Summary
Описан протокол для чувствительного и количественного обнаружения активности топоизомеразы 1 с использованием расширенного анализа обнаружения активности ферментов по скользящему кругу. Способ позволяет обнаруживать активность топоизомеразы 1 из очищенных компонентов или экстрактов клеток/тканей. Этот протокол имеет широкий спектр применения в любой области, связанной с обнаружением ферментативной активности.
Abstract
Методы, основанные на изотермической амплификации, такие как амплификация по скользящему кругу, были успешно использованы для обнаружения нуклеиновых кислот, количеств белка или других соответствующих молекул. Эти методы оказались существенными альтернативами ПЦР или ИФА для клинических и исследовательских применений. Кроме того, обнаружение количества белка (с помощью вестерн-блоттинга или иммуногистохимии) часто недостаточно для предоставления информации для диагностики рака, тогда как измерение активности фермента представляет собой ценный биомаркер. Измерение активности ферментов также позволяет диагностировать и потенциально лечить патогенные заболевания. У всех эукариот топоизомеразы являются ключевыми ДНК-связывающими ферментами, участвующими в контроле топологического состояния ДНК во время важных клеточных процессов, и являются одними из важных биомаркеров для прогноза и лечения рака.
На протяжении многих лет топоизомеразы были в значительной степени исследованы в качестве потенциальной мишени противопаразитарных и противоопухолевых препаратов с библиотеками природных и синтетических низкомолекулярных соединений, которые исследуются каждый год. Здесь представлен метод амплификации скользящего круга, называемый анализом повышения активности ферментов (REEAD), который позволяет количественно измерять активность топоизомеразы 1 (TOP1) простым, быстрым и безгелевым способом. Расщепляя и лигируя специально разработанный субстрат ДНК, TOP1 превращает олигонуклеотид ДНК в замкнутый круг, который становится шаблоном для амплификации скользящего круга, давая ~ 103 тандемных продукта повторяющегося круга. В зависимости от включения нуклеотидов во время амплификации существует возможность различных методов считывания, от флуоресценции до хемилюминесценции и колориметрии. Поскольку каждое TOP1-опосредованное расщепление-лигирование генерирует один замкнутый круг ДНК, анализ является высокочувствительным и непосредственно количественным.
Introduction
Топоизомеразы относятся к классу ДНК-модифицирующих ферментов, и многие из них оказались полезными в качестве биомаркеров заболеваний человека 1,2,3,4,5,6. TOP1 участвует в разрешении топологического стресса, связанного с клеточными процессами, такими как репликация ДНК, транскрипция генов, рекомбинация и хромосомная сегрегация7. TOP1 может разрешать как отрицательные, так и положительные суперкатушки с помощью механизма, который включает в себя образование переходного одноцепочечного разрыва в ДНК 8,9. После связывания с ДНК TOP1 позиционирует активный сайт тирозина (Tyr723) для выполнения нуклеофильной атаки на фосфодиэфирную основу. Затем образуется комплекс расщепления TOP1-ДНК с ферментом, ковалентно прикрепленным к 3'-концу сломанной цепи ДНК. Это снимает торсионное напряжение, позволяя 5'-концу расщепленной пряди вращаться вокруг неповрежденной нити. Наконец, гидроксильная группа 5'-конца выполняет нуклеофильную атаку на 3'-фосфотирозиловую связь. В результате высвобождается ТОП1, а костяк ДНК восстанавливается8.
Было разработано несколько анализов для исследования этапов каталитического цикла TOP1, включая релаксационный анализ10, электрофоретический анализ сдвига подвижности (EMSA)11,12, анализы расщепления-лигирования ДНК13,14 и анализ комплекса ферментов in vivo (ICE)15 . Тем не менее, эти анализы имеют несколько ограничений, поскольку они зависят от гелевого электрофореза, который требует интеркалирующих агентов ДНК, или они требуют высокоспециализированной подготовки и оборудования. Кроме того, анализы требуют большого количества очищенного фермента TOP1 (от 1 до 5 нг для релаксационного анализа и от 50 до 200 нг для ЭМСА и анализа расщепления-лигирования) или экстрактов из по меньшей мере 106 клеток для оптимальной работы. Поэтому был разработан высокочувствительный метод, который позволяет специфически обнаруживать активность TOP1 в сырых биологических образцах и на уровне одного каталитического события, называемый анализом REEAD,16.
Здесь представлен протокол обнаружения активности TOP1 с помощью анализа REEAD16 . Схематическое изображение анализа показано на рисунке 1. Специально разработанная силиконовая сетка прикреплена к функционализированному слайду для создания многолуночной установки со стеклянным затвором, называемой wellmaker на следующем рисунке (рисунок 1A). За этим следует соединение 5'-аминомодифицированного праймера с функциональными группами NHS в колодцах слайда (рисунок 1B). TOP1-опосредованная реакция расщепления и лигирования превращает специфический субстрат ДНК в замкнутый круг. Субстрат, специфичный для TOP1 (рисунок 1C), спонтанно складывается в форму гантели, содержащую двухцепочечный стержень и две одноцепочечные петли. Одна из петель дополняет поверхностно-закрепленную грунтовку. Область ствола содержит излюбленный участок расщепления TOP1 с тремя основаниями вверх по течению от 3'-конца и 5'-гидроксильным свесом. Циркуляризация субстрата может быть достигнута с использованием либо клеточного/тканевого экстракта (фиг.1С), либо рекомбинантного, очищенного TOP1 (фиг.1D).
Когда субстрат расщепляется TOP1, фермент становится временно связанным с 3'-концом, и трехосновной фрагмент диффундирует, позволяя 5'-свесу отжигаться до субстрата и облегчая опосредованное TOP1 лигирование. Лигирование приводит к циркуляризации субстрата и последующей диссоциации TOP1. Замкнутый круг гибридизуется с поверхностно-анкеровой грунтовкой (фиг.1Е) и используется в качестве шаблона для изотермического усиления подвижного круга (RCA), опосредованного полимеразой phi29, которая может выполнять RCA со смещением нитей, давая 103 тандемных повторяющихся продукта. Во время стадии RCA могут быть включены флуоресцентно меченые (фиг.1F) или биотин-связанные (фиг.1G) нуклеотиды17. Включение флуоресцентно меченых нуклеотидов позволяет обнаруживать РКП либо с помощью флуоресцентного микроскопа, либо флуоресцентного сканера. Альтернативно, антибиотиновое антитело, связанное с пероксидазой хрена (HRP) (фиг.1H), может связывать биотинилированные нуклеотиды, что позволяет обнаруживать продукты свернутого круга (RCP) с использованием либо усиленной хемилюминесценции (ECL), либо путем превращения 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB) в обнаруживаемый цвет. RCA следует линейной кинетике реакции, что делает анализ REEAD непосредственно количественным, поскольку один RCP представляет собой одну РЕАКЦИЮ расщепления-лигирования, опосредованную TOP1. Здесь показано, что этот анализ может быть использован для обнаружения активности TOP1 в качестве очищенного рекомбинантного фермента или извлеченного из сырых образцов и в качестве инструмента скрининга лекарств против TOP1.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Список буферных композиций, оборудования и других необходимых материалов можно найти в Таблице материалов.
1. Клеточная культура
- Культивируйте предпочтительные клетки в подходящей среде и выращивайте их в соответствии с инструкциями. Например, выращивайте Caco2, клетки, полученные из колоректальной аденокарциномы, в минимальной незаменимой среде (MEM), дополненной 20% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 1% заменимыми аминокислотами (NEAA), 100 единицами / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина. Выдерживают клеточные культуры в увлажненном инкубаторе (5% CO2/95% воздушной атмосферы при 37 °C). Разложите клетки на колбы для культивирования тканей и разделите каждые 3 дня, чтобы поддерживать клетки при 70% слиянии.
- Соберите клетки из 70% сливающейся колбы путем обработки трипсином (0,25% трипсина, 0,02% раствора ЭДТА) и промыть фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS).
- Повторное суспендирование клеточной гранулы в PBS для регулировки концентрации в клетке до 0,5 × 106 клеток на трубку. Открутите при 200 × г в течение 5 мин и осторожно аспирируйте супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки, используемые для REEAD, должны использоваться свежими и храниться на льду. Результаты, полученные с помощью клеток Caco2, были недавно опубликованы17. Анализ был протестирован с различными клеточными линиями, включая клетки рака толстой кишки, молочной железы, легких и шейки матки 18,19,20,21,22,23, но его можно использовать со всеми сырыми биологическими образцами, содержащими TOP1, такими как ткани, кровь и слюна.
2. Подготовка функционализированных слайдов
- Прикрепите специально разработанную силиконовую изоляторную сетку к функционализированному слайду, тем самым сделав скважину. Нажмите на силикон, чтобы избежать образования пузырьков воздуха (см. Рисунок 1А).
- Приготовьте смесь 5 мкМ 5'-амино-праймера в 1x буфере печати. Добавьте 4 мкл смеси в каждую лунку и поместите скважину в камеру гибридизации с насыщенным NaCl при температурах от 15 °C до 25 °C, защищенную от света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гибридная камера может быть легко изготовлена с помощью коробки наконечника пипетки, заполненной насыщенным NaCl. Гибридизация занимает минимум 16 ч и максимум 72 ч. Последовательность 5'-амино-праймера показана на рисунке 1B. Слайды функционализированы с группами NHS, чтобы обеспечить связывание аминомодифицированных олигонуклеотидов.
3. Генерация замкнутых круговых подложек
- Приготовление замкнутых круговых субстратов с рекомбинантным TOP1 или клеточным экстрактом.
- Лизируйте клеточную гранулу 0,5 × 106 клеток в 500 мкл лизисного буфера для достижения плотности клеток 1000 клеток/мкл. Инкубируйте в течение 10 мин на льду.
- Приготовьте круговую смесь из 2 мкл 5 мкМ TOP1-специфического субстрата (последовательность субстрата следующая: 5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC TAT TTT TTT AAA AAA TCT AAG TCT AAG TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA AGA') и 2 мкл рекомбинантного фермента TOP1 или 2 мкл клеточного экстракта (см. шаг 3.1.1) в 16 мкл 1x РЕАКЦИОННЫЙ БУФЕР TOP1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация используемого рекомбинантного TOP1 зависит от выбранного метода считывания (см. Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4 и Рисунок 5). Последовательность субстрата, специфичного для TOP1 , показана на рисунке 1С. - Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C (см. рисунок 1C,D).
- Остановите реакцию, добавив 2 мкл 1% SDS.
- Приготовление закрытых циркулярных субстратов в присутствии лекарственных препаратов
- Приготовьте круговую смесь из 2 мкл 5 мкМ TOP1-специфического субстрата и 1 мкл 100% ДМСО или 1 мкл 1,6 мМ камптотецина (CPT) в 14 мкл 1x реакционного буфера TOP1. Добавьте 2 мкл 5 нг/мкл рекомбинантного фермента TOP1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Могут быть использованы другие низкомолекулярные соединения или лекарства. В этом случае должно быть произведено титрование соединения. Если соединение растворяется в растворителе, отличном от ДМСО, его следует использовать в качестве контроля вместо ДМСО. - Инкубировать в течение 1 мин при 37 °C.
- Остановите реакцию, добавив 2 мкл 1% SDS.
- Приготовьте круговую смесь из 2 мкл 5 мкМ TOP1-специфического субстрата и 1 мкл 100% ДМСО или 1 мкл 1,6 мМ камптотецина (CPT) в 14 мкл 1x реакционного буфера TOP1. Добавьте 2 мкл 5 нг/мкл рекомбинантного фермента TOP1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 3 может быть запущен параллельно с шагом 2, и круги могут храниться при 4 °C в течение ночи. Альтернативно, круги ДНК могут быть получены одновременно с этапом 4 и немедленно использованы. Последовательность субстрата, специфичного для TOP1 , показана на рисунке 1С. Субстрат складывается в форму гантели с двойной областью ствола, содержащей предпочтительное место расщепления TOP1 и две одноцепочечные петли. Открытый субстрат гантелей преобразуется в замкнутый круглый субстрат методом TOP1-опосредованного расщепления и лигирования и далее именуется кругом. Поскольку существует избыток 5'-амино-праймера, не будет конкуренции между открытыми и закрытыми СУБСТРАТАМИ, специфичными для TOP1.
4. Блокировка скважины
- Погрузите скважину в лоток размером 5 см х 5 см, заполненный буфером 1, который был предварительно нагрет до 50 °C. Используя пипетку, протолкните жидкость внутрь колодцев, чтобы убедиться, что нет пузырьков воздуха. Инкубировать в течение 30 мин при 50 °C.
- Снимите буфер 1 и смойте 2 x 1 мин с dH2O. Энергично встряхните вручную.
- Добавьте буфер 2, который был предварительно нагрет до 50 °C. Убедитесь, что в колодцах нет пузырьков воздуха. Инкубировать в течение 30 мин при 50 °C.
- Вымыть 2 х 1 мин с dH2O. Энергично встряхнуть вручную.
- Мыть с 70% EtOH в течение 1 мин. Энергично встряхните вручную.
- Дайте установке скважины высохнуть на воздухе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сжатый воздух для сушки скважин. В качестве альтернативы можно продувать воздух с помощью пипетки Пастера. Убедитесь, что колодцы сухие, прежде чем продолжить.
5. Гибридизация кругов с скважиной
- Добавьте 4 мкл окружностей (выполненных на шаге 3) к каждой соответствующей скважине.
- Поместите измельчитель в камеру влажности на 1 ч с dH2Oпри 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Камера влажности может быть изготовлена с использованием коробки для наконечников пипеток, заполненных dH2O. В качестве альтернативы, гибридизация может быть выполнена ночью при 25 ° C в камере влажности.
6. Стирка
- Промыть скважину буфером 3.
- Удалите буфер 3 и замените его буфером 4.
- Удалите буфер 4 и вымойте 70% EtOH.
- Удалите EtOH и дайте скважине высохнуть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы промывки выполняются в течение 1 мин в лотке размером 5 см х 5 см путем полного погружения горки. Всегда следите за тем, чтобы внутри скважин не было пузырьков воздуха.
7. Усиление скользящего круга
- Приготовьте смесь RCA из 1x реакционного буфера Phi29, дополненного 0,2 мкг/мкл BSA, 1 единицей полимеразы Phi29 и либо 0,25 мМ dNTP и 0,0125 мМ ATTO-488-dUTP для считывания флуоресценции, либо 0,1 мМ dATP, 0,1 мМ DTTP, 0,1 мМ dGTP, 0,09 мМ dCTP и 0,01 мМ Биотина-dCTP для считывания колориметрической/хемилюминесценции. Добавьте 4 мкл к каждой лунке. См. рисунок 1E.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление смеси RCA должно производиться на льду. При включении флуоресцентных нуклеотидов в RCA избегайте прямого света от этого этапа, чтобы защитить флуорофоры. - Инкубировать в течение 2 ч при 37 °C в камере влажности. В случае использования флуоресцентных нуклеотидов установите камеру влажности в темное время суток. См. рисунок 1F,G.
8. Стирка
- Для протоколов хемилюминесценции или колориметрического считывания промыть скважину, как на шаге 6, а затем перейти к этапу 11.
- Для протокола считывания флуоресценции снимите силиконовую сетку с помощью пинцета перед стиркой, как показано в следующих шагах.
- Мойте горку в течение 10 минут в буфере 3.
- Удалите буфер 3 и замените его буфером 4. Стирать 5 мин.
- Удалите буфер 4 и мойте в течение 1 мин в 70% EtOH.
- Удалите EtOH и дайте скважине высохнуть.
9. Визуализация изделий флуоресцентного подвижного круга с помощью флуоресцентного сканера
- Сканируйте слайд в флуоресцентном сканере с помощью фильтров, соответствующих используемому флуорофору. Используйте максимально возможный фотоумножитель, который не дает насыщенности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентный сканер, используемый для получения изображений в этом протоколе, оснащен лазером 473 нм и фильтром возбуждения FAM 490 нм, излучением 520 нм. - Импортируйте изображение в ImageJ и измените тип изображения на 8-битный (Изображение | Тип | 8-бит). Чтобы измерить полосы отдельно, ограничьте измеряемую область с помощью инструмента «Рисование прямоугольников » на панели инструментов. Нарисуйте нужную область и измерьте интенсивность (Анализ | Мера). Затем переместите первоначально нарисованную область в следующую полосу и измерьте.
- Построение данных в нужном программном обеспечении. Репрезентативные изображения, включая количественную оценку, извлеченные из ImageJ, изображены на рисунке 2.
10. Визуализация изделий флуоресцентного подвижного круга с помощью флуоресцентного микроскопа
- С помощью ручки, устойчивой к EtOH, нарисуйте положение колодцев перед удалением силиконовой сетки и промыте затвор, как на шаге 8.2. После этапов промывки установите затвор с 1 мкл монтажной среды без 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) и добавьте покровное стекло. Чтобы обеспечить визуализацию в камере, приклейте слайд на предметное стекло микроскопа размером 76 x 26 мм.
- Анализ с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного 60-кратным масляным погружным объективом и камерой. Сделайте 12-15 снимков каждого образца/колодца.
- Импорт изображений в ImageJ и складывание изображений (Изображение | Стеки | Изображение в стек). Измените тип изображения на 8-битный (Изображение | Тип | 8-бит).
- Установка порогового значения (Изображение | Настроить | Порог).
- Установите порог следующим образом: установите нижнюю панель и отрегулируйте верхнюю панель так, чтобы только правильные сигналы были красными, а фон черным. Убедитесь, что порог является как можно ниже, прежде чем реальные сигналы начнут исчезать.
- Пролистайте отдельные изображения и убедитесь, что они соответствуют изображениям, прежде чем устанавливать порог. Обратите внимание, что пороговое значение может меняться от эксперимента к эксперименту.
- Подсчет сигналов (Анализ | Анализ частиц). Убедитесь, что в настройках ImageJ установлен флажок сводное поле.
- Экспортируйте результаты в электронную таблицу или другое программное обеспечение для дальнейшей обработки данных. Репрезентативные изображения, включая количественную оценку, извлеченные из ImageJ, изображены на рисунке 3.
11. Соединение HRP-конъюгированного антибиотинового антитела с продуктами катящегося круга, мечеными биотином
- Добавьте 4 мкл HRP-конъюгированного антибиотинового антитела, разбавленного 1:300 в буфере 5, дополненном 5% обезжиренным обезжиренным молоком и 5% BSA в каждую лунку.
- Инкубировать в течение 50 мин при 15-25 °C в камере влажности (см. Рисунок 1H).
- Стирка 3 x 3 мин с буфером 5.
- Высушите скважину.
12. Визуализация продуктов прокатного круга с маркировкой биотина
- Визуализация с ECL
- Смешайте 40 мкл ECL Luminol и 40 мклH2O2 непосредственно перед использованием. Добавьте 2 мкл к каждой лунке.
- Визуализируйте слайд с помощью ПЗС-камеры или на рентгеновских пленках.
- Визуализация с помощью TMB
- После шага 11.4 снимите силиконовую сетку. Затем добавьте 400 мкл TMB поверх всего слайда и поместите слайд в камеру влажности. Подождите ~5-10 мин для развития цвета. После развития цвета промойте горку с 70% EtOH.
- Визуализируйте развитие цвета невооруженным глазом. Сфотографируйте слайд фотоаппаратом или мобильным телефоном.
- Импортируйте изображение в ImageJ и измените тип изображения на 8-битный (Изображение | Тип | 8-бит). Чтобы измерить полосы отдельно, ограничьте измеряемую область с помощью инструмента «Рисование прямоугольников » на панели инструментов. Нарисуйте нужную область и измерьте интенсивность (Анализ | Мера). Затем переместите первоначально нарисованную область в следующую полосу и измерьте.
- Построение данных в нужном программном обеспечении. Репрезентативные изображения, включая количественную оценку, извлеченную из ImageJ, изображены на рисунке 4, рисунке 5 и рисунке 6.
Representative Results
Здесь представлен протокол для определения активности TOP1 с помощью анализа REEAD16. Протокол использовался для обнаружения рекомбинантной активности TOP1 с использованием четырех различных методов считывания: флуоресцентного сканера, флуоресцентного микроскопа, хемилюминесценции и колориметрии. Протокол также использовался для обнаружения активности TOP1, извлеченного из клеток Caco2, в качестве примера сырого экстракта, с хемилюминесценцией или считыванием TMB. Кроме того, протокол использовался в качестве инструмента скрининга лекарств для обнаружения ингибирования рекомбинантной активности TOP1 CPT, в качестве примера ингибитора, специфичного для TOP1, с использованием метода считывания хемилюминесценции.
Результаты, полученные при анализе активности TOP1 с использованием флуоресцентного считывания, показаны на рисунках 2 и 3. Репрезентативное сканирование флуоресцентного слайда и полученная в результате количественная оценка показаны на рисунке 2. Как видно из количественной оценки, это считывание имеет предел обнаружения 12,5 нг ОТ TOP1. Репрезентативные изображения и полученная в результате количественная оценка, полученная при использовании считывания флуоресцентного микроскопа, показаны на рисунке 3. Используя этот метод считывания, предел обнаружения составляет всего 0,1 нг от TOP1. Результаты, полученные при анализе активности TOP1 с использованием считывания хемилюминесценции, показаны на рисунке 4, а результаты колориметрического считывания показаны на рисунке 5. Предел обнаружения этих методов считывания составляет 6 нг TOP1 или в виде TOP1, извлеченного из 312 клеток Caco2. На рисунке 6 показаны измерения активности TOP1 в присутствии 80 мкМ CPT или DMSO в качестве примера применения скрининга лекарств. Репрезентативное изображение и полученная в результате количественная оценка трех независимых экспериментов показывают, что CPT ингибирует TOP1-опосредованную циркуляризацию субстрата, как и ожидалось24,25.
Рисунок 1: Схематическое представление протокола REEAD. (A,B) Подготовка функционализированных слайдов. Силиконовая сетка крепится к функционализированному слайду. Затем 5'-амино-праймер соединяется с слайдом, тем самым обеспечивая усиление подложки, специфичной для TOP1. (С,Г) Генерация замкнутых круговых подложек. Субстрат, специфичный для TOP1, складывается в форму гантели с предпочтительным местом расщепления TOP1 в двухцепочечном стебле и последовательностью связывания грунтовки в одной из двух одноцепочечных петель. (C) TOP1 высвобождается при лизисе клеток. При TOP1-опосредованном расщеплении и перевязке субстрат превращается в замкнутый круг; (D) используется очищенный, рекомбинантный ТОП1. E) Усиление по скользящему кругу. Закрытые круглые подложки гибридизуются с поверхностно-анкеровой грунтовкой и усиливаются RCA с использованием полимеразы Phi29. RCA может быть достигнута либо путем включения флуоресцентных нуклеотидов, как в F, либо биотинилированных нуклеотидов, как в G. Продукты флуоресцентного подвижного круга визуализируются с помощью флуоресцентного микроскопа или флуоресцентного сканера. (H) Соединение HRP-конъюгированного антибиотинового антитела. Биотинилированные продукты прокатного круга инкубируют с HRP-конъюгированным антибиотиновым антителом. Развитие сигнала опосредовано ферментом HRP, и сигналы визуализируются либо ECL и обнаруживаются с помощью ПЗС-камеры, либо с помощью TMB, генерирующего колориметрическую визуализацию. Сокращения: REEAD = повышение активности ферментов по скользящему кругу; RCA = усиление скользящего круга; TOP1 = топоизомераза 1; HRP = пероксидаза хрена; ECL = усиленная хемилюминесценция; TMB = 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Измерения активности TOP1 с помощью флуоресцентного сканера. Левая панель показывает репрезентативное изображение слайда при анализе активности 3-50 нг TOP1 с использованием протокола считывания флуоресцентного сканера. Правая панель показывает результирующую количественную оценку. t-тест с поправкой Уэлча, p = 0,0064, n = 4. Аббревиатура: TOP1 = топоизомераза 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Измерения активности TOP1 с помощью флуоресцентного микроскопа. Левая панель показывает репрезентативные изображения слайда при анализе активности 0,1-12,5 нг TOP1 с использованием протокола считывания флуоресцентного микроскопа. Обратите внимание, что изображения являются обрезанными версиями, чтобы правильно показать точки. По этой причине они не похожи на количество сигналов в количественной оценке, показанной на правой панели. t-тест с поправкой Уэлча, p = 0,0136, n = 3. Аббревиатура: TOP1 = топоизомераза 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Измерения активности TOP1 с использованием считывания хемилюминесценции. (A) Левая панель показывает репрезентативное изображение слайда при анализе активности 3-50 нг TOP1 с использованием протокола считывания хемилюминесценции. Правая панель показывает результирующую количественную оценку. t-тест с поправкой Уэлча, p < 0,0001, n = 4. (B) Левая панель показывает репрезентативное изображение слайда при анализе активности TOP1, извлеченного из 156-40 000 клеток Caco2 с использованием протокола считывания хемилюминесценции. Правая панель показывает результирующую количественную оценку. t-тест с поправкой Уэлча, p = 0,0224, n = 3. Сокращения: ТОП1 = топоизомераза 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Измерения активности TOP1 с использованием колориметрического считывания. (A) Левая панель показывает репрезентативное изображение слайда при анализе 3-50 нг TOP1 с использованием протокола колориметрического считывания. Правая панель показывает результирующую количественную оценку. t-тест с поправкой Уэлча, p = 0,0012, n = 4. (B) Левая панель показывает репрезентативное изображение слайда при анализе активности TOP1, извлеченного из 156-40 000 клеток Caco2 с использованием протокола колориметрического считывания. Правая панель показывает результирующую количественную оценку. t-тест с поправкой Уэлча, p = 0,0117, n = 3. Сокращения: ТОП1 = топоизомераза 1; TMB = 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Измерения активности TOP1 после медикаментозного лечения с использованием протоколов считывания хемилюминесценции. Левая панель показывает репрезентативное изображение слайда при анализе 10 нг ТОП1 в присутствии 5% DMSO или 80 мкМ CPT в течение 1 мин. Правая панель показывает результирующую количественную оценку. t-тест с поправкой Уэлча, p = 0,0017, n = 3. Сокращения: ТОП1 = топоизомераза 1; CPT = камптотецин; ДМСО = диметилсульфоксид; Neg = отрицательный контроль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Топоизомеразы представляют собой класс ДНК-модифицирующих ферментов, которые привлекают высокий исследовательский и клинический интерес, являясь мишенью низкомолекулярных соединений с потенциальным эффектом в противоопухолевом лечении или в борьбе с инфекционными заболеваниями. Более того, активность человека ТОП1 зарекомендовала себя как эффективный биомаркер прогноза рака и лечения 18,19,23. Хотя именно активность TOP1 влияет на эффективность химиотерапевтического ингибитора26, часто именно количество ДНК-РНК или количество TOP1 оценивается в клинических условиях. Это связано с отсутствием быстрых, простых и свободных от геля инструментов, которые могут обеспечить точную и точную количественную оценку активности топоизомеразы в любых лабораторных условиях.
Здесь описан протокол анализа REEAD, позволяющий измерять активность TOP1 без геля. В этом протоколе очищенный TOP1 или сырой экстракт из клеток инкубируется со специально разработанным СУБСТРАТОМ в форме гантели ДНК, который при расщеплении/ лигировании, опосредованном TOP1, превращается в замкнутую круглую молекулу. Затем круги гибридизуются на стеклянной поверхности и усиливаются RCA. Чтобы обеспечить простоту использования при выполнении реакций, происходящих на слайде, силиконовая сетка прикреплена к стеклу, создавая отдельные колодцы, где происходят реакции. Таким образом, протокол использует преимущества многолуночной системы - силиконовой сетки, называемой wellmaker.
Протокол использовался для обнаружения активности рекомбинантных TOP1 и TOP1, извлеченных из клеток колоректальной аденокарциномы Caco2, использованных в качестве примера. Более того, в качестве примера REEAD, который будет использоваться в качестве инструмента скрининга лекарств, протокол был использован для обнаружения ингибирования активности TOP1 известным ингибитором TOP1 CPT 24,25. Анализ сочетался с различными методами считывания показаний – флуоресцентной микроскопией, дающей высокую чувствительность, и флуоресцентным сканером, хемилюминесцентным или колориметрическим, которые требуют менее специализированного оборудования и обучения. Высокочувствительное считывание флуоресцентного микроскопа имеет ограничения, заключающиеся в необходимости качественной настройки флуоресцентного микроскопа, квалифицированного персонала и трудоемкого получения и анализа изображений.
По этим причинам флуоресцентный сканер считывает, что позволяет быстрее собирать и анализировать даже если за счет представленной чувствительности. В случае отсутствия флуоресцентного сканера можно рассмотреть две отличные альтернативы, методы хемилюминесценции и колориметрического считывания. Оба метода быстры и просты, не требуют дорогостоящего оборудования или специализированной подготовки. Во всех форматах считывания REEAD имеет много преимуществ по сравнению с современными анализами, которые являются более трудоемкими, основанными на геле (с требованиями интеркалирующих агентов) и менее непосредственно количественными. Тем не менее, в представленном протоколе есть несколько критических шагов. При проведении скрининга лекарственного средства временные точки, концентрация препарата и соотношение количества ТОП1/СУБСТРАТ ДНК должны быть оптимизированы по сравнению с описанными настройками, оптимизированными для CPT. Препарат можно исследовать, выполняя преинкубацию с субстратом ДНК или преинкубацию с ферментом TOP1. Это может дать ценную информацию о способности молекулы ингибировать TOP1 и дать представление о механизме действия препарата.
Более того, если вы испытываете низкие или отсутствующие сигналы, это, скорее всего, связано с неэффективным лизисом сырого образца или деградацией TOP1 в экстракте из-за неправильного использования ингибиторов протеазы. Кроме того, это также может быть связано с недостаточным хранением важных компонентов анализа, таких как рекомбинантная TOP1, полимераза phi29, нуклеотиды, субстрат и праймер. Наконец, следует избегать повторных циклов замораживания-оттаивания олигонуклеотидов, так как это резко влияет на эффективность анализа. При использовании сырого экстракта эффективность экстракции конкретного биологического образца должна быть оптимизирована, а количество и активность TOP1 могут отличаться от примера, представленного здесь. По этой причине каждый сырой экстракт, подлежащий испытанию, потребует титрования для определения предела обнаружения анализа и диапазона чувствительности при использовании этого конкретного образца. Протокол был оптимизирован для обнаружения человека TOP1. Активность других эукариотических TOP1 можно измерить, но концентрацию NaCl и время инкубации, возможно, потребуется оптимизировать в соответствии с методом очистки ферментов и оптимальной активностью фермента. Более циркуляризированные субстраты будут результатом длительной инкубации, тогда как меньше циркуляризированных субстратов будет результатом укороченной инкубации.
В дополнение к представленным приложениям, REEAD позволяет измерять активность TOP1 в сырых экстрактах из небольших биопсий больных раком18, прогнозировать цитотоксический противоопухолевый эффект CPT в линиях раковых клеток 20,21,22 и даже обнаружение активности фермента в отдельных клетках 20,21 . Кроме того, представленная настройка REEAD с использованием скважины позволяет проводить скрининг на основе нескольких скважин в библиотеках синтетических или природных соединений. В дополнение к этому была разработана модифицированная версия анализа REEAD, называемая REEAD C/L. Эта установка позволяет проводить отдельные исследования стадий расщепления и перевязки реакции TOP127. С помощью REEAD C/L можно определить механизм действия ингибиторов малых молекул и охарактеризовать их как каталитические ингибиторы TOP1 с потенциальными противопаразитарными эффектами28 или как яды TOP1, используемые для противоопухолевого лечения24,25. Наконец, со специфическим редизайном субстратов ДНК в соответствии с различными требованиями (для связывания ДНК или расщепления-лигирования) других ферментов TOP1, REEAD также использовался для выявления инфекционных заболеваний (например, в случае Plasmodium falciparum, вызывающего малярию29) или Leishmania donovani и вируса оспы обезьян (данные не показаны). Или он может быть использован для идентификации низкомолекулярных соединений с антипатогенными эффектами. Представленный протокол предоставляет ученым в области TOP1 простой метод обнаружения активности ферментов практически без оптимизации и с возможностью адаптации к еще более широким приложениям в будущем.
Disclosures
Авторы C.T. и K.M. являются сотрудниками VPCIR biosciences ApS. C.T., B.R.K. и M.S. являются акционерами и/или держателями опционов на акции. C.T., B.R.K. и M.S. заявляют, что они названы изобретателями патента EP2022/057172, поданного от имени VPCIR biosciences ApS. Другие авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить лаборанта Норико Ю. Хансена, кафедру молекулярной биологии и генетики Орхусского университета, за техническую помощь в отношении очистки ферментов Phi29 и TOP1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Camera for fluorescence image analysis | |||
| CCD camera | For chemiluninescence image analysis | ||
| Fluorescence microscope | Olympus | Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
| Fluorescence scanner | Typhoon | FLA 9500 | Equipped with 473 laser and FAM filter |
| Humidity chamber with dH2O | |||
| Hybridization chamber with saturated NaCl | |||
| ImageJ software | Fiji | Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Materials | |||
| Cell culture | |||
| Cell growth medium appropiate for the chosen cell line | |||
| Trypsin | Sigma | #T4174 | |
| Pen strep | Sigma | #P4300 | |
| Tissue culture flasks | ThermoFisher | #178983 | |
| FBS | Gibco | #10270106 | |
| NEEA | Sigma | #M7145 | |
| PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
| Functionalized slides | |||
| 5'-amine anti-TOP1 primer | Sigma | 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’ | |
| Activated Codelink HD slides | SurModics | #DHD1-0023 | |
| Silicon grid | Grace-biolabs | Custom made | |
| Pertex glue | Histolabs | #00801 | |
| Microscope slide 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Other microscope slide of same dimension can be used |
| DNA circles and rolling circle amplification | |||
| TOP1 specific substrate | Sigma | 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’ | |
| ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
| Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
| dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
| Phi29 polymerase | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
| Recombinant TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
| Detection of rolling circle products | |||
| BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
| Cover glass | |||
| ECL mixture | Cytiva | #RPN2236 | |
| HRP conjugated anti-biotin antibody | Merck | #A4541 | |
| Mounting medium (vectachield) | Vector laboratories | #H-1000 | |
| Buffer list | |||
| 1x PE Buffer | 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O | ||
| 6x Print Buffer | 300 mM Na3PO4, pH 8.5 | ||
| Blocking solution | Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9 | ||
| Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors | ||
| 10x TOP1 Reaction Buffer | 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | ||
| 10x Phi29 Reaction Buffer | 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT | ||
| Buffer 1 | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 2 | 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS | ||
| Buffer 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Buffer 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Chemicals for buffers | |||
| Tris | Sigma | #T1506 | |
| HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
| EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
| PMSF | Sigma | #05056489001 | |
| SDS | Applichem | #436143 | |
| Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
| NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
| Ethanolamine | Sigma | #411000 | |
| SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
| Tris-acetate | Sigma | #T1258 | |
| Mg-acetate | Sigma | #M0631 | |
| K-acetate | Sigma | #1.04820.1000 | |
| Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
| DTT | Sigma | #D0632 | |
| CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
| MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
| NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
| Skimmed milk powder | Sigma | #70166 | |
| BSA | Sigma | #A4503 |
References
- Baldwin, E. L., Osheroff, N. Etoposide, topoisomerase II and cancer. Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents. 5 (4), 363-372 (2005).
- Gilbert, D. C., Chalmers, A. J., El-Khamisy, S. F. Topoisomerase I inhibition in colorectal cancer: Biomarkers and therapeutic targets. British Journal of Cancer. 106 (1), 18-24 (2012).
- Ikeguchi, M., et al. TopoisomeraseI expression in tumors as a biological marker for CPT-11 chemosensitivity in patients with colorectal cancer. Surgery Today. 41 (9), 1196-1199 (2011).
- Meisenberg, C., et al. Clinical and cellular roles for TDP1 and TOP1 in modulating colorectal cancer response to irinotecan. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (2), 575-585 (2015).
- Palshof, J. A., et al. Topoisomerase I copy number alterations as biomarker for irinotecan efficacy in metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 17 (1), 1-10 (2017).
- Proszek, J., et al. Topoisomerase I as a biomarker: Detection of activity at the single molecule level. Sensors. 14 (1), 1195-1207 (2014).
- Leppard, J. B., Champoux, J. J. Human DNA topoisomerase I: Relaxation, roles, and damage control. Chromosoma. 114 (2), 75-85 (2005).
- Champoux, J. J. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 369-413 (2001).
- Redinbo, M. R., et al. Crystal structures of human topoisomerase I in covalent and noncovalent complexes with DNA. Science. 279 (5356), 1504-1513 (1998).
- Nitiss, J. L., Soans, E., Rogojina, A., Seth, A., Mishina, M.
- Tesauro, C., et al. Erybraedin C, a natural compound from the plant Bituminaria bituminosa, inhibits both the cleavage and religation activities of human topoisomerase I. Biochemical Journal. 425 (3), 531-539 (2010).
- Keller, J. G., et al. Topoisomerase 1 inhibits MYC promoter activity by inducing G-quadruplex formation. Nucleic Acids Research. 50 (11), 6332-6342 (2022).
- Christiansen, K., Westergaard, O. Characterization of intra- and intermolecular DNA ligation mediated by eukaryotic topoisomerase I. Role of bipartite DNA interaction in the ligation process. Journal of Biological Chemistry. 269 (1), 721-729 (1994).
- Svejstrup, J. Q., Christiansen, K., Andersen, A. H., Lund, K., Westergaard, O. Minimal DNA duplex requirements for topoisomerase I-mediated cleavage in vitro. Journal of Biological Chemistry. 265 (1), 12529-12535 (1990).
- Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 283-299 (2018).
- Stougaard, M., et al. Single-molecule detection of human topoisomerase I cleavage-ligation activity. ACS Nano. 3 (1), 223-233 (2009).
- Keller, J. G., Petersen, K. V., Knudsen, B. R., Tesauro, C. Simple and fast DNA-based tool to investigate topoisomerase 1 activity, a biomarker for drug susceptibility in colorectal cancer. Recent Underst. Colorectal Cancer Treatment. , (2022).
- Jakobsen, A. K., et al. Correlation between topoisomerase I and tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 activities in non-small cell lung cancer tissue. Experimental and Molecular Pathology. 99 (1), 56-64 (2015).
- Jakobsen, A. K., et al. TDP1 and TOP1 as targets in anticancer treatment of NSCLC: Activity and protein level in normal and tumor tissue from 150 NSCLC patients correlated to clinical data. Lung Cancer. 164, 23-32 (2022).
- Keller, J. G., et al. On-slide detection of enzymatic activities in selected single cells. Nanoscale. 9 (36), 13546-13553 (2017).
- Keller, J. G., Stougaard, M., Knudsen, B. R.
- Tesauro, C., et al. Different camptothecin sensitivities in subpopulations of colon cancer cells correlate with expression of different phospho-isoforms of topoisomerase i with different activities. Cancers. 12 (5), 1240 (2020).
- Tesauro, C., et al. Topoisomerase i activity and sensitivity to camptothecin in breast cancer-derived cells: A comparative study. BMC Cancer. 19 (1), 1-15 (2019).
- Pommier, Y. DNA topoisomerase I Inhibitors: Chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chemical Reviews. 109 (7), 2894-2902 (2009).
- Pommier, Y. Drugging topoisomerases: lessons and challenges. ACS Chemical Biology. 8 (1), 82-95 (2013).
- Bailly, C. Irinotecan: 25 years of cancer treatment. Pharmacological Research. 148, 104398 (2019).
- Petersen, K. V., et al. Simple and fast dna based sensor system for screening of small-molecule compounds targeting eukaryotic topoisomerase 1. Pharmaceutics. 13 (8), 1255 (2021).
- García-Estrada, C., Prada, C. F., Fernández-Rubio, C., Rojo-Vázquez, F., Balaña-Fouce, R. DNA topoisomerases in apicomplexan parasites: promising targets for drug discovery. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277 (1689), 1777-1787 (2010).
- Hede, M. S., et al. Detection of the malaria causing Plasmodium parasite in saliva from infected patients using topoisomerase I activity as a biomarker. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
