En protokoll for sensitiv og kvantitativ påvisning av topoisomerase 1-aktivitet ved bruk av den rullende sirkelen forbedret enzymaktivitetsdeteksjonsanalyse er beskrevet. Metoden tillater påvisning av topoisomerase 1-aktivitet fra rensede komponenter eller celle-/vevsekstrakter. Denne protokollen har omfattende applikasjoner i alle felt som involverer påvisning av enzymatisk aktivitet.
Isotermiske forsterkningsbaserte teknikker som rullesirkelforsterkning har blitt brukt med hell for påvisning av nukleinsyrer, proteinmengder eller andre relevante molekyler. Disse metodene har vist seg å være betydelige alternativer til PCR eller ELISA for kliniske og forskningsapplikasjoner. Videre er påvisning av proteinmengde (ved Western blot eller immunhistokjemi) ofte utilstrekkelig til å gi informasjon for kreftdiagnose, mens måling av enzymaktivitet representerer en verdifull biomarkør. Måling av enzymaktivitet muliggjør også diagnose og potensiell behandling av patogenbårne sykdommer. I alle eukaryoter er topoisomeraser de viktigste DNA-bindende enzymene som er involvert i kontrollen av DNA-topologisk tilstand under viktige cellulære prosesser og er blant de viktige biomarkørene for kreftprognose og behandling.
Gjennom årene har topoisomeraser blitt vesentlig undersøkt som et potensielt mål for antiparasittiske og anticancer medisiner med biblioteker av naturlige og syntetiske småmolekylære forbindelser som undersøkes hvert år. Her presenteres den rullende sirkelforsterkningsmetoden, kalt rolling circle enhanced enzyme activity detection (REEAD) assay som muliggjør kvantitativ måling av topoisomerase 1 (TOP1) aktivitet på en enkel, rask og gelfri måte. Ved å spalte og ligere et spesialdesignet DNA-substrat, konverterer TOP1 et DNA-oligonukleotid til en lukket sirkel, som blir malen for rullende sirkelforsterkning, noe som gir ~ 103 tandem gjenta rullende sirkelprodukter. Avhengig av nukleotidinkorporeringen under forsterkningen, er det mulighet for forskjellige avlesningsmetoder, fra fluorescens til kjemiluminescens til kolorimetrisk. Siden hver TOP1-mediert spaltningsligering genererer en lukket DNA-sirkel, er analysen svært følsom og direkte kvantitativ.
Topoisomeraser tilhører klassen av DNA-modifiserende enzymer, og mange av disse har vist seg nyttige som biomarkører for menneskelige sykdommer 1,2,3,4,5,6. TOP1 er involvert i å løse det topologiske stresset forbundet med cellulære prosesser som DNA-replikasjon, gentranskripsjon, rekombinasjon og kromosomal segregering7. TOP1 kan løse både negative og positive superspoler ved en mekanisme som innebærer dannelse av et forbigående enkeltstrenget brudd i DNA 8,9. Etter binding til DNA posisjonerer TOP1 det aktive stedet tyrosin (Tyr723) for å utføre et nukleofilt angrep på fosfodiesterryggraden. Et TOP1-DNA-spaltningskompleks genereres deretter med enzymet kovalent festet til 3′-enden av den ødelagte DNA-strengen. Dette frigjør vridningsspenning ved å la 5′-enden av den spaltede strengen dreie seg om den intakte strengen. Til slutt utfører hydroksylgruppen i 5′-enden et nukleofilt angrep på 3′-fosfotyrosylbindingen. Som et resultat frigjøres TOP1, og DNA-ryggraden gjenopprettes8.
Flere analyser er utviklet for å undersøke trinnene i TOP1-katalytisk syklus, inkludert avslapningsanalysen10, elektroforetisk mobilitetsskiftanalyse (EMSA) 11,12, DNA-selvmordsspaltningsligeringsanalyser 13,14 og in vivo-komplekset av enzymer (ICE) analyse 15 . Imidlertid har disse analysene flere begrensninger da de er avhengige av gelelektroforese, som krever DNA-interkalerende midler, eller de krever høyt spesialisert opplæring og utstyr. Videre krever analysene store mengder renset TOP1-enzym (fra 1 til 5 ng for avslapningsanalysen og 50 til 200 ng for EMSA og spaltningsligeringsanalysen) eller ekstrakter fra minst 106 celler for å fungere optimalt. Derfor erdet utviklet en svært sensitiv metode som muliggjør spesifikk deteksjon av TOP1-aktivitet i rå biologiske prøver og på enkeltkatalytisk hendelsesnivå, kalt REEAD-analysen.
Her presenteres en protokoll for påvisning av TOP1-aktivitet ved bruk av REEAD-analysen16 . En skjematisk fremstilling av analysen er avbildet i figur 1. Et spesialdesignet silikongitter er festet til et funksjonalisert lysbilde for å lage et glass-lysbilde multiwell oppsett, kalt wellmaker i det følgende (figur 1A). Dette etterfølges av kobling av en 5′-aminomodifisert primer til de funksjonelle NHS-gruppene i brønnene i lysbildet (figur 1B). TOP1-mediert spaltnings- og ligeringsreaksjon konverterer et spesifikt DNA-substrat til en lukket sirkel. Det TOP1-spesifikke substratet (figur 1C) brettes spontant inn i en manualform som inneholder en dobbeltstrenget stamme og to enkeltstrengede løkker. En av løkkene er komplementær til den overflateforankrede primeren. Stammeområdet inneholder et favorisert TOP1-spaltningssted tre baser oppstrøms fra 3′-enden og et 5′-hydroksyloverheng. Sirkulærisering av substratet kan oppnås ved bruk av enten celle/vevekstrakt (figur 1C) eller rekombinant, renset TOP1 (figur 1D).
Når substratet spaltes av TOP1, blir enzymet forbigående bundet til 3′-enden og trebasefragmentet diffunderer, slik at 5′-overhenget blir anneal til substratet og letter TOP1-mediert ligering. Ligeringen resulterer i sirkulærisering av substratet og deretter dissosiasjon av TOP1. Den lukkede sirkelen hybridiseres til den overflateforankrede primeren (figur 1E) og brukes som en mal for isotermisk rullende sirkelforsterkning (RCA) mediert av phi29-polymerasen, som kan utføre RCA med strengforskyvning, noe som gir 103 tandemrepetisjonsprodukter. Under RCA-trinnet kan fluorescerende merkede (figur 1F) eller biotinkoblede (figur 1G) nukleotider inkorporeres17. Inkorporering av fluorescerende merkede nukleotider muliggjør deteksjon av RCP-ene enten ved hjelp av et fluorescensmikroskop eller en fluorescensskanner. Alternativt kan et pepperrotperoksidase (HRP)-koblet antibiotinantistoff (figur 1H) binde de biotinylerte nukleotidene, og dermed muliggjøre påvisning av valsede sirkelprodukter (RCP) ved bruk av enten forbedret kjemiluminescens (ECL) eller ved omdannelse av 3,3′,5,5′-tetrametylbenzidin (TMB) til en detekterbar farge. RCA følger en lineær reaksjonskinetikk, noe som gjør REEAD-analysen direkte kvantitativ, da en RCP representerer en enkelt TOP1-mediert spaltningsligeringsreaksjon. Her er det vist at denne analysen kan brukes til å oppdage TOP1-aktivitet som et renset rekombinant enzym eller ekstrahert fra råprøver og som et anti-TOP1-legemiddelscreeningverktøy.
Topoisomeraser representerer en klasse DNA-modifiserende enzymer som tiltrekker seg høy forskning og klinisk interesse, og er målet for småmolekylære forbindelser med potensiell effekt i kreftbehandling eller i bekjempelse av smittsomme sykdommer. Videre har aktiviteten til human TOP1 vist seg å være en effektiv biomarkør for kreftprognose og behandling18,19,23. Selv om det er TOP1-aktiviteten som påvirker effekten av en kjemoterapeutisk inhibitor26, er det ofte mengden DNA-RNA eller mengden TOP1 som vurderes i kliniske omgivelser. Dette skyldes mangelen på raske, enkle og gelbaserte gratis verktøy som kan gi nøyaktig og presis kvantifisering av topoisomeraseaktivitet i alle laboratorieinnstillinger.
Her beskrives en protokoll for REEAD-analysen som tillater måling av TOP1-aktivitet på en gelfri måte. I denne protokollen inkuberes renset TOP1 eller råekstrakt fra celler med et spesialdesignet DNA-hantelformet substrat som ved spalting / ligering mediert av TOP1 omdannes til et lukket, sirkulært molekyl. Sirklene hybridiseres deretter på en glassoverflate og forsterkes av RCA. For å gjøre det enkelt å utføre reaksjoner som skjer på lysbildet, er et silikongitter festet til glasset, noe som gjør individuelle brønner der reaksjonene finner sted. På denne måten utnytter protokollen et multiwell-system – et silikongitter kalt wellmaker.
Protokollen ble brukt til å oppdage aktiviteten til rekombinant TOP1 og TOP1 ekstrahert fra kolorektale adenokarsinomceller Caco2, brukt som et eksempel. Videre, som et eksempel på REEAD som skal brukes som et narkotikascreeningsverktøy, ble protokollen brukt til å oppdage TOP1-aktivitetshemming av den velkjente TOP1-hemmerenCPT 24,25. Analysen ble kombinert med forskjellige avlesningsmetoder – fluorescensmikroskopi, som gir høy følsomhet, og en fluorescensskanner, kjemiluminescens eller kolorimetrisk, som krever mindre spesialisert utstyr og trening. Den svært følsomme fluorescensmikroskopavlesningen har begrensningene i behovet for en fluorescensmikroskopinnstilling av god kvalitet, dyktig personell og tidkrevende bildeinnsamling og analyse.
Av disse grunner presenteres fluorescensskanneravlesningen som gir raskere innsamling og analyse, selv om det går på bekostning av følsomheten. Ved mangel på fluorescensskanner kan to gode alternativer, kjemiluminescens og kolorimetriske avlesningsmetoder, vurderes. Begge metodene er raske og enkle, og krever ikke dyrt utstyr eller spesialisert opplæring. I alle avlesningsformatene har REEAD mange fordeler sammenlignet med de nyeste analysene, som er mer tidkrevende, gelbaserte (med kravene til interkalerende midler) og mindre direkte kvantitative. Det er imidlertid noen få kritiske trinn i den presenterte protokollen. Ved håndtering av legemiddelscreeningen bør tidspunktene, legemiddelkonsentrasjonen og forholdet mellom TOP1-mengde / DNA-substrat optimaliseres sammenlignet med de beskrevne innstillingene som er optimalisert for CPT. Legemidlet kan undersøkes ved å utføre en preinkubasjon med DNA-substratet eller en preinkubasjon med TOP1-enzymet. Dette kan gi verdifull informasjon om molekylets evne til å hemme TOP1 og gi innsikt i stoffets virkningsmekanisme.
Videre, hvis du opplever lave eller fraværende signaler, skyldes dette mest sannsynlig en ineffektiv lysis av råprøven eller en nedbrytning av TOP1 i ekstraktet på grunn av feil bruk av proteasehemmere. I tillegg kan dette også skyldes utilstrekkelig lagring av de viktige analysekomponentene, som rekombinant TOP1, phi29-polymerase, nukleotider, substrat og primer. Til slutt bør gjentatte fryse-tine sykluser av oligonukleotidene unngås, da dette dramatisk påvirker analyseytelsen. Når råekstrakt brukes, må ekstraksjonseffektiviteten til den spesifikke biologiske prøven optimaliseres, og mengden og aktiviteten til TOP1 kan variere fra eksemplet som er rapportert her. Av denne grunn vil hvert råekstrakt som skal testes, kreve en titrering for identifisering av analysedeteksjonsgrensen og følsomhetsområdet ved bruk av den aktuelle prøven. Protokollen er optimalisert for påvisning av human TOP1. Aktiviteten til andre eukaryote TOP1-er kan måles, men NaCl-konsentrasjonen og inkubasjonstiden må kanskje optimaliseres i henhold til enzymrensingsmetoden og optimal enzymaktivitet. Flere sirkulæriserte substrater vil skyldes langvarig inkubasjon, mens færre sirkulæriserte substrater vil skyldes forkortet inkubasjon.
I tillegg til de presenterte applikasjonene tillater REEAD måling av TOP1-aktiviteten i råekstrakter fra små biopsier fra kreftpasienter18, prediksjonen av den cytotoksiske krefteffekten av CPT i kreftcellelinjer 20,21,22, og til og med påvisning av enzymaktiviteten i enkeltceller20,21 . Videre muliggjør den presenterte REEAD-innstillingen ved hjelp av brønnmakeren multiwell-basert narkotikascreening av biblioteker av syntetiske eller naturlige forbindelser. I tillegg til dette er det utviklet en modifisert versjon av REEAD-analysen, kalt REEAD C/L. Dette oppsettet muliggjør separate undersøkelser av spaltnings- og ligeringstrinnene til TOP1-reaksjonen27. Med REEAD C / L er det mulig å bestemme virkningsmekanismen til små molekylhemmere og karakterisere dem som TOP1 katalytiske hemmere med potensielle antiparasittiske effekter28 eller som TOP1-giftstoffer som skal brukes til kreftbehandling24,25. Til slutt, med spesifikk redesign av DNA-substratene for å matche de forskjellige kravene (for DNA-binding eller spaltningsligering) av andre TOP1-enzymer, har REEAD også blitt brukt til påvisning av smittsomme sykdommer (som i tilfelle Plasmodium falciparum, forårsaker malaria29), eller Leishmania donovani og Monkeypox-virus (data ikke vist). Eller det kan brukes til å identifisere små molekylforbindelser med antipatogene effekter. Den presenterte protokollen gir forskere i TOP1-feltet en enkel metode for å oppdage enzymaktivitet med liten eller ingen optimalisering og med muligheten til å bli tilpasset enda bredere applikasjoner i fremtiden.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker laboratorietekniker Noriko Y. Hansen, Institutt for molekylærbiologi og genetikk, Aarhus Universitet, for teknisk assistanse i forhold til Phi29 og TOP1 enzymrensinger.
Equipment | |||
Camera for fluorescence image analysis | |||
CCD camera | For chemiluninescence image analysis | ||
Fluorescence microscope | Olympus | Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
Fluorescence scanner | Typhoon | FLA 9500 | Equipped with 473 laser and FAM filter |
Humidity chamber with dH2O | |||
Hybridization chamber with saturated NaCl | |||
ImageJ software | Fiji | Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
Materials | |||
Cell culture | |||
Cell growth medium appropiate for the chosen cell line | |||
Trypsin | Sigma | #T4174 | |
Pen strep | Sigma | #P4300 | |
Tissue culture flasks | ThermoFisher | #178983 | |
FBS | Gibco | #10270106 | |
NEEA | Sigma | #M7145 | |
PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
Functionalized slides | |||
5'-amine anti-TOP1 primer | Sigma | 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’ | |
Activated Codelink HD slides | SurModics | #DHD1-0023 | |
Silicon grid | Grace-biolabs | Custom made | |
Pertex glue | Histolabs | #00801 | |
Microscope slide 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Other microscope slide of same dimension can be used |
DNA circles and rolling circle amplification | |||
TOP1 specific substrate | Sigma | 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’ | |
ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
Phi29 polymerase | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
Recombinant TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
Detection of rolling circle products | |||
BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
Cover glass | |||
ECL mixture | Cytiva | #RPN2236 | |
HRP conjugated anti-biotin antibody | Merck | #A4541 | |
Mounting medium (vectachield) | Vector laboratories | #H-1000 | |
Buffer list | |||
1x PE Buffer | 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O | ||
6x Print Buffer | 300 mM Na3PO4, pH 8.5 | ||
Blocking solution | Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9 | ||
Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors | ||
10x TOP1 Reaction Buffer | 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | ||
10x Phi29 Reaction Buffer | 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT | ||
Buffer 1 | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C. | ||
Buffer 2 | 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C. | ||
Buffer 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS | ||
Buffer 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
Buffer 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
Chemicals for buffers | |||
Tris | Sigma | #T1506 | |
HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
PMSF | Sigma | #05056489001 | |
SDS | Applichem | #436143 | |
Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
Ethanolamine | Sigma | #411000 | |
SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
Tris-acetate | Sigma | #T1258 | |
Mg-acetate | Sigma | #M0631 | |
K-acetate | Sigma | #1.04820.1000 | |
Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
DTT | Sigma | #D0632 | |
CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
Skimmed milk powder | Sigma | #70166 | |
BSA | Sigma | #A4503 |