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Neuroscience

Modelado del desarrollo cerebeloso humano in vitro en estructura 2D

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64462

Summary

El presente protocolo explica la generación de una monocapa 2D de células cerebelosas a partir de células madre pluripotentes inducidas para investigar las primeras etapas del desarrollo cerebeloso.

Abstract

El desarrollo preciso y oportuno del cerebelo es crucial no solo para la coordinación y el equilibrio motor precisos, sino también para la cognición. Además, la interrupción en el desarrollo cerebeloso se ha implicado en muchos trastornos del desarrollo neurológico, como el autismo, el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH) y la esquizofrenia. Las investigaciones del desarrollo cerebeloso en humanos anteriormente solo han sido posibles a través de estudios post-mortem o neuroimágenes, sin embargo, estos métodos no son suficientes para comprender los cambios moleculares y celulares que ocurren in vivo durante el desarrollo temprano, que es cuando se originan muchos trastornos del desarrollo neurológico. La aparición de técnicas para generar células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) a partir de células somáticas y la capacidad de volver a diferenciar aún más las iPSC en neuronas han allanado el camino para el modelado in vitro del desarrollo temprano del cerebro. El presente estudio proporciona pasos simplificados hacia la generación de células cerebelosas para aplicaciones que requieren una estructura monocapa de 2 dimensiones (2D). Las células cerebelosas que representan las primeras etapas del desarrollo se derivan de iPSC humanas a través de los siguientes pasos: primero, los cuerpos embrioides se hacen en cultivo tridimensional (3D), luego se tratan con FGF2 e insulina para promover la especificación del destino cerebeloso, y finalmente, se diferencian terminalmente como una monocapa en sustratos recubiertos de poli-l-ornitina (PLO) / laminina. A los 35 días de diferenciación, los cultivos de células cerebelosas derivadas de iPSC expresan marcadores cerebelosos que incluyen ATOH1, PTF1α, PAX6 y KIRREL2, lo que sugiere que este protocolo genera precursores neuronales cerebelosos glutamatérgicos y GABAérgicos, así como progenitores de células de Purkinje. Además, las células diferenciadas muestran una morfología neuronal distinta y son positivas para marcadores de inmunofluorescencia de identidad neuronal como TUBB3. Estas células expresan moléculas de guía axonal, incluyendo semaforina-4C, plexina-B2 y neuropilina-1, y podrían servir como modelo para investigar los mecanismos moleculares del crecimiento de neuritas y la conectividad sináptica. Este método genera neuronas cerebelosas humanas útiles para aplicaciones posteriores, incluyendo expresión génica, estudios fisiológicos y morfológicos que requieren formatos monocapa 2D.

Introduction

Comprender el desarrollo cerebeloso humano y las ventanas de tiempo críticas de este proceso es importante no solo para decodificar las posibles causas de los trastornos del desarrollo neurológico, sino también para identificar nuevos objetivos para la intervención terapéutica. Modelar el desarrollo cerebeloso humano in vitro ha sido un desafío, sin embargo, con el tiempo, han surgido muchos protocolos que diferencian las células madre embrionarias humanas (hESC) o iPSC con destinos de linaje cerebeloso 1,2,3,4,5,6,7,8 . Además, es importante desarrollar protocolos que generen resultados reproducibles, sean relativamente simples (para reducir el error) y no sean pesados en costos monetarios.

Los primeros protocolos para la diferenciación cerebelosa se generaron a partir de cultivos 2D a partir de cuerpos embrioides (EB) en placas, induciendo el destino cerebeloso con varios factores de crecimiento similares al desarrollo in vivo, incluyendo WNT, BMPs y FGFs 1,9. Los protocolos publicados más recientes indujeron la diferenciación principalmente en el cultivo de organoides 3D con FGF2 e insulina, seguido de FGF19 y SDF1 para estructuras rómbicas similares a labios3,4, o utilizaron una combinación de FGF2, FGF4 y FGF85. Ambos métodos de inducción de organoides cerebelosos dieron como resultado organoides cerebelosos 3D similares, ya que ambos protocolos informaron una expresión similar de marcadores cerebelosos en puntos de tiempo idénticos. Holmes y Heine ampliaron su protocolo 3D5 para mostrar que las células cerebelosas 2D se pueden generar a partir de hESCs e iPSCs, que comienzan como agregados 3D. Además, Silva et al.7 demostraron que las células que representan neuronas cerebelosas maduras en 2D pueden generarse con un enfoque similar al de Holmes y Heine, utilizando un punto de tiempo diferente para cambiar de 3D a 2D y extender el tiempo de crecimiento y maduración.

El protocolo actual induce el destino cerebeloso en iPSC libres de alimentador mediante la generación de cuerpos embrioides (EB) flotantes libres utilizando insulina y FGF2 y luego colocando los EB en platos recubiertos de OLP / laminina el día 14 para el crecimiento y diferenciación 2D. Para el día 35, se obtienen células con identidad cerebelosa. La capacidad de recapitular las primeras etapas del desarrollo cerebeloso, especialmente en un entorno 2D, permite a los investigadores responder preguntas específicas que requieren experimentos con una estructura monocapa. Este protocolo también es susceptible de modificaciones adicionales, como superficies con micropatrones, ensayos de crecimiento axonal y clasificación celular para enriquecer las poblaciones celulares deseadas.

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Protocol

La investigación con sujetos humanos fue aprobada bajo el número de aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Iowa número 201805995 y el número de aprobación del Comité de Células Madre Pluripotentes Humanas de la Universidad de Iowa 2017-02. Las biopsias de piel se obtuvieron de los sujetos después de obtener el consentimiento informado por escrito. Los fibroblastos se cultivaron en DMEM con 15% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de solución de aminoácidos no esenciales MEM a 37 °C y 5% deCO2. Los fibroblastos se reprogramaron utilizando un kit de reprogramación episomal siguiendo el protocolo del fabricante (ver Tabla de materiales) utilizando un nucleofector para electroporación. Todos los procedimientos se realizaron en un gabinete de seguridad biológica Tipo A2 de Clase II ("capucha" para abreviar). Todos los medios de cultivo celular estaban libres de antibióticos; Por lo tanto, cada componente que entró en la campana se limpió con etanol al 70%. Todos los medios y componentes de cultivo celular se filtraron estérilmente o se abrieron en la campana para mantener su esterilidad.

1. Preparación experimental

  1. Prepare placas recubiertas de matriz de membrana basal (BMM).
    NOTA: BMM se solidifica más rápidamente a temperaturas más cálidas. Las placas deben prepararse rápida e inmediatamente a 4 °C para su almacenamiento.
    1. Descongele el BMM (ver Tabla de materiales) en hielo, a 4 °C durante al menos 2 h, o durante la noche.
    2. Mezclar DMEM/F12 y BMM hasta una concentración final de 80 μg/mL. Distribuir la solución de BMM en placas de cultivo de tejidos (1 ml para placas de 35 mm y 2 ml para placas de 60 mm) e incubar a 37 °C durante al menos 1 h o durante la noche antes de colocar las células.
      NOTA: Los platos no utilizados se pueden conservar a 4 °C durante 2 semanas.
  2. Prepare placas recubiertas de poli-L-ornitina/laminina (OLP/laminina).
    1. Prepare 20 μg/ml de PLO (consulte la Tabla de materiales) en DPBS+/+ estéril y agregue 1 ml a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar durante la noche a 37 °C en la incubadora.
    2. Al día siguiente, aspirar la OLP con un aspirador de vacío y lavar dos veces con DPBS+/+. Secar al aire en la campana.
      NOTA: Las placas secadas al aire se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas, envueltas en papel de aluminio, para su uso futuro.
    3. Prepare 10 μg/ml de laminina (consulte la Tabla de materiales) en DPBS+/+ y agregue 1 ml a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar al menos durante 3 h o durante la noche a 37 °C en la incubadora.
    4. Aspire la laminina con un aspirador de vacío y agregue 1 ml de DPBS+/+ mediano o estéril.
      NOTA: El recubrimiento de laminina no debe secarse. PBS o un medio de cultivo apropiado debe agregarse inmediatamente para evitar esto. Las placas recubiertas se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
  3. Prepare la solución de paso de PSC.
    NOTA: Se requiere un osmómetro (consulte la Tabla de materiales) para hacer la solución de paso PSC10.
    1. Disolver 11,49 g de cloruro de potasio (KCl) y 0,147 g de citrato de sodio dihidratado (HOC(COONa)(CH 2 COONa)2*2H2O)en 400 ml de agua estéril de cultivo celular (ver Tabla de materiales).
    2. Mida el volumen de la solución y anístrelo como el volumen inicial (Vi).
    3. Mida la osmolaridad y ajústela a 570 mOsm agregando agua estéril de grado de cultivo celular utilizando la fórmula Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
    4. Filtrar-esterilizar la solución con un filtro de 0,20 μm y hacer 10 ml de alícuotas. Guarde las alícuotas a temperatura ambiente (RT) hasta por 6 meses.
  4. Preparar el medio de células madre pluripotentes (PSC).
    NOTA: Las iPSC se mantienen en un medio que contiene FGF2 termoestable (consulte la Tabla de materiales), lo que proporciona un horario de alimentación libre de fines de semana. Otros medios PSC disponibles comercialmente no han sido probados para este protocolo.
    1. Descongele el suplemento medio de PSC durante la noche a 4 °C.
    2. Añadir 10 ml de suplemento de medio PSC a 500 ml de medio de PSC basal. Preparar 25 ml de alícuotas y almacenar a −20 °C.
      NOTA: Las alícuotas congeladas pueden almacenarse a -20 °C durante 6 meses. Las alícuotas descongeladas deben conservarse a 4 °C y utilizarse en un plazo de 2 semanas. Las células se pueden congelar para su almacenamiento a largo plazo en un medio PSC con 10% (v / v) de dimetilsulfóxido (DMSO).
  5. Prepare el medio de descongelación PSC.
    1. Suplemento de medio PSC con 50 nM de cromano, 1,5 μM de emricasan, 1x suplemento de poliamina y 0,7 μM trans-ISRIB (CEPTcocktail 11) (ver Tabla de materiales).
    2. Filtrar-esterilizar con un filtro de 0,20 μm y conservar a 4 °C durante un máximo de 4 semanas.
  6. Preparar pipetas de vidrio desmenuzado.
    1. Tire de las pipetas Pasteur de vidrio de 22,9 cm (9 pulgadas) en dos piezas por encima de un quemador Bunsen, ~ 2 cm por debajo del cuello, creando dos pipetas, con el lado más delgado siendo ~ 4 cm más corto que el otro.
    2. Con la ayuda de la llama, doble las puntas del lado tirado para crear una "r" suave.
    3. Coloque las pipetas tiradas en manguitos de autoclave y autoclave para esterilización.
  7. Preparar el medio de diferenciación cerebelosa (MDL).
    1. Mezcle IMDM y la mezcla de nutrientes F12 de Ham en una proporción de 1: 1. Complemente la mezcla con 1x suplemento de L-alanina-L-glutamina, concentrado de lípidos químicamente definido al 1% (v/v), 0.45 mM 1-tio-glicerol, 15 μL/ml de apotransferrina, 5 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) y 7 μg/ml de insulina (ver Tabla de materiales).
    2. Filtrar-esterilizar con un filtro de 0,20 μm, almacenar a 4 °C y utilizar en el plazo de 1 mes.
  8. Preparar el medio de maduración cerebelosa (MMC).
    1. Suplemento de medio neurobasal con 1x suplemento de L-alanina-L-glutamina y 1x suplemento de N-2 (ver Tabla de Materiales).
    2. Filtrar-esterilizar con un filtro de 0,20 μm, almacenar a 4 °C y utilizar en un plazo de 2 semanas.

2. Cultura iPSC sin alimentador

  1. Descongele las celdas siguiendo los pasos a continuación.
    1. Introducir una placa BMM (paso 1.1) en la incubadora a 37 °C para gelificar durante al menos 1 h o durante la noche antes de descongelar las células.
    2. Precaliente 10 ml de medio de descongelación PSC (paso 1.5) a 37 °C.
    3. Transfiera el criovial con células de nitrógeno líquido a un baño de agua a 37 ° C.
      NOTA: Para evitar generar una fuente de contaminación en el espacio de cultivo celular, no se recomienda el uso de un baño de agua estándar. En cambio, el agua dulce se puede calentar en un vaso pequeño a 37 ° C para generar un baño de agua de un solo uso.
    4. Cuando quede un pequeño trozo de hielo en el tubo, retírelo del baño de agua, seque el tubo y rocíe con etanol al 70%. Transfiera el tubo a la campana y use una pipeta serológica de 2 ml o 5 ml (consulte la Tabla de materiales) para transferir suavemente las células a un tubo cónico de 15 ml.
    5. Agregue 8 ml de medio de descongelación de PSC a las células gota a gota mientras gira el tubo cónico. Centrifugar a 200 x g durante 5 min en RT.
    6. Aspire cuidadosamente el sobrenadante con un aspirador de vacío sin alterar la bolita celular. Resuspender las células en 2 mL de medio de descongelación PSC.
    7. Aspire el BMM de la placa y agregue las células resuspendidas gota a gota por toda la placa para una distribución uniforme.
    8. Colocar la placa en la incubadora a 37 °C, 5%CO2. Actualice el medio al día siguiente con el medio PSC. Después de eso, cambie el medio diariamente.
  2. Mantenga las celdas siguiendo los pasos a continuación.
    1. Precaliente el volumen necesario de medio PSC a 37 °C (por ejemplo, 1 ml de medio por placa de 35 mm).
    2. Investigar las placas en busca de células o colonias diferenciadas y extraer las células diferenciadas con una pipeta de vidrio tirado (paso 1.6).
      NOTA: Las colonias iPSC tienen bordes lisos con células morfológicamente idénticas.
    3. Cambiar el medio gastado diariamente y el paso cada 3-4 días o cuando se alcance el 70% de confluencia.
  3. Paso de las celdas.
    1. Coloque la cantidad necesaria de placas BMM en la incubadora durante al menos 1 h o durante la noche antes de pasar. Precaliente la cantidad necesaria de PSC medio (paso 1.3) a 37 °C.
    2. Con una pipeta de vidrio tirado, limpie cualquier célula o colonia diferenciada.
    3. Aspirar el medio gastado con un aspirador de vacío y añadir medio de disociación PSC, 1 ml por plato de 35 mm. Incubar a 37 °C durante 1-3 min.
      NOTA: Si las colonias se están levantando en la solución de paso de PSC antes de agregar el medio PSC, el tiempo de incubación se puede reducir.
    4. Aspire la solución de paso de PSC y agregue el medio PSC precalentado.
    5. Usando una punta de pipeta estéril de 200 μL, raye las líneas paralelas entre sí en una dirección, gire la placa 90° y haga un segundo conjunto de líneas de rayado perpendiculares a las anteriores (haciendo un patrón de rayado cruzado a través de la placa).
    6. Aspire la solución BMM de las placas fijas. Recoger las colonias mediante una pipeta serológica y distribuirlas en nuevas placas BMM.
    7. Incubar a 37 °C, 5%CO2. Cambie el medio diariamente.
  4. Congelar las células.
    1. Prepare los crioviales etiquetando el contenido y esterilice bajo luz ultravioleta (UV) en la campana (consulte la Tabla de materiales) durante 30 minutos.
    2. Prepare el medio de congelación PSC complementando el medio PSC con DMSO al 10% (v / v). Siga los pasos 2.3.2-2.3.5.
    3. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml con una pipeta serológica de 5 ml y centrifuga a 200 x g durante 5 min a RT.
    4. Aspirar cuidadosamente el medio y resuspender el pellet celular en medio de congelación PSC.
    5. Distribuir en crioviales. Coloque los viales en un recipiente de congelación y colóquelos en un congelador a -80 °C.
    6. Al día siguiente, transfiera los crioviales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

3. Diferenciación cerebelosa

NOTA: Antes de comenzar la diferenciación, las iPSC se pasan a seis platos de 35 mm y están listas para la diferenciación cuando están al 70% de confluencia. Cada placa de 35 mm se transferirá a un pocillo de la placa de 6 pocillos.

  1. El día 0, levante las colonias sanas de iPSC para la formación de EB.
    1. Agregue 1 ml de CDM (paso 1.7) suplementado con 10 μM Y-27632 y 10 μM SB431542 (consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo de una placa de fijación ultra baja (ULA) de 6 pocillos y colóquela en la incubadora hasta que las colonias levantadas estén listas para agregarse a los pocillos.
    2. Limpie las células diferenciadas con una pipeta de vidrio tirado. Aspirar el medio y añadir 1 ml de solución de paso PSC por cada plato de 35 mm. Incubar durante 3 min a 37 °C, aspirar y añadir 2 mL de MDL suplementado con 10 μM Y-27632 y 10 μM SB431542.
      NOTA: Si las colonias despegan en la solución de paso de PSC antes de agregar CDM, el tiempo de incubación se puede reducir.
    3. Bajo un microscopio invertido de luz transmitida, levante suavemente las colonias usando el borde doblado de la pipeta de vidrio tirado con un aumento de 4x. Una vez que se levante cada colonia, transfiera suavemente todo a un pocillo de la placa ULA de 6 pocillos con una pipeta serológica de 10 ml. Repita este proceso para cada placa iPSC. Incubar las células a 37 °C con 5% deCO2.
      NOTA: Si las colonias son demasiado grandes o están fusionadas, se pueden cortar con la punta de la pipeta de vidrio extraído para crear EB más pequeños.
  2. El día 2, agregue FGF2 a cada pocillo a una concentración final de 50 ng / ml.
    NOTA: El FGF2 utilizado para la diferenciación cerebelosa no es estable al calor. Este protocolo no ha sido probado con FGF2 termoestable.
  3. El día 7, haz un cambio medio de 1/3. Para 3 ml de medio total en un pozo, con una pipeta de 1.000 μL, aspire suavemente 1 ml de medio gastado y reemplácelo con 1 ml de MDL fresco. Incubar los EB durante 7 días.
  4. El día 14, aspire suavemente casi todo el medio gastado con un pipetor de 1.000 μL. Para garantizar un daño mínimo a los EB, gire la placa para reunir todos los EB en el centro de la placa, y luego incline la placa y aspire lentamente desde el borde.
    1. A medida que la cantidad media disminuye, coloque lentamente la placa plana y continúe aspirando. Deje suficiente medio para evitar que se resequen los EB. Después, agregue 3 ml de CDM fresco suplementado con 10 μM Y-27632. Transfiera los EB utilizando una pipeta serológica de 10 ml a un plato recubierto de OLP/laminina (paso 1.2).
      NOTA: Dependiendo de la aplicación posterior, los EB se pueden transferir a una placa OLP/laminina de 6 pocillos o los EB individuales se pueden transferir a un solo pocillo de una placa o cubrecubierta de 24 pocillos recubierta de OLP/laminina.
  5. El día 15, aspirar el medio y reemplazarlo con CDM fresco.
    NOTA: Es importante agregar suficiente medio a los pocillos para asegurar suficiente medio entre alimentaciones ya que, con el tiempo, habrá evaporación (por ejemplo, para un pozo en una placa de 6 pocillos, agregue 3 ml de medio). Si el medio ha comenzado a acidificarse (se vuelve claro y amarillo), refresque el medio incluso si no está en el horario de alimentación hasta el final del protocolo.
  6. El día 21, aspirar el medio gastado y reemplazarlo con MMC. El día 28, cambie el medio con MMC fresca. En el día 35, cosecha las células para otras aplicaciones.

4. Preparación de la muestra para el aislamiento de ARN

  1. Aspirar el medio y añadir 500 μL de reactivo de disociación celular (ver Tabla de materiales) a cada pocillo de la placa de 6 pocillos. Déjalo actuar durante un par de segundos y aspira.
  2. Incubar el plato, con la tapa puesta, a temperatura ambiente durante 2 min. Golpee los lados de la placa para separar las celdas.
  3. Añadir 1 ml de MMC (paso 1.8) y recoger las células en un tubo de 1,5 ml.
  4. Granular las células por centrifugación utilizando una mini centrífuga de sobremesa (ver Tabla de materiales) durante 30 s a RT (velocidad máxima 2000 x g), desechar el medio y agregar 1 ml de 1x PBS pH 7.4 para lavar el pellet celular.
  5. Vuelva a granular las células con una mini centrífuga de sobremesa durante 30 s en RT y lavar con PBS una vez más.
  6. Granular las células y desechar el PBS. Lise las células en fenol y guanidina isotiocianato que contiene reactivo (ver Tabla de materiales).
    NOTA: Las células lisadas en fenol e isotiocianato de guanidina que contienen reactivo pueden almacenarse a −80 °C hasta por 1 año. Las células se pueden lisar directamente en el plato dependiendo del método de aislamiento de ARN y los reactivos que se utilicen. Debido al bajo número de células en un plato, el aislamiento de ARN utilizando columnas de espín de sílice (ver Tabla de materiales) dará como resultado mayores rendimientos de ARN.

5. Preparación de células para la tinción inmunofluorescente

NOTA: Para una placa de 24 pocillos, un EB por pocillo es suficiente.

  1. En el día 35, aspirar el medio gastado y lavar las células agregando 1 ml de DPBS+/+ por pocillo (para un pocillo de una placa de 24 pocillos).
  2. Aspirar el DPBS+/+ y añadir 500 μL de paraformaldehído frío al 4% (PFA, ver Tabla de materiales) preparado en DPBS+/+ por pocillo. Incubar durante 20 min en RT.
  3. Retire el PFA al 4% y lave las células dos veces con DPBS+/+, como en el paso 5.1. Añadir 1 ml de DPBS+/+ y almacenar las células a 4 °C hasta que se realice la tinción.
    NOTA: Se aconseja hacer la tinción inmunofluorescente dentro de 1 semana después de la fijación para evitar el desprendimiento de células y la pérdida de antígenos. Sin embargo, dependiendo del anticuerpo y la ubicación celular del objetivo, la tinción se puede hacer en momentos posteriores hasta 4 semanas después de la fijación.

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Representative Results

Descripción general de la diferenciación cerebelosa 3D a 2D
Las células cerebelosas se generan a partir de iPSCs. La figura 1A muestra el flujo de trabajo general y la adición de componentes principales para la diferenciación. El día 0, los EB se fabrican levantando suavemente las colonias iPSC (Figura 1B) utilizando una pipeta de vidrio tirado en CDM que contiene SB431542 e Y-27632 y se colocan en placas de fijación ultrabaja. FGF2 se añade el día 2. En el día 7, se cambia un tercio del medio y se observa la formación de EB (Figura 1C). El día 14, los EB agrandados (Figura 1D) se colocan en platos recubiertos de OLP / laminina en CDM complementados con Y-27632. El día 15, el medio se sustituye por CDM sin Y-27632. Las células comienzan a migrar hacia afuera desde los EB (Figura 1E) a lo largo de la superficie recubierta. El día 21, se realiza un cambio completo del medio, y el medio se cambia a MMC. Después de eso, el medio se cambia una vez a la semana (o con mayor frecuencia si el medio se acidifica rápidamente). Para el día 35, hay una monocapa de células con morfología y complejidad similares a las neuronales (Figura 1F, G).

Las células 2D expresan marcadores celulares cerebelosos
Las células se cosechan el día 35 para el aislamiento de ARN y el etiquetado inmunofluorescente. La expresión de genes que se sabe que están presentes durante el desarrollo cerebeloso se mide mediante RT-qPCR (Figura 2). Las células expresan marcadores progenitores cerebelosos tempranos como ATOH1 12,13 (labio rómbico, progenitores glutamatérgicos) y PTF1α14 (zona ventricular, progenitores GABAérgicos), así como los marcadores celulares progenitores de Purkinje KIRREL2 15 y SKOR2 15. Además de los marcadores de células cerebelosas del desarrollo temprano, también se observa la expresión de genes de desarrollo en etapas posteriores, OTX2 y SIX3. El marcaje inmunofluorescente de las células muestra tinción positiva para los marcadores cerebelosos EN2 y PTF1α (Figura 3A,D), el marcador neuronal TUBB3 (Figura 3G), así como para el marcador de proliferación Ki67 (Figura 3J). La tinción nuclear con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) muestra núcleos celulares (Figura 3B,E,H,K). Para validar aún más este protocolo, se utilizaron iPSCs derivadas de pacientes con un trastorno neuropsiquiátrico para generar células cerebelosas y analizar la expresión del marcador de células cerebelosas en el día 35. Los datos de RT-qPCR indican un perfil de expresión similar al de las iPSCs de control (Figura complementaria 1). Además, la expresión de moléculas de guía axonal relevantes para el desarrollo cerebeloso está presente tanto en las células cerebelosas de control como en las derivadas del paciente (Figura complementaria 2).

Figure 1
Figura 1: Descripción general de la línea de tiempo del protocolo e imágenes representativas. (A) Un esquema esquemático del protocolo de diferenciación cerebelosa que represente el tipo de medio de cultivo, los suplementos agregados al medio de cultivo, los días en que se requiere un cambio de medio (indicado con líneas verticales) y el recubrimiento superficial de la placa de cultivo. (B) Imágenes representativas de campo brillante de iPSCs en el día 0 y células diferenciadas que se limpiarán antes de hacer EBs (mostradas en círculo rojo), (C) EBs en el día 7 y (D) día 14, (E) el día después de emplatar las EBs, y (F,G) madurando las celdas en el día 35. Barra de escala (B-D): 1 mm; (E-G): 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Expresión de marcadores de células cerebelosas en células cerebelosas 2D en el día 35. Resultados de la expresión génica RT-qPCR en el día 35 para genes seleccionados que representan diferentes marcadores de desarrollo cerebeloso y tipos de células, normalizados a GAPDH. Los valores -ΔCt representan valores GAPDH-Ct restados de los valores objetivo-Ct; Los valores más cercanos a cero indican una mayor expresión. Cualquier valor por debajo de la línea marcada representa una expresión por debajo del límite detectable. N = 2 líneas iPSC, los datos se presentan como media ± DE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Marcaje inmunofluorescente de células cerebelosas 2D en el día 35. Las células se fijan con PFA al 4% en el día 35 y se tiñen con DAPI e inmunomarcadas para (A) EN2 (verde), (B) DAPI (azul), (C) EN2-DAPI fusionado; (D) PTF1α (rojo), (E) DAPI (azul), (F) PTF1α-DAPI fusionado; (G) TUBB3 (verde), (H) DAPI (azul), (I) TUBB3-DAPI fusionado; y (J) Ki67 (rojo), (K) DAPI (azul), (L) Ki67-DAPI fusionado. Barras de escala: 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Imágenes representativas de la diferenciación cerebelosa mediante iPSCs derivadas de pacientes diagnosticados de esquizofrenia. (A) colonias de iPSC, (B) EBs en el día 7, (C) día 14, (D) células que crecen a partir de EBs plateadas en el plato recubierto de OLP/laminina el día 15, y (E) células cerebelosas en el día 35. (F) Resultados de RT-qPCR para la expresión génica en el día 35 para marcadores de células cerebelosas, normalizados a GAPDH. Los valores -ΔCt representan valores GAPDH-Ct restados de los valores objetivo-Ct; Los valores más cercanos a cero indican una mayor expresión. Cualquier valor por debajo de la línea marcada representa una expresión por debajo del límite detectable. N = 2 líneas iPSC, los datos se presentan como media ± DE. Barra de escala (A-C): 1 mm; (D,E): 500 μm. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Expresión génica de moléculas de guía axonal de células cerebelosas 2D en el día 35. Resultados de la expresión génica RT-qPCR en el día 35 para moléculas seleccionadas involucradas en la señalización de guía axónica, normalizadas a GAPDH. Se sabe que todos los genes mostrados se expresan en el cerebelo, excepto PlxnB3, que tiene una baja expresión en el cerebelo a lo largo del desarrollo. Los valores -ΔCt representan valores GAPDH-Ct restados de los valores objetivo-Ct; Los valores más cercanos a cero indican una mayor expresión. Cualquier valor por debajo de la línea marcada representa una expresión por debajo del límite detectable. N (control) = 1, N (SCZ) = 1, y se muestra la media de los experimentos realizados por triplicado. Abreviatura: SCZ = esquizofrenia. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La capacidad de modelar el desarrollo cerebeloso humano in vitro es importante para el modelado de enfermedades, así como para promover la comprensión del desarrollo normal del cerebro. Los protocolos menos complicados y rentables crean más oportunidades para la generación de datos replicables y una amplia implementación en múltiples laboratorios científicos. Aquí se describe un protocolo de diferenciación cerebelosa utilizando un método modificado de generación de EB que no requiere enzimas o agentes de disociación, utilizando factores de crecimiento reportados por Muguruma et al. 4 y un protocolo de crecimiento celular monocapa 2D modificado similar al método de Holmes et al. 5.

El protocolo general comienza generando EB a partir de iPSCs, seguido de la inducción de la diferenciación cerebelosa y, finalmente, el recubrimiento para el cultivo monocapa 2D. Durante este proceso, se observó una cantidad significativa de muerte celular entre los días 7-14. Debido a esta pérdida celular, se recomienda comenzar con un gran número de EB; para una placa de 6 pocillos de celdas 2D, se recomienda comenzar con un mínimo de seis placas (placas de 35 mm o 60 mm) de iPSC. Además, la adición de Y-27632 en el momento de chapar EB en OLP/laminina aumenta significativamente la unión de los EB al sustrato. Es importante verificar visualmente el medio en las culturas de forma intermitente. Si el medio se está volviendo amarillo (acidificante), se recomienda cambiar el medio incluso si no está en el esquema de alimentación. El número total de células que se adhieren variará de un experimento a otro, lo que requerirá un refresco más frecuente o menos frecuente de nutrientes en el medio.

Los resultados de RT-qPCR revelaron que las iPSCs se diferenciaron en células que representan las primeras etapas del cerebelo en desarrollo. Los datos actuales sugieren que, en el día 35 de diferenciación, hay células que expresan el marcador de destino celular neuronal (TUBB3 16,17), marcadores progenitores glutamatérgicos y GABAérgicos (ATOH1 12,13 y PTF1α14, respectivamente), marcadores de límite mesencéfalo-cerebro (EN1 18, EN2 18, GBX2 19), marcadores organizadores ístmicos (WNT1 18, FGF8 19), marcador celular derivado del labio rómbico (PAX6 18 ), y marcadores progenitores de células de Purkinje (KIRREL215, SKOR220). También se observó expresión del marcador rómbico del labio OTX221. Protocolos previos de organoides cerebelosos que utilizan hESCs han observado que la inducción de FGF2 da como resultado células que expresan GBX2 pero muy pocas células OTX2 positivas, mientras que un protocolo similar que utiliza iPSCs mostró idéntica expresión de ARNm de GBX2 y OTX2 en organoides cerebelosos8. Sin embargo, las neuronas cerebelosas derivadas de células madre embrionarias de ratón (mESC) contienen grupos separados de células positivas para OTX2 y GBX24, y se ha demostrado que OTX2 se expresa en todo el desarrollo cerebeloso 22 del ratón22 y humano21,23. El perfil de expresión diferencial de OTX2 entre protocolos que utilizan los mismos factores de especificación de destino podría deberse a otras diferencias entre los protocolos o diferencias individuales entre hESCs e iPSCs; Esto merece una mayor investigación. La expresión de SIX3 también se observó en el cultivo el día 35. SIX3 se expresa en el tubo neural anterior durante el desarrollo, y su expresión en el cerebelo humano permanece baja durante todo el desarrollo y la edad adulta23,24; sin embargo, se expresa en el cerebelo neonatal y adulto del ratón25. Esto sugiere que podría haber una subpoblación de células que se diferencian hacia un destino anterior, o pueden representar una subpoblación de células cerebelosas que expresan SIX3 durante el desarrollo. Estas células podrían ser exploradas más a fondo.

Los protocolos de diferenciación a menudo se desarrollan utilizando hESCs o iPSCs de sujetos sanos, pero es importante confirmar que estos protocolos se pueden aplicar a iPSCs derivadas de pacientes para diseccionar los cambios moleculares y celulares en la enfermedad. Para probar aún más nuestro protocolo, junto con nuestras líneas de control iPSC, diferenciamos las líneas iPSC que se reprogramaron a partir de fibroblastos obtenidos de pacientes diagnosticados con esquizofrenia. La literatura previa ha demostrado que los pacientes diagnosticados con esquizofrenia tienen anomalías cerebelosas funcionales y anatómicas26,27,28. Estos cambios se observan en pacientes adultos, pero pueden comenzar durante el desarrollo y requieren más investigación. En general, se observó que las células cerebelosas de pacientes con esquizofrenia expresaron los marcadores cerebelosos probados en el día 35 y morfológicamente no fueron diferentes de las células cerebelosas derivadas de las iPSCs control (Figura suplementaria 1). Esto sugiere que este protocolo puede investigar el desarrollo cerebeloso humano en el contexto de la enfermedad. Además, también se examinó la expresión de marcadores de guía axonal en el día 35, tanto en líneas celulares de control como de esquizofrenia, ya que uno de los principales componentes del desarrollo es la búsqueda de la vía axonal y la conectividad neuronal 29,30,31,32. De hecho, en el día 35, se verificaron moléculas de guía axonal que están indicadas en el desarrollo cerebeloso, incluyendo semaforina-4C, plexina-B2 y neuropilina-1 (Figura complementaria 2). Durante el desarrollo, la expresión de plexina-B3 es baja en el cerebelo humano23, y también se observó una menor expresión de plexina-B3 en comparación con las otras moléculas de guía axonal para las diferenciaciones. Junto con la expresión de los marcadores cerebelosos, esto es una fuerte indicación de que este protocolo de diferenciación genera células cerebelosas que expresan las señales correctas para la conectividad neuronal en esa estructura.

Es importante tener en cuenta que los tipos de células generados utilizando este FGF2 y el protocolo de diferenciación cerebelosa inducida por insulina no se identificaron mediante análisis de células individuales. Nayler et al.8 publicaron recientemente un conjunto de datos de perfiles unicelulares de organoides cerebelosos generados utilizando un protocolo de inducción similar, y se anticipa que las investigaciones futuras emplearán cada vez más métodos unicelulares para abordar estas preguntas. Las células más allá del día 35 tampoco se probaron para determinar su expresión o morfología. La expresión de los marcadores cerebelosos en puntos de tiempo posteriores y cómo cambian con el tiempo dará más información sobre la madurez de las células. Se ha demostrado que el cultivo conjunto de células cerebelosas derivadas de células madre con precursores de células granulosas cerebelosas de ratón4 o cortes cerebelosos fetales humanos33 genera células cerebelosas maduras, especialmente neuronas de Purkinje, que a menudo están ausentes en los organoides cerebelosos. En particular, un estudio reciente mostró que los organoides cerebelosos disociados en el día 35 de diferenciación y plateados para el crecimiento 2D también dan lugar a neuronas cerebelosas maduras sin necesidad de cocultivo7. Estas aplicaciones tienen como objetivo investigar las últimas etapas del desarrollo cerebeloso y la maduración neuronal en comparación con este protocolo, que se puede utilizar para investigar las primeras etapas de desarrollo. Otra comparación interesante podría surgir de la comparación de neuronas cerebelosas embrionarias de ratón cultivadas34 con neuronas cerebelosas humanas derivadas de iPSC, lo que podría resaltar las diferencias en el desarrollo y la especificación del destino entre las dos especies.

En resumen, el presente protocolo se puede utilizar para aplicaciones que requieren células cerebelosas 2D in vitro generadas a partir de iPSCs. Este protocolo no incluye pasos o materiales complejos, es rentable y se puede usar como modelo para el desarrollo cerebeloso temprano para investigar la expresión génica, la morfología celular y la fisiología.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

Agradecemos a Jenny Gringer Richards por su minucioso trabajo en la validación de nuestros sujetos de control, a partir de los cuales generamos las iPSC de control. Este trabajo fue apoyado por NIH T32 MH019113 (a D.A.M. y K.A.K.), el Nellie Ball Trust (a T.H.W. y A.J.W.), NIH R01 MH111578 (a V.A.M. y J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (a A.J.W.) y Roy J. Carver Charitable Trust (a V.A.M., J.A.W. y A.J.W.). Las figuras fueron creadas con BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26D
1-thio-glycerol Sigma M6145
2 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26B
250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia Fisher Scientific FB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish Falcon 353001
4D Nucleofector core unit Lonza 276885 Nucleofector
5 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish Falcon 353004
6-well ultra-low attachment plates Corning 3471
9" Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Apo-transferrin Sigma T1147
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A9418
Cell culture grade water Cytiva SH30529.02
Chemically defined lipid concentrate Gibco 11905031
Chroman 1 Cayman 34681
Class II, Type A2, Biological safety Cabinet NuAire, Inc. NU-540-600 Hood, UV light
Costar 24-well plate, TC treated Corning 3526
Costar 6-well plate, TC treated Corning 3516
DAPI solution Thermo Scientific 62248
DMEM Gibco 11965092
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO (Dimethly sulfoxide) Sigma D2438
DPBS+/+ Gibco 14040133
Emricasan Cayman 22204
Epi5 episomal iPSC reprogramming kit Life Technologies A15960
Essential 8-Flex Gibco A2858501 PSC medium with heat-stable FGF2
EVOS XL Core Imaging system Life Technologies AMEX1000
Fetal bovine serum - Premium Select Atlanta Biologicals S11150
FGF2 Peprotech 100-18B
GlutaMAX supplement Gibco 35050061 L-alanine-L-glutamine supplement
Ham's F12 Nutrient Mix Gibco 11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific 50144906
Human Anti-EN2, mouse Santa Cruz Biotechnology sc-293311
Human anti-Ki67/MKI67, rabbit R&D Systems MAB7617
Human anti-PTF1a, rabbit Novus Biologicals NBP2-98726
Human anti-TUBB3, mouse Biolegend 801213
IMDM Gibco 12440053
Insulin Gibco 12585
Laminin Mouse Protein Gibco 23017015
Matrigel Matrix Corning 354234 Basement membrane matrix
MEM-NEAA Gibco 11140050
Mini Centrifuge Labnet International C1310 Benchtop mini centrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) New England BioLabs T2040 Silica spin columns
Monarch Total RNA Miniprep Kit New England BioLabs T2010 Silica spin columns
N-2 supplement Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103049
PBS, pH 7.4 Gibco 10010023
PFA 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Polyamine supplement Sigma P8483
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma 3655
Potassium chloride Sigma 746436
SB431542 Sigma 54317
See through self-sealable pouches Steriking SS-T2 (90x250) Autoclave pouches
Sodium citrate dihydrate  Fisher Scientific S279-500
Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia Research Products International 256131
Trans-ISRIB Cayman 16258
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018 Phenol and guanidine isothiocyanate
TrypLE Express Enzyme (1x) Gibco 12604039 Cell dissociation reagent 
Vapor pressure osmometer Wescor, Inc. Model 5520 Osmometer
Y-27632 Biogems 1293823

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References

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Neurociencia Número 187 Cerebelo desarrollo 3D a 2D células madre pluripotentes inducidas diferenciación modelo de enfermedad
Modelado del desarrollo cerebeloso humano <em>in vitro</em> en estructura 2D
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Madencioglu, D. A., Kruth, K. A.,More

Madencioglu, D. A., Kruth, K. A., Wassink, T. H., Magnotta, V. A., Wemmie, J. A., Williams, A. J. Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure. J. Vis. Exp. (187), e64462, doi:10.3791/64462 (2022).

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