम/एल, और एनएसीएल का 10 ग्राम/एल; पीएच = 7.0) जोड़ें और 1 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस और 118 आरपीएम पर इनक्यूबेट करें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिन के लिए 3,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    6. समाधान के ऊपरी 800 माइक्रोन को त्यागें और शेष समाधान को मिलाएं। फिर, इसे एलबी पर प्लेट करें (जैसा कि चरण 4.1.4 में उल्लेख किया गया है अगर और प्लास्मिड के लिए 50 माइक्रोग्राम/एमएल कनामाइसिन और जीवी3010 सक्षम कोशिकाओं के लिए 50 माइक्रोग्राम/एमएल जेंटामाइसिन और 25 माइक्रोग्राम/एमएल रिफैम्पिसिन के साथ जोड़ा गया है)। प्लेटों को 48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: यह कुछ कालोनियों लेने और पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए ब्याज7 के जीन की पुष्टि करने के लिए बेहतर है.
  2. प्लेटों से कुछ जीवाणु कालोनियों उठाओ और उन्हें एलबी मीडिया प्लस उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं में डाल दिया (4.1.6 कदम देखें). 36-48 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस और 218 आरपीएम पर सेते हैं।
  3. 2 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 3,000 x ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें। आयुध घुसपैठ बफर (10 एमएम एमजीसीएल2, 10 एमएम एमईएस, पीएच = 5.6, 250 माइक्रोन एसिटोसिरिंगोन) में आयुध डिपो600 = 1.0 के लिए कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  4. एक 1 एमएल सुई रहित सिरिंज का उपयोग कर (abaxial) एपिडर्मिस में inoculum (चरण 4.3 से उत्पन्न) घुसपैठ.
    नोट: पूरे पत्ते में घुसपैठ करना और दोहराने के लिए चुनना बेहतर है। 4-5 पौधों के लिए, एक निर्माण का उपयोग करें। प्रत्येक पत्ती के लिए, 1.5 एमएल resuspended एग्रोबैक्टीरिया पर्याप्त है।
  5. 16 घंटे प्रकाश (लगभग 75 μmol·m-2·s-1) और 23 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे अंधेरे फोटोपेरियोड के साथ जलवायु कक्ष में 36 घंटे के लिए पौधों को बनाए रखें।
  6. निर्माण घुसपैठ के 36 घंटे के बाद, निर्माण के पहले से ही फ़िल्टर किए गए पत्तों में 5 माइक्रोन बायोटिन (10 एमएम एमजीसीएल2 समाधान में) के 1 एमएल घुसपैठ करें।
  7. पत्ती के ऊतकों की कटाई से पहले उपचारित पौधों को अतिरिक्त 4-12 घंटे के लिए बनाए रखें।
    नोट: पिछले अध्ययन के अनुसार, लक्ष्य प्रोटीन 36 घंटे में चोटियों, इसलिए 36 एचपीआई बायोटिन घुसपैठ 4,6 चुनें। बायोटिन के लिए इनक्यूबेशन अवधि लक्ष्य अध्ययन पर निर्भर करती है, लेकिन वर्तमान प्रयोग के अनुसार, प्रोटीन को लेबल करने के लिए 8 घंटे इनक्यूबेशन की अवधि अधिक उपयुक्त है।

5. नमूनों का संग्रह

नोट: नमूना संग्रह के लिए सभी सामग्री केरातिन संदूषण से बचने के लिए बाँझ होना चाहिए, और सभी प्रोटोकॉल चरणों को संदूषण मुक्त वातावरण में किया जाना चाहिए।

  1. घुसपैठ की गई पत्तियों को काटें और प्रोटीन के क्षरण से बचने के लिए उन्हें जल्दी से तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
  2. इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण के माध्यम से प्रोटीन का पूर्व-पता लगाना6; सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन (सह-आईपी) से पहले इसकी अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।

6. पत्ती से कुल प्रोटीन निष्कर्षण

  1. मूसल और मोर्टार का उपयोग करके पत्तियों को पीसें, जल्दी से 1x PBS-BSA PH 7.4 के 2 एमएल डालें और धीरे-धीरे पीस लें।
  2. एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब लें, शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर एक त्वरित निस्पंदन सामग्री फिल्टर रखें, त्वरित निस्पंदन सामग्री फिल्टर के माध्यम से नमूना मिश्रण को ट्यूब में स्थानांतरित करें, और इसे बर्फ पर रखें।
  3. नमूनों को 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 1% प्रोटीन अवरोधक कॉकटेल जोड़ें।
  4. 7-8 बार ऊपर और नीचे की ओर मोड़कर सामग्री मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिन के लिए 1,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
  5. नमूनों के ऊपरी विलायक को नए 2 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें, 10% β-डी-माल्टोसाइड (β-डीएम) जोड़ें, और 5 मिन के लिए बर्फ पर रखें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।

7. डिसाल्टिंग कॉलम को संतुलित करें

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर स्तंभ अपकेंद्रित्र.
    नोट: स्तंभ के एक तरफ चिह्नित करें और सुनिश्चित करें कि चिह्नित पक्ष सभी सेंट्रीफ्यूजेशन प्रक्रियाओं के दौरान बाहर की ओर है।
  2. स्तंभ के ऊपर और नीचे के कवर निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिन के लिए 1,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।
  3. स्तंभ के संग्रह ट्यूब से तरल समाधान त्यागें और धोने के लिए 1x पीबीएस बफर के 5 एमएल जोड़ें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिन के लिए 1,000 x ग्राम पर कॉलम को सेंट्रीफ्यूज करें।
  5. चरण 7.3 और 7.4 को कम से कम पांच बार दोहराएं।

8. चुंबकीय मोती धोने

  1. एक 1.5 एमएल ट्यूब ले लो और स्ट्रेप्टाविडिन-सी 1-संयुग्मित चुंबकीय मोती के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  2. धोने के लिए 1x पीबीएस-बीएसए के 1 एमएल जोड़ें, अच्छी तरह मिलाएं और 3 मिन के लिए चुंबक स्टैंड पर रखें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  3. चरण 8.2 को कम से कम तीन बार दोहराएं।
  4. प्रत्येक धोने के बाद, चुंबकीय रैक पर ट्यूब जगह जगह धुलाई बफर को हटाने के लिए ट्यूब के एक तरफ की ओर मोती adsorb.

9. बायोटिनिलेटेड प्रोटीन का संवर्धन

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिन के लिए कॉलम और अपकेंद्रित्र में नमूने के 2 एमएल जोड़ें।
  2. उन्हें संतुलित करने के लिए स्ट्रेप्टाविडिन-सी 1-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के 50 माइक्रोन में डिसाल्टेड प्रोटीन निकालने के 1 एमएल जोड़ें।
  3. सामान्य गति से रोटेटर पर ट्यूब रखें ताकि समाधान अच्छी तरह से मिश्रण और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट हो।
  4. आरटी पर 3 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर मोती रखें, या जब तक वे ट्यूब के एक तरफ इकट्ठा, धीरे सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए.
  5. धोने बफर मैं (पानी में 2% एसडीएस) के 1 एमएल जोड़ें, एक रोटेटर पर 2 मिनट के लिए आरटी पर बारी बारी से और 9.4 कदम दोहराएँ.
  6. वॉश बफर II (50 एमएम एचईपीईएस: पीएच = 7.5, 500 एमएम एनएसीएल, 1 एमएम ईडीटीए, 0.1% डीऑक्सीकोलिक एसिड [डब्ल्यू/वी], और 1% ट्राइटन एक्स-100) के 1 एमएल जोड़ने के बाद 2 मिन के लिए आरटी पर रोटेटर पर ट्यूब रखें। 9.4 कदम दोहराएँ.
  7. वॉश बफर III (10 एमएम ट्रिस-एचसीएल: पीएच = 7.4, 250 एमएम लीसीएल, 1 एमएम ईडीटीए, 0.1% डीऑक्सीकोलिक एसिड [डब्ल्यू/वी], 1% एनपी40 [वी/वी]) के 1 एमएल जोड़ें, और आरटी पर 2 मिन के लिए एक प्रकार के बरतन का उपयोग करके घुमाएं। उसके बाद, चरण 9.4 दोहराएँ।
  8. डिटर्जेंट को हटाने के लिए, 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच = 7.5) के 1.7 एमएल जोड़ें और चरण 9.4 दोहराएं। इस चरण को एक बार और दोहराएं।
  9. आरटी पर 50 मिमी अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर के 1 एमएल में प्रत्येक 2 मिनट के लिए मोती छह बार धो लें और चरण 9.4 दोहराएं।
  10. 50 एमएम Tris-HCl (पीएच 8.0), 12% (w/v) सुक्रोज (Suc), 2% (w/v) लिथियम लॉरिल सल्फेट, और 1.5% (w/v) dithiothreitol युक्त प्रोटीन निकालने के 50 माइक्रोन जोड़ें मोती, 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में गर्मी सदमे और चरण 9.4 का पालन करें। नियंत्रण रेखा-एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सतह पर तैरनेवाला स्टोर.

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Representative Results

पिछले शोध के अनुसार, ककड़ी जीन APRR2 उम्मीदवार जीन है जो सफेद अपरिपक्व फल रंग8 को नियंत्रित करता है। यहां, खीरे में एपीआरआर 2 के इंटरैक्टिंग पार्टनर प्रोटीन को खोजने के लिए निकटता लेबलिंग एंजाइम के रूप में एयरआईडी का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। निर्माण को ककड़ी के पत्तों में स्थानांतरित कर दिया गया था, और 36 घंटे के बाद घुसपैठ के बाद, बायोटिन को स्थानांतरित कर दिया गया था। 48 घंटे के बाद नमूने सफल परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए लिया गया. प्रोटीन पश्चिमी धब्बा के लिए प्रोटोकॉल में ऊपर उल्लेख के रूप में निकाला गया. चित्रा 1 में प्रतिनिधि डेटा ने घुसपैठ किए गए ककड़ी के पत्तों में प्रोटीन अभिव्यक्ति और बायोटिनाइलेशन का संकेत दिया, जो नई संशोधित तकनीक के आधार पर अपेक्षित निष्कर्ष थे। परिणामों ने नियंत्रण की तुलना में लेबल किए गए प्रोटीन और अतिरिक्त बैंड का उच्च अभिव्यक्ति स्तर दिखाया। यह पुष्टि करता है कि AirID ने जीन ऑफ इंटरेस्ट (GOI) के लक्ष्य प्रोटीन को सफलतापूर्वक टैग किया। इसके अलावा, एंटी-फ्लैग और एंटी-माउस एंटीबॉडी का उपयोग करके परिणामों की भी पुष्टि की गई, जिसने एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी(चित्रा 2)के साथ लक्ष्य बैंड को सफलतापूर्वक दिखाया। पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के माध्यम से पुष्टि के बाद, हम आगे ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग सह आईपी प्रदर्शन किया, और घुसपैठ पत्तियों 'biotinylated प्रोटीन सफलतापूर्वक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए समृद्ध थे, के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है. स्ट्रेप्टाविडिन सी 1 संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ बायोटिनिलेटेड प्रोटीन को समृद्ध करने के बाद, विभिन्न आकारों के कई प्रोटीन देखे गए, और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से स्मियर बैंड(चित्रा 3)का पता चला।

Figure 1
चित्रा 1: स्ट्रेप्टाविडिन-एचआरपी का उपयोग करके एयरआईडी के कार्य की पुष्टि करने के लिए पत्तियों में परिवर्तन के बाद प्रोटीन का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। यह आंकड़ा पुष्टि करता है कि बायोटिनिलेटेड प्रोटीन में निर्माण परिवर्तित नमूनों के लिए चार स्वतंत्र प्रतिकृतियां हैं। जंगली प्रकार की पत्तियों को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। प्रत्येक प्रतिकृति के लिए, नमूनों के 10 माइक्रोन पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए लोड किए गए थे। स्ट्रेप्टाविडिन-एचआरपी (1: 6000 कमजोर पड़ने) का उपयोग विभिन्न नमूनों में बायोटिनिलेटेड प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: टाक अनुक्रम का पता लगाने के लिए पत्तियों में परिवर्तन के बाद प्रोटीन का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। 3x-फ्लैग टैग अनुक्रम को सफल परिवर्तन की पुष्टि करने के लिए ब्याज के जीन के साथ जोड़ा गया था। सभी रूपांतरित नमूनों में पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के माध्यम से टैक अनुक्रम की पहचान की गई थी। जंगली प्रकार के ककड़ी के पत्ते के नमूनों को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। नमूनों के कुल 10 माइक्रोन पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए लोड किए गए थे, और परिणामों की पुष्टि 1:3000 के कमजोर पड़ने पर पहले एंटीबॉडी के रूप में एंटी-फ्लैग और कमजोर पड़ने पर दूसरे एंटीबॉडी के रूप में एंटी-माउस का उपयोग करके 1: 10000 कमजोर पड़ने पर की गई थी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: प्रोटीन अर्क का इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण। सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन (सह-आईपी) के बाद, स्ट्रेप्टाविडिन-एचआरपी के साथ कुकुमिस सैटिवस (ककड़ी) के एग्रोइनफिल्ट्रेटेड पत्तियों में बायोटिनिलेटेड प्रोटीन का पश्चिमी धब्बा विश्लेषण किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

वर्तमान प्रयोग में, AirID का उपयोग निकटता लेबलिंग के लिए किया गया था, जिसे Kido et al. ने एक बड़े जीनोम डेटासेट और पांच पारंपरिक BirA एंजाइम5 का उपयोग करके पैतृक एंजाइम पुनर्निर्माण के एल्गोरिथ्म के माध्यम से विकसित किया। यादृच्छिक उत्परिवर्तन गतिविधि 9,10 को बढ़ाने के लिए पारंपरिक विकासवादी प्रोटीन इंजीनियरिंग में इस्तेमाल किया गया के रूप में यादृच्छिक उत्परिवर्तन गतिशील अनुक्रम परिवर्तन का उत्पादन नहीं कर सकते. अन्य पीएल एंजाइमों की तुलना में, AirID के कई फायदे हैं। पहले यह पीएल विधि केवल पशु प्रणालियों पर लागू थी। इस अध्ययन में, इसका उपयोग पौधों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच के लिए किया गया था। प्रोटोकॉल बताता है कि पौधों में एयरआईडी-आधारित पीएल को चरण दर चरण कैसे स्थापित किया जाए, जिसमें पत्ती के नमूने तैयार करना, मुफ्त बायोटिन को हटाना, निकाले गए प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करना और बायोटिनिलेटेड प्रोटीन को समृद्ध करना शामिल है।

ककड़ी में अच्छी तरह से स्थापित एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता क्षणिक अभिव्यक्ति का उपयोग करते हुए, इस दृष्टिकोण का उपयोग ककड़ी में ब्याज के लक्ष्य प्रोटीन के पीपीआई को खोजने के लिए किया जाता है। क्षणिक अभिव्यक्ति संलयन प्रोटीन की overexpression में परिणाम हो सकता है. AirID संलयन का परीक्षण यह सुनिश्चित करने के लिए भी किया जाना चाहिए कि यह ब्याज के लक्ष्य प्रोटीन के कार्य में हस्तक्षेप नहीं करता है, जो एक और महत्वपूर्ण विचार है। हालांकि, जबकि पीएल क्षणभंगुर या कमजोर पीपीआई का पता लगाने के लिए मानक आईपी-एमएस तकनीकों पर कई फायदे प्रदान करता है, इसकी कुछ सीमाएं भी हैं। सबसे पहले और सबसे महत्वपूर्ण, एक उम्मीदवार इंटरैक्शन प्रोटीन की खोज स्वचालित रूप से चारा प्रोटीन के साथ प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष बातचीत का मतलब नहीं है, बल्कि चारा प्रोटीन9 के निकट निकटता को दर्शाती है। पीपीआई को आगे स्वतंत्र परख (जैसे, सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन, द्वि-आणविक प्रतिदीप्ति पूरक (बीआईएफसी), या इन विट्रो जीएसटी-पुल डाउन परख का उपयोग करके विवो में सत्यापित किया जा सकता है, जिसे आगे पीपीआई को सत्यापित करने के लिए किया जा सकता है।

अध्ययन में पाया गया कि AirID की समीपस्थ बायोटिनाइलेशन गतिविधि TurboID की तुलना में काफी कम थी। इन विट्रो और कोशिकाओं में, टर्बोआईडी में उच्चतम समीपस्थ बायोटिनाइलेशन गतिविधि थी। इस एंजाइम 9,11 biotinylateकरने के लिए 10 मिनट के भीतर इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, 6 घंटे से अधिक और उच्च बायोटिन सांद्रता के लंबे समय तक इनक्यूबेशन के लिए इलाज की गई कोशिकाओं में, उच्चतम टर्बोआईडी गतिविधि ने अप्रत्याशित प्रोटीन, जैसे ट्यूबुलिन और जीएफपी (जैसे 50 एमएम बायोटिन) पर अतिरिक्त बायोटिनाइलेशन का नेतृत्व किया। पीपीआई के लिए समीपस्थ बायोटिनाइलेशन एंजाइम के रूप में उपयोग किए जाने के विपरीत, टर्बोआईडी को पहली बार बायोटिन-लेबलिंग एंजाइम 4,6,5,7 के रूप में रिपोर्ट किया गया था। यदि टर्बोआईडी पीपीआई का मूल्यांकन करना था, तो यह सीमित परिस्थितियों में सबसे अच्छा काम करेगा, जैसे कि समय अवधि कम है, कोशिकाओं में लगभग 1 घंटे। एयरआईडी, ट्यूबुलिन और जीएफपी का बायोटिनाइलेशन उन्हीं परिस्थितियों में नहीं पाया गया जैसा कि टर्बोआईडी बायोटिनाइलेशन के लिए देखा गया था। AirID-संलयन प्रोटीन दोनों यात्रियों में प्रत्येक प्रसिद्ध इंटरैक्टर के बायोटिनाइलेशन में सक्षम पाए गए, जैसा कि स्ट्रेप्टाविडिन-पुल डाउन परख और एलसी-एमएस / एमएस विश्लेषण5 द्वारा प्रदर्शित किया गया था। कम एटीपी सांद्रता (1 मिमी) में, बायोटिनॉयल-5-एएमपी का गठन टर्बोआईडी की तुलना में एयरआईडी के लिए अधिक मजबूत था। यह टर्बोआईडी की तुलना में बायोटिन (5 एमएम बायोटिन के साथ या बायोटिन पूरक के बिना) की कम सांद्रता का पक्षधर है, जो उच्च सांद्रता पसंद करता है। इसके अलावा, LC-MS/MS का उपयोग करने वाली बायोटिनिलेशन साइटों की एक परीक्षा से पता चला कि AirID बायोटिनाइलेशन पास के Lys अवशेषों पर कोई अद्वितीय अनुक्रम वरीयता के साथ हुआ, यह दर्शाता है कि बायोटिनाइलेशन प्रक्रिया गैर-तरजीही5 थी। हालांकि बायोआईडी और एयरआईडी के बीच अनुक्रम समानता 82% है, एयरआईडी ने इंटरैक्टिंग प्रोटीन के खिलाफ उच्च बायोटिनाइलेशन गतिविधि दिखाई। किडो एट अल., 2020 ने पाया कि AirID इन विट्रो और कोशिकाओं में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का विश्लेषण कर सकता है। उनके निष्कर्ष बताते हैं कि एयरआईडी पर निर्भर बायोटिनाइलेशन रासायनिक यौगिकों के पीपीआई विश्लेषण के लिए उपयोगी हो सकता है। लक्ष्य प्रोटीन के विवो भागीदारों में की पहचान जैविक कार्यों12,13 को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, और यह नए पीपीआई का पता चला है, तो बायोआईडी का उपयोग कर विवो निकटता बायोटिनाइलेशन में कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है. यहां तक कि जब बायोटिन को पूरक किया गया था, तब भी एयरआईडी की स्थिर अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप सेल-ग्रोथ निषेध नहीं हुआ, यह दर्शाता है कि एयरआईडी-फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति बहुत कम विषाक्त होगी5. AirID को संयोजन में PPI-निर्भर बायोटिनिलेशन सटीकता में सुधार करने का अनुमान है; संक्षेप में, यह निष्कर्ष निकाला गया है कि AirID पौधों में PPI विश्लेषण के लिए आदर्श है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 32000197 से X.H.), चीन पोस्टडॉक्टोरल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2019T120467 से X.H.) से विशेष वित्तीय अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetosyringone Beijing solaribo science and technology Co.Ltd S1519
Acryl/Bis 30% solution Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd 1510KA4528
Agar BioFroxx GmbH D64683
Agarose tsingke (Shanghai) Co.Ltd TSJ001
Ammonium bicarbonate Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd G313BA0018
Biotin BBI life Sciences G908BA0012
CaCl2 BBI life Sciences E209BA0008
Competent cells GV3101 Made in the current experiment
Desalting column Thermo scientific WC321753
Deoxycholic acid Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd G818BA0029
DH5α competent cells Made in the current experiment E.coli DH5α
β-D-maltoside Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd S818
EDTA Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd E104BA0029
Glycine Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd 161BA0031
HEPES Beijing solaribo science and technology Co.Ltd H8090
LiCl Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd H209BA0003
MES Beijing solaribo science and technology Co.Ltd M8019
MiraCloth EMD Milipore Corp/MERCK kgAa Darmstadt, Germenay 3429963 Quick filtration material filter
MgCl2 Beijing solaribo science and technology Co.Ltd 20200819
NaCl Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd H324BA0003
NP40 Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd N8030
Protein inhibitor cocktail Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd S3450
PVDF BIO-RAD 5820172
SDS Beijing Scolario Science and Tech Co.Ltd S1015
Silwet Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd S9430
Streptavidin-C1-conjugated magnetic beads Enriching Biotechnology 7E511E1 Magnetic beads
TEMED Servicebio G2056
Triton X-100 Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd GB03BA007
Tris-HCl Sangon Biotech (Shanghai) Co.Ltd F828BA0020
Tryptone Thermo scientific LP0042

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References

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AirID निकटता लेबलिंग प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन पीएल दृष्टिकोण संशोधित एस्कॉर्बेट पेरोक्सीडेज एपेक्स एस्चेरिचिया कोलाई बायोटिन लिगेज बीरा बायोआईडी टर्बोआईडी प्रतिबंध उपन्यास संस्करण प्लांट सिस्टम AT4G18020 (एपीआरआर 2) प्रोटीन चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल वेक्टर निर्माण एग्रोइन्फिल्ट्रेशन बायोटिन परिवर्तन प्रोटीन निष्कर्षण आत्मीयता शुद्धिकरण तकनीक पौधों में पीपीआई का विश्लेषण
पौधों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के लिए AirID- आधारित निकटता लेबलिंग
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Zada, A., Khan, I., Zhang, M.,… More

Zada, A., Khan, I., Zhang, M., Cheng, Y., Hu, X. AirID-Based Proximity Labeling for Protein-Protein Interaction in Plants. J. Vis. Exp. (187), e64428, doi:10.3791/64428 (2022).

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