Ett protokoll för känslig och kvantitativ detektion av topoisomeras 1-aktivitet med användning av rolling circle-testet för förbättrad enzymaktivitetsdetektering beskrivs. Metoden möjliggör detektion av topoisomeras 1-aktivitet från renade komponenter eller cell-/vävnadsextrakt. Detta protokoll har omfattande tillämpningar inom alla områden som involverar detektion av enzymatisk aktivitet.
Isotermiska förstärkningsbaserade tekniker såsom rullande cirkelförstärkning har framgångsrikt använts för detektion av nukleinsyror, proteinmängder eller andra relevanta molekyler. Dessa metoder har visat sig vara betydande alternativ till PCR eller ELISA för kliniska och forskningstillämpningar. Dessutom är detektionen av proteinmängd (med Western blot eller immunohistokemi) ofta otillräcklig för att ge information för cancerdiagnos, medan mätningen av enzymaktivitet utgör en värdefull biomarkör. Mätning av enzymaktivitet möjliggör också diagnos och potentiell behandling av patogenburna sjukdomar. I alla eukaryoter är topoisomeraser de viktigaste DNA-bindande enzymerna som är involverade i kontrollen av DNA-topologiskt tillstånd under viktiga cellulära processer och är bland de viktiga biomarkörerna för cancerprognos och behandling.
Under årens lopp har topoisomeraser undersökts väsentligt som ett potentiellt mål för antiparasitiska och cancerläkemedel med bibliotek av naturliga och syntetiska småmolekylära föreningar som undersöks varje år. Här presenteras rullande cirkelförstärkningsmetod, kallad rolling circle enhanced enzyme activity detection (REEAD) analys som möjliggör kvantitativ mätning av topoisomeras 1 (TOP1) aktivitet på ett enkelt, snabbt och gelfritt sätt. Genom att klyva och ligera ett specialdesignat DNA-substrat omvandlar TOP1 en DNA-oligonukleotid till en sluten cirkel, som blir mallen för rullande cirkelförstärkning, vilket ger ~ 103 tandem upprepade rullande cirkelprodukter. Beroende på nukleotidinkorporeringen under förstärkningen finns det möjlighet till olika avläsningsmetoder, från fluorescens till kemiluminescens till kolorimetrisk. Eftersom varje TOP1-medierad klyvningsligering genererar en sluten DNA-cirkel är analysen mycket känslig och direkt kvantitativ.
Topoisomeraser tillhör klassen DNA-modifierande enzymer och många av dessa har visat sig användbara som biomarkörer för mänskliga sjukdomar 1,2,3,4,5,6. TOP1 är involverad i att lösa den topologiska stressen i samband med cellulära processer såsom DNA-replikation, gentranskription, rekombination och kromosomal segregering7. TOP1 kan lösa både negativa och positiva superspolar genom en mekanism som involverar bildandet av ett övergående enkelsträngat brott i DNA 8,9. Efter bindning till DNA positionerar TOP1 det aktiva tyrosinet (Tyr723) för att utföra en nukleofil attack på fosfodiester-ryggraden. Ett TOP1-DNA-klyvningskomplex genereras sedan med enzymet kovalent fäst vid 3′-änden av den trasiga DNA-strängen. Detta frigör vridspänningar genom att låta 5′-änden av den klyvda strängen rotera runt den intakta strängen. Slutligen utför hydroxylgruppen i 5′-änden en nukleofil attack på 3′-fosfotyrosylbindningen. Som ett resultat frigörs TOP1 och DNA-ryggraden återställs8.
Flera analyser har utvecklats för att undersöka stegen i TOP1-katalytiska cykeln, inklusive avslappningsanalysen10, den elektrophoretiska mobilitetsskiftanalysen (EMSA) 11,12, DNA-självmordsklyvnings-ligeringsanalyserna 13,14 och in vivo-komplexet av enzymer (ICE) -analys 15 . Dessa analyser har dock flera begränsningar eftersom de är beroende av gelelektrofores, vilket kräver DNA-interkaleringsmedel, eller de kräver högspecialiserad utbildning och utrustning. Dessutom kräver analyserna stora mängder renat TOP1-enzym (från 1 till 5 ng för avslappningsanalysen och 50 till 200 ng för EMSA och klyvnings-ligeringsanalysen) eller extrakt från minst 106 celler för att fungera optimalt. Därför har en mycket känslig metod som möjliggör specifik detektion av TOP1-aktivitet i råa biologiska prover och på den enda katalytiska händelsenivån, kallad REEAD-analysen, utvecklats16.
Här presenteras ett protokoll för detektering av TOP1-aktivitet med REEAD-analys16 . En schematisk representation av analysen visas i figur 1. Ett specialdesignat silikongaller är fäst vid en funktionaliserad bild för att skapa en glasskiva multiwell-installation, kallad wellmaker i följande (figur 1A). Detta följs av koppling av en 5′-aminomodifierad primer till de funktionella NHS-grupperna i borrmassans brunnar (figur 1B). TOP1-medierad klyvning och ligeringsreaktion omvandlar ett specifikt DNA-substrat till en sluten cirkel. Det TOP1-specifika substratet (figur 1C) viks spontant till en hantelform som innehåller en dubbelsträngad stam och två enkelsträngade slingor. En av slingorna kompletterar den ytförankrade primern. Stamregionen innehåller en gynnad TOP1-klyvningsplats tre baser uppströms från 3′-änden och ett 5′-hydroxylöverhäng. Cirkularisering av substratet kan uppnås med antingen cell-/vävnadsextrakt (figur 1C) eller rekombinant, renad TOP1 (figur 1D).
När substratet klyvs av TOP1 blir enzymet övergående bundet till 3′-änden och trebasfragmentet diffunderar, vilket gör att 5′-överhänget kan glödgas till substratet och underlätta TOP1-medierad ligering. Ligeringen resulterar i cirkularisering av substratet och därefter dissociationen av TOP1. Den slutna cirkeln hybridiseras till den ytförankrade primern (figur 1E) och används som en mall för isotermisk rullande cirkelförstärkning (RCA) medierad av phi29-polymeraset, som kan utföra RCA med strängförskjutning, vilket ger 103 tandemupprepningsprodukter. Under RCA-steget kan fluorescerande märkta (figur 1F) eller biotinkopplade (figur 1G) nukleotider införlivas17. Införlivande av fluorescerande märkta nukleotider möjliggör detektion av RCP: erna antingen med hjälp av ett fluorescensmikroskop eller en fluorescensskanner. Alternativt kan en pepparrotsperoxidas (HRP)-kopplad antibiotinantikropp (figur 1H) binda de biotinylerade nukleotiderna, vilket möjliggör detektion av de rullade cirkelprodukterna (RCP) med användning av antingen förbättrad kemiluminescens (ECL) eller genom omvandling av 3,3′,5,5′-tetrametylbenzidin (TMB) till en detekterbar färg. RCA följer en linjär reaktionskinetisk, vilket gör REEAD-analysen direkt kvantitativ, eftersom en RCP representerar en enda TOP1-medierad klyvningsligeringsreaktion. Här visas att denna analys kan användas för att detektera TOP1-aktivitet som ett renat rekombinant enzym eller extraheras från råprover och som ett anti-TOP1-läkemedelsscreeningsverktyg.
Topoisomeraser representerar en klass av DNA-modifierande enzymer som lockar hög forskning och kliniskt intresse, vilket är målet för småmolekylära föreningar med potentiell effekt vid behandling mot cancer eller i kampen mot infektionssjukdomar. Dessutom har aktiviteten hos human TOP1 visat sig vara en effektiv biomarkör för cancerprognos och behandling18,19,23. Även om det är TOP1-aktiviteten som påverkar effekten av en kemoterapeutisk hämmare26, är det ofta mängden DNA-RNA eller mängden TOP1 som bedöms i kliniska miljöer. Detta beror på bristen på snabba, enkla och gelbaserade fria verktyg som kan ge exakt och exakt kvantifiering av topoisomerasaktivitet i alla laboratorieinställningar.
Här beskrivs ett protokoll för REEAD-analysen som möjliggör mätning av TOP1-aktivitet på ett gelfritt sätt. I detta protokoll inkuberas renat TOP1- eller råextrakt från celler med ett specialdesignat DNA-hantelformat substrat som vid klyvning/ligering medierat av TOP1 omvandlas till en sluten, cirkulär molekyl. Cirklarna hybridiseras sedan på en glasyta och förstärks av RCA. För att möjliggöra enkel användning vid utförandet av reaktioner som händer på bilden är ett silikonnät fäst vid glaset, vilket gör enskilda brunnar där reaktionerna äger rum. På detta sätt utnyttjar protokollet ett multiwell-system – ett silikonnät som kallas wellmaker.
Protokollet användes för att detektera aktiviteten hos rekombinanta TOP1 och TOP1 extraherade från kolorektal adenokarcinomceller Caco2, som används som ett exempel. Dessutom, som ett exempel på REEAD som ska användas som ett läkemedelsscreeningsverktyg, användes protokollet för att detektera TOP1-aktivitetshämning av den välkända TOP1-hämmaren CPT24,25. Analysen var kopplad till olika avläsningsmetoder-fluorescensmikroskopi, vilket ger en hög känslighet, och en fluorescensskanner, kemiluminescens eller kolorimetrisk, som kräver mindre specialiserad utrustning och utbildning. Den mycket känsliga fluorescensmikroskopavläsningen har begränsningarna av behovet av en fluorescensmikroskopinställning av god kvalitet, skicklig personal och tidskrävande bildförvärv och analys.
Av dessa skäl avläses fluorescensskannern som möjliggör snabbare förvärv och analys även om det är på bekostnad av känsligheten presenteras. Vid brist på en fluorescensskanner kan två utmärkta alternativ, kemiluminescens och kolorimetriska avläsningsmetoder, övervägas. Båda metoderna är snabba och enkla och kräver ingen dyr utrustning eller specialutbildning. I alla avläsningsformat har REEAD många fördelar jämfört med de senaste analyserna, som är mer tidskrävande, gelbaserade (med kraven på interkaleringsmedel) och mindre direkt kvantitativa. Det finns dock några kritiska steg i det presenterade protokollet. Vid hantering av läkemedelsscreeningen bör tidpunkterna, läkemedelskoncentrationen och förhållandet mellan TOP1-mängden / DNA-substratet optimeras jämfört med de beskrivna inställningarna optimerade för CPT. Läkemedlet kan undersökas genom att utföra en preinkubation med DNA-substratet eller en preinkubation med TOP1-enzymet. Detta kan ge värdefull information om molekylens förmåga att hämma TOP1 och ge insikt i läkemedlets verkningsmekanism.
Dessutom, om man upplever låga eller frånvarande signaler, beror detta troligen på en ineffektiv lys av råprovet eller en nedbrytning av TOP1 i extraktet på grund av felaktig användning av proteashämmare. Dessutom kan detta också bero på otillräcklig lagring av de viktiga analyskomponenterna, såsom rekombinant TOP1, phi29-polymeras, nukleotider, substrat och primer. Slutligen bör upprepade frys-tina cykler av oligonukleotiderna undvikas, eftersom detta dramatiskt påverkar analysprestandan. När råextrakt används måste extraktionseffektiviteten för det specifika biologiska provet optimeras och mängden och aktiviteten för TOP1 kan variera från det exempel som rapporteras här. Av denna anledning kommer varje råextrakt som ska testas att kräva en titrering för identifiering av analysdetekteringsgränsen och känslighetsintervallet vid användning av det specifika provet. Protokollet har optimerats för detektering av human TOP1. Aktiviteten hos andra eukaryota TOP1 kan mätas, men NaCl-koncentrationen och inkubationstiden kan behöva optimeras enligt enzymreningsmetoden och optimal enzymaktivitet. Mer cirkulära substrat kommer att bli resultatet av långvarig inkubation, medan färre cirkulära substrat kommer att bli resultatet av förkortad inkubation.
Förutom de presenterade applikationerna möjliggör REEAD mätning av TOP1-aktiviteten i råa extrakt från små biopsier från cancerpatienter18, förutsägelsen av den cytotoxiska anticancereffekten av CPT i cancercellinjer 20,21,22 och till och med detektering av enzymaktiviteten i enstaka celler20,21 . Dessutom möjliggör den presenterade REEAD-inställningen med hjälp av wellmaker multiwell-baserad drogscreening av bibliotek av syntetiska eller naturliga föreningar. Utöver detta har en modifierad version av REEAD-analysen, kallad REEAD C / L, utvecklats. Denna inställning möjliggör separata undersökningar av klyvnings- och ligeringsstegen i TOP1-reaktionen27. Med REEAD C / L är det möjligt att bestämma verkningsmekanismen för småmolekylära hämmare och karakterisera dem som TOP1-katalytiska hämmare med potentiella antiparasitiska effekter28 eller som TOP1-gifter som ska användas för cancerbehandling24,25. Slutligen, med specifik redesign av DNA-substraten för att matcha de olika kraven (för DNA-bindning eller klyvningsligering) av andra TOP1-enzymer, har REEAD också använts för detektion av infektionssjukdomar (som i fallet med Plasmodium falciparum, som orsakar malaria29) eller Leishmania donovani och Monkeypox-virus (data visas inte). Eller det kan användas för att identifiera småmolekylära föreningar med antipatogena effekter. Det presenterade protokollet ger forskare inom TOP1-området en enkel metod för att upptäcka enzymaktivitet med liten eller ingen optimering och med möjlighet att anpassas till ännu bredare applikationer i framtiden.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka laboratorietekniker Noriko Y. Hansen, Institutionen för molekylärbiologi och genetik, Aarhus universitet, för tekniskt stöd i samband med Phi29- och TOP1-enzymrening.
Equipment | |||
Camera for fluorescence image analysis | |||
CCD camera | For chemiluninescence image analysis | ||
Fluorescence microscope | Olympus | Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
Fluorescence scanner | Typhoon | FLA 9500 | Equipped with 473 laser and FAM filter |
Humidity chamber with dH2O | |||
Hybridization chamber with saturated NaCl | |||
ImageJ software | Fiji | Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
Materials | |||
Cell culture | |||
Cell growth medium appropiate for the chosen cell line | |||
Trypsin | Sigma | #T4174 | |
Pen strep | Sigma | #P4300 | |
Tissue culture flasks | ThermoFisher | #178983 | |
FBS | Gibco | #10270106 | |
NEEA | Sigma | #M7145 | |
PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
Functionalized slides | |||
5'-amine anti-TOP1 primer | Sigma | 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’ | |
Activated Codelink HD slides | SurModics | #DHD1-0023 | |
Silicon grid | Grace-biolabs | Custom made | |
Pertex glue | Histolabs | #00801 | |
Microscope slide 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Other microscope slide of same dimension can be used |
DNA circles and rolling circle amplification | |||
TOP1 specific substrate | Sigma | 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’ | |
ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
Phi29 polymerase | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
Recombinant TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
Detection of rolling circle products | |||
BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
Cover glass | |||
ECL mixture | Cytiva | #RPN2236 | |
HRP conjugated anti-biotin antibody | Merck | #A4541 | |
Mounting medium (vectachield) | Vector laboratories | #H-1000 | |
Buffer list | |||
1x PE Buffer | 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O | ||
6x Print Buffer | 300 mM Na3PO4, pH 8.5 | ||
Blocking solution | Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9 | ||
Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors | ||
10x TOP1 Reaction Buffer | 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | ||
10x Phi29 Reaction Buffer | 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT | ||
Buffer 1 | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C. | ||
Buffer 2 | 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C. | ||
Buffer 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS | ||
Buffer 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
Buffer 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
Chemicals for buffers | |||
Tris | Sigma | #T1506 | |
HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
PMSF | Sigma | #05056489001 | |
SDS | Applichem | #436143 | |
Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
Ethanolamine | Sigma | #411000 | |
SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
Tris-acetate | Sigma | #T1258 | |
Mg-acetate | Sigma | #M0631 | |
K-acetate | Sigma | #1.04820.1000 | |
Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
DTT | Sigma | #D0632 | |
CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
Skimmed milk powder | Sigma | #70166 | |
BSA | Sigma | #A4503 |