Summary
Настоящая работа описывает новый экспериментальный протокол, который использует 3D-печатный держатель для обеспечения визуализации живых клеток с высоким разрешением энуклеированных глобусов. Благодаря этому протоколу клеточная сигнальная активность кальция в раненом эпителии роговицы из глобусов ex vivo может наблюдаться в режиме реального времени.
Abstract
Заживление эпителиальной раны роговицы – это миграционный процесс, инициируемый активацией пуринергических рецепторов, экспрессируемых на эпителиальных клетках. Эта активация приводит к событиям мобилизации кальция, которые распространяются от клетки к клетке, которые необходимы для инициирования клеточной подвижности в раневом слое, способствуя эффективному заживлению ран. Лаборатория Тринкауса-Рэндалла разработала методологию визуализации реакции заживления ран роговицы в шарах мышей ex vivo в режиме реального времени. Этот подход включает в себя энуклеацию неповрежденного глобуса от мыши, которая была усыплена в соответствии с установленными протоколами, и немедленную инкубацию земного шара с помощью индикаторного красителя кальция. На этом этапе может быть применено встречное пятно, которое окрашивает другие особенности клетки, чтобы помочь с визуализацией и показать клеточные ориентиры. Протокол хорошо работал с несколькими различными красителями живых клеток, используемыми для контрокраширования, включая Актин SiR для окрашивания актина и темно-красное окрашивание плазматической мембраны для окрашивания клеточной мембраны. Чтобы исследовать реакцию на рану, эпителий роговицы повреждается с помощью иглы 25 G, а глобусы помещаются в 3D-печатный держатель. Размеры 3D-печатного держателя калибруются для обеспечения иммобилизации земного шара на протяжении всего эксперимента и могут быть изменены для размещения глаз разных размеров. Визуализация реакции раны живыми клетками выполняется непрерывно на различных глубинах по всей ткани с течением времени с использованием конфокальной микроскопии. Этот протокол позволяет нам генерировать изображения с высоким разрешением и качеством публикации с использованием 20-кратного воздушного объектива на конфокальном микроскопе. Другие цели также могут быть использованы для этого протокола. Он представляет собой значительное улучшение качества визуализации живых клеток в шарах мышей ex vivo и позволяет идентифицировать нервы и эпителий.
Introduction
Роговица
Роговица представляет собой четкую, аваскулярную структуру, покрывающую переднюю поверхность глаза, которая преломляет свет, чтобы обеспечить зрение и защищает внутреннюю часть глаза от повреждений. Поскольку роговица подвергается воздействию окружающей среды, она подвержена повреждениям как от механических причин (царапины), так и от инфекции. Травма роговицы у здорового пациента обычно заживает в течение 1-3 дней. Однако у пациентов с основными состояниями, включая дефицит лимбальных стволовых клеток и диабет II типа, процесс заживления ран роговицы может быть значительно продлен1. Поскольку роговица сильно иннервируется, эти незаживающие язвы роговицы и рецидивирующие эрозии роговицы очень болезненны и значительно снижают качество жизни пациентов, испытывающих их1.
Передача сигналов сотовой связи
Когда в противном случае здоровая роговица повреждена, сигнальные события кальция в клетках, прилегающих к ране, предшествуют и вызывают клеточную миграцию в раневое ложе, где они закрывают травму без риска рубцевания 2,3. Эти сигнальные события были хорошо охарактеризованы в моделях культур эпителиальных клеток роговицы с использованием визуализации живых клеток2. Предварительные эксперименты демонстрируют значительно большую передачу сигналов кальция после травмы в недиабетических клетках по сравнению с диабетическими клетками. Однако характеристика событий передачи сигналов клетками в глобусах ex vivo оказалась технической проблемой.
Визуализация живых клеток
Предыдущие исследования успешно регистрировали сигнальные события кальция из моделей посева клеток in vitro заживления ран роговицы 4,5,6. Разработка методологии для получения высококачественных изображений этих сигнальных событий в ткани ex vivo представляет большой интерес, поскольку она позволила бы изучать эти события в более сложной и реалистичной системе. Предыдущие подходы включали рассечение роговицы с последующей иммобилизацией в УФ-индуцированном геле PEG 7,8,9. Иммобилизация является важным, но сложным шагом при работе с живой тканью, поскольку она должна оставаться жизнеспособной и гидратированной на протяжении всего эксперимента. Кроме того, иммобилизация не должна повреждать ткани. В то время как раствор PEG обездвиживал ткань, разрешение и качество полученных изображений не были последовательными. Поэтому были разработаны 3D-печатные держатели для иммобилизации неповрежденных глобусов для получения изображений более высокого качества с меньшим риском повреждения тканей.
Подход
Уникальный 3D-печатный держатель был разработан для иммобилизации неповрежденных глобусов ex vivo для визуализации живых клеток. Этот держатель предотвращает повреждение от двух основных источников: он позволяет визуализировать энуклеированный глобус без необходимости рассечения роговицы и исключает воздействие ультрафиолетового света. Без этих источников повреждений полученные изображения более точно представляли реакцию на царапины, сделанные экспериментально. Кроме того, держатель для 3D-печати был откалиброван в соответствии с точными размерами мышиного глаза. Это обеспечило гораздо лучшую посадку, чем иммобилизация в растворе ПЭГ, что привело к более высокому качеству изображения при более мощных объективах из-за уменьшения движения тканей. Крышка, прикрепленная к верхней части держателя, гарантирует, что глобус остается неподвижным на протяжении всего эксперимента и что при применении питательных сред для поддержания гидратации и жизнеспособности не происходит смещения земного шара. Возможность печати держателя до точных размеров также позволяет нам генерировать оптимальную посадку для мышиных глаз разных размеров из-за возраста или статуса заболевания. Эта технология может быть применена более широко для разработки держателей для глаз различных видов на основе их размеров.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры с участием животных были одобрены Ассоциацией исследований в области зрения и офтальмологии для использования животных в офтальмологической помощи и исследованиях зрения и протоколом IACUC Бостонского университета (201800302).
1. Проектирование 3D-печатных держателей и обложек
- Спроектируйте 3D-печатные держатели и обложку с учетом среднего диаметра глобусов мыши и напечатайте дизайн на 3D-принтере (рисунок 1A, B).
- Держите диаметр внутренней стенки держателя немного больше, чем средний диаметр глобуса, чтобы учесть различные размеры отдельных мышей. Держите высоту держателя на уровне около половины диаметра глобуса, обеспечивая плотное прилегание глобуса при закреплении 3D-печатной крышки.
- Размер планки крышки держателя соответствует длине внешнего диаметра держателя с шириной от 1/4 до 1/2 диаметра держателя. Крышка имеет размер, обеспечивающий доступ к глобусу, когда он закреплен в держателе для гидратации и удаления глаза в конце эксперимента.
- Распечатайте держатель и крышку.
2. Сбор образцов
- Усыпление мышей (для этого исследования использовались самцы мышей C57BL/6 в возрасте 9-12 недель и 27 недель) с использованием установленных протоколов в соответствии с институциональными руководящими принципами. Для этого протокола выполните эвтаназию с углекислым газом с последующим обезглавливанием.
- Удалите головку мыши и поместите ее сразу на лед, чтобы сохранить жизнеспособность ткани. Энуклеат глобусов с помощью инструментов для рассечения, предотвращая при этом повреждение тканей.
- Проптозируйте земной шар с помощью пинцета. Обрежьте зрительный нерв с помощью ножниц для рассечения чуть ниже, где он удерживается пинцетом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для дальнейших мер предосторожности выполните следующие действия в ламинарной вытяжке. - Инкубируют глобусы в 2 мл среды в чашке для культивирования клеток p35, включая индикатор кальция и/или окрашивание клеточной мембраны в течение 1 ч в инкубаторе 37 °C, 5% CO2 с условиями низкой освещенности. Убедитесь, что глобусы погружены в среду окрашивания для равномерного окрашивания.
- Для экспериментов, проведенных здесь, используйте индикатор кальция Fluo4-AM (1:100)2 и встречное пятно клеточной мембраны, темно-красное пятно плазматической мембраны (1:10 000)2 с конечной концентрацией 1% (v/v) DMSO и 0,1% (мас./об.) плуроновой кислоты в 2 мл кератиноцитарной сывороточной среды (KSFM) со следующими добавками роста: 25 мкг/мл экстракта гипофиза крупного рогатого скота, 0,02 нМ эпидермального фактора роста, 0,3 мМCaCl2 и пенициллин-стрептомицин (100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно).
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия и время инкубации варьируются в зависимости от показателя кальция, типа ткани и объема образца. При использовании плуроновой кислоты рекомендуется соблюдать осторожность, так как она делает ткани проницаемыми. Этот протокол требует 10% плуроновой кислоты. Экспериментально было установлено, что более низкие концентрации плуроновой кислоты неэффективны, а более высокие концентрации рискуют повредить ткань.
- Для экспериментов, проведенных здесь, используйте индикатор кальция Fluo4-AM (1:100)2 и встречное пятно клеточной мембраны, темно-красное пятно плазматической мембраны (1:10 000)2 с конечной концентрацией 1% (v/v) DMSO и 0,1% (мас./об.) плуроновой кислоты в 2 мл кератиноцитарной сывороточной среды (KSFM) со следующими добавками роста: 25 мкг/мл экстракта гипофиза крупного рогатого скота, 0,02 нМ эпидермального фактора роста, 0,3 мМCaCl2 и пенициллин-стрептомицин (100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно).
3. Подготовка держателей образцов
- Прикрепите держатели к чистой стеклянной крышке с клеем, который ранее не использовался. Клей, используемый в этом протоколе, поступает из одноразовых контейнеров для обеспечения стерильности, и каждый раз используется новый, неоткрытый контейнер.
- Вымойте держатель в 70% этаноле. Поместите клей на держатель и приклейте держатель к стеклянной нижней крышке. Убедитесь, что клей не находится во внутренней области держателя, так как клей может флуоресцировать, усложняя визуализацию.
- Подождите, пока клей затвердеет. Убедитесь, что держатель защищен от крышки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов, представленных в этой рукописи, использовались клеточные пластины P35 со стеклянным дном. Другие слайды и/или пластины со стеклянным дном могут быть заменены в зависимости от потребностей эксперимента.
4. Ранение глазных шаров
- Удалите глобусы из окрашивающего раствора с помощью стерильных глазных капельниц, позаботившись о предотвращении повреждения тканей интересующей области. Промывайте глобусы в течение 5 минут при комнатной температуре, используя стерильный фосфатно-буферный физиологический раствор для удаления лишнего пятна, и поместите глобусы в среду для транспортировки в микроскоп.
- Намотайте глобусы с помощью стерильной иглы 25 Г в интересующей области.
- Используя стерильную пипетку для глаз, поднимите и удерживайте глобус от задней части глаза. Это сохранит земной шар стабильным, предотвратит его скатывание и позволит сделать постоянные раны. Используя эту установку, зрительный нерв будет находиться внутри сопла пипетки глаза, а роговица будет обращена наружу.
- Для царапины раны осторожно переместите стерильную иглу весом 25 г по открытой роговице. Для колотой раны аккуратно вдавите иглу непосредственно в центральную роговицу. Следите за тем, чтобы рана не проколола роговицу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пропустите этот шаг, если для эксперимента не требуется раневая реакция или раненая среда. Предыдущие исследования показали, что как царапины, так и колотые раны мышей, сделанные с использованием этого метода, являются последовательными как по диаметру, так и по глубине10. Подтверждение размеров раны между независимыми глобусами проводилось с помощью анализа интересующей области.
5. Размещение образца на держателе
- Поместите роговицу или лимбальную область на крышку во внутренней области держателя и стабилизируйте с помощью 3D-печатной крышки (рисунок 1C-H).
- Убедитесь, что глобус расположен правильно и что интересующий его участок находится в контакте со стеклянным чехлом. После того, как глобус был помещен в держатель, не пытайтесь удалить глобус, так как это может привести к повреждению тканей.
- Приклейте 3D-печатную крышку к держателю с помощью клея, обеспечивая стабилизацию. Убедитесь, что планка крышки прилипает к держателю, а не к глобусу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Область, подлежащая изображению, помещается вниз, потому что протокол записан для использования на перевернутом микроскопе. Протокол может быть адаптирован для вертикальных микроскопов с использованием держателей с меньшим внутренним радиусом и снятием крышки. Это приведет к меньшей стабилизации земного шара.
6. Образец изображения
- Включите микроскоп и камеру окружающей среды и убедитесь, что камера увлажнена. Установите экологическую камеру на 35 °C и 5% CO2 на время эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскопы с камерами окружающей среды предпочтительны для этой процедуры, чтобы предотвратить обезвоживание и поддерживать земной шар при оптимальных температурах, но не требуются. - Поместите крышку, держатель и стабилизированный глобус на ступень микроскопа в камере окружающей среды и изображение с использованием методов визуализации живых клеток9.
- Пипетка дополнительно наносит питательные среды на крышку для предотвращения обезвоживания и поддержания жизнеспособности тканей. Убедитесь, что в колодце достаточно среды, чтобы покрыть глобус в держателе. В зависимости от продолжительности визуализации, добавляйте свежую среду, когда это необходимо, на протяжении всего эксперимента.
- Начните эксперименты с использованием методов и протоколов визуализации живых клеток. Используйте маломощные лазерные установки для сохранения ткани и предотвращения повреждения тканей в длительных экспериментах. Используйте соответствующие цели для больших рабочих расстояний. Эксперименты в этой рукописи проводились с использованием 20-кратного объектива.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мощность и коэффициент усиления лазера, продолжительность эксперимента, местоположение и плоскость изображения являются переменными в зависимости от экспериментальных параметров. Эксперименты по визуализации на неповрежденных глобусах продолжительностью от 1 ч до 4 ч были успешно выполнены в прошлых публикациях10. - Записывайте и сохраняйте данные в предпочтительном формате файла. Программное обеспечение, используемое микроскопом, создает файлы .czi для записи данных.
- Распоряжаться глобусами в соответствии со стандартными институциональными протоколами в конце протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол использовался для последовательного получения данных и изображений10 качества публикации. Полученные изображения представляют собой значительное улучшение по сравнению с предыдущими подходами (рисунок 2). С помощью 3D-печатного держателя можно захватывать изображения по всем слоям роговицы, а также наблюдать мобилизацию кальция в различных z-плоскостях (рисунок 3). Этот подход был использован для сравнения клеточно-клеточной сигнализации между апикальным и базальным клеточным слоями в ране у молодых и старых мышей10.
Улучшенная стабильность также позволила получать изображения глобусов значительно дольше, чем это было возможно ранее. Это позволило продлить исследования клеточной миграции в раневое ложе на несколько часов сверх предыдущих возможностей. С этой расширенной временной шкалой можно наблюдать существенные различия в клеточном поведении во время реакции заживления ран между молодыми и старыми мышами после травмы роговицы10. Для этого протокола данные собирались каждые 5 мин в течение 4 ч. При использовании держателя не наблюдалось значительного дрейфа в плоскостях x, y или z на протяжении всего эксперимента (рисунок 4, видео 1).
Преимущество этого протокола заключается в том, что он позволяет визуализировать различные области роговицы на основе размещения глобуса в держателе. В недавней публикации эта функция была использована для сбора изображений как в центральной части роговицы, так и в роговице-лимбальной области (рисунок 5)10. Было обнаружено, что повреждение центральной роговицы продуцирует сигнальные события кальция в клетках, прилегающих к нервам в лимбальной области10. Универсальность держателя выходит за рамки стабилизации глобуса для экспериментов по визуализации и используется для нескольких различных применений. Поместив роговицу лицевой стороной вверх в держатель, были проведены эксперименты с наноиндентированием для измерения жесткости эпителия роговицы, базальной мембраны и стромы у молодых и старых мышей10,11.
Рисунок 1: Схема и настройка 3D-печатного держателя. (A) Дизайн 3D-печатного держателя с аннотированными размерами высоты и ширины. (B) Репрезентативное изображение файла САПР из программного обеспечения 3D-принтера. (C) Репрезентативное изображение держателя с прикрепленной крышкой, содержащей мышиный глобус. (D) Стерильный одноразовый клей наносится на дно держателя для 3D-печати. (E) Держатель для 3D-печати приклеивается к стеклянной чашке для культивирования клеток p35. (F) Энуклеированный глобус помещают роговицу вниз в держатель с помощью стерильной пипетки. (G) Крышка прикреплена к верхней части 3D-печатного держателя для обеспечения иммобилизации земного шара. (H) Пластина со стеклянным дном с прикрепленным держателем и глобусом помещается на ступень микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Использование специализированных 3D-печатных держателей для стабилизации земного шара и получения более качественных данных изображения многослойных структур. (A) и (B) представляют собой типичные данные визуализации раненой роговицы ex vivo, стабилизированной без и с 3D-печатным держателем, соответственно. Сигнальные события кальция (зеленый) и клеточный контрокрашен (темно-красное окрашивание плазматической мембраны) могут быть четко идентифицированы в апикальном, базальном и стромальном слоях роговицы в (B), но не в (A). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Z-стек роговицы, обездвиженной в 3D-печатном держателе. Репрезентативные изображения z-стека, сделанные через слои роговицы при царапине раны (обозначены белой звездочкой). Образец окрашивается темно-красным окрашиванием плазматической мембраны для визуализации клеточных мембран и Fluo4-AM (зеленый) для визуализации передачи сигналов кальция. (A) Апикальный клеточный слой, (B) апикальные и базальные клетки, (C) базальноклеточный слой и (D) строма могут быть замечены в раневом слое. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативный 4-часовой эксперимент с временными рядами роговицы, показывающий небольшое движение земного шара в направлениях x, y или z. На снимке изображена царапина раны (обозначенная белой звездочкой) на центральной роговице шара ex vivo мышей. Глобус окрашен темно-красным окрашиванием плазматической мембраны для визуализации клеточных мембран и Fluo4-AM (зеленый) для визуализации сигнальных событий кальция. Глобус обездвиживается с помощью 3D-печатного держателя. Снимки были сделаны с интервалом в 1 час, начиная с 5 минут после травмы. Небольшой дрейф в направлениях x, y или z наблюдался с использованием этой настройки визуализации на протяжении всего эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Диаграмма расположения изображений на неповрежденном глобусе. 3D-печатный держатель позволяет визуализировать неповрежденный глобус ex vivo в различных местах. Держатель использовался для сбора изображений как из центральной, так и из лимбальной областей роговицы. Глобусы окрашиваются темно-красным окрашиванием плазматической мембраны для обнаружения клеточных мембран и Fluo4-AM (зеленый) для обнаружения сигналов кальция. (A) Репрезентативное изображение центральной роговицы при царапине раны. (B) Репрезентативное изображение лимбальной области роговицы после травмы центральной роговицы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Видео 1: Видео глобуса, обездвиженного в 3D-печатном держателе в течение 4 часов. Глобус был обездвижен с помощью 3D-печатного держателя и окрашен темно-красным пятном плазматической мембраны (красным) для визуализации клеточных мембран и Fluo4-AM (зеленый) для визуализации сигнальных событий кальция. Снимок делался каждые 5 мин в течение 4 ч, начиная с 5 мин после травмы. Небольшой дрейф в направлениях x, y или z наблюдался с использованием этой настройки визуализации на протяжении всего эксперимента. Скорость воспроизведения составляет 30 кадров в секунду. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает метод визуализации живых клеток, который использует 3D-печатный держатель для стабилизации и обездвиживания неповрежденных глаз животных. Он предназначен для обхода нескольких существенных недостатков, признанных предыдущими протоколами визуализации живых клеток ткани роговицы ex vivo . Этот протокол предлагает множество преимуществ для визуализации живых клеток неповрежденных глобусов. Это значительно уменьшает ненужное повреждение тканей, которое может помешать реакции заживления ран на экспериментально индуцированные царапины ран. Это включает в себя повреждение нервов и эпителия от рассечения и воздействия ультрафиолетового света. Кроме того, этот протокол облегчает гидратацию и жизнеспособность тканей, иммобилизуя ткань таким образом, чтобы можно было периодически применять питательную среду без срыва экспериментов. Изменяя ориентацию глаза в держателе, протокол позволяет получать изображения различных областей на земном шаре. Использование конфокальной микроскопии наряду с этим протоколом позволяет визуализировать различные плоскости земного шара, позволяя наблюдать взаимодействия между тканевыми структурами. Протокол очень универсален и может быть адаптирован к глобусам различных размеров от мышей и других видов. Держатели и крышки могут быть легко извлечены из визуальных колодцев, стерилизованы и использованы повторно. Протокол 3D-печати эффективен и экономичен по времени, что позволяет удобно создавать множество держателей одновременно. Глобусы могут быть зафиксированы внутри держателей, если образцы необходимо сохранить и снова отобразить на более позднем этапе. Фиксированная ткань сохраняет темно-красное пятно плазматической мембраны и пятна Fluo4-AM в течение нескольких недель после фиксации, которые могут быть использованы в качестве маркеров при окрашивании для определенного белка (белков).
Предыдущие протоколы предусматривали рассечение глаза и последующее использование УФ-активированного Геля PEG для иммобилизации роговицы для визуализации 7,8,9. Повреждение ткани, полученное с помощью этих методов, может поставить под сомнение экспериментальные результаты. Это особенно важно учитывать при изучении клеточных и тканевых процессов, участвующих в заживлении ран, поскольку это дополнительное повреждение за пределами экспериментально примененных ран может изменить реакцию заживления ран 4,12. Ввод сенсорных нервов роговицы будет затронут предыдущим протоколом, так как процесс рассечения разрывает нервы от их клеточных тел в тройничном ганглии13. Кроме того, рассечение роговицы само по себе вызывает реакцию на травму, поскольку растворимые факторы, высвобождающиеся после травмы, ответственны за реакцию заживления ран4. Эта новая процедура устраняет эти недостатки, изображая глобусы неповрежденными. Используя эту методологию, повреждение глаза ограничивается разрезанием зрительного нерва при энуклеации и поддерживает жизнеспособность клеток в роговице в течение длительных периодов времени. Вместе эти улучшения создают лучшее моделирование реакции раны.
Иммобилизация является важным, но сложным шагом при работе с живой тканью, поскольку она должна оставаться жизнеспособной и гидратированной на протяжении всего эксперимента. В то время как роговицы и глобусы могут быть защищены УФ-индуцированным гелем PEG, процедура требует УФ-облучения после помещения ткани в держатель8. Было отмечено, что облучение, необходимое для полимеризации ПЭГ, снижает клеточную реакцию. Кроме того, PEG уменьшал разрешение изображений, а функция AiryScan требовалась для наблюдения за сигналами клеток. В этом новом протоколе размеры держателя оптимизированы для точного соответствия глобусам, а полоса крышки обеспечивает дополнительный слой иммобилизации. Держатель и крышка устраняют необходимость использования PEG, который производит изображения более высокого качества с более высоким разрешением с кадрами процесса заживления ран в режиме реального времени. Одним из решений вышеупомянутых проблем было бы полностью отказаться от визуализации живых клеток и зафиксировать глобусы в параформальдегиде (4%) в заранее определенное время после травмы. Однако при фиксированной ткани нельзя наблюдать протекающие клеточные процессы, такие как передача сигналов кальция и влияние этих процессов на физические изменения в ткани. Для групп, заинтересованных в регистрации и количественной оценке коммуникационных событий между клетками в эпителии роговицы, ограничения, налагаемые фиксацией тканей, делают этот метод непрактичным для таких целей.
Этот новый протокол имеет два ключевых этапа: (1) эвтаназия и немедленная энуклеация земного шара и (2) позиционирование и ориентация глобуса внутри держателя. Разрезание зрительного нерва и энуклеация земного шара должны выполняться осторожно путем пропотозирования глаза без размещения корсета для сохранения внутренних и внешних структур. Позиционирование и ориентация необходимы для визуализации интересующих объектов и обеспечения максимально возможного поля зрения с адекватной детализацией. Правильное размещение глобуса необходимо перед нанесением крышки на держатель.
Несколько переменных протокола могут быть скорректированы в зависимости от требований экспериментальных параметров. Держатели могут быть напечатаны в различных размерах для размещения глобусов разного объема. Параметры, касающиеся диаметра и высоты держателя относительно размера глобуса, остаются неизменными во всех диапазонах размеров. Если пользователь испытывает дрейф в z-плоскости, потенциальная причина может заключаться в том, что ткань не обездвижена, и держатель должен быть повторно изготовлен. Окрашивание неповрежденных шаров может быть скорректировано в зависимости от экспериментальных параметров, используемых пятен, а также оптимальной среды и концентраций для интересующей ткани. Продолжительность эксперимента может быть скорректирована до тех пор, пока сохраняется жизнеспособность тканей. Краткосрочные эксперименты, включающие 1 ч постоянной визуализации ткани, и долгосрочные эксперименты, включающие визуализацию ткани через регулярные промежутки времени в течение 4 ч, были успешно выполнены. Эти эксперименты проводились на перевернутом микроскопе, и этот протокол был разработан для оптимального использования с аналогичной настройкой визуализации. Как только глобус стабилизируется и позиционируется внутри держателя, удаление глобуса может привести к повреждению тканей; таким образом, оптимальное позиционирование и ориентация земного шара перед креплением защитной планки имеют важное значение. Глобусы могут быть зафиксированы в 4% параформальдегиде, еще находясь внутри держателей для дальнейшего анализа локализации белка. Предварительные данные показали, что темно-красное окрашивание плазматической мембраны и окрашивание Fluo4-AM сохраняются в процессе фиксации.
Хотя этот протокол имеет много преимуществ по сравнению с предыдущими протоколами, у этого экспериментального подхода есть несколько ограничений. Одним из недостатков является то, что трудно извлечь глобус из держателя, не повредив эпителий роговицы. Таким образом, глобус должен быть зафиксирован в держателе для повторной визуализации с использованием методов локализации белка или РНК на более позднем этапе. Это может ограничить последующие исследования. Другим недостатком этого протокола во время длительных протоколов визуализации является то, что гидратация должна поддерживаться. Необходимость ручного повторного применения носителя через регулярные промежутки времени требует, чтобы кто-то активно контролировал процесс визуализации в течение эксперимента. Это может оказаться логистически сложным для расширенных протоколов визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У нас нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить NIH за следующую грантовую поддержку: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) и 5T32GM008541-24 (KS). Мы также хотели бы отметить Массачусетский фонд исследований глаз львов и Фонд трансплантации роговицы Новой Англии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioengineering. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
