Summary
En protokoll for sensitiv og kvantitativ påvisning av topoisomerase 1-aktivitet ved bruk av den rullende sirkelen forbedret enzymaktivitetsdeteksjonsanalyse er beskrevet. Metoden tillater påvisning av topoisomerase 1-aktivitet fra rensede komponenter eller celle-/vevsekstrakter. Denne protokollen har omfattende applikasjoner i alle felt som involverer påvisning av enzymatisk aktivitet.
Abstract
Isotermiske forsterkningsbaserte teknikker som rullesirkelforsterkning har blitt brukt med hell for påvisning av nukleinsyrer, proteinmengder eller andre relevante molekyler. Disse metodene har vist seg å være betydelige alternativer til PCR eller ELISA for kliniske og forskningsapplikasjoner. Videre er påvisning av proteinmengde (ved Western blot eller immunhistokjemi) ofte utilstrekkelig til å gi informasjon for kreftdiagnose, mens måling av enzymaktivitet representerer en verdifull biomarkør. Måling av enzymaktivitet muliggjør også diagnose og potensiell behandling av patogenbårne sykdommer. I alle eukaryoter er topoisomeraser de viktigste DNA-bindende enzymene som er involvert i kontrollen av DNA-topologisk tilstand under viktige cellulære prosesser og er blant de viktige biomarkørene for kreftprognose og behandling.
Gjennom årene har topoisomeraser blitt vesentlig undersøkt som et potensielt mål for antiparasittiske og anticancer medisiner med biblioteker av naturlige og syntetiske småmolekylære forbindelser som undersøkes hvert år. Her presenteres den rullende sirkelforsterkningsmetoden, kalt rolling circle enhanced enzyme activity detection (REEAD) assay som muliggjør kvantitativ måling av topoisomerase 1 (TOP1) aktivitet på en enkel, rask og gelfri måte. Ved å spalte og ligere et spesialdesignet DNA-substrat, konverterer TOP1 et DNA-oligonukleotid til en lukket sirkel, som blir malen for rullende sirkelforsterkning, noe som gir ~ 103 tandem gjenta rullende sirkelprodukter. Avhengig av nukleotidinkorporeringen under forsterkningen, er det mulighet for forskjellige avlesningsmetoder, fra fluorescens til kjemiluminescens til kolorimetrisk. Siden hver TOP1-mediert spaltningsligering genererer en lukket DNA-sirkel, er analysen svært følsom og direkte kvantitativ.
Introduction
Topoisomeraser tilhører klassen av DNA-modifiserende enzymer, og mange av disse har vist seg nyttige som biomarkører for menneskelige sykdommer 1,2,3,4,5,6. TOP1 er involvert i å løse det topologiske stresset forbundet med cellulære prosesser som DNA-replikasjon, gentranskripsjon, rekombinasjon og kromosomal segregering7. TOP1 kan løse både negative og positive superspoler ved en mekanisme som innebærer dannelse av et forbigående enkeltstrenget brudd i DNA 8,9. Etter binding til DNA posisjonerer TOP1 det aktive stedet tyrosin (Tyr723) for å utføre et nukleofilt angrep på fosfodiesterryggraden. Et TOP1-DNA-spaltningskompleks genereres deretter med enzymet kovalent festet til 3'-enden av den ødelagte DNA-strengen. Dette frigjør vridningsspenning ved å la 5'-enden av den spaltede strengen dreie seg om den intakte strengen. Til slutt utfører hydroksylgruppen i 5'-enden et nukleofilt angrep på 3'-fosfotyrosylbindingen. Som et resultat frigjøres TOP1, og DNA-ryggraden gjenopprettes8.
Flere analyser er utviklet for å undersøke trinnene i TOP1-katalytisk syklus, inkludert avslapningsanalysen10, elektroforetisk mobilitetsskiftanalyse (EMSA) 11,12, DNA-selvmordsspaltningsligeringsanalyser 13,14 og in vivo-komplekset av enzymer (ICE) analyse 15 . Imidlertid har disse analysene flere begrensninger da de er avhengige av gelelektroforese, som krever DNA-interkalerende midler, eller de krever høyt spesialisert opplæring og utstyr. Videre krever analysene store mengder renset TOP1-enzym (fra 1 til 5 ng for avslapningsanalysen og 50 til 200 ng for EMSA og spaltningsligeringsanalysen) eller ekstrakter fra minst 106 celler for å fungere optimalt. Derfor erdet utviklet en svært sensitiv metode som muliggjør spesifikk deteksjon av TOP1-aktivitet i rå biologiske prøver og på enkeltkatalytisk hendelsesnivå, kalt REEAD-analysen.
Her presenteres en protokoll for påvisning av TOP1-aktivitet ved bruk av REEAD-analysen16 . En skjematisk fremstilling av analysen er avbildet i figur 1. Et spesialdesignet silikongitter er festet til et funksjonalisert lysbilde for å lage et glass-lysbilde multiwell oppsett, kalt wellmaker i det følgende (figur 1A). Dette etterfølges av kobling av en 5'-aminomodifisert primer til de funksjonelle NHS-gruppene i brønnene i lysbildet (figur 1B). TOP1-mediert spaltnings- og ligeringsreaksjon konverterer et spesifikt DNA-substrat til en lukket sirkel. Det TOP1-spesifikke substratet (figur 1C) brettes spontant inn i en manualform som inneholder en dobbeltstrenget stamme og to enkeltstrengede løkker. En av løkkene er komplementær til den overflateforankrede primeren. Stammeområdet inneholder et favorisert TOP1-spaltningssted tre baser oppstrøms fra 3'-enden og et 5'-hydroksyloverheng. Sirkulærisering av substratet kan oppnås ved bruk av enten celle/vevekstrakt (figur 1C) eller rekombinant, renset TOP1 (figur 1D).
Når substratet spaltes av TOP1, blir enzymet forbigående bundet til 3'-enden og trebasefragmentet diffunderer, slik at 5'-overhenget blir anneal til substratet og letter TOP1-mediert ligering. Ligeringen resulterer i sirkulærisering av substratet og deretter dissosiasjon av TOP1. Den lukkede sirkelen hybridiseres til den overflateforankrede primeren (figur 1E) og brukes som en mal for isotermisk rullende sirkelforsterkning (RCA) mediert av phi29-polymerasen, som kan utføre RCA med strengforskyvning, noe som gir 103 tandemrepetisjonsprodukter. Under RCA-trinnet kan fluorescerende merkede (figur 1F) eller biotinkoblede (figur 1G) nukleotider inkorporeres17. Inkorporering av fluorescerende merkede nukleotider muliggjør deteksjon av RCP-ene enten ved hjelp av et fluorescensmikroskop eller en fluorescensskanner. Alternativt kan et pepperrotperoksidase (HRP)-koblet antibiotinantistoff (figur 1H) binde de biotinylerte nukleotidene, og dermed muliggjøre påvisning av valsede sirkelprodukter (RCP) ved bruk av enten forbedret kjemiluminescens (ECL) eller ved omdannelse av 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) til en detekterbar farge. RCA følger en lineær reaksjonskinetikk, noe som gjør REEAD-analysen direkte kvantitativ, da en RCP representerer en enkelt TOP1-mediert spaltningsligeringsreaksjon. Her er det vist at denne analysen kan brukes til å oppdage TOP1-aktivitet som et renset rekombinant enzym eller ekstrahert fra råprøver og som et anti-TOP1-legemiddelscreeningverktøy.
Protocol
MERK: Finn en liste over buffersammensetninger, utstyr og andre materialer som kreves i Materialfortegnelse.
1. Cellekultur
- Dyrk de foretrukne cellene i egnet medium og dyrk dem i henhold til instruksjonene. Som et eksempel vokser Caco2, kolorektale adenokarsinomavledede celler, i Minimal Essential Medium (MEM) supplert med 20% føtalt bovint serum (FBS), 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 100 enheter / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin. Oppretthold cellekulturene i en fuktet inkubator (5% CO2/95% luftatmosfære ved 37 ° C). Plate cellene i vevskultur kolber og delt hver 3. dag for å opprettholde cellene ved 70% sammenheng.
- Høst cellene fra en 70% sammenflytende kolbe ved trypsinbehandling (0,25% trypsin, 0,02% EDTA-løsning) og vask med fosfatbufret saltvann (PBS).
- Resuspend cellepelleten i PBS for å justere cellekonsentrasjonen til 0,5 × 106 celler / rør. Spinn med 200 × g i 5 minutter og aspirer supernatanten forsiktig.
MERK: Celler som brukes til REEAD må brukes friske og oppbevares på is. Resultatene oppnådd med Caco2-celler er nylig publisert17. Analysen har blitt testet med en rekke cellelinjer, inkludert kolon, bryst, lunge og livmorhalskreft avledet celler 18,19,20,21,22,23, men den kan brukes med alle rå biologiske prøver som inneholder TOP1, for eksempel vev, blod og spytt.
2. Utarbeidelse av funksjonaliserte lysbilder
- Fest det spesialdesignede silikonisolatorgitteret til det funksjonaliserte lysbildet, og gjør dermed brønnmaskinen. Trykk på silikonet for å unngå dannelse av luftbobler (se figur 1A).
- Forbered en blanding av 5 μM 5'-aminoprimer i 1x utskriftsbuffer. Tilsett 4 μL av blandingen i hver brønn og sett brønnamkeren i et hybridiseringskammer med mettet NaCl ved temperaturer mellom 15 °C og 25 °C, beskyttet mot lys.
MERK: Et hybridiseringskammer kan enkelt lages ved å bruke en pipettespissboks fylt med mettet NaCl. Hybridiseringen tar minst 16 timer og maksimalt 72 timer. Se sekvensen av 5'-aminoprimeren i figur 1B. Lysbildene er funksjonalisert med NHS-grupper for å tillate binding av amino-modifiserte oligonukleotider.
3. Generering av lukkede sirkulære underlag
- Fremstilling av lukkede sirkulære substrater med rekombinant TOP1 eller celleekstrakt.
- Lyse en cellepellets på 0,5 × 106 celler i 500 μL lysisbuffer for å nå en celletetthet på 1000 celler / μL. Inkuber i 10 minutter på is.
- Forbered en sirkelblanding av 2 μL av 5 μM TOP1-spesifikt substrat (sekvensen av substratet er som følger: 5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3') og 2 μL rekombinant TOP1 enzym eller 2 μL celleekstrakt (se trinn 3.1.1) i 16 μL på 1x TOP1 reaksjonsbuffer.
MERK: Konsentrasjonen av rekombinant TOP1 som brukes, avhenger av den valgte avlesningsmetoden (se figur 2, figur 3, figur 4 og figur 5). Se sekvensen av det TOP1-spesifikke substratet i figur 1C. - Inkuber i 30 minutter ved 37 °C (se figur 1C,D).
- Stopp reaksjonen ved å tilsette 2 μL av 1% SDS.
- Fremstilling av lukkede sirkulære substrater i nærvær av legemidler
- Forbered en sirkelblanding av 2 μL av 5 μM TOP1-spesifikt substrat og 1 μL 100% DMSO eller 1 μL 1,6 mM camptothecin (CPT) i 14 μL 1x TOP1 reaksjonsbuffer. Tilsett 2 μL 5 ng / μL rekombinant TOP1 enzym.
MERK: Andre små molekylforbindelser eller legemidler kan brukes. I så fall bør en titrering av forbindelsen gjøres. Hvis forbindelsen oppløses i et annet løsningsmiddel enn DMSO, bør dette brukes som en kontroll i stedet for DMSO. - Rug i 1 min ved 37 °C.
- Stopp reaksjonen ved å tilsette 2 μL av 1% SDS.
- Forbered en sirkelblanding av 2 μL av 5 μM TOP1-spesifikt substrat og 1 μL 100% DMSO eller 1 μL 1,6 mM camptothecin (CPT) i 14 μL 1x TOP1 reaksjonsbuffer. Tilsett 2 μL 5 ng / μL rekombinant TOP1 enzym.
MERK: Trinn 3 kan startes parallelt med trinn 2, og sirklene kan lagres ved 4 °C over natten. Alternativt kan DNA-sirklene klargjøres samtidig med trinn 4 og brukes umiddelbart. Se sekvensen av det TOP1-spesifikke substratet i figur 1C. Underlaget brettes sammen til en manualform med et dobbeltstammeområde som inneholder et foretrukket TOP1-spaltningssted og to enkeltstrengede løkker. Det åpne manualsubstratet omdannes til et lukket sirkulært substrat ved TOP1-mediert spaltning og ligering og blir heretter referert til som en sirkel. Siden det er et overskudd av 5'-aminoprimeren, vil det ikke være noen konkurranse mellom åpne og lukkede TOP1-spesifikke substrater.
4. Blokkering av brønnmakeren
- Senk brønnmakeren ned i et brett på 5 cm x 5 cm fylt med buffer 1 som ble forvarmet til 50 °C. Ved å bruke en pipette, skyv væsken inn i brønnene for å sikre at det ikke er luftbobler. Inkuber i 30 minutter ved 50 °C.
- Fjern buffer 1 og vask 2 x 1 min med dH2O. Rist kraftig for hånd.
- Tilsett buffer 2 som er forvarmet til 50 °C. Pass på at det ikke er luftbobler i brønnene. Inkuber i 30 minutter ved 50 °C.
- Vask 2 x 1 min med dH2O. Rist kraftig for hånd.
- Vask med 70% EtOH i 1 min. Rist kraftig for hånd.
- La brønnmakeroppsettet lufttørke.
MERK: Bruk trykkluft til å tørke brønnene. Alternativt er det mulig å blåse luft ved hjelp av en Pasteur-pipette. Sørg for at brønnene er tørre før du fortsetter.
5. Hybridisering av sirklene til brønnmakeren
- Legg til 4 μL av sirklene (laget i trinn 3) til hver tilsvarende brønn.
- Plasser brønnmaskinen i et fuktighetskammer i 1 time med dH2O ved 37 °C.
MERK: Et fuktighetskammer kan lages ved å bruke en eske for pipettespisser fylt med dH2O. Alternativt kan hybridiseringen gjøres over natten ved 25 °C i fuktighetskammeret.
6. Vask
- Vask brønnmakeren med buffer 3.
- Fjern buffer 3 og erstatt med buffer 4.
- Fjern buffer 4 og vask med 70% EtOH.
- Fjern EtOH og la brønnmakeren tørke.
MERK: Alle vasketrinnene utføres i 1 minutt i et brett på 5 cm x 5 cm ved å senke lysbildet helt ned. Pass alltid på at det ikke er luftbobler inne i brønnene.
7. Forsterkning av rullende sirkel
- Forbered en RCA-blanding av 1x Phi29 Reaction Buffer supplert med 0,2 μg / μL BSA, 1 enhet Phi29 polymerase, og enten 0,25 mM dNTP og 0,0125 mM ATTO-488-dUTP for fluorescensavlesning, eller 0,1 mM dATP, 0,1 mM DTTP, 0,1 mM dGTP, 0,09 mM dCTP og 0,01 mM Biotin-dCTP for kolorimetrisk / kjemiluminescensavlesning. Tilsett 4 μL i hver brønn. Se figur 1E.
MERK: Tilberedning av RCA-blandingen må gjøres på is. Når du inkorporerer fluorescerende nukleotider i RCA, unngå direkte lys fra dette trinnet for å beskytte fluoroforene. - Rug i 2 timer ved 37 °C i fuktighetskammeret. Ved fluorescerende nukleotider som brukes, sett fuktighetskammeret i mørket. Se figur 1F,G.
8. Vasking
- For kjemiluminescens- eller kolorimetriske avlesningsprotokoller, vask brønnmakeren som i trinn 6, og fortsett deretter til trinn 11.
- For fluorescensavlesningsprotokollen, fjern silikongitteret ved hjelp av pinsett før vask som i de følgende trinnene.
- Vask lysbildet i 10 minutter i buffer 3.
- Fjern buffer 3 og erstatt med buffer 4. Vask i 5 min.
- Fjern buffer 4 og vask i 1 min i 70% EtOH.
- Fjern EtOH og la brønnmakeren tørke.
9. Visualisering av fluorescerende rullende sirkelprodukter ved hjelp av en fluorescensskanner
- Skann lysbildet i en fluorescensskanner ved hjelp av filtrene som tilsvarer fluoroforen som brukes. Bruk maksimal fotomultiplikator mulig som ikke gir metning.
MERK: Den fluorescerende skanneren som brukes til bildeopptak i denne protokollen, er utstyrt med en 473 nm laser og en FAM-filter-eksitasjon 490 nm, utslipp 520 nm. - Importer bildet til ImageJ og endre bildetypen til 8-bit (Bilde | Type | 8-biter). Hvis du vil måle båndene separat, begrenser du det målte området ved hjelp av rektangeltegneverktøyet fra verktøylinjen. Tegn ønsket område og mål intensiteten (Analyser | Mål). Flytt deretter det opprinnelig tegnede området til neste bånd og mål.
- Plott dataene i ønsket programvare. Representative bilder inkludert kvantifisering hentet fra ImageJ er avbildet i figur 2.
10. Visualisering av fluorescerende rullende sirkelprodukter ved hjelp av et fluorescensmikroskop
- Med en EtOH-bestandig penn tegner du brønnens posisjon før du fjerner silikongitteret og vasker lysbildet som i trinn 8.2. Etter vasketrinnene, monter lysbildet med 1 μL monteringsmedium uten 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) og legg til et dekselglass. For å tillate visualisering i kameraet, lim lysbildet på et 76 mm x 26 mm mikroskop lysbilde.
- Analyser ved hjelp av et fluorescensmikroskop utstyrt med et 60x oljenedsenkningsmål og et kamera. Ta 12-15 bilder av hver prøve / brønn.
- Importer bildene til ImageJ og stable bildene (Bilde | Stabler | Bilde å stable). Endre bildetypen til 8-biters (Bilde | Type | 8-biter).
- Angi terskelen (Bilde | Juster | Terskel).
- Sett terskelen som følger: sett den nedre linjen og juster den øvre linjen slik at bare de riktige signalene er røde og bakgrunnen er svart. Sørg for at terskelen er så lav som mulig før de reelle signalene begynner å forsvinne.
- Rydd gjennom de enkelte bildene og sørg for at de samsvarer med bildene før du setter terskelen. Vær oppmerksom på at terskelen kan endres fra eksperiment til eksperiment.
- Tell signalene (Analyser | Analyser partikler). Kontroller at det summerte feltet i ImageJ-innstillingene er merket av.
- Eksporter resultatene til et regneark eller annen programvare for videre databehandling. Representative bilder inkludert kvantifisering hentet fra ImageJ er avbildet i figur 3.
11. Kobling av HRP-konjugert antibiotinantistoff til de biotinmerkede rullesirkelproduktene
- Tilsett 4 μL HRP-konjugert anti-biotin antistoff fortynnet 1:300 i Buffer 5 supplert med 5% ikke-fett skummet melk og 5% BSA til hver brønn.
- Inkuber i 50 minutter ved 15-25 °C i fuktighetskammeret (se figur 1H).
- Vask 3 x 3 min med buffer 5.
- Tørk brønnmakeren.
12. Visualisering av de biotinmerkede rullesirkelproduktene
- Visualisering med ECL
- Bland 40 μL ECL Luminol og 40 μL H 2 O2umiddelbart før bruk. Tilsett 2 μL i hver brønn.
- Visualiser lysbildet ved hjelp av et CCD-kamera eller på røntgenfilmer.
- Visualisering med TMB
- Etter trinn 11.4, fjern silikongitteret. Deretter legger du til 400 μL TMB på toppen av hele lysbildet og legger lysbildet i et fuktighetskammer. Vent til ~ 5-10 min for fargeutvikling. Etter fargeutviklingen, vask lysbildet med 70% EtOH.
- Visualiser fargeutviklingen med det blotte øye. Ta et bilde av lysbildet med et fotokamera eller en mobiltelefon.
- Importer bildet til ImageJ og endre bildetypen til 8-bit (Bilde | Type | 8-biter). Hvis du vil måle båndene separat, begrenser du det målte området ved hjelp av rektangeltegneverktøyet fra verktøylinjen. Tegn ønsket område og mål intensiteten (Analyser | Mål). Flytt deretter det opprinnelig tegnede området til neste bånd og mål.
- Plott dataene i ønsket programvare. Representative bilder, inkludert kvantifisering hentet fra ImageJ, er avbildet i figur 4, figur 5 og figur 6.
Representative Results
Her presenteres en protokoll for påvisning av TOP1-aktivitet ved bruk av REEAD-analysen16. Protokollen ble brukt til å oppdage rekombinant TOP1-aktivitet ved hjelp av fire forskjellige avlesningsmetoder: fluorescensskanner, fluorescensmikroskop, kjemiluminescens og kolorimetrisk. Protokollen ble også brukt til å oppdage aktiviteten til TOP1 ekstrahert fra Caco2-celler, som et eksempel på råekstrakt, med kjemiluminescens eller TMB-avlesning. Videre ble protokollen brukt som et legemiddelscreeningsverktøy for å oppdage hemming av rekombinant TOP1-aktivitet ved CPT, som et eksempel på en TOP1-spesifikk inhibitor, ved bruk av kjemiluminescensavlesningsmetoden.
Resultatene oppnådd ved analyse av TOP1-aktiviteten ved bruk av fluorescensavlesningen er avbildet i figur 2 og figur 3. En representativ skanning av fluorescerende lysbilde og den resulterende kvantifiseringen er vist i figur 2. Som det fremgår av kvantifiseringen, har denne avlesningen en deteksjonsgrense på 12,5 ng TOP1. Representative bilder og den resulterende kvantifiseringen oppnådd ved bruk av fluorescerende mikroskopavlesning er vist i figur 3. Ved hjelp av denne avlesningsmetoden er deteksjonsgrensen så lite som 0,1 ng TOP1. Resultatene oppnådd ved analyse av TOP1-aktiviteten ved bruk av kjemiluminescensavlesningen er avbildet i figur 4, og resultatene fra kolorimetrisk avlesning er avbildet i figur 5. Deteksjonsgrensen for disse avlesningsmetodene er ved 6 ng TOP1 eller som TOP1 ekstrahert fra 312 Caco2-celler. Figur 6 viser målingene av TOP1-aktiviteten i nærvær av 80 μM CPT eller DMSO som et eksempel på bruk av narkotikascreening. Det representative bildet og den resulterende kvantifiseringen av tre uavhengige eksperimenter viser at CPT hemmer TOP1-mediert sirkulærisering av substratet som forventet24,25.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av REEAD-protokollen. (A,B) Utarbeidelse av de funksjonaliserte lysbildene. Silikongitteret er festet til det funksjonaliserte lysbildet. Deretter kobles 5'-aminoprimeren til lysbildet, og muliggjør dermed forsterkning av det TOP1-spesifikke substratet. (C,D) Generering av lukkede sirkulære underlag. Det TOP1-spesifikke substratet brettes sammen til en manualform med et foretrukket TOP1-spaltningssted i den dobbeltstrengede stammen og en primerbindende sekvens i en av de to enkeltstrengede løkkene. (C) TOP1 frigjøres ved lysis av cellene. Ved TOP1-mediert spaltning og ligering omdannes substratet til en lukket sirkel; (D) renset, rekombinant TOP1 brukes. (E) Forsterkning av rullende sirkel. De lukkede sirkulære substratene hybridiseres til den overflateforankrede primeren og forsterkes av RCA ved bruk av Phi29-polymerase. RCA kan oppnås enten ved inkorporering av fluorescerende nukleotider som i F eller biotinylerte nukleotider som i G. De fluorescerende rullesirkelproduktene visualiseres ved hjelp av enten et fluorescensmikroskop eller en fluorescensskanner. (H) Kobling av det HRP-konjugerte antibiotinantistoffet. De biotinylerte rullesirkelproduktene inkuberes med det HRP-konjugerte antibiotinantistoffet. Signalutviklingen formidles av HRP-enzymet, og signalene visualiseres enten ved ECL og detekteres ved hjelp av et CCD-kamera eller ved hjelp av TMB som genererer en kolorimetrisk visualisering. Forkortelser: REEAD = rullende sirkel forbedret enzymaktivitetsdeteksjon; RCA = rullende sirkelforsterkning; TOP1 = topoisomerase 1; HRP = pepperrot peroksidase; ECL = forbedret kjemiluminescens; TMB = 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Målinger av TOP1-aktivitet ved hjelp av fluorescensskanneren. Venstre panel viser et representativt bilde av lysbildet når du analyserer aktiviteten til 3-50 ng TOP1 ved hjelp av fluorescensskanneravlesningsprotokollen. Høyre panel viser den resulterende kvantifiseringen. t-test med Welchs korreksjon, p = 0,0064, n = 4. Forkortelse: TOP1 = topoisomerase 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Målinger av TOP1-aktivitet ved bruk av fluorescensmikroskopet. Venstre panel viser representative bilder av lysbildet når du analyserer aktiviteten til 0,1-12,5 ng TOP1 ved hjelp av fluorescensmikroskopavlesningsprotokollen. Merk at bildene er beskårne versjoner for å vise prikkene riktig. Av denne grunn ligner de ikke nummeret på signalene i kvantifiseringen som vises i høyre panel. t-test med Welchs korreksjon, p = 0,0136, n = 3. Forkortelse: TOP1 = topoisomerase 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Målinger av TOP1-aktivitet ved hjelp av kjemiluminescensavlesningen. (A) Venstre panel viser et representativt bilde av lysbildet når du analyserer aktiviteten til 3-50 ng TOP1 ved hjelp av kjemiluminescensavlesningsprotokollen. Høyre panel viser den resulterende kvantifiseringen. t-test med Welchs korreksjon, p < 0,0001, n = 4. (B) Venstre panel viser et representativt bilde av lysbildet når du analyserer aktiviteten til TOP1 hentet fra 156-40 000 Caco2-celler ved hjelp av kjemiluminescensavlesningsprotokollen. Høyre panel viser den resulterende kvantifiseringen. t-test med Welchs korreksjon, p = 0,0224, n = 3. Forkortelser: TOP1 = topoisomerase 1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Målinger av TOP1-aktivitet ved hjelp av kolorimetrisk avlesning. (A) Venstre panel viser et representativt bilde av lysbildet når du analyserer 3-50 ng TOP1 ved hjelp av kolorimetrisk avlesningsprotokoll. Høyre panel viser den resulterende kvantifiseringen. t-test med Welchs korreksjon, p = 0,0012, n = 4. (B) Venstre panel viser et representativt bilde av lysbildet når du analyserer aktiviteten til TOP1 hentet fra 156-40 000 Caco2-celler ved hjelp av kolorimetrisk avlesningsprotokoll. Høyre panel viser den resulterende kvantifiseringen. t-test med Welchs korreksjon, p = 0,0117, n = 3. Forkortelser: TOP1 = topoisomerase 1; TMB = 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Målinger av TOP1-aktivitet etter medikamentell behandling ved bruk av kjemiluminescensavlesningsprotokollene. Venstre panel viser et representativt bilde av lysbildet når du analyserer 10 ng TOP1 i nærvær av 5% DMSO eller 80 μM CPT i 1 min. Høyre panel viser den resulterende kvantifiseringen. t-test med Welchs korreksjon, p = 0,0017, n = 3. Forkortelser: TOP1 = topoisomerase 1; CPT = camptothecin; DMSO = dimetylsulfoksid; Neg = negativ kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Topoisomeraser representerer en klasse DNA-modifiserende enzymer som tiltrekker seg høy forskning og klinisk interesse, og er målet for småmolekylære forbindelser med potensiell effekt i kreftbehandling eller i bekjempelse av smittsomme sykdommer. Videre har aktiviteten til human TOP1 vist seg å være en effektiv biomarkør for kreftprognose og behandling18,19,23. Selv om det er TOP1-aktiviteten som påvirker effekten av en kjemoterapeutisk inhibitor26, er det ofte mengden DNA-RNA eller mengden TOP1 som vurderes i kliniske omgivelser. Dette skyldes mangelen på raske, enkle og gelbaserte gratis verktøy som kan gi nøyaktig og presis kvantifisering av topoisomeraseaktivitet i alle laboratorieinnstillinger.
Her beskrives en protokoll for REEAD-analysen som tillater måling av TOP1-aktivitet på en gelfri måte. I denne protokollen inkuberes renset TOP1 eller råekstrakt fra celler med et spesialdesignet DNA-hantelformet substrat som ved spalting / ligering mediert av TOP1 omdannes til et lukket, sirkulært molekyl. Sirklene hybridiseres deretter på en glassoverflate og forsterkes av RCA. For å gjøre det enkelt å utføre reaksjoner som skjer på lysbildet, er et silikongitter festet til glasset, noe som gjør individuelle brønner der reaksjonene finner sted. På denne måten utnytter protokollen et multiwell-system - et silikongitter kalt wellmaker.
Protokollen ble brukt til å oppdage aktiviteten til rekombinant TOP1 og TOP1 ekstrahert fra kolorektale adenokarsinomceller Caco2, brukt som et eksempel. Videre, som et eksempel på REEAD som skal brukes som et narkotikascreeningsverktøy, ble protokollen brukt til å oppdage TOP1-aktivitetshemming av den velkjente TOP1-hemmerenCPT 24,25. Analysen ble kombinert med forskjellige avlesningsmetoder - fluorescensmikroskopi, som gir høy følsomhet, og en fluorescensskanner, kjemiluminescens eller kolorimetrisk, som krever mindre spesialisert utstyr og trening. Den svært følsomme fluorescensmikroskopavlesningen har begrensningene i behovet for en fluorescensmikroskopinnstilling av god kvalitet, dyktig personell og tidkrevende bildeinnsamling og analyse.
Av disse grunner presenteres fluorescensskanneravlesningen som gir raskere innsamling og analyse, selv om det går på bekostning av følsomheten. Ved mangel på fluorescensskanner kan to gode alternativer, kjemiluminescens og kolorimetriske avlesningsmetoder, vurderes. Begge metodene er raske og enkle, og krever ikke dyrt utstyr eller spesialisert opplæring. I alle avlesningsformatene har REEAD mange fordeler sammenlignet med de nyeste analysene, som er mer tidkrevende, gelbaserte (med kravene til interkalerende midler) og mindre direkte kvantitative. Det er imidlertid noen få kritiske trinn i den presenterte protokollen. Ved håndtering av legemiddelscreeningen bør tidspunktene, legemiddelkonsentrasjonen og forholdet mellom TOP1-mengde / DNA-substrat optimaliseres sammenlignet med de beskrevne innstillingene som er optimalisert for CPT. Legemidlet kan undersøkes ved å utføre en preinkubasjon med DNA-substratet eller en preinkubasjon med TOP1-enzymet. Dette kan gi verdifull informasjon om molekylets evne til å hemme TOP1 og gi innsikt i stoffets virkningsmekanisme.
Videre, hvis du opplever lave eller fraværende signaler, skyldes dette mest sannsynlig en ineffektiv lysis av råprøven eller en nedbrytning av TOP1 i ekstraktet på grunn av feil bruk av proteasehemmere. I tillegg kan dette også skyldes utilstrekkelig lagring av de viktige analysekomponentene, som rekombinant TOP1, phi29-polymerase, nukleotider, substrat og primer. Til slutt bør gjentatte fryse-tine sykluser av oligonukleotidene unngås, da dette dramatisk påvirker analyseytelsen. Når råekstrakt brukes, må ekstraksjonseffektiviteten til den spesifikke biologiske prøven optimaliseres, og mengden og aktiviteten til TOP1 kan variere fra eksemplet som er rapportert her. Av denne grunn vil hvert råekstrakt som skal testes, kreve en titrering for identifisering av analysedeteksjonsgrensen og følsomhetsområdet ved bruk av den aktuelle prøven. Protokollen er optimalisert for påvisning av human TOP1. Aktiviteten til andre eukaryote TOP1-er kan måles, men NaCl-konsentrasjonen og inkubasjonstiden må kanskje optimaliseres i henhold til enzymrensingsmetoden og optimal enzymaktivitet. Flere sirkulæriserte substrater vil skyldes langvarig inkubasjon, mens færre sirkulæriserte substrater vil skyldes forkortet inkubasjon.
I tillegg til de presenterte applikasjonene tillater REEAD måling av TOP1-aktiviteten i råekstrakter fra små biopsier fra kreftpasienter18, prediksjonen av den cytotoksiske krefteffekten av CPT i kreftcellelinjer 20,21,22, og til og med påvisning av enzymaktiviteten i enkeltceller20,21 . Videre muliggjør den presenterte REEAD-innstillingen ved hjelp av brønnmakeren multiwell-basert narkotikascreening av biblioteker av syntetiske eller naturlige forbindelser. I tillegg til dette er det utviklet en modifisert versjon av REEAD-analysen, kalt REEAD C/L. Dette oppsettet muliggjør separate undersøkelser av spaltnings- og ligeringstrinnene til TOP1-reaksjonen27. Med REEAD C / L er det mulig å bestemme virkningsmekanismen til små molekylhemmere og karakterisere dem som TOP1 katalytiske hemmere med potensielle antiparasittiske effekter28 eller som TOP1-giftstoffer som skal brukes til kreftbehandling24,25. Til slutt, med spesifikk redesign av DNA-substratene for å matche de forskjellige kravene (for DNA-binding eller spaltningsligering) av andre TOP1-enzymer, har REEAD også blitt brukt til påvisning av smittsomme sykdommer (som i tilfelle Plasmodium falciparum, forårsaker malaria29), eller Leishmania donovani og Monkeypox-virus (data ikke vist). Eller det kan brukes til å identifisere små molekylforbindelser med antipatogene effekter. Den presenterte protokollen gir forskere i TOP1-feltet en enkel metode for å oppdage enzymaktivitet med liten eller ingen optimalisering og med muligheten til å bli tilpasset enda bredere applikasjoner i fremtiden.
Disclosures
Forfatterne C.T. og K.M. er ansatte i VPCIR biosciences ApS. C.T., B.R.K. og M.S. er aksjonærer og/eller aksjeopsjonsinnehavere. C.T., B.R.K. og M.S. erklærer at de er navngitte oppfinnere av patentet EP2022/057172 arkivert i navnet til VPCIR biosciences ApS. De andre forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker laboratorietekniker Noriko Y. Hansen, Institutt for molekylærbiologi og genetikk, Aarhus Universitet, for teknisk assistanse i forhold til Phi29 og TOP1 enzymrensinger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Camera for fluorescence image analysis | |||
| CCD camera | For chemiluninescence image analysis | ||
| Fluorescence microscope | Olympus | Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
| Fluorescence scanner | Typhoon | FLA 9500 | Equipped with 473 laser and FAM filter |
| Humidity chamber with dH2O | |||
| Hybridization chamber with saturated NaCl | |||
| ImageJ software | Fiji | Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Materials | |||
| Cell culture | |||
| Cell growth medium appropiate for the chosen cell line | |||
| Trypsin | Sigma | #T4174 | |
| Pen strep | Sigma | #P4300 | |
| Tissue culture flasks | ThermoFisher | #178983 | |
| FBS | Gibco | #10270106 | |
| NEEA | Sigma | #M7145 | |
| PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
| Functionalized slides | |||
| 5'-amine anti-TOP1 primer | Sigma | 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’ | |
| Activated Codelink HD slides | SurModics | #DHD1-0023 | |
| Silicon grid | Grace-biolabs | Custom made | |
| Pertex glue | Histolabs | #00801 | |
| Microscope slide 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Other microscope slide of same dimension can be used |
| DNA circles and rolling circle amplification | |||
| TOP1 specific substrate | Sigma | 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’ | |
| ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
| Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
| dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
| Phi29 polymerase | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
| Recombinant TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
| Detection of rolling circle products | |||
| BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
| Cover glass | |||
| ECL mixture | Cytiva | #RPN2236 | |
| HRP conjugated anti-biotin antibody | Merck | #A4541 | |
| Mounting medium (vectachield) | Vector laboratories | #H-1000 | |
| Buffer list | |||
| 1x PE Buffer | 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O | ||
| 6x Print Buffer | 300 mM Na3PO4, pH 8.5 | ||
| Blocking solution | Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9 | ||
| Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors | ||
| 10x TOP1 Reaction Buffer | 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | ||
| 10x Phi29 Reaction Buffer | 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT | ||
| Buffer 1 | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 2 | 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS | ||
| Buffer 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Buffer 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Chemicals for buffers | |||
| Tris | Sigma | #T1506 | |
| HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
| EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
| PMSF | Sigma | #05056489001 | |
| SDS | Applichem | #436143 | |
| Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
| NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
| Ethanolamine | Sigma | #411000 | |
| SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
| Tris-acetate | Sigma | #T1258 | |
| Mg-acetate | Sigma | #M0631 | |
| K-acetate | Sigma | #1.04820.1000 | |
| Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
| DTT | Sigma | #D0632 | |
| CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
| MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
| NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
| Skimmed milk powder | Sigma | #70166 | |
| BSA | Sigma | #A4503 |
References
- Baldwin, E. L., Osheroff, N. Etoposide, topoisomerase II and cancer. Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents. 5 (4), 363-372 (2005).
- Gilbert, D. C., Chalmers, A. J., El-Khamisy, S. F. Topoisomerase I inhibition in colorectal cancer: Biomarkers and therapeutic targets. British Journal of Cancer. 106 (1), 18-24 (2012).
- Ikeguchi, M., et al. TopoisomeraseI expression in tumors as a biological marker for CPT-11 chemosensitivity in patients with colorectal cancer. Surgery Today. 41 (9), 1196-1199 (2011).
- Meisenberg, C., et al. Clinical and cellular roles for TDP1 and TOP1 in modulating colorectal cancer response to irinotecan. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (2), 575-585 (2015).
- Palshof, J. A., et al. Topoisomerase I copy number alterations as biomarker for irinotecan efficacy in metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 17 (1), 1-10 (2017).
- Proszek, J., et al. Topoisomerase I as a biomarker: Detection of activity at the single molecule level. Sensors. 14 (1), 1195-1207 (2014).
- Leppard, J. B., Champoux, J. J. Human DNA topoisomerase I: Relaxation, roles, and damage control. Chromosoma. 114 (2), 75-85 (2005).
- Champoux, J. J. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 369-413 (2001).
- Redinbo, M. R., et al. Crystal structures of human topoisomerase I in covalent and noncovalent complexes with DNA. Science. 279 (5356), 1504-1513 (1998).
- Nitiss, J. L., Soans, E., Rogojina, A., Seth, A., Mishina, M.
- Tesauro, C., et al. Erybraedin C, a natural compound from the plant Bituminaria bituminosa, inhibits both the cleavage and religation activities of human topoisomerase I. Biochemical Journal. 425 (3), 531-539 (2010).
- Keller, J. G., et al. Topoisomerase 1 inhibits MYC promoter activity by inducing G-quadruplex formation. Nucleic Acids Research. 50 (11), 6332-6342 (2022).
- Christiansen, K., Westergaard, O. Characterization of intra- and intermolecular DNA ligation mediated by eukaryotic topoisomerase I. Role of bipartite DNA interaction in the ligation process. Journal of Biological Chemistry. 269 (1), 721-729 (1994).
- Svejstrup, J. Q., Christiansen, K., Andersen, A. H., Lund, K., Westergaard, O. Minimal DNA duplex requirements for topoisomerase I-mediated cleavage in vitro. Journal of Biological Chemistry. 265 (1), 12529-12535 (1990).
- Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 283-299 (2018).
- Stougaard, M., et al. Single-molecule detection of human topoisomerase I cleavage-ligation activity. ACS Nano. 3 (1), 223-233 (2009).
- Keller, J. G., Petersen, K. V., Knudsen, B. R., Tesauro, C. Simple and fast DNA-based tool to investigate topoisomerase 1 activity, a biomarker for drug susceptibility in colorectal cancer. Recent Underst. Colorectal Cancer Treatment. , (2022).
- Jakobsen, A. K., et al. Correlation between topoisomerase I and tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 activities in non-small cell lung cancer tissue. Experimental and Molecular Pathology. 99 (1), 56-64 (2015).
- Jakobsen, A. K., et al. TDP1 and TOP1 as targets in anticancer treatment of NSCLC: Activity and protein level in normal and tumor tissue from 150 NSCLC patients correlated to clinical data. Lung Cancer. 164, 23-32 (2022).
- Keller, J. G., et al. On-slide detection of enzymatic activities in selected single cells. Nanoscale. 9 (36), 13546-13553 (2017).
- Keller, J. G., Stougaard, M., Knudsen, B. R.
- Tesauro, C., et al. Different camptothecin sensitivities in subpopulations of colon cancer cells correlate with expression of different phospho-isoforms of topoisomerase i with different activities. Cancers. 12 (5), 1240 (2020).
- Tesauro, C., et al. Topoisomerase i activity and sensitivity to camptothecin in breast cancer-derived cells: A comparative study. BMC Cancer. 19 (1), 1-15 (2019).
- Pommier, Y. DNA topoisomerase I Inhibitors: Chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chemical Reviews. 109 (7), 2894-2902 (2009).
- Pommier, Y. Drugging topoisomerases: lessons and challenges. ACS Chemical Biology. 8 (1), 82-95 (2013).
- Bailly, C. Irinotecan: 25 years of cancer treatment. Pharmacological Research. 148, 104398 (2019).
- Petersen, K. V., et al. Simple and fast dna based sensor system for screening of small-molecule compounds targeting eukaryotic topoisomerase 1. Pharmaceutics. 13 (8), 1255 (2021).
- García-Estrada, C., Prada, C. F., Fernández-Rubio, C., Rojo-Vázquez, F., Balaña-Fouce, R. DNA topoisomerases in apicomplexan parasites: promising targets for drug discovery. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277 (1689), 1777-1787 (2010).
- Hede, M. S., et al. Detection of the malaria causing Plasmodium parasite in saliva from infected patients using topoisomerase I activity as a biomarker. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
