Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

İnsan Serebellar Gelişiminin In Vitro in 2D Yapının Modellenmesi

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64462
Automatic Translation
1,3,4,5, 1,3,4,5, 1,3, 1,2,3,4,5, 1,3,4,5, 1,3,4,5
1Department of Psychiatry, University of Iowa, 2Department of Radiology, University of Iowa, 3Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Iowa Neuroscience Institute, University of Iowa, 5Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

Summary

Mevcut protokol, serebellar gelişimin erken aşamalarını araştırmak için indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden 2D tek katmanlı bir serebellar hücre üretimini açıklamaktadır.

Abstract

Beyinciğin hassas ve zamanında gelişimi sadece doğru motor koordinasyon ve denge için değil, aynı zamanda biliş için de çok önemlidir. Ek olarak, serebellar gelişimdeki bozulma, otizm, dikkat eksikliği-hiperaktivite bozukluğu (DEHB) ve şizofreni dahil olmak üzere birçok nörogelişimsel bozuklukta rol oynamıştır. İnsanlarda serebellar gelişimin araştırılması daha önce sadece ölüm sonrası çalışmalar veya nörogörüntüleme yoluyla mümkün olmuştur, ancak bu yöntemler, birçok nörogelişimsel bozukluğun ortaya çıktığı erken gelişim sırasında in vivo olarak meydana gelen moleküler ve hücresel değişiklikleri anlamak için yeterli değildir. Somatik hücrelerden insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) üretme tekniklerinin ortaya çıkması ve iPSC'leri nöronlara daha fazla yeniden ayırt etme yeteneği, erken beyin gelişiminin in vitro modellemesinin yolunu açmıştır. Bu çalışma, 2 boyutlu (2B) tek katmanlı bir yapı gerektiren uygulamalar için serebellar hücreler üretmeye yönelik basitleştirilmiş adımlar sunmaktadır. Erken gelişim aşamalarını temsil eden serebellar hücreler, aşağıdaki adımlarla insan iPSC'lerinden türetilir: ilk olarak, embriyoid cisimler 3 boyutlu (3D) kültürde yapılır, daha sonra serebellar kader spesifikasyonunu teşvik etmek için FGF2 ve insülin ile muamele edilir ve son olarak, poli-l-ornitin (PLO) / laminin kaplı substratlar üzerinde tek katmanlı olarak terminal olarak farklılaştırılırlar. 35 günlük farklılaşmada, iPSC kaynaklı serebellar hücre kültürleri, ATOH1, PTF1α, PAX6 ve KIRREL2 dahil olmak üzere serebellar belirteçleri eksprese eder, bu da bu protokolün glutamaterjik ve GABAerjik serebellar nöronal öncüllerin yanı sıra Purkinje hücre progenitörleri ürettiğini düşündürür. Ayrıca, farklılaşmış hücreler farklı nöronal morfoloji gösterir ve TUBB3 gibi nöronal kimliğin immünofloresan belirteçleri için pozitiftir. Bu hücreler, semaforin-4C, pleksin-B2 ve nöropilin-1 dahil olmak üzere aksonal rehberlik moleküllerini eksprese eder ve nörit büyümesinin ve sinaptik bağlantının moleküler mekanizmalarını araştırmak için bir model olarak hizmet edebilir. Bu yöntem, 2D tek katmanlı formatlar gerektiren gen ekspresyonu, fizyolojik ve morfolojik çalışmalar dahil olmak üzere aşağı akış uygulamaları için yararlı insan serebellar nöronları üretir.

Introduction

İnsan serebellar gelişimini ve bu sürecin kritik zaman pencerelerini anlamak, sadece nörogelişimsel bozuklukların olası nedenlerini çözmek için değil, aynı zamanda terapötik müdahale için yeni hedeflerin belirlenmesi için de önemlidir. İnsan serebellar gelişiminin in vitro olarak modellenmesi zor olmuştur, ancak zamanla, insan embriyonik kök hücrelerini (hESC'ler) veya iPSC'leri serebellar soy kaderleriyle farklılaştıran birçok protokol ortaya çıkmıştır 1,2,3,4,5,6,7,8 . Ayrıca, tekrarlanabilir sonuçlar üreten, nispeten basit (hatayı azaltmak için) ve parasal maliyetler üzerinde ağır olmayan protokoller geliştirmek önemlidir.

Serebellar farklılaşma için ilk protokoller, kaplanmış embriyoid cisimlerden (EB'ler) 2D kültürlerden üretildi ve WNT, BMP'ler ve FGF'ler 1,9 dahil olmak üzere in vivo gelişime benzer çeşitli büyüme faktörleriyle serebellar kaderi indükledi. Daha yeni yayınlanan protokoller, öncelikle FGF2 ve insülin ile 3D organoid kültüründe farklılaşmaya neden oldu, ardından eşkenar dörtgen dudak benzeri yapılar3,4 için FGF19 ve SDF1 izledi veya FGF2, FGF4 ve FGF85'in bir kombinasyonunu kullandı. Her iki serebellar organoid indüksiyon yöntemi de benzer 3D serebellar organoidlerle sonuçlandı, çünkü her iki protokol de aynı zaman noktalarında benzer serebellar belirteç ekspresyonu bildirdi. Holmes ve Heine, 2D serebellar hücrelerin 3D agregalar olarak başlayan hESC'lerden ve iPSC'lerden üretilebileceğini göstermek için 3D protokol5'lerini genişletti. Ek olarak, Silva ve ark.7, 2D'deki olgun serebellar nöronları temsil eden hücrelerin, 3B'den 2B'ye geçmek ve büyüme ve olgunlaşma süresini uzatmak için farklı bir zaman noktası kullanarak, Holmes ve Heine'e benzer bir yaklaşımla üretilebileceğini göstermiştir.

Mevcut protokol, insülin ve FGF2 kullanarak serbest yüzen embriyoid cisimler (EB'ler) üreterek ve daha sonra EB'leri 2D büyüme ve farklılaşma için 14. günde FK / laminin kaplı tabaklara kaplayarak besleyicisiz iPSC'lerde serebellar kaderi indüklemektedir. 35. günde, serebellar kimliğe sahip hücreler elde edilir. Serebellar gelişimin erken aşamalarını, özellikle 2D bir ortamda, özetleme yeteneği, araştırmacıların tek katmanlı bir yapı ile deneyler gerektiren belirli soruları cevaplamalarını sağlar. Bu protokol aynı zamanda istenen hücre popülasyonlarını zenginleştirmek için mikro desenli yüzeyler, aksonal büyüme testleri ve hücre sıralama gibi daha ileri modifikasyonlara da uygundur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

İnsan denekleri araştırması, 201805995 Iowa Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu onay numarası ve Iowa Üniversitesi İnsan Pluripotent Kök Hücre Komitesi onay numarası 2017-02 altında onaylanmıştır. Deneklerden deri biyopsileri yazılı bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra alındı. Fibroblastlar DMEM'de %15 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 MEM-esansiyel olmayan amino asit solüsyonu ile 37 °C'de ve %5 CO2'de kültürlendi. Fibroblastlar, elektroporasyon için bir nükleofektör kullanılarak üreticinin protokolünü ( Malzeme Tablosuna bakınız) takiben epizomal bir yeniden programlama kiti kullanılarak yeniden programlandı. Tüm prosedürler Sınıf II Tip A2 biyolojik güvenlik kabininde ("kısaca "başlık") gerçekleştirildi. Tüm hücre kültürü ortamları antibiyotik içermiyordu; bu nedenle, davlumbaza giren her bileşen %70 etanol ile temizlendi. Tüm hücre kültürü ortamları ve bileşenleri, sterilitelerini korumak için steril filtrelenmiş veya davlumbazda açılmıştır.

1. Deneysel hazırlık

  1. Bodrum membran matrisi (BMM) kaplı plakalar hazırlayın.
    NOT: BMM, daha sıcak sıcaklıklarda daha hızlı katılaşır. Plakalar hızlı bir şekilde hazırlanmalı ve depolanması için hemen 4 ° C'ye yerleştirilmelidir.
    1. BMM'yi ( Malzeme Tablosuna bakınız) buz üzerinde, 4 °C'de en az 2 saat veya gece boyunca çözün.
    2. DMEM/F12 ve BMM'yi 80 μg/mL'lik son konsantrasyona kadar karıştırın. BMM çözeltisini doku kültürü kaplarına dağıtın (35 mm için 1 mL ve 60 mm tabaklar için 2 mL) ve hücreleri kaplamadan önce en az 1 saat veya gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Kullanılmayan tabaklar 4 °C'de 2 hafta saklanabilir.
  2. Poli-L-ornitin/laminin (PLO/laminin) kaplı plakalar hazırlayın.
    1. Steril DPBS +/+ içinde 20 μg / mL PLO ( Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın ve 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL ekleyin. İnkübatörde gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Ertesi gün, FKÖ'yü bir vakum aspiratörü ile aspire edin ve DPBS + / + ile iki kez yıkayın. Kaputta hava kurutulur.
      NOT: Havada kurutulmuş plakalar, gelecekte kullanılmak üzere alüminyum folyoya sarılmış olarak 2 haftaya kadar 4 ° C'de saklanabilir.
    3. DPBS +/+ içinde 10 μg / mL laminin (Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın ve 6 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 1 mL ekleyin. İnkübatörde en az 3 saat veya gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    4. Laminini bir vakum aspiratörü ile aspire edin ve 1 mL orta veya steril DPBS + / + ekleyin.
      NOT: Laminin kaplama kurumamalıdır. Bunu önlemek için PBS veya uygun bir kültür ortamı derhal eklenmelidir. Kaplamalı plakalar 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
  3. PSC passaging çözümünü hazırlayın.
    NOT: PSC geçiş çözeltisi10'u yapmak için bir ozmometre (Malzeme Tablosuna bakınız) gereklidir.
    1. 11.49 g potasyum klorür (KCl) ve 0.147 g sodyum sitrat dihidrat (HOC (COONa) (CH 2 COONa) 2 * 2H 2 O) 400 mL steril hücre kültürüsınıfı suda çözün (bkz.
    2. Çözeltinin hacmini ölçün ve başlangıç hacmi (Vi) olarak kaydedin.
    3. Ozmolariteyi ölçün ve Vi × Oi = Vf × 570 mOsm formülünü kullanarak steril hücre kültürü sınıfı su ekleyerek 570 mOsm'a ayarlayın.
    4. Çözeltiyi 0.20 μm'lik bir filtre ile filtreleyerek sterilize edin ve 10 mL alikot yapın. Alikotları oda sıcaklığında (RT) 6 aya kadar saklayın.
  4. Pluripotent kök hücre (PSC) ortamı hazırlayın.
    NOT: iPSC'ler, ısıya dayanıklı FGF2 içeren bir ortamda tutulur ( Malzeme Tablosuna bakınız), hafta sonu içermeyen bir besleme programı sağlar. Ticari olarak temin edilebilen diğer PSC ortamları bu protokol için denenmemiştir.
    1. PSC orta takviyesini gece boyunca 4 ° C'de çözün.
    2. 500 mL bazal PSC ortamına 10 mL PSC ortam takviyesi ekleyin. 25 mL aliquots yapın ve -20 ° C'de saklayın.
      NOT: Dondurulmuş alikotlar 6 ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir. Çözülmüş alikotlar 4 ° C'de saklanmalı ve 2 hafta içinde kullanılmalıdır. Hücreler, %10 (v/v) dimetil sülfoksit (DMSO) içeren bir PSC ortamında uzun süreli depolama için dondurulabilir.
  5. PSC çözme ortamını hazırlayın.
    1. 50 nM kroman, 1.5 μM emricasan, 1x poliamin takviyesi ve 0.7 μM trans-ISRIB (CEPT kokteyli11) ile PSC ortamını destekleyin (bkz.
    2. 0,20 μm filtre ile filtreyle sterilize edin ve 4 °C'de 4 haftaya kadar saklayın.
  6. Çekilmiş cam pipetler hazırlayın.
    1. 22,9 cm (9 inç) cam Pasteur pipetleri bir Bunsen brülörün üstünde, boynun ~2 cm altında iki parçaya çekerek iki pipet oluşturun, daha ince tarafı diğerinden ~4 cm daha kısadır.
    2. Alevin yardımıyla, pürüzsüz bir "r" oluşturmak için çekilen tarafın uçlarını bükün.
    3. Çekilen pipetleri sterilizasyon için otoklav manşonlarına ve otoklavlara yerleştirin.
  7. Serebellar farklılaşma ortamı (CDM) hazırlayın.
    1. IMDM ve Ham'ın F12 besin karışımını 1: 1 oranında karıştırın. Karışımı 1x L-alanin-L-glutamin takviyesi,% 1 (v / v) kimyasal olarak tanımlanmış lipit konsantresi, 0.45 mM 1-tiyo-gliserol, 15 μL / mL apo-transferrin, 5 mg / mL sığır serum albümini (BSA) ve 7 μg / mL insülin ile destekleyin (bkz.
    2. 0,20 μm filtre ile filtre sterilize edin, 4 °C'de saklayın ve 1 ay içinde kullanın.
  8. Serebellar olgunlaşma ortamı (CMM) hazırlayın.
    1. 1x L-alanin-L-glutamin takviyesi ve 1x N-2 takviyesi ile nörobazal ortamı destekleyin (bakınız Malzeme Tablosu).
    2. 0,20 μm filtre ile filtre sterilize edin, 4 °C'de saklayın ve 2 hafta içinde kullanın.

2. Besleyicisiz iPSC kültürü

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek hücreleri çözün.
    1. Hücreleri çözmeden önce en az 1 saat veya gece boyunca jelleşmek için 37 °C inkübatöre bir BMM plakası (adım 1.1) yerleştirin.
    2. 37 °C'de önceden ısıtılmış 10 mL PSC çözme ortamı (adım 1.5).
    3. Kriyovyali hücrelerle sıvı azottan 37 ° C'de bir su banyosuna aktarın.
      NOT: Hücre kültürü alanında bir kontaminasyon kaynağı oluşmasını önlemek için, standart bir su banyosu kullanılması önerilmez. Bunun yerine, tatlı su, bir kerelik kullanım su banyosu oluşturmak için küçük bir beherde 37 ° C'ye ısıtılabilir.
    4. Tüpte küçük bir buz parçası kaldığında, su banyosundan çıkarın, tüpü kurutun ve% 70 etanol ile püskürtün. Tüpü davlumbaza aktarın ve hücreleri nazikçe 15 mL'lik bir konik tüpe aktarmak için 2 mL veya 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    5. Konik tüpü döndürürken hücrelere damla damla 8 mL PSC çözme ortamı ekleyin. RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj.
    6. Süpernatantı hücre peletini rahatsız etmeden bir vakum aspiratörü ile dikkatlice aspire edin. Hücreleri 2 mL PSC çözme ortamında yeniden askıya alın.
    7. BMM'yi plakadan aspire edin ve eşit dağılım için yeniden askıya alınmış hücreleri plakanın her yerine damla damla ekleyin.
    8. Plakayı inkübatöre 37 ° C'de,% 5 CO2'ye yerleştirin. PSC ortamı ile ertesi gün ortamı yenileyin. Bundan sonra, ortamı günlük olarak değiştirin.
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek hücreleri koruyun.
    1. Gerekli PSC ortam hacmini 37 ° C'de önceden ısıtın (örneğin, 35 mm plaka başına 1 mL ortam).
    2. Diferansiye hücreler veya koloniler için plakaları araştırın ve farklılaşmış hücreleri çekilmiş bir cam pipetle çıkarın (adım 1.6).
      NOT: iPSC kolonileri, morfolojik olarak aynı hücrelere sahip pürüzsüz kenarlara sahiptir.
    3. Harcanan ortamı günlük olarak değiştirin ve her 3-4 günde bir veya% 70 akıcılığa ulaşıldığında geçiş yapın.
  3. Hücreleri geçirin.
    1. Gerekli miktarda BMM plakasını, geçmeden önce en az 1 saat veya gece boyunca inkübatöre yerleştirin. Gerekli miktarda PSC ortamını (adım 1.3) 37 °C'de önceden ısıtın.
    2. Çekilmiş bir cam pipet kullanarak, farklılaşmış hücreleri veya kolonileri temizleyin.
    3. Harcanan ortamı bir vakum aspiratörü ile aspire edin ve 35 mm çanak başına 1 mL PSC ayrışma ortamı ekleyin. 1-3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: PSC ortamı eklemeden önce PSC pasaj çözeltisinde koloniler kalkıyorsa, inkübasyon süresi azaltılabilir.
    4. PSC pasaj solüsyonunu aspire edin ve önceden ısıtılmış PSC ortamı ekleyin.
    5. Steril bir 200 μL pipet ucu kullanarak, çizik çizgilerini bir yönde birbirine paralel hale getirin, plakayı 90° döndürün ve öncekilere dik ikinci bir çizik çizgileri seti yapın (plaka boyunca çapraz taranmış bir desen oluşturur).
    6. BMM çözeltisini ayarlanmış plakalardan aspire edin. Serolojik bir pipet kullanarak kolonileri toplayın ve yeni BMM plakalarına dağıtın.
    7. 37 °C'de inkübe edin,% 5 CO2. Ortamı günlük olarak değiştirin.
  4. Hücreleri dondurun.
    1. İçeriği etiketleyerek kriyovyalleri hazırlayın ve 30 dakika boyunca davlumbazda ultraviyole ( UV) ışık altında sterilize edin (bkz.
    2. PSC ortamını %10 (v/v) DMSO ile destekleyerek PSC dondurma ortamını hazırlayın. 2.3.2-2.3.5 arasındaki adımları izleyin.
    3. Hücreleri 5 mL'lik serolojik pipetle 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın.
    4. Ortamı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini PSC dondurma ortamında yeniden askıya alın.
    5. Kriyovallere dağıtın. Şişeleri dondurucu bir kaba koyun ve kabı -80 ° C'lik bir dondurucuya yerleştirin.
    6. Ertesi gün, kriyovyalleri uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarın.

3. Serebellar farklılaşma

NOT: Farklılaştırmaya başlamadan önce, iPSC'ler altı adet 35 mm'lik kalıba geçirilir ve %70 akıcılıkta olduklarında farklılaşmaya hazırdır. Her 35 mm'lik plaka, 6 delikli plakanın bir kuyucuğuna aktarılacaktır.

  1. 0. günde, EB oluşumu için sağlıklı iPSC kolonilerini kaldırın.
    1. 6 kuyulu ultra düşük ataşman (ULA) plakasının her bir kuyucuğuna 10 μM Y-27632 ve 10 μM SB431542 ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile desteklenmiş 1 mL CDM (adım 1.7) ekleyin ve kaldırılan koloniler kuyucuklara eklenmeye hazır olana kadar inkübatöre yerleştirin.
    2. Farklılaşmış hücreleri çekilmiş bir cam pipet kullanarak temizleyin. Ortamı aspire edin ve her 35 mm'lik çanak için 1 mL PSC pasaj çözeltisi ekleyin. 37 ° C'de 3 dakika boyunca inkübe edin, aspire edin ve 10 μM Y-27632 ve 10 μM SB431542 ile desteklenmiş 2 mL CDM ekleyin.
      NOT: CDM eklemeden önce PSC pasaj çözeltisinde koloniler kalkıyorsa, inkübasyon süresi azaltılabilir.
    3. İletilen ışıklı ters çevrilmiş mikroskop altında, 4x büyütme kullanarak çekilen cam pipetin bükülmüş kenarını kullanarak kolonileri yavaşça kaldırın. Her koloni kaldırıldıktan sonra, 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak hepsini 6 delikli ULA plakasının bir kuyucuğuna yavaşça aktarın. Her iPSC plakası için bu işlemi tekrarlayın. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
      NOT: Koloniler çok büyükse veya birleştirilmişse, daha küçük EB'ler oluşturmak için çekilmiş cam pipetin ucuyla dilimlenebilirler.
  2. 2. günde, her bir kuyucuğa FGF2'yi 50 ng / mL'lik son konsantrasyona ekleyin.
    NOT: Serebellar farklılaşma için kullanılan FGF2 ısıya dayanıklı değildir. Bu protokol ısıya dayanıklı FGF2 ile test edilmemiştir.
  3. 7. günde, 1/3 orta bir değişim yapın. Bir kuyucuktaki toplam 3 mL ortam için, 1.000 μL'lik bir pipetleyici ile, 1 mL harcanmış ortamı nazikçe aspire edin ve 1 mL taze CDM ile değiştirin. EB'leri 7 gün boyunca inkübe edin.
  4. 14. günde, 1.000 μL'lik bir pipetör kullanarak harcanan ortamın neredeyse tamamını nazikçe aspire edin. EB'lere minimum hasar verilmesini sağlamak için, plakanın ortasındaki tüm EB'leri toplamak için plakayı döndürün ve ardından plakayı eğin ve kenardan yavaşça aspire edin.
    1. Orta miktar azaldıkça, plakayı yavaşça düz bir şekilde yerleştirin ve aspirasyona devam edin. EB'lerin kurumasını önlemek için yeterli ortam bırakın. Daha sonra, 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş 3 mL taze CDM ekleyin. EB'leri 10 mL'lik serolojik pipet kullanarak PLO/laminin kaplı bir kaba aktarın (adım 1.2).
      NOT: Çıkış yönündeki uygulamaya bağlı olarak, EB'ler 6 delikli bir PLO/laminin plakasına veya tek EB'ler PLO/laminin kaplı 24 delikli plaka veya kapak kaymasının tek bir kuyucuğuna aktarılabilir.
  5. 15. günde, ortamı aspire edin ve taze CDM ile değiştirin.
    NOT: Beslemeler arasında yeterli ortamı sağlamak için kuyucuklara yeterli ortam eklemek önemlidir, çünkü zamanla buharlaşma olacaktır (örneğin, 6 delikli bir plakadaki bir kuyu için 3 mL ortam ekleyin). Ortam asitleşmeye başladıysa (berrak ve sarıya dönerse), protokolün sonuna kadar besleme programında olmasa bile ortamı yenileyin.
  6. 21. günde, harcanan ortamı aspire edin ve CMM ile değiştirin. 28. günde, ortamı taze CMM ile değiştirin. 35. günde, daha fazla uygulama için hücreleri toplayın.

4. RNA izolasyonu için numune hazırlama

  1. Ortamı aspire edin ve 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna 500 μL hücre ayrışma reaktifi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Birkaç saniye bekletin ve aspire edin.
  2. Plakayı, kapağı açıkken, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri ayırmak için plakanın kenarlarına dokunun.
  3. 1 mL CMM ekleyin (adım 1.8) ve hücreleri 1.5 mL'lik bir tüpe toplayın.
  4. RT'de (maksimum hız 2000 x g) 30 sn için tezgah üstü bir mini santrifüj (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak hücreleri santrifüjleme yoluyla peletleyin, ortamı atın ve hücre peletini yıkamak için 1 mL 1x PBS pH 7.4 ekleyin.
  5. RT'de 30 sn'lik masaüstü mini santrifüj kullanarak hücreleri tekrar pelet edin ve PBS ile bir kez daha yıkayın.
  6. Hücreleri toplayın ve PBS'yi atın. Reaktif içeren fenol ve guanidin izotiyosiyanat içindeki hücreleri lize edin (bakınız Malzeme Tablosu).
    NOT: Fenol ve guanidin izotiyosiyanat içeren reaktifte lize edilen hücreler -80 °C'de 1 yıla kadar saklanabilir. Hücreler, RNA izolasyon yöntemine ve kullanılan reaktiflere bağlı olarak doğrudan çanak içinde lize edilebilir. Bir çanaktaki düşük hücre sayısı nedeniyle, RNA'yı silika spin sütunları kullanarak izole etmek ( bakınız Malzeme Tablosu) daha yüksek RNA verimine neden olacaktır.

5. İmmünofloresan boyama için hücrelerin hazırlanması

NOT: 24 delikli bir plaka için, kuyu başına bir EB yeterlidir.

  1. 35. günde, harcanan ortamı aspire edin ve kuyu başına 1 mL DPBS +/+ ekleyerek hücreleri yıkayın (24 delikli bir plakanın bir kuyucuğu için).
  2. DPBS +/+ aspire edin ve kuyucuk başına DPBS +/+ içinde hazırlanan 500 μL soğuk% 4 paraformaldehit (PFA, bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin. RT'de 20 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
  3. % 4 PFA'yı çıkarın ve hücreleri adım 5.1'de olduğu gibi DPBS +/++ ile iki kez yıkayın. 1 mL DPBS +/+ ekleyin ve boyama yapılana kadar hücreleri 4 ° C'de saklayın.
    NOT: Hücre dekolmanı ve antijen kaybını önlemek için immünofloresan boyamanın fiksasyondan sonraki 1 hafta içinde yapılması önerilir. Bununla birlikte, antikora ve hedefin hücresel konumuna bağlı olarak, boyama fiksasyondan 4 hafta sonrasına kadar daha sonraki zamanlarda yapılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3B'den 2B'ye serebellar farklılaşmaya genel bakış
Serebellar hücreler iPSC'lerden başlayarak üretilir. Şekil 1A , genel iş akışını ve farklılaştırma için ana bileşenlerin eklenmesini göstermektedir. 0. günde, EB'ler, SB431542 ve Y-27632 içeren CDM'de çekilmiş bir cam pipet kullanılarak iPSC kolonilerinin yavaşça kaldırılmasıyla yapılır (Şekil 1B) ve ultra düşük ataşmanlı plakalara yerleştirilir. FGF2, 2. günde eklenir. 7. günde, ortamın üçte biri değiştirilir ve EB oluşumu gözlenir (Şekil 1C). 14. günde, genişlemiş EB'ler (Şekil 1D), Y-27632 ile desteklenmiş CDM'de FK / laminin kaplı kaplar üzerine kaplanır. 15. Günde, ortam Y-27632 olmadan CDM ile değiştirilir. Hücreler, kaplanmış yüzey boyunca EB'lerden (Şekil 1E) dışa doğru göç etmeye başlar. 21. günde, tam bir ortam değişimi gerçekleştirilir ve ortam CMM'ye geçirilir. Bundan sonra, ortam haftada bir kez değiştirilir (veya ortam hızlı bir şekilde asitleşirse daha sık). 35. günde, nöronal benzeri morfolojisi ve karmaşıklığı olan tek katmanlı bir hücre tabakası vardır (Şekil 1F, G).

2D hücreler serebellar hücre belirteçlerini eksprese eder
Hücreler, RNA izolasyonu ve immünofloresan etiketleme için 35. günde toplanır. Serebellar gelişim sırasında mevcut olduğu bilinen genlerin ekspresyonu RT-qPCR ile ölçülür (Şekil 2). Hücreler, ATOH1 12,13 (eşkenar dörtgen dudak, glutamaterjik progenitörler) ve PTF1α 14 (ventriküler zon, GABAerjik progenitörler) gibi erken serebellar progenitör belirteçlerinin yanı sıra Purkinje progenitör hücre belirteçleri KIRREL2 15 ve SKOR2 15'i eksprese eder. Erken gelişimsel serebellar hücre belirteçlerine ek olarak, daha sonraki aşamadaki gelişim genlerinin, OTX2 ve SIX3'ün ekspresyonu da gözlenir. Hücrelerin immünofloresan etiketlemesi, serebellar belirteçler EN2 ve PTF1α (Şekil 3A, D), nöronal belirteç TUBB3 (Şekil 3G) ve proliferasyon belirteci Ki67 (Şekil 3J) için pozitif boyanma göstermektedir. 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile nükleer boyama hücre çekirdeklerini gösterir (Şekil 3B,E,H,K). Bu protokolü daha da doğrulamak için, nöropsikiyatrik bozukluğu olan hastalardan türetilen iPSC'ler, 35. günde serebellar hücreler üretmek ve serebellar hücre belirteci ekspresyonunu analiz etmek için kullanıldı. RT-qPCR verileri, kontrol iPSC'leri ile benzer bir ifade profilini göstermektedir (Ek Şekil 1). Ek olarak, serebellar gelişim ile ilgili aksonal kılavuz moleküllerinin ekspresyonu hem kontrol hem de hasta kaynaklı serebellar hücrelerde mevcuttur (Ek Şekil 2).

Figure 1
Şekil 1: Protokol zaman çizelgesine ve temsili görüntülere genel bakış. (A) Kültür ortamının türünü, kültür ortamına eklenen takviyeleri, ortam değişikliğinin gerekli olduğu günleri (dikey çizgilerle belirtilir) ve kültür kabının yüzey kaplamasını gösteren serebellar farklılaşma protokolünün şematik bir taslağı. (B) 0. günde iPSC'lerin temsili parlak alan görüntüleri ve EB'ler yapılmadan önce temizlenecek farklılaşmış hücreler (kırmızı daire ile gösterilmiştir), (C) 7. gün ve (D) 14. gündeki EB'ler, (E) EB'lerin kaplanmasından sonraki gün ve (F, G) 35. günde olgunlaşan hücreler. Ölçek çubuğu (B-D): 1 mm; (E-G): 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: 35. günde 2D serebellar hücrelerde serebellar hücre belirteçlerinin ekspresyonu. RT-qPCR gen ekspresyonu, GAPDH'ye normalize edilmiş farklı serebellar gelişim belirteçlerini ve hücre tiplerini temsil eden seçilmiş genler için 35. günde sonuçlanır. -ΔCt değerleri, hedef-Ct değerlerinden çıkarılan GAPDH-Ct değerlerini temsil eder; sıfıra yakın değerler daha yüksek ifadeyi gösterir. İşaretli çizginin altındaki herhangi bir değer, algılanabilir sınırın altındaki ifadeyi temsil eder. N = 2 iPSC satırı, veriler ortalama ± SD olarak sunulmaktadır .

Figure 3
Şekil 3: 35. günde 2D serebellar hücrelerin immünofloresan etiketlemesi. Hücreler 35. günde %4 PFA ile sabitlenir ve DAPI ile nükleer boyanır ve (A) EN2 (yeşil), (B) DAPI (mavi), (C) EN2-DAPI için immün olarak etiketlenir; (D) PTF1α (kırmızı), (E) DAPI (mavi), (F) PTF1α-DAPI birleştirilmiş; (G) TUBB3 (yeşil), (H) DAPI (mavi), (I) TUBB3-DAPI birleştirilmiş; ve (J) Ki67 (kırmızı), (K) DAPI (mavi), (L) Ki67-DAPI birleştirildi. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Şizofreni teşhisi konan hastalardan türetilen iPSC'ler kullanılarak serebellar farklılaşmanın temsili görüntüleri. (A) iPSC kolonileri, (B) 7. günde EB'ler, (C) 14. gün, (D) 15. günde FKÖ/laminin kaplı çanak üzerindeki kaplanmış EB'lerden büyüyen hücreler ve (E) 35. günde serebellar hücreler. (F) SEREBELLAR hücre belirteçleri için 35. günde gen ekspresyonu için RT-qPCR sonuçları, GAPDH'ye normalleştirilmiştir. -ΔCt değerleri, hedef-Ct değerlerinden çıkarılan GAPDH-Ct değerlerini temsil eder; sıfıra yakın değerler daha yüksek ifadeyi gösterir. İşaretli çizginin altındaki herhangi bir değer, algılanabilir sınırın altındaki ifadeyi temsil eder. N = 2 iPSC çizgisi, veriler ortalama ± olarak sunulur SD. Ölçek çubuğu (A-C): 1 mm; (D,E): 500 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: 35. günde 2D serebellar hücrelerin aksonal kılavuzluk moleküllerinin gen ekspresyonu. RT-qPCR gen ekspresyonu, GAPDH'ye normalleştirilmiş, akson kılavuz sinyalizasyonunda yer alan seçilmiş moleküller için 35. günde sonuçlanır. Gösterilen tüm genlerin, gelişim boyunca beyincikte düşük ekspresyona sahip olan PlxnB3 hariç, beyincikte eksprese edildiği bilinmektedir. -ΔCt değerleri, hedef-Ct değerlerinden çıkarılan GAPDH-Ct değerlerini temsil eder; sıfıra yakın değerler daha yüksek ifadeyi gösterir. İşaretli çizginin altındaki herhangi bir değer, algılanabilir sınırın altındaki ifadeyi temsil eder. N (kontrol) = 1, N (SCZ) = 1 ve üçlü olarak çalıştırılan deneylerin ortalaması gösterilmiştir. Kısaltma: SCZ = şizofreni. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İnsan serebellar gelişimini in vitro olarak modelleme yeteneği, hastalık modellemesi için ve normal beyin gelişiminin anlaşılmasını ilerletmek için önemlidir. Daha az karmaşık ve uygun maliyetli protokoller, çoğaltılabilir veri üretimi ve birden fazla bilimsel laboratuvarda geniş uygulama için daha fazla fırsat yaratır. Burada, Muguruma ve ark. tarafından bildirilen büyüme faktörleri kullanılarak, enzimler veya ayrışma ajanları gerektirmeyen EB'ler üretmek için modifiye edilmiş bir yöntem kullanılarak bir serebellar farklılaşma protokolü açıklanmaktadır. 4 ve Holmes ve ark.'nın yöntemine benzer modifiye edilmiş bir 2D tek katmanlı hücre büyüme protokolü. 5.

Genel protokol, iPSC'lerden EB'ler üreterek başlar, ardından serebellar farklılaşmanın indüksiyonu ve son olarak 2D tek katmanlı kültür için kaplama yapılır. Bu süreçte 7-14. günler arasında önemli miktarda hücre ölümü gözlendi. Bu hücre kaybı nedeniyle, çok sayıda EB ile başlamanız önerilir; 6 delikli 2D hücreli bir plaka için, en az altı plaka (35 mm veya 60 mm plakalar) iPSC ile başlanması önerilir. Ayrıca, EB'lerin FKÖ/laminin üzerine kaplanması sırasında Y-27632'nin eklenmesi, EB'lerin substrata bağlanmasını önemli ölçüde artırır. Kültürlerdeki ortamı aralıklı olarak görsel olarak kontrol etmek önemlidir. Ortam sararıyorsa (asitleştirici), besleme şemasında olmasa bile ortamın değiştirilmesi önerilir. Bağlanan toplam hücre sayısı deneyden deneye değişecek ve ortamdaki besinlerin daha sık veya daha az sıklıkta yenilenmesini gerektirecektir.

RT-qPCR sonuçları, iPSC'lerin gelişmekte olan beyinciğin erken aşamalarını temsil eden hücrelere farklılaştığını ortaya koymuştur. Mevcut veriler, farklılaşmanın 35. gününde, nöronal hücre kader belirtecini (TUBB3 16,17), glutamaterjik ve GABAerjik progenitör belirteçlerini (sırasıyla ATOH1 12,13 ve PTF1α 14), orta beyin-arka beyin sınır belirteçlerini (EN1 18, EN2 18, GBX2 19), isthmic düzenleyici belirteçleri (WNT118, FGF819), eşkenar dörtgen dudak türevi hücre belirteçlerini (PAX6 18) ifade eden hücrelerin olduğunu göstermektedir. ) ve Purkinje hücre progenitör belirteçleri (KIRREL215, SKOR220). Eşkenar dörtgen dudak işaretleyicisi OTX221'in ekspresyonu da gözlendi. hESC'leri kullanan önceki serebellar organoid protokolleri, FGF2 indüksiyonunun GBX2 eksprese eden hücrelerle sonuçlandığını, ancak çok az OTX2 pozitif hücre ile sonuçlandığını, iPSC'leri kullanan benzer bir protokolün ise serebellar organoidlerde GBX2 ve OTX2'nin aynı mRNA ekspresyonunu gösterdiğini gözlemlemiştir8. Bununla birlikte, fare embriyonik kök hücresi (mESC) kaynaklı serebellar nöronlar ayrı OTX2 ve GBX2 pozitif hücre kümeleriiçerir 4 ve OTX2'nin fare22 ve insan 21,23 serebellar gelişimi boyunca eksprese edildiği gösterilmiştir. Aynı kader spesifikasyon faktörlerini kullanan protokoller arasındaki OTX2'nin diferansiyel ifade profili, protokoller arasındaki diğer farklılıklardan veya hESC'ler ile iPSC'ler arasındaki bireysel farklılıklardan kaynaklanıyor olabilir; bu daha fazla araştırmayı hak ediyor. SIX3 ekspresyonu da 35. günde kültürde gözlendi. SIX3, gelişim sırasında anterior nöral tüpte eksprese edilir ve insan beyinciğindeki ekspresyonu gelişim ve yetişkinlik döneminde düşük kalır23,24; ancak yenidoğan ve erişkin fare beyinciği25'te ifade edilir. Bu, bir ön kadere doğru farklılaşan hücrelerin bir alt popülasyonu olabileceğini veya gelişim sırasında SIX3'ü eksprese eden serebellar hücrelerin bir alt popülasyonunu temsil edebileceğini düşündürmektedir. Bu hücreler daha fazla araştırılabilir.

Farklılaşma protokolleri genellikle sağlıklı deneklerden hESC'ler veya iPSC'ler kullanılarak geliştirilir, ancak bu protokollerin hastalıktaki moleküler ve hücresel değişiklikleri incelemek için hasta kaynaklı iPSC'lere uygulanabileceğini doğrulamak önemlidir. Protokolümüzü daha fazla test etmek için, kontrol iPSC hatlarımızın yanı sıra, şizofreni teşhisi konan hastalardan elde edilen fibroblastlardan yeniden programlanan iPSC hatlarını farklılaştırdık. Önceki literatür şizofreni tanısı alan hastalarda fonksiyonel ve anatomik serebellar anormallikler olduğunu göstermiştir26,27,28. Bu değişiklikler yetişkin hastalarda gözlenir, ancak gelişim sırasında başlayabilir ve daha fazla araştırma gerektirebilir. Genel olarak, şizofreni hastalarından alınan serebellar hücrelerin 35. günde test edilen serebellar belirteçleri eksprese ettiği ve morfolojik olarak kontrol iPSC'lerinden türetilen serebellar hücrelerden farklı olmadığı gözlenmiştir (Ek Şekil 1). Bu, bu protokolün hastalık bağlamında insan serebellar gelişimini araştırabileceğini düşündürmektedir. Ayrıca, 35. günde aksonal kılavuz belirteçlerin ekspresyonu da hem kontrol hem de şizofreni hücre hatlarında incelenmiştir, çünkü gelişimin ana bileşenlerinden biri aksonal yol bulma ve nöronal bağlantı 29,30,31,32'dir. Nitekim, 35. günde, semaforin-4C, pleksin-B2 ve nöropilin-1 dahil olmak üzere serebellar gelişimde belirtilen aksonal kılavuzluk molekülleri doğrulandı (Ek Şekil 2). Gelişim sırasında, insan beyincik23'te pleksin-B3 ekspresyonu düşüktür ve farklılaşmalar için diğer aksonal rehberlik moleküllerine kıyasla daha düşük bir pleksin-B3 ekspresyonu da gözlenmiştir. Serebellar belirteçlerin ekspresyonu ile birlikte, bu farklılaşma protokolünün, bu yapıdaki nöronal bağlantı için doğru ipuçlarını ifade eden serebellar hücreler ürettiğinin güçlü bir göstergesidir.

Bu FGF2 ve insülin kaynaklı serebellar farklılaşma protokolü kullanılarak üretilen hücre tiplerinin, tek hücreli analiz yoluyla tanımlanmadığını belirtmek önemlidir. Nayler ve ark.8 yakın zamanda benzer bir indüksiyon protokolü kullanılarak üretilen serebellar organoidlerin tek hücreli profillemesinin bir veri kümesini yayınladı ve gelecekteki araştırmaların bu soruları ele almak için giderek daha fazla tek hücreli yöntemler kullanacağı tahmin edilmektedir. 35. günün ötesindeki hücreler de ekspresyon veya morfoloji açısından test edilmedi. Serebellar belirteçlerin daha sonraki zaman noktalarında ekspresyonu ve zamanla nasıl değiştikleri, hücrelerin olgunluğu hakkında daha fazla bilgi verecektir. Kök hücre kaynaklı serebellar hücrelerin fare serebellar granül hücre öncülleri4 veya insan fetal serebellar dilimleri33 ile birlikte kültürlenmesinin, olgun serebellar hücreleri, özellikle de serebellar organoidlerde sıklıkla bulunmayan Purkinje nöronları ürettiği gösterilmiştir. Özellikle, yakın tarihli bir çalışma, farklılaşma günü 35'te ayrışan ve 2D büyüme için kaplanan serebellar organoidlerin, birliktekültürlenmeye ihtiyaç duymadan olgun serebellar nöronlara yol açtığını göstermiştir. Bu uygulamalar, gelişimin erken aşamalarını araştırmak için kullanılabilecek bu protokole kıyasla serebellar gelişimin sonraki aşamalarını ve nöral olgunlaşmayı araştırmayı amaçlamaktadır. Bir başka ilginç karşılaştırma, kültürlenmiş embriyonik fare serebellar nöronları34'ün iPSC türevi insan serebellar nöronlarıyla karşılaştırılmasından kaynaklanabilir ve potansiyel olarak iki tür arasındaki gelişim ve kader spesifikasyonundaki farklılıkları vurgulayabilir.

Özetle, mevcut protokol, iPSC'lerden üretilen in vitro 2D serebellar hücreleri gerektiren uygulamalar için kullanılabilir. Bu protokol karmaşık adımlar veya materyaller içermez, uygun maliyetlidir ve gen ekspresyonunu, hücre morfolojisini ve fizyolojisini araştırmak için erken serebellar gelişim için bir model olarak kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Jenny Gringer Richards'a, kontrol iPSC'lerini oluşturduğumuz kontrol konularımızı doğrulamadaki kapsamlı çalışmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH T32 MH019113 (D.A.M. ve K.A.K.'ya), Nellie Ball Trust (T.H.W. ve A.J.W.'ye), nih R01 MH111578 (V.A.M. ve J.A.W.'ye), nih KL2 TR002536 (A.J.W.'ye) ve Roy J. Carver Charitable Trust (V.A.M., J.A.W. ve A.J.W.) tarafından desteklenmiştir. Figürler BioRender.com ile yaratıldı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26D
1-thio-glycerol Sigma M6145
2 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26B
250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia Fisher Scientific FB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish Falcon 353001
4D Nucleofector core unit Lonza 276885 Nucleofector
5 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish Falcon 353004
6-well ultra-low attachment plates Corning 3471
9" Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Apo-transferrin Sigma T1147
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A9418
Cell culture grade water Cytiva SH30529.02
Chemically defined lipid concentrate Gibco 11905031
Chroman 1 Cayman 34681
Class II, Type A2, Biological safety Cabinet NuAire, Inc. NU-540-600 Hood, UV light
Costar 24-well plate, TC treated Corning 3526
Costar 6-well plate, TC treated Corning 3516
DAPI solution Thermo Scientific 62248
DMEM Gibco 11965092
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO (Dimethly sulfoxide) Sigma D2438
DPBS+/+ Gibco 14040133
Emricasan Cayman 22204
Epi5 episomal iPSC reprogramming kit Life Technologies A15960
Essential 8-Flex Gibco A2858501 PSC medium with heat-stable FGF2
EVOS XL Core Imaging system Life Technologies AMEX1000
Fetal bovine serum - Premium Select Atlanta Biologicals S11150
FGF2 Peprotech 100-18B
GlutaMAX supplement Gibco 35050061 L-alanine-L-glutamine supplement
Ham's F12 Nutrient Mix Gibco 11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific 50144906
Human Anti-EN2, mouse Santa Cruz Biotechnology sc-293311
Human anti-Ki67/MKI67, rabbit R&D Systems MAB7617
Human anti-PTF1a, rabbit Novus Biologicals NBP2-98726
Human anti-TUBB3, mouse Biolegend 801213
IMDM Gibco 12440053
Insulin Gibco 12585
Laminin Mouse Protein Gibco 23017015
Matrigel Matrix Corning 354234 Basement membrane matrix
MEM-NEAA Gibco 11140050
Mini Centrifuge Labnet International C1310 Benchtop mini centrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) New England BioLabs T2040 Silica spin columns
Monarch Total RNA Miniprep Kit New England BioLabs T2010 Silica spin columns
N-2 supplement Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103049
PBS, pH 7.4 Gibco 10010023
PFA 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Polyamine supplement Sigma P8483
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma 3655
Potassium chloride Sigma 746436
SB431542 Sigma 54317
See through self-sealable pouches Steriking SS-T2 (90x250) Autoclave pouches
Sodium citrate dihydrate  Fisher Scientific S279-500
Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia Research Products International 256131
Trans-ISRIB Cayman 16258
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018 Phenol and guanidine isothiocyanate
TrypLE Express Enzyme (1x) Gibco 12604039 Cell dissociation reagent 
Vapor pressure osmometer Wescor, Inc. Model 5520 Osmometer
Y-27632 Biogems 1293823

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).
  2. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
  3. Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
  4. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  5. Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).
  6. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
  7. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).
  8. Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959 (2021).
  9. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
  10. Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).
  11. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
  14. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
  15. Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).
  16. Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
  17. Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
  18. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
  19. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
  20. Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
  21. Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
  22. Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
  23. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  24. Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
  25. Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
  26. Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
  27. Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
  28. Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
  29. Saywell, V., Cioni, J. -M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
  30. Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
  31. Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
  32. Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
  33. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232 (2015).
  34. Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).

Tags

Nörobilim Sayı 187 Beyincik gelişim 3B'den 2B'ye indüklenmiş pluripotent kök hücre farklılaşma hastalık modeli
İnsan Serebellar Gelişiminin <em>In Vitro in</em> 2D Yapının Modellenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madencioglu, D. A., Kruth, K. A.,… More

Madencioglu, D. A., Kruth, K. A., Wassink, T. H., Magnotta, V. A., Wemmie, J. A., Williams, A. J. Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure. J. Vis. Exp. (187), e64462, doi:10.3791/64462 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter