Summary
Det aktuella arbetet beskriver ett nytt experimentellt protokoll som använder en 3D-tryckt hållare för att möjliggöra högupplöst levande cellavbildning av enucleated glober. Genom detta protokoll kan den cellulära kalciumsignalaktiviteten i sårat hornhinneepitel från ex vivo-glober observeras i realtid.
Abstract
Corneal epitelial sårläkning är en migrerande process som initieras genom aktivering av purinerga receptorer uttryckta på epitelceller. Denna aktivering resulterar i kalciummobiliseringshändelser som sprider sig från cell till cell, vilket är viktigt för att initiera cellulär rörlighet i sårbädden, vilket främjar effektiv sårläkning. Trinkaus-Randall-labbet har utvecklat en metod för att avbilda hornhinnans sårläkningssvar i ex vivo murina jordklot i realtid. Detta tillvägagångssätt innebär att man enucleing en intakt jordklot från en mus som har avlivats enligt etablerade protokoll och omedelbart inkuberar jordklotet med ett kalciumindikatorfärgämne. En motfärg som fläckar andra funktioner i cellen kan appliceras i detta skede för att hjälpa till med avbildning och visa cellulära landmärken. Protokollet fungerade bra med flera olika levande cellfärger som används för motfärgning, inklusive SiR-aktin för att färga aktin och djupröd plasmamembranfläck för att färga cellmembranet. För att undersöka svaret på ett sår skadas hornhinneepitelet med en 25 G-nål och kloten placeras i en 3D-tryckt hållare. Dimensionerna på den 3D-tryckta hållaren är kalibrerade för att säkerställa immobilisering av jordklotet under hela experimentets varaktighet och kan modifieras för att rymma ögon i olika storlekar. Levande cellavbildning av sårsvaret utförs kontinuerligt på olika djup i vävnaden över tid med hjälp av konfokalmikroskopi. Detta protokoll gör det möjligt för oss att generera högupplösta bilder av publikationskvalitet med ett 20x luftmål på ett konfokalmikroskop. Andra mål kan också användas för detta protokoll. Det representerar en signifikant förbättring av kvaliteten på levande cellavbildning i ex vivo murina jordklot och möjliggör identifiering av nerver och epitel.
Introduction
Hornhinna
Hornhinnan är en klar, avaskulär struktur som täcker ögats främre yta som bryter ljus för att möjliggöra syn och skyddar ögats inre från skador. Eftersom hornhinnan utsätts för miljön är den mottaglig för skador från både mekaniska orsaker (repor) och från infektion. En hornhinneskada hos en annars frisk patient läker vanligtvis inom 1-3 dagar. Men hos patienter med underliggande tillstånd inklusive limbal stamcellsbrist och typ II-diabetes kan hornhinnans sårläkningsprocess förlängas kraftigt1. Eftersom hornhinnan är mycket innerverad är dessa icke-helande hornhinnesår och återkommande hornhinneerosioner mycket smärtsamma och minskar kraftigt livskvaliteten hos patienter som upplever dem1.
Cell signalering
När en i övrigt frisk hornhinna skadas föregår kalciumsignaleringshändelser i cellerna intill såret och föranleder cellulär migration in i sårbädden, där de stänger skadan utan risk för ärrbildning 2,3. Dessa signalhändelser har karakteriserats väl i hornhinneepitelcellodlingsmodeller med hjälp av levande cellavbildning2. Preliminära experiment visar signifikant mer kalciumsignalering efter skada i icke-diabetiska celler jämfört med diabetesceller. Karakterisering av cellsignaleringshändelserna i ex vivo-glober har dock visat sig vara en teknisk utmaning.
Avbildning av levande celler
Tidigare studier har framgångsrikt registrerat kalciumsignaleringshändelser från in vitro-cellodlingsmodeller av hornhinnesårläkning 4,5,6. Att utveckla en metod för att producera högkvalitativa bilder av dessa signalhändelser i ex vivo-vävnad är av stort intresse eftersom det skulle göra det möjligt att studera dessa händelser i ett mer komplext och verklighetstroget system. Tidigare tillvägagångssätt har involverat dissektion av hornhinnan följt av immobilisering i en UV-inducerad PEG-gel 7,8,9. Immobilisering är ett viktigt men utmanande steg när man arbetar med levande vävnad, eftersom det måste förbli livskraftigt och hydratiserat under hela experimentets gång. Dessutom får immobilisering inte skada vävnaden. Medan PEG-lösningen immobiliserade vävnaden var upplösningen och kvaliteten på de producerade bilderna inte konsekventa. Därför utvecklades 3D-tryckta hållare för att immobilisera intakta jordklot för att producera bilder av högre kvalitet med mindre risk för vävnadsskador.
Tillvägagångssättet
En unik 3D-tryckt hållare utvecklades för att immobilisera intakta ex vivo-glober för levande cellavbildning. Denna hållare förhindrar skador från två huvudkällor: det möjliggör avbildning av en enucleated globe utan att behöva dissekera hornhinnan, och det eliminerar exponering för UV-ljus. Utan dessa skadekällor representerade de erhållna bilderna mer exakt svaret på repskadorna som gjordes experimentellt. Dessutom kalibrerades den 3D-tryckta hållaren till de exakta måtten på det murina ögat. Detta gav en mycket bättre passform än immobilisering i PEG-lösningen, vilket ledde till en bild av högre kvalitet vid lägre effektmål på grund av minskad vävnadsrörelse. En täckstång fäst på toppen av hållaren säkerställer att jordklotet förblir orörligt under hela experimentets varaktighet och att det inte finns någon förskjutning av jordklotet när tillväxtmedier appliceras för att upprätthålla hydrering och livskraft. Möjligheten att skriva ut hållaren till exakta dimensioner gör det också möjligt för oss att skapa en optimal passform för murina ögon i olika storlekar på grund av ålder eller sjukdomsstatus. Denna teknik kan tillämpas bredare för att utveckla hållare för olika arters ögon baserat på deras dimensioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Försöken med djurförsökspersoner godkändes av Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic Care and Vision Research och Boston University IACUC protocol (201800302).
1. Designa 3D-tryckta hållare och omslagsfält
- Designa de 3D-tryckta hållarna och täcklisten som står för musglobernas medeldiameter och 3D-skriv ut designen (figur 1A, B).
- Håll diametern på hållarens innervägg något större än jordens medeldiameter för att ta hänsyn till de olika storlekarna på enskilda möss. Håll hållarens höjd på ungefär hälften av jordklotets diameter, vilket säkerställer en tät passform av jordklotet när den säkras av den 3D-tryckta omslagsstången.
- Dimensionera hållarens täckstång till längden på hållarens ytterdiameter med en bredd som är 1/4 till 1/2 av hållarens diameter. Täckstången är dimensionerad för att möjliggöra åtkomst till jordklotet när den är säkrad i hållaren för hydrering och avlägsnande av ögat vid slutet av experimentet.
- Skriv ut hållaren och omslagsfältet.
2. Insamling av prover
- Avlivningsmöss (manliga C57BL/6-möss i åldern 9-12 veckor och 27 veckor gamla användes för denna studie) med hjälp av etablerade protokoll i enlighet med institutionella riktlinjer. För detta protokoll, utför eutanasi med koldioxid följt av halshuggning.
- Ta bort mushuvudet och placera det omedelbart på is för att bevara vävnadens livskraft. Enucleate globerna med hjälp av dissektionsverktyg samtidigt som vävnadsskador förhindras.
- Proptose jordklotet med pincett. Klipp synnerven med dissektionssax strax nedanför där den hålls av pincetten.
OBS: För ytterligare försiktighetsåtgärder, utför följande steg i en laminär flödeshuv. - Inkubera jordgloberna i 2 ml medium i en p35-cellodlingsskål inklusive en kalciumindikator och/eller cellmembranfläck i 1 timme i en 37 °C, 5% CO2-inkubator med svagt ljus. Se till att jordgloberna är nedsänkta i färgningsmediet för enhetlig färgning.
- För de experiment som utförs här, använd kalciumindikatorn, Fluo4-AM (1:100)2, och cellmembranräknare fläck, djupröd plasmamembranfläck (1:10 000)2, med en slutlig koncentration av 1% (v/v) DMSO och 0,1% (w/v) pluronsyra i 2 ml keratinocytserumfritt medium (KSFM) med följande tillväxttillskott: 25 μg/ml bovint hypofysextrakt, 0,02 nM epidermal tillväxtfaktor, 0,3 mM CaCl2 och penicillin-streptomycin (100 enheter/ml respektive 100 μg/ml).
OBS: Inkubationsförhållandena och tiderna varierar beroende på kalciumindikator, vävnadstyp och provvolym. Vid användning av plurunonsyra rekommenderas försiktighet eftersom det gör vävnaden permeabel. Detta protokoll kräver 10% pluronsyra. Lägre koncentrationer av pluronsyra har fastställts experimentellt för att vara ineffektiva, och högre koncentrationer riskerar skador på vävnaden.
- För de experiment som utförs här, använd kalciumindikatorn, Fluo4-AM (1:100)2, och cellmembranräknare fläck, djupröd plasmamembranfläck (1:10 000)2, med en slutlig koncentration av 1% (v/v) DMSO och 0,1% (w/v) pluronsyra i 2 ml keratinocytserumfritt medium (KSFM) med följande tillväxttillskott: 25 μg/ml bovint hypofysextrakt, 0,02 nM epidermal tillväxtfaktor, 0,3 mM CaCl2 och penicillin-streptomycin (100 enheter/ml respektive 100 μg/ml).
3. Beredning av provhållare
- Fäst hållarna på en ren glasbottenkåpa med lim som inte har använts tidigare. Limet som används i detta protokoll kommer från engångsbehållare för att säkerställa sterilitet och en ny, oöppnad behållare används varje gång.
- Tvätta hållaren i 70% etanol. Placera lim på hållaren och fäst hållaren på glasbottenlocket. Se till att inget lim finns inom hållarens inre område eftersom lim kan fluorescera, vilket komplicerar avbildning.
- Vänta tills limet stelnar. Kontrollera att hållaren är säker mot täckglaset.
OBS: P35-cellplattor med glasbottenskydd användes för de experiment som presenterades i detta manuskript. Andra glasbottenglas och/eller plattor kan ersättas baserat på experimentets behov.
4. Sår av ögongloberna
- Ta bort jordkloten från färgningslösningen med sterila ögondroppare, var noga med att förhindra vävnadsskador på det intressanta området. Tvätta jordgloberna i 5 minuter vid rumstemperatur med steril fosfatbuffrad saltlösning för att avlägsna överflödig fläck och placera jordgloberna i mediet för transport till mikroskopet.
- Linda jordkloten med en steril 25 G nål i intresseområdet.
- Använd en steril ögondroppare och plocka upp och håll jordklotet från baksidan av ögat. Detta kommer att hålla jordklotet stabilt, förhindra att det rullar och göra det möjligt att göra konsekventa sår. Med hjälp av denna inställning kommer den optiska nerven att vara inuti ögondroppmunstycket och hornhinnan kommer att vända utåt.
- För ett repsår, flytta försiktigt en steril 25 G nål över den exponerade hornhinnan. För ett punkteringssår, tryck försiktigt nålen direkt i den centrala hornhinnan. Se till att såret inte punkterar hornhinnan.
Hoppa över det här steget om ett sårsvar eller en sårad miljö inte krävs för experimentet. Tidigare studier har visat att både repsår och punkteringssår på murina hornhinnor gjorda med denna metod är konsekventa i både diameter och djup10. Bekräftelse av sårdimensionerna mellan oberoende jordklot utfördes med hjälp av en intresseanalys.
5. Provplacering på hållaren
- Placera hornhinnan eller limbalområdet på täckglaset i hållarens inre område och stabilisera med det 3D-tryckta locket (figur 1C-H).
- Bekräfta att jordklotet är korrekt placerat och att platsen av intresse är i kontakt med glasöverdraget. När jordklotet har placerats i hållaren, försök inte ta bort jordklotet eftersom det kan orsaka vävnadsskador.
- Fäst det 3D-tryckta locket på hållaren med lim, vilket säkerställer stabilisering. Se till att täckstången fäster vid hållaren och inte jordklotet.
OBS: Området som ska avbildas placeras ner eftersom protokollet är skrivet för användning på ett inverterat mikroskop. Protokollet kan anpassas för upprättstående mikroskop med hjälp av hållare med mindre innerradie och borttagning av täckstången. Detta kommer att resultera i mindre jordklotsstabilisering.
6. Exempel på avbildning
- Slå på mikroskopet och miljökammaren och kontrollera att kammaren är fuktad. Ställ in miljökammaren på 35 °C och 5 %CO2 under hela experimentet.
OBS: Mikroskop med miljökammare är att föredra för denna procedur för att förhindra uttorkning och för att hålla jordklotet vid optimala temperaturer men krävs inte. - Placera täckglaset, hållaren och den stabiliserade jordgloben på mikroskopsteget i miljökammaren och bilden med hjälp av tekniker för avbildning av levande celler9.
- Pipettera ytterligare tillväxtmedium på täckglaset för att förhindra uttorkning och bibehålla vävnadens livskraft. Se till att det finns tillräckligt med medium i brunnen för att täcka jordklotet i hållaren. Beroende på bildbehandlingens varaktighet, lägg till nytt medium när det behövs under hela experimentet.
- Börja experiment med tekniker och protokoll för avbildning av levande celler. Använd laserinställningar med låg effekt för att bevara vävnaden och förhindra vävnadsskador i långvariga experiment. Använd lämpliga mål för långa arbetsavstånd. Experimenten i detta manuskript utfördes med ett 20x mål.
OBS: Lasereffekten och förstärkningen, experimentell varaktighet, plats och bildplan är alla variabler beroende på de experimentella parametrarna. Bildexperiment på intakta jordklot från 1 h till 4 h i varaktighet har utförts framgångsrikt i tidigare publikationer10. - Spela in och spara data i önskat filformat. Programvaran som används av mikroskopet producerar .czi-filer för datainspelning.
- Kassera jordkloten enligt de vanliga institutionella protokollen i slutet av protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll har använts för att konsekvent producera data och bilder av publikationskvalitet10. De bilder som erhållits representerar en signifikant förbättring jämfört med tidigare metoder (figur 2). Med hjälp av den 3D-tryckta hållaren kan bilder fångas genom hornhinnans lager och kalciummobilisering i olika z-plan kan observeras (figur 3). Detta tillvägagångssätt har använts för att jämföra cell-cellsignalering mellan apikala och basala cellskikt vid ett sår hos unga och gamla möss10.
Den förbättrade stabiliteten har också möjliggjort avbildning av jordglober under betydligt längre tid än tidigare möjligt. Detta har gjort det möjligt att förlänga studier av cellulär migration till sårbädden med flera timmar utöver tidigare kapacitet. Med denna utökade tidslinje kan betydande skillnader i cellulärt beteende observeras under sårläkningssvaret mellan unga och gamla möss efter hornhinneskada10. För detta protokoll samlades data in var 5: e minut i 4 timmar. Vid användning av hållaren observerades ingen signifikant drift i x-, y- eller z-planen under experimentets gång (figur 4, video 1).
En fördel med detta protokoll är att det gör att olika regioner i hornhinnan kan avbildas baserat på placeringen av jordklotet i hållaren. I en nyligen publicerad publikation utnyttjades denna funktion för att samla bilder både vid den centrala hornhinnan och i hornhinnan-limbalregionen (figur 5)10. En skada på den centrala hornhinnan visade sig producera kalciumsignaleringshändelser i celler intill nerverna i limbalregionen10. Hållarens mångsidighet går utöver att stabilisera jordklotet för avbildningsexperiment och har använts för flera olika applikationer. Genom att placera hornhinnan med framsidan uppåt i hållaren utfördes nanoindentationsexperiment för att mäta styvheten hos hornhinneepitelet, källarmembranet och stroma hos unga och gamla möss10,11.
Bild 1: Scheman och inställning av den 3D-tryckta hållaren. (A) Design av den 3D-tryckta hållaren med kommenterade höjd- och bredddimensioner. (B) Representativ CAD-filbild från 3D-skrivarprogramvaran. C) Representativ bild av innehavaren med det bifogade locket som innehåller en murin jordglob. (D) Sterilt lim för engångsbruk appliceras på botten av den 3D-tryckta hållaren. (E) Den 3D-tryckta hållaren fästs på en p35-cellodlingsskål med glasbotten. (F) En enucleated jordglob placeras hornhinnan ner i hållaren med hjälp av en steril ögondroppare. (G) Täckstången fästs på toppen av den 3D-tryckta hållaren för att säkerställa immobilisering av jordklotet. (H) Glasbottenplattan med en vidhäftad hållare och jordglob placeras på mikroskopscenen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Använda specialiserade 3D-tryckta hållare för att stabilisera jordklotet och ge bilddata av högre kvalitet av flerskiktiga strukturer . (A) och (B) representerar typiska levande bilddata för en sårad ex vivo-hornhinna stabiliserad utan respektive med en 3D-tryckt hållare. Kalciumsignaleringshändelser (grön) och cellmotfärgning (djupröd plasmamembranfläck) kan tydligt identifieras i hornhinnans apikala, basala och stromala skikt i (B) men inte i (A). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Z-stack av en hornhinna immobiliserad i den 3D-tryckta hållaren. Representativa bilder av en z-stack som tas genom hornhinnans lager vid ett repsår (betecknat med en vit asterisk). Provet är färgat med djupröd plasmamembranfläck för att visualisera cellmembranen och Fluo4-AM (grön) för att visualisera kalciumsignalering. (A) Det apikala cellskiktet, (B) apikala och basala celler, (C) basalcellskiktet och (D) stroma kan ses i sårbädden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativt 4 timmars tidsserieexperiment av en hornhinna som avslöjar liten rörelse av jordklotet i x-, y- eller z-riktningarna. Bilden är av en repsårskada (betecknad med en vit asterisk) vid den centrala hornhinnan på en ex vivo murin jordglob. Jordklotet är färgat med djupröd plasmamembranfläck för att visualisera cellmembranen och Fluo4-AM (grön) för att visualisera kalciumsignaleringshändelser. Jordklotet immobiliseras med en 3D-tryckt hållare. Bilderna togs med 1 h mellanrum, med början 5 min efter skada. Lite drift i x-, y- eller z-riktningarna observerades med hjälp av denna avbildningsinställning under hela experimentets gång. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 5: Diagram över avbildningsplatser på en intakt jordglob. Den 3D-tryckta hållaren tillåter avbildning av en intakt ex vivo-jordglob på olika platser. Hållaren användes för att samla in bilder från både hornhinnans centrala och limbala regioner. Glober är färgade med djupröd plasmamembranfläck för att detektera cellmembranen och Fluo4-AM (grön) för att detektera kalciumsignalering. (A) Representativ bild av den centrala hornhinnan vid ett repsår. B) Representativ bild av hornhinnans limbala område efter en skada på den centrala hornhinnan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Film av en jordglob immobiliserad i en 3D-tryckt hållare i 4 timmar. En jordglob immobiliserades med den 3D-tryckta hållaren och färgades med djupröd plasmamembranfläck (röd) för att visualisera cellmembranen och Fluo4-AM (grön) för att visualisera kalciumsignaleringshändelser. En bild togs var 5:e minut i 4 h, med början 5 min efter skada. Lite drift i x-, y- eller z-riktningarna observerades med hjälp av denna avbildningsinställning under hela experimentets gång. Uppspelningshastigheten är 30 bilder per sekund. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en levande cellavbildningsteknik som använder en 3D-tryckt hållare för att stabilisera och immobilisera intakta djurögon. Den är utformad för att kringgå flera signifikanta nackdelar som erkänns med tidigare levande cellavbildningsprotokoll för ex vivo hornhinnevävnad. Detta protokoll erbjuder många fördelar för levande cellavbildning av intakta jordklot. Det minskar avsevärt onödiga vävnadsskador som kan störa sårläkningssvaret på experimentellt inducerade repsår. Detta inkluderar skador på nerver och epitel från dissektion och exponering för UV-ljus. Dessutom underlättar detta protokoll vävnadshydrering och livskraft genom att immobilisera vävnaden på ett sätt som gör att tillväxtmediet kan appliceras periodiskt utan störningar av experimenten. Genom att ändra ögats orientering i hållaren möjliggör protokollet avbildning av olika regioner på jordklotet. Användningen av konfokalmikroskopi tillsammans med detta protokoll möjliggör avbildning av olika plan i världen, vilket möjliggör observation av interaktioner mellan vävnadsstrukturer. Protokollet är mycket mångsidigt och kan anpassas till jordglober i olika storlekar från möss och andra arter. Hållarna och locken kan enkelt tas bort från bildbrunnarna, steriliseras och återanvändas. 3D-utskriftsprotokollet är effektivt och tidseffektivt, vilket möjliggör en bekväm skapande av många hållare samtidigt. Kloten får fästas i behållarna om proverna behöver förvaras och avbildas igen vid ett senare tillfälle. Fast vävnad behåller djupröd plasmamembranfläck och Fluo4-AM-fläckar i flera veckor efter fixering, som kan användas som markörer vid färgning för ett specifikt protein(er).
Tidigare protokoll krävde dissektion av ögat och efterföljande användning av en UV-aktiverad PEG-gel för att immobilisera hornhinnan för avbildning 7,8,9. Skador på vävnaden som uppstår genom dessa tekniker kan förvirra experimentella resultat. Detta är särskilt viktigt att tänka på när man studerar cell- och vävnadsprocesserna som är involverade i sårläkning, eftersom denna ytterligare skada utöver de experimentellt applicerade såren kan förändra sårläkningssvaret 4,12. Ingången av sensoriska hornhinnenerver kommer att påverkas av det tidigare protokollet, eftersom dissektionsprocessen skär nerverna från sina cellkroppar i trigeminal ganglion13. Dessutom skulle dissektion av hornhinnan i sig orsaka ett skadesvar, eftersom lösliga faktorer som frigörs från en skada är ansvariga för sårläkningssvaret4. Denna nya procedur tar itu med dessa svagheter genom att avbilda jordkloten intakta. Med hjälp av denna metod är skador på ögat begränsade till skärning av synnerven vid enucleation och upprätthåller cellviabiliteten i hornhinnan under längre perioder. Tillsammans skapar dessa förbättringar en bättre simulering av sårsvaret.
Immobilisering är ett viktigt men utmanande steg när man arbetar med levande vävnad, eftersom det måste förbli livskraftigt och hydratiserat under hela experimentets gång. Medan hornhinnorna och jordgloberna kan säkras med UV-inducerad PEG-gel, kräver proceduren UV-bestrålning efter att vävnaden placerats i hållaren8. Det observerades att bestrålningen som krävdes för att polymerisera PEG minskade cellulär respons. Dessutom minskade PEG upplösningen på bilderna, och AiryScan-funktionen krävdes för att observera cellsignalering. I detta nya protokoll optimeras hållarens dimensioner för att exakt passa kloten, och täckstången ger ett extra lager av immobilisering. Hållaren och täckstången eliminerar behovet av att använda PEG, vilket ger bilder av högre kvalitet och högre upplösning med realtidsfilmer av sårläkningsprocessen. En lösning på ovan nämnda problem skulle vara att helt avstå från avbildning av levande celler och fixa jordkloten i paraformaldehyd (4%) vid förutbestämda tider efter skada. Men med fast vävnad kan pågående cellulära processer såsom kalciumsignalering och effekterna av dessa processer på fysiska förändringar i vävnaden inte observeras. För grupper som är intresserade av att registrera och kvantifiera kommunikationshändelser mellan celler i hornhinneepitelet gör gränserna för vävnadsfixering denna teknik opraktisk för sådana ändamål.
Detta nya protokoll har två viktiga steg: (1) eutanasi och omedelbar jordglobenucleation, och (2) positionering och orientering av jordklotet inom innehavaren. Skärningen av synnerven och enucleationen av jordklotet måste utföras noggrant genom att proptosing ögat utan att placera en tandställning för att bevara de inre och yttre strukturerna. Positionering och orientering är nödvändiga för avbildning av intressanta platser och för att säkerställa att största möjliga synfält är i fokus med tillräcklig detalj. Korrekt placering av jordklotet är nödvändigt innan du applicerar täckstången på hållaren.
Flera variabler i protokollet kan justeras beroende på kraven i de experimentella parametrarna. Hållarna kan skrivas ut i olika storlekar för att rymma glober med olika volymer. Parametrarna för hållarens diameter och höjd i förhållande till jordklotets storlek förblir desamma över storleksintervall. Om användaren upplever drift i z-planet kan den potentiella orsaken vara att vävnaden inte är immobiliserad, och hållaren bör tillverkas om. Färgningen av de intakta jordkloten kan justeras beroende på de experimentella parametrarna, de använda fläckarna och den optimala miljön och koncentrationerna för vävnaden av intresse. Den experimentella varaktigheten kan justeras så länge vävnadens livskraft bibehålls. Kortvariga experiment med 1 h konstant avbildning av vävnaden och långsiktiga experiment med avbildning av vävnaden med jämna mellanrum under 4 timmar har båda utförts framgångsrikt. Dessa experiment utfördes på ett inverterat mikroskop, och detta protokoll var utformat för optimal användning med en liknande bildinställning. När jordklotet har stabiliserats och placerats i hållaren kan avlägsnande av jordklotet leda till vävnadsskador; Således är optimal positionering och orientering av jordklotet innan du fäster täckstången avgörande. Jordgloberna kan fixeras i 4% paraformaldehyd medan de fortfarande är inom hållarna för vidare analys av proteinlokalisering. Preliminära data har visat att djupröd plasmamembranfläck och Fluo4-AM-färgning båda behålls genom fixeringsprocessen.
Även om detta protokoll har många fördelar jämfört med tidigare protokoll, finns det några begränsningar för detta experimentella tillvägagångssätt. En nackdel är att det är svårt att ta bort jordklotet från hållaren utan att skada hornhinnans epitel. Således måste jordklotet fixeras i hållaren för omavbildning med hjälp av protein- eller RNA-lokaliseringsmetoder vid ett senare tillfälle. Detta kan begränsa uppföljningsstudier. En annan nackdel med detta protokoll under långvariga avbildningsprotokoll är att hydrering måste upprätthållas. Behovet av att manuellt applicera mediet igen med jämna mellanrum kräver att någon aktivt övervakar bildprocessen för experimentets omfattning. Detta kan visa sig vara logistiskt utmanande för utökade bildprotokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka NIH för följande bidragsstöd: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) och 5T32GM008541-24 (KS). Vi vill också uppmärksamma Massachusetts Lions Eye Research Fund och New England Corneal Transplant Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioengineering. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
