Summary
En protokoll presenteres for bestemmelse av biomarkører med lav forekomst fra tørkede serumprøver eksemplifisert med biomarkøren progastrinfrigjørende peptid (ProGRP). Antistoffbelagte magnetiske perler brukes til selektiv opprydding og anrikning av et proteotypisk ProGRP-peptid. Det fangede peptidet analyseres deretter ved væskekromatografi-tandemmassespektrometri.
Abstract
Denne artikkelen presenterer en protokoll med detaljerte beskrivelser for effektiv prøveopprydding av proteiner med lav overflod fra tørkede prøver. Dette utføres ved hjelp av perlebasert proteolyse før proteotypisk peptidaffinitetsfangst og væskekromatografitandemmassespektrometri (LC-MS/MS) bestemmelse. Prosedyren kan brukes på både konvensjonelle tørkede prøver ved bruk av papirkort (f.eks. tørkede blodflekker [DBS] og tørkede serumflekker [DSS]), samt prøver samlet med nyere prøvetakingsmetoder som volumetrisk absorberende mikroprøvetaking (VAMS). I tillegg til å beskrive denne prosedyren, presenteres fremstillingen av både trypsinperler og antistoffbelagte perler på en trinnvis måte i dette arbeidet. Fordelene ved den presenterte prosedyren er tidseffektiv proteolyse ved bruk av perler og selektiv robust opprydding ved bruk av peptidaffinitetsfangst. Den nåværende prosedyren beskriver bestemmelsen av den lav-overflod småcellet lungekreft (SCLC) biomarkør, progastrinfrigjørende peptid (ProGRP), i tørket serum (både DSS og VAMS). Detaljerte prosedyrer for preparasjon av perler gjør det enklere å implementere arbeidsflyten i nye applikasjoner eller andre laboratorier. Det er påvist at resultatene kan være avhengig av prøvetakingsmaterialet; For dette prosjektet ble det sett høyere signalintensiteter for prøver samlet inn ved hjelp av VAMS sammenlignet med DSS.
Introduction
Mikrosampling har eksistert i mer enn 100 år siden Ivar Bang beskrev glukosemåling fra DBS i 19131. Etter at Guthrie og Susi introduserte DBS i 1963 for bestemmelse av fenylalanin hos nyfødte2, har teknikken blitt stadig mer utbredt. De første rapportene om DBS for prøvetaking og lagring av proteiner ble gjort tidlig på 1970-tallet3,4, og et tiår senere, på 1980-tallet, fant vi den første rapporten om massespektrometri (MS) for bestemmelse av proteiner fra DBS5. Til tross for denne tidlige introduksjonen var det først etter århundreskiftet at MS-bestemmelse av proteiner fra DBS og andre mikrosamplingsteknikker ble mer utbredt.
I klinisk sammenheng er det av interesse å påvise proteiner i diagnostikk og oppfølging av sykdommer, samt for behandlingsovervåking og dopingformål. Denne målrettede bestemmelsen av proteinanalytter ved MS fra små mengder tørkede prøver er fortsatt utfordrende, og krever ofte omfattende prøvepreparering før analyse.
Målrettet kvantitativ bestemmelse av proteiner ved MS utføres vanligvis ved å anvende bottom-up-tilnærmingen, fordøye proteinene til peptider før analyse. Denne prosedyren produserer et myriade av peptider, noe som gjør direkte analyse av den fordøyede biologiske prøven utfordrende. En måte å omgå dette på er å bruke et selektivt affinitetsoppryddingstrinn på forhånd av MS-analyse enten før eller etter fordøyelsen 6,7,8. På denne måten isoleres proteinet av interesse (eller dets proteotypiske peptid, hvis affinitetsfangsttrinnet utføres etter fordøyelsen) selektivt fra prøvematrisen før analyse, noe som gir lavere deteksjonsgrenser9.
Mikrosampling ved hjelp av DBS-kort har visse fordeler sammenlignet med konvensjonelle blodprøver, inkludert lavt prøvevolum, mindre invasiv prøvetaking og økt lagringsstabilitet. Prøvematrisen er imidlertid forskjellig og kan introdusere andre utfordringer i analysen (f.eks. tørket vs. væskeprøvematrise og kapillærblod vs. serum eller plasma)10,11. En annen utfordring som observeres med DBS er den såkalte hematokriteffekten, der blodhematokriten påvirker prøvevolumet som videre behandles for analyse, og dermed introduserer interindividuell variasjon i analysen12. Nyere mikroprøvetakingsenheter, som VAMS introdusert i 201413, løser dette problemet ved å samle et fast volum blod i stedet for en bloddråpe.
Denne protokollen beskriver et oppsett for analyse av biomarkører med lav overflod fra tørkede mikroprøver. Etter eluering fordøyes den tørkede prøven, og deretter isoleres det proteotypiske peptidet ved peptidaffinitetsfangst. Modellanalytten er SCLC-biomarkøren ProGRP. Siden ProGRP ikke kan bestemmes pålitelig fra fullblod, ble serum brukt som prøvematrise. Representative resultater fra både DSS og serumprøver tatt med VAMS er vist.
Protocol
Serum fra friske blodgivere ble brukt til fremstilling av standardløsninger. Bruk av serum fra friske blodgivere ble utført i henhold til norsk lov. Informert samtykke ble innhentet fra alle forsøkspersonene. Serumprøver ble analysert med metoder i henhold til relevante retningslinjer og forskrifter. Den beskrevne protokollen er en modifisert versjon av metoden beskrevet i tidligere arbeid14. En oversikt over sammensetningen av buffere og løsninger og hvordan de skal tilberedes, finnes i tilleggstabell S1, mens materialfortegnelsen inneholder materialer, utstyr og reagenser som brukes i denne protokollen.
1. Fremstilling av antistoffbelagte magnetiske perler
- Beregn mengden antistoff som er nødvendig for å forberede ønsket antall perler. Bruk 1 mg antistoff per 50 mg magnetiske perler.
MERK: Vanligvis brukes 20 μL av en 20 mg/ml perlesuspensjon per prøve i påfølgende eksperimenter (se trinn 5.1). - Beregn antistoffvolumet som er nødvendig for å forberede ønsket antall perler.
MERK: Antistoffvolumet er avhengig av antistoffkonsentrasjon og må beregnes for hvert antistoff. - Overfør ønsket volum antistoffoppløsning til et 5 ml mikrosentrifugerør med lav proteinbinding. Som et eksempel, hvis antistoffoppløsningen inneholder 1 mg / ml antistoff, bruk 0,4 ml for å forberede 1,0 ml perlesuspensjon (20 mg perler / ml med 1 mg antistoff / 50 mg perler).
MERK: Antistoffene skal være i en aminfri buffer. Bruk mikrosentrifugerør med lav proteinbinding for alle oppløsninger som inneholder proteiner for å unngå analytttap på grunn av adsorpsjon. - Legg til en liten magnetisk omrøringsstang til antistoffløsningen og juster pH til 2,5 under kontinuerlig omrøring. Bruk en pH-måler med en mikroelektrode for å måle pH og justere pH ved trinnvis tilsetning av definerte volumer på 1,0 M HCl (start med å legge til 10 μL deler av 1,0 M HCl og reduser volumet når pH nærmer seg 2,5). Registrer det totale volumet på 1,0 M HCl som er nødvendig for å justere pH til 2,5.
- Fjern mikroelektroden og inkuber det surgjorte antistoffet på is på en magnetomrører i 1 time.
MERK: Syrebehandling av antistoffet utføres for å fremme riktig orientering av antistoffene på perlen. Konsentrasjonen av HCl kan reduseres til 0,5 M eller 0,2 M HCl, avhengig av bufferkonsentrasjonen i antistoffoppløsningen. - Nøytraliser antistoffoppløsningen. Bruk en pH-måler med en mikroelektrode for å måle pH og juster pH til 7 ved trinnvis tilsetning av definerte volumer på 1,0 M NaOH (start med en del på 10 μL og reduser volumet når pH nærmer seg 7). Registrer det totale volumet på 1,0 M NaOH lagt til.
MERK: Konsentrasjonen av NaOH bør være den samme som HCl-konsentrasjonen som ble brukt i trinn 1.4. NaOH er svært etsende; Bruk verneutstyr, inkludert hansker og egnet øyevern. - Beregn ønsket volum av tosylaktiverte magnetiske perler som skal brukes.
MERK: Vanligvis anbefales det å bruke 20 mg perler/ml når du utfører småskalakobling. Minst 5 mg perler skal brukes. - Bland den magnetiske dråpesuspensjonen grundig på en hvirvelblander og trekk opp et volum som inneholder ønsket mengde dråpesuspensjon. For eksempel, for å klargjøre 1 ml perlesuspensjon, trekk opp et volum som inneholder 20 mg perler (667 μL hvis konsentrasjonen av perler er 30 mg/ml).
- Plasser perlesuspensjonen på et magnetstativ i 1 min og fjern supernatanten. Vask kulene 2x med samme volum Type 1H2O (667 μL hvis en 30 mg/ml perleoppløsning brukes til å tilberede 1 ml 20 mg/ml antistoffbelagte perler). Bland med en virvelblander etter hver tilsetning av vaskeoppløsning og sett på magnetstativet i 1 min før du fjerner supernatanten.
- Legg følgende til magnetkulene: syrebehandlet antistoff, 0,5 M boratbuffer (pH 9,5) (1/5 av totalvolumet da den endelige konsentrasjonen skal være 0,1 M; dette tilsvarer 0,2 ml for å forberede 1 ml perlesuspensjon), og koblingsbuffer for antistoffkobling (for å fremstille 1 ml antistoffbelagte magnetiske perler, bør volumet av koblingsbuffer være lik 1 ml - volum syrebehandlet antistoff - 0,2 ml boratbuffer). Bland med en virvelmikser.
MERK: Volumet av syrebehandlet antistoff er lik volumet av antistoffoppløsning (0,4 ml ved fremstilling av 1 ml perlesuspensjon ved bruk av en 1 mg/ml antistoffløsning) + volumet på 1,0 M HCl som brukes til å justere pH til 2,5 + volumet på 1,0 M NaOH som brukes til å justere pH til 7).
MERK: Sammensetningen av 0,5 M boratbuffer (pH 9,5) og koblingsbuffer for antistoffkobling finnes i tilleggstabell S1. - Roter ved omgivelsestemperatur over natten ved hjelp av en ende-over-ende prøvemikser, helst med gjensidig rotasjon og vibrasjon.
- Sentrifuge i 10 min ved 239 × g. Plasser røret på magneten i 2 min og fjern supernatanten.
- Vask kulene 2 x 2 timer og en gang over natten ved å rotere i lagringsbufferen for antistoffperler ved omgivelsestemperatur ved hjelp av en ende-over-ende prøveblander. Bruk samme volum som totalvolumet i trinn 1.10. Plasser slangen på magneten i 1 min og fjern supernatanten mellom hver vask.
MERK: Sammensetningen av lagringsbuffer for antistoffperler finnes i tilleggstabell S1. - Oppbevares i ønsket buffer (f.eks. samme buffer som i trinn 1,13) ved bruk av ønsket lagerkonsentrasjon av perler (typisk 20 mg/ml). Oppbevares i kjøleskapet.
2. Fremstilling av 2 ml trypsin immobiliserte perler (20 mg / ml perler)
- Tilsett 20 ml 1 mM HCl til 2 ml NHS-aktiverte agaroseperler for å vaske perlene.
- Bland og sentrifuger ved 2 655 × g i 5 minutter. Fjern supernatanten.
- Tilsett 20 ml 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,8). Bland med en virvelblander og sentrifuge ved 2 655 × g i 5 minutter. Fjern supernatanten.
MERK: Sammensetningen av 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,8) finnes i tilleggstabell S1. - Tilsett 2 ml 20 mg/ml trypsin (oppløst i kaldkoblingsbuffer for trypsinkobling).
MERK: Sammensetningen av koblingsbuffer for trypsinkobling finnes i tilleggstabell S1. Oppbevar bufferen i kjøleskapet. - Inkuber i 25 minutter ved 22 °C og 1 100 o/min ved hjelp av en temperaturkontrollert mikser. Sentrifuge ved 2 655 × g i 5 minutter. Fjern supernatanten.
- Tilsett 2 ml modifikasjonsbuffer for fremstilling av trypsinperler og inkuber i 20 minutter ved 22 ° C og 1,100 o / min ved hjelp av en temperaturkontrollert mikser. Sentrifuge ved 2 655 × g i 5 min. Fjern supernatanten.
MERK: Sammensetningen av modifikasjonsbufferen for fremstilling av trypsinperler finnes i tilleggstabell S1. Oppbevar bufferen i kjøleskapet. - Tilsett 10 ml blokkeringsbuffer for fremstilling av trypsinperler og inkuber i 10 minutter ved 22 ° C og 1,100 o / min ved hjelp av en temperaturkontrollert mikser. Sentrifuge ved 2 655 × g i 5 min. Fjern supernatanten.
MERK: Sammensetningen av blokkeringsbuffer for fremstilling av trypsinperler finnes i tilleggstabell S1. Oppbevar bufferen i kjøleskapet. - Tilsett 2 ml lagringsbuffer, bland med en hvirvelblander og oppbevar i kjøleskapet til bruk.
MERK: Sammensetningen av lagringsbuffer for trypsinperler finnes i tilleggstabell S1. Oppbevar bufferen i kjøleskapet.
3. DSS/VAMS prøvetaking og påfølgende ekstraksjon av tørket serum
- Forbered standarder ved å spike serumet med ProGRP (eller proteinet av interesse) på riktig nivå. Hold spikingvolumet ≤ 1% av totalvolumet.
MERK: Her ble en stamløsning på 295 μg / ml ProGRP i vann brukt til fremstilling av piggete serumstandarder. - Bland standardene på en virvelmikser.
- Påfør 10 μL serum (piggete standarder) på DBS-kort eller la 10 μL serum samles opp av VAMS (10 μL) ved hjelp av produsentens retningslinjer. For DSS, sørg for at stedet er innenfor den stiplede sirkelen.
- La lufttørke ved omgivelsestemperatur i minst 2 timer.
- Klipp ut hele stedet og overfør det til et 2 ml lavproteinbindende mikrosentrifugerør eller fjern VAMS fra holderen og plasser den i et 2 ml mikrosentrifugerør med lav proteinbinding.
- Tilsett 1000 μL 100 mM ammoniumbikarbonat (ABC) løsning. Trekk ut det tørkede serumet fra flekken/VAMS i 1 time ved 22 °C ved hjelp av en temperaturkontrollert mikser ved 1000 o / min.
- Overfør ekstraktet til et nytt 1,5 ml lavproteinbindende mikrosentrifugerør for tryptisk proteolyse.
4. Fordøyelse av DSS/VAMS ekstrakter
- Bruk 30 μL trypsinperler (som tilberedt i avsnitt 2) per prøve. Overfør et volum som inneholder trypsinperler for alle prøver til et nytt 1,5 ml lavproteinbindende mikrosentrifugerør, sentrifuge ved 2,655 × g i 5 minutter, og fjern supernatanten.
- Vask trypsinkulene 2x med 1 ml kald 50 mM ABC, før du resuspenderer i samme volum som ble pipettert ut. Sentrifuge ved 2 655 × g i 5 minutter og fjern supernatanten mellom trinnene.
- Tilsett 30 μL vasket trypsinperler til hvert DSS / VAMS ekstrakt for å starte fordøyelsen.
- Inkuber i 2 timer ved 37 °C og 1000 o/min ved hjelp av en temperaturkontrollert mikser eller lignende. Sentrifuge ved 2 655 × g i 5 minutter og overfør supernatanten (ikke perlene) til et nytt 2,0 ml mikrosentrifugerør med lav proteinbinding.
- Tilsett 25 μL 14 ng / ml intern standard (IS) oppløsning som inneholder det stabile isotopmerkede (SIL) peptidet ALGNQQPSWDSSNF [K_13C6_15N2] i 100 mM ABC-løsning.
5. Fangst av proteotypisk ProGRP-peptid ved bruk av antistoffbelagte magnetiske perler
- Bruk 20 mikrol antistoffbelagte perler (20 mg/ml som tilberedt i avsnitt 1) per ekstraksjon. Overfør alle antistoffbelagte perler til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør med lav proteinbinding, plasser på magneten i 1 min og fjern lagringsbufferen.
- Vask de magnetiske antistoffbelagte perlene med 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS), pH 7,4, inneholdende 0,05 % polysorbat 20, og 2 x 1 ml PBS før resuspendering i samme volum som ble pipettert ut. Bland på en virvelblander og sett på magneten i 1 min mellom bufferutvekslingene.
MERK: PBS inneholder 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mMNa2 HPO 4 og 1,8 mM KH2PO4. Det anbefales å klargjøre løsningen ved en 10x konsentrasjon for økt stabilitet. For sammensetningen av 100 ml 10x PBS, se tilleggstabell S1. Fortynning av 10x PBS 10x vil oppnå en pH på ~ 7,4. - Tilsett 20 μL vasket magnetisk perlesuspensjon til hvert lavproteinbindende mikrosentrifugerør som inneholder et fordøyd DSS / VAMS-ekstrakt og IS. Utfør immunekstraksjon i 1 time ved hjelp av en ende-over-ende-prøveblander ved omgivelsestemperatur.
- Vask magnetkulene med følgende løsninger: 500 μL PBS med 0,05% (v / v) polysorbat 20, 400 μL PBS, 300 μL 10 mM Tris HCl (pH 7,4) og 300 μL 100 mM ABC.
- Etter tilsetning av hver vaskeoppløsning, fjern det lavproteinbindende mikrosentrifugerøret med perler og vaskeoppløsning fra magnetstativet og snu forsiktig til homogent. Plasser deretter det lavproteinbindende mikrosentrifugerøret på magneten i 30 s, inverter i 30 s og sett på magneten i 1 min. Fjern vaskeoppløsningen.
- Spinn ned den gjenværende suspensjonen ved hjelp av en mikrosentrifuge. Plasser på magneten i 1 min og fjern den gjenværende vaskeoppløsningen.
- Tilsett 15 μL 2% (v / v) maursyre i type 1 H2O til hver prøve og inkuber i 5 minutter ved 22 ° C og 1000 o / min ved hjelp av en temperaturkontrollert mikser eller lignende for å eluere de fangede peptidene. Plasser på magneten i 1 min og overfør eluatet til et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør med lav proteinbinding. Gjenta én gang og overfør det andre eluatet til det samme lavproteinbindende mikrosentrifugerøret som det første eluatet.
- Tilsett 20 μL 100 mM ABC til hvert eluat (totalvolum på 50 μL).
- Sentrifuge (mikrosentrifuge) og overføre 40 μL av eluatet til mikroinnsatser for høyytelses væskekromatografi (HPLC) hetteglass.
6. Analyse ved LC-MS/MS
- Bruk en micro LC trippel quadrupole MS med elektrosprayionisering for høy robusthet.
- Klargjør LC-MS/MS-systemet for analysen ved å rense pumpene med mobil fase A (20 mM FA i H 2 O og MeCN,95: 5 v / v) og B (20 mM FA i H2O og MeCN, 5: 95 v / v).
- Sett inn analysekolonnen (C18, 50 mm x 1 mm indre diameter [ID], 3 μm partikler).
- Fortsett å klargjøre instrumentet for analyse ved å følge oppstartsprosedyrene for det spesifikke instrumentet.
- I instrumentprogramvaren setter du søyleovnstemperaturen til 25 °C og strømningshastigheten til 50 μL/min (100 % mobil fase A).
- Balansere kolonnen med mobil fase A i minst 15 minutter.
- Plasser prøvene i den automatiske prøvetakeren.
- Klargjøre instrumentmetoden for analyse av det ProGRP-spesifikke, tryptiske peptidet ALGNQQPSWDSEDSSNFK og dets IS.
MERK: Flere metodeparametere er instrumentspesifikke og må optimaliseres på det spesifikke instrumentet som brukes. Detaljer om metodeparametrene som brukes her, er beskrevet i trinn 6.9 til 6.11. - For gradientprogrammet i LC, bruk følgende innstillinger: strømningshastighet: 50 μL / min; fra tid 0,0 til 3,0 min: 100% mobil fase A; fra tid 3,0 til 18,0 min: kjør en lineær gradient fra 0% til 50% mobil fase B; fra tid 18,0 til 18,1 min: øke mobilfase B fra 50% til 100%; fra tid 18,1 til 20,0 min: 100% mobil fase B; fra tid 20,0 til 20,1 min: reduser mobilfase B fra 100% til 0%; fra tid 20,1 til 30 min: 100 % mobil fase A for å balansere kolonnen på nytt (bruk minst 10 kolonnevolumer).
- For MS/MS-innstillinger, kjør MS/MS i positiv modus ved hjelp av instrumentinnstillinger som sikrer effektiv ionisering. For å følge denne protokollen, bruk en sprøytespenning på +4,000 V, en oppvarmet kapillærtemperatur på 270 ° C, nitrogen som arkgass (5 vilkårlige enheter) og argon (2 mTorr) for kollisjonsindusert dissosiasjon (CID) fragmentering. Hvis instrumentet tillater det, diriger LC-strømmen til å kaste bort de første 2 min (0-2 min) og de siste 1 min (29-30 min) av løpet, i stedet for inn i MS.
- Bruk utvalgte reaksjonsmonitoreringsoverganger (SRM) for (A) signaturpeptidet (ALGNQQPSWDSEDSSNFK): 1 005,45→913,3, 1 005,45→1 028,3 og 1 005,45→1 398,5 og (B) IS SIL-peptidet (ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15N2]): 1 009,45→921,3, 1 009,45→1 036,3 og 1 009,45→1 406,5. Bruk optimalisert kollisjonsenergi (35 V i denne protokollen) for alle overvåkede overganger.
- Forbered en sekvens som inneholder prøvene som skal kjøres ved hjelp av programvaren som er tilgjengelig for LC-MS / MS-systemet. Sett injeksjonsvolumet til 10 μL.
MERK: Sørg for å legge til tomme prøver og kvalitetskontrollprøver etter behov. - Trykk på "Run sequence" i instrumentprogramvaren for å starte sekvensen.
- Overvåk toppområdet av affinitetsfanget, ProGRP-spesifikt, tryptisk peptid ALGNQQPSWDSEDSSNFK og dets IS SIL-peptid.
MERK: Valg og bekreftelse av signaturpeptidet, ALGNQQPSWDSEDSSNFK, er beskrevet andre steder14.
Representative Results
En oversikt over den analytiske arbeidsflyten ved hjelp av både DSS-prøvetaking og VAMS er vist i figur 1. Bortsett fra forskjellene i prøvetakingsmetode, er prosedyrene identiske. Bilder av serumprøven med de to prøvetakingsmetodene kan ses i figur 2.
Begge prøvetakingsformene (VAMS og DSS) er egnet for prøvetaking av ProGRP-holdig serum. Dette fremgår av figur 3 hvor MS-kromatogrammer av det proteotypiske peptidet og IS SIL-peptidet fra DSS- og VAMS-prøvetaking er vist. I tillegg er MS-kromatogrammet etter analyse av en kontrollprøve bestående av 10 μL pigget flytende serumprøve behandlet på samme måte som de tørkede prøvene inkludert. Sistnevnte ble fortynnet i samme volum som volumet av DSS / VAMS ekstraksjonsløsning, utsatt for fordøyelse ved hjelp av trypsinperler og renset opp ved hjelp av peptidaffinitetsfangst.
Ved sammenligning av VAMS- og DSS-prøvetaking (figur 4) gir VAMS et høyere proteotypisk peptid/IS-arealforhold enn DSS. Dette indikerer at det kan være tap av målproteinet ProGRP til papiret som brukes til DSS (ren cellulose). Ved sammenligning med en kontrollprøve, der serumet ikke tørkes før videre prosessering og analyse (figur 4), er det vist at VAMS gir tilsvarende arealforhold som kontrollprøven (tosidig t-test, s≤ 0,65), noe som indikerer at det ikke er tap av prøvetakingsmaterialet, mens DSS gir et signifikant lavere arealforhold (tosidig t-test, s≤ 0,005), noe som indikerer tap av prøvetakingsmaterialet.
En kort evaluering ble utført med VAMS. Linearitet ble vist fra 10 til 1000 ng/ml (R2 = 0,9996), med en deteksjonsgrense (LOD, S/N = 3) på 6,7 ng/ml. LOD anses som tilfredsstillende da analysen ble utført på en ganske gammel trippel kvadrupol (2008) med en 1 mm ID-kolonne. Repeterbarheten av alle nivåer med S/N > 10 ble også vurdert som tilfredsstillende med RSD mellom 7 % og 17 % (n = 3), ved bruk av IS-korreksjon.
Affinitetsfangst kan utføres både før og etter fordøyelsestrinnet ved enten å fange proteinet av interesse eller dets proteotypiske peptid. Den nåværende prosedyren beskriver registrering av peptidaffinitet. En fordel med denne tilnærmingen sammenlignet med proteinfangst er at bare peptidet av interesse fanges opp, og en enda mer effektiv prøveopprydding oppnås. Dette er illustrert i figur 5, og viser et mer komplekst full scan kromatogram med mer støy etter proteinfangst sammenlignet etter peptidfangst. Prøvene analysert i figur 5 er ikke samplet ved hjelp av DSS-prøvetaking eller VAMS; Serum er imidlertid også prøvematrisen, og affinitetsfangst utføres ved bruk av det samme antistoffet som brukes til peptidfangst i den beskrevne prosedyren.
Figur 1: Oversikt over den analytiske arbeidsflyten ved hjelp av både DSS- og VAMS-prøvetaking. Forkortelser: DSS = tørket serumflekk; VAMS = volumetrisk absorberende mikroprøvetaking; LC-MS/MS = væskekromatografi-tandemmassespektrometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bilder av serum samplet med ulike metoder . (A) DBS cellulosekort og (B) VAMS. Forkortelser: DBS = tørket blodflekk; VAMS = volumetrisk absorberende mikrosampling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative MS-kromatogrammer av det proteotypiske peptidet og IS SIL-peptidet etter DSS- og VAMS-prøvetaking, samt for en pigget serumprøve tilsatt direkte i ekstraksjonsløsningen. MS-kromatogrammene viser 10 μL serumprøver tilsatt 1,5 μg/ml ProGRP og påført (A) VAMS, (B) celluloseprøvetakingskortet (for DSS), eller (C) direkte på ekstraksjonsbufferen (kontrollprøven). Tjuefem mikroliter 14 ng / ml er SIL-peptid tilsatt til alle prøver før peptidaffinitetsfangst. Forkortelser: DSS = tørket serumflekk; VAMS = volumetrisk absorberende mikroprøvetaking; MS = massespektrometri; ProGRP = progastrinfrigjørende peptid; IS = intern standard; SIL = stabil isotop-merket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative resultater av ALGNQQPSWDSEDSSNFK/IS-arealforholdet for serumprøver tilsatt ProGRP og påført (10 μL) til VAMS, DSS, eller direkte på ekstraksjonsløsning (kontrollprøve). Konsentrasjonen av ProGRP er 1,5 μg/ml, n = 4 for hver tilstand; 25 μL av 14 ng / ml SIL-peptid tilsettes alle prøver før peptidaffinitetsfangst. *indikerer at arealforholdet er signifikant forskjellig fra prøver brukt på VAMS (tosidig t-test, s≤ 0,005). Feilfelt er ± standardavvik. Forkortelser: DSS = tørket serumflekk; VAMS = volumetrisk absorberende mikroprøvetaking; ProGRP = progastrinfrigjørende peptid; IS = intern standard; SIL = stabil isotop-merket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sammenligning av basetoppkromatogrammer (full scan Orbitrap-analyse) etter intakt proteinekstraksjon (blå) og proteotypisk epitoppeptidekstraksjon (rød). Ekstraherte ionekromatogrammer av det proteotypiske epitoppeptidet (ALGNQQPSWDSEDSSNFK, m/z 1005.45) er vist til høyre. Serum tilsatt 150 ng ml−1 ProGRP ble brukt som prøve. Denne figuren er gjengitt fra Levernæs m.fl.14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstabell S1: En oversikt over sammensetningen av buffere og løsninger og hvordan disse skal klargjøres. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Den beskrevne protokollen inneholder informasjon om hvordan man utfører flere viktige trinn i analysen av biomarkører med lav overflod fra tørkede mikroprøver (DSS og VAMS), inkludert fremstilling av trypsinperler og antistoffbelagte magnetiske perler. Basert på tidligere erfaring behandler vi alltid antistoffet med syre før perlimmobilisering for å forbedre orienteringen av antistoffene15.
Et av de kritiske trinnene i denne prosedyren er valget av det mest passende mikrosamplingsformatet. Først må man vurdere om den aktuelle analytten kan bestemmes fra fullblod, eller om konsentrasjonen påvirkes av blodcellene og må bestemmes i serum eller plasma (som for modellanalytten, ProGRP).
Både papir- og polymerbaserte tilnærminger har fordeler og begrensninger; For ProGRP gir VAMS en klar fordel med hensyn til analyttgjenvinning etter ekstraksjon fra prøvetakeren. Dette kan imidlertid sannsynligvis optimaliseres ved hjelp av en annen ekstraksjonsløsning for DSS-prøvene. Dette potensielle samspillet mellom analytten og prøvetakingsmaterialet er likevel viktig å ta hensyn til, da det kan føre til økt analytisk variasjon og høyere deteksjonsgrenser. Siden IS brukes er et SIL-peptid og først tilsettes etter fordøyelsen, korrigerer IS for trinnene etter fordøyelsen (f.eks. affinitetsekstraksjon og LC-MS/MS-analyse). IS-korreksjon er ikke mulig for ekstraksjon fra DSS/VAMS og fordøyelsestrinnet.
To typer perler brukes i prosedyren: trypsinperler for fordøyelsen etter ekstraksjon av serumprøven fra prøvetakeren, og antistoffbelagte magnetiske perler for fangst av det proteotypiske peptidet etter fordøyelsen. En viktig grunn til å bruke trypsinperler, i tillegg til å øke fordøyelsen, er å minimere gjenværende trypsinaktivitet i prøven under affinitetsfangst. Dette er viktig for å unngå tryptisk proteolyse av mAb under affinitetsfangst.
Agaroseperler ble brukt til fremstilling av trypsinperlene, mens magnetiske perler ble brukt til fremstilling av antistoffbelagte perler. Agaroseperler er rimeligere enn magnetiske perler, men har en begrensning om at separasjon av perlene fra løsningen krever sentrifugering. Dette gjør separasjonen av perler og supernatant mindre effektiv enn ved bruk av magnetiske perler. I tillegg er automatisering av arbeidsflyten vanskelig ved bruk av agaroseperler. Imidlertid er magnetiske NHS-aktiverte perler tilgjengelige og kan brukes til en mer strømlinjeformet og automatisert arbeidsflyt for prøvepreparering.
Mikrosampling er en viktig trend i bioanalysen av både legemidler og biomarkører. En utfordring med dagens tilnærming er den begrensede mengden prøvevolum (10 μL), noe som kan være spesielt viktig ved bestemmelse av svært lav mengdeanalytter som ProGRP (pg/ml-lavt ng/ml-nivå). Denne utfordringen kan imidlertid omgås ved hjelp av toppmoderne analyseutstyr. For disse analyttene med lav overflod er valg av prøvepreparering avgjørende, og selektiv prøveopprydding gjennom antistoffbasert affinitetsfangst er oftest nødvendig. Siden peptidfangst har vist seg å gi renere ekstrakter og lavere deteksjonsgrenser enn proteinfangst (ved bruk av samme antistoff)14, fokuserer den nåværende metoden på denne tilnærmingen i kombinasjon med mikrosampling. En annen fordel med peptidfangstmetoden er at IS SIL-peptidet også korrigerer for affinitetsfangsttrinnet.
I dette arbeidet ble et antistoff rettet mot et protein brukt til peptidfangst. Dette er en fordel da tilgjengeligheten av hyllevare antistoffer rettet mot proteiner er høyere enn hyllevare antistoffer rettet mot proteotypiske peptider. For at et antiproteinantistoff effektivt skal fange et proteotypisk peptid, må imidlertid epitopen være intakt etter proteinfordøyelse. I tillegg, for mange antistoffer, er den eksakte epitopen ikke kjent, noe som gjør søket etter et anti-protein antistoff kjedelig. Dette begrenser antall tilgjengelige antiproteinantistoffer som gjelder for peptidfangst. Den beskrevne prosedyren er demonstrert ved bruk av serum som matrise og ProGRP som målanalytt. Prosedyren er ment å kunne brukes på andre matriser og andre målanalytter. I stedet for å bruke et kommersielt tilgjengelig antiproteinantistoff for affinitetsfangst av det proteotypiske peptidet, er det mulig å også bruke skreddersydde, anti-peptidantistoffer. Oppryddingseffektiviteten av peptidfangst sammenlignet med proteinfangst er illustrert i figur 5. Ved å bytte ut agaroseperlene som brukes til fremstilling av trypsinperler med magnetiske perler, bør prosedyren også være kompatibel med arbeidsstasjoner for robotprøvepreparering på markedet.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Vi anerkjenner Prof. Elisabeth Paus ved Radiumhospitalet (Oslo universitetssykehus, Oslo, Norge) for å ha levert ProGRP-standarden og anti-ProGRP monoklonalt antistoff, M18. Publiseringsavgiften ble dekket av et stipend fra apoteker Harald Conrad Thaulows legat. Trine Grønhaug Halvorsen og Léon Reubsaet er partnere i konsortiet National Network of Advanced Proteomics Infrastructure (NAPI), som er finansiert av Norges forskningsråds INFRASTRUKTUR-program (prosjektnummer: 295910).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid N-hydroxysuccinimide ester | Carbosynt (Staad, Switzerland) | FA33719 | Store in freezer below -20 °C |
| ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (≥ 95%) |
Innovagen (Lund, Sweden) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Ammonium bicarbonate BioUltra (≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 09830-500G | |
| Aquasil C18 column, 3 µm, 50 mm x 1 mm | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | 77503-051030 | Analytical column compatible with 100% aqueous mobile phase |
| Benzamidine (≥ 95.0% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 12072 | Store in fridge at 2-6 °C |
| Calsium chloride dihydrate (≥ 99% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 223506-500G | |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 5804000010 | |
| Cloned ProGRP isoform 1 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Disodium hydrogenphosphate dihydrate (pro analysis) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 30435-500G | |
| Disodium hydrogenphosphate dodecahydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06579.0500 | |
| Dynabeads M-280 tosylactivated 10 mL | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 14204 | Store in fridge at 2-6 °C |
| DynaMag-2 | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 123-21D | |
| Ethanolamine (pro analysis, ≥ 99%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | #02400 | |
| Formic acid (≥ 99% ) for LC-MS | VWR International (Radnor, PA, USA) | 84865.260 | |
| FTA DMPK-C cellulose card | Whatman (Kent, UK) | WB129243 | DBS card |
| HPLC vials, clear glass, 1.5 mL, 32 x 11.6 mm, Clean Pack | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 11 09 0519 | |
| Hulamixer sample mixer | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 101561503016 | Sample mixer with end-over-end mixing and reciprocal rotation and vibration |
| Human serum from healty blood donors | Bloodbank, Ullevål, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Hydrochloric acid fuming 37% (Emsure for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00317.1000 | |
| LC-MS/MS system: Ultimate 3000 system (Autosampler, WPS-3000TRS; Micropump, LPG-3400M; Flow manager, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) and TSQ Quantum access. Controlled by Xcalibur 2.2 SP1.48 | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | Not applicable | |
| LiChrosolv Acetonitrile hypergrade for LC-MS | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00029.2500 | |
| LL Biotrode, Combined glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0224.100 | |
| Magnetic stirrer, Type M10 | Franz Morat KG (Eisenbach, Germany) | 10236 | |
| Micro inserts, glass (31 x 6 mm, 0.1 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 548-0006 | |
| MilliQ integral 3 with Q-POD | Merck Millipore (Molsheim, France) | ZRXQ003T0 | For production of Type 1 water |
| monoclonal antibody M18 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in fridge at 2-6 °C |
| Neoteryx Mitra microsampler (10 μL) 4 sampler Clamshell | Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | NC1382947 | |
| NHS-activated sepharose beads 4 fast flow | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | GE17-0906-01 | Agarose beads, store in fridge at 2-6 °C |
| Optifit, Refill pipet tips, 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 613-2911 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 10 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790012 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 1,000 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 791002 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 200 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790202 | |
| pH glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0233.100 | |
| pH meter 744 | Metrohm (Herisau, Sveits) | 8.744.1003 | |
| Pipet 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725090 | |
| Pipet m10 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725020 | |
| Pipet m100 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725050 | |
| Pipet m1,000 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725070 | |
| Pipet m20 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725030 | |
| Potassium chloride (KCl ≥ 99.9%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P-3911 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.04873.0250 | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 0.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0133 (0030 108.094) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0132 (0030 108.116) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 2.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0134 (0030 108.450) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 5.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0792 (0030108.302) | |
| Scissors | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | Z186716-1EA | |
| Sodium azide (BioUltra; ≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 71289-5G | |
| Sodium chloride (for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06404.1000 | |
| Sodium dihydrogenphosphate monohydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06346.0500 | |
| Sodium hydroxide (AnalaR NORMAPUR) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 28244.295 | |
| Sodium tetraborate decahydrate (≥ 99. %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | S9640-500G | |
| Spectrafuge Mini Centrifuge | LABNET International (Edison, NJ, USA) | C1301 | |
| Stirring magnet, 25 mm x 6 mm Ø, circular | Leybold (Cologne, Germany) | 666 851 | |
| Stuart Scientific SA8 vortex mixer | Stuart (Staffordshire, UK) | Z648531-1EA | |
| SuperClear centrifuge tubes (15 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0150 | |
| SuperClear centrifuge tubes (50 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0155 | |
| Thermomixer comfort 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 53,55,27,831 | Temperature controlled mixer |
| Trizma base (reagent grade, ≥ 99.0 %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T6066 | Tris(hydroxymethyl)aminometan (tris) |
| Trizma HCl (reagent grade, ≥ 99.0%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T3253-100G | Tris(hydroxymethyl)aminometan HCl (tris HCl) |
| Trypsin (TCPK-treated from bovine pancreas, 10,000-15,000 BAEE units/mg Protein) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T8802 | Store in freezer below -20 °C |
| Tween 20 | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P7949-500ML | polysorbate 20 |
| Tweezers | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | TEM-78511-27 | |
| Vial caps, white, 9 mm | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 09 15 0981 | |
| Mitra microsampler with VAMS (Volumetric adsorptive microsampling) technology, 10 µL, 4-sampler clamshell | Neoteryx (Torrance, CA, USA) |
References
- Bang, I. B.
- Guthrie, R., Susi, A. A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. Pediatrics. 32 (3), 338-343 (1963).
- Laurell, C. B. A screening test for α1-antitrypsin deficiency. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 29 (3), 247-248 (1972).
- Thielmann, K., Aquino, A. M. Whole blood samples dried and stored on filter paper as substrate for the electrophoretic separation on hemoglobin S from hemoglobin A. A screening procedure. Clinica Chimica Acta. 35 (1), 237-238 (1971).
- Wada, Y., Fujita, T., Kidoguchi, K., Hayashi, A. Fetal hemoglobin variants in 80,000 Japanese neonates: High prevalence of Hb F Yamaguchi (AγT 80 Asp→Asn). Human Genetics. 72 (3), 196-202 (1986).
- Halvorsen, T. G., McKitterick, N., Kish, M., Reubsaet, L. Affinity capture in bottom-up protein analysis-overview of current status of proteolytic peptide capture using antibodies and molecularly imprinted polymers. Analytica Chimica Acta. 1182, 338714 (2021).
- Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Antibody based affinity capture LC-MS/MS in quantitative determination of proteins in biological matrices. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 95, Supplement C 132-139 (2017).
- Neubert, H., et al. Protein biomarker quantification by immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Current state and future vision. Clinical Chemistry. 66 (2), 282-301 (2020).
- Pan, S., et al. Mass spectrometry based targeted protein quantification: methods and applications. Journal of Proteome Research. 8 (2), 787-797 (2008).
- Enderle, Y., Foerster, K., Burhenne, J. Clinical feasibility of dried blood spots: Analytics, validation, and applications. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 130, 231-243 (2016).
- Londhe, V., Rajadhyaksha, M. Opportunities and obstacles for microsampling techniques in bioanalysis: Special focus on DBS and VAMS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 182, 113102 (2020).
- Denniff, P., Spooner, N. The effect of hematocrit on assay bias when using dbs samples for the quantitative bioanalysis of drugs. Bioanalysis. 2 (8), 1385-1395 (2010).
- Denniff, P., Spooner, N. Volumetric absorptive microsampling: A dried sample collection technique for quantitative bioanalysis. Analytical Chemistry. 86 (16), 8489-8495 (2014).
- Levernæs, M. C. S., et al. Immunocapture sample clean-up in determination of low abundant protein biomarkers-a feasibility study of peptide capture by anti-protein antibodies. RSC Advances. 9 (60), 34902-34911 (2019).
- Conradie, J. D., Govender, M., Visser, L. Elisa solid phase: Partial denaturation of coating antibody yields a more efficient solid phase. Journal of Immunological Methods. 59 (3), 289-299 (1983).
