Summary
Le présent travail décrit un nouveau protocole expérimental qui utilise un support imprimé en 3D pour permettre l’imagerie de cellules vivantes à haute résolution de globes énucléés. Grâce à ce protocole, l’activité de signalisation cellulaire du calcium dans l’épithélium cornéen blessé des globes ex vivo peut être observée en temps réel.
Abstract
La cicatrisation des plaies épithéliales cornéennes est un processus migratoire initié par l’activation des récepteurs purinergiques exprimés sur les cellules épithéliales. Cette activation entraîne des événements de mobilisation du calcium qui se propagent de cellule en cellule, ce qui est essentiel pour initier la motilité cellulaire dans le lit de la plaie, favorisant une cicatrisation efficace de la plaie. Le laboratoire Trinkaus-Randall a développé une méthodologie pour imager la réponse de cicatrisation des plaies cornéennes dans des globes murins ex vivo en temps réel. Cette approche consiste à énucléer un globe intact d’une souris qui a été euthanasiée selon les protocoles établis et à incuber immédiatement le globe avec un colorant indicateur de calcium. Une contre-coloration qui colore d’autres caractéristiques de la cellule peut être appliquée à ce stade pour aider à l’imagerie et montrer les points de repère cellulaires. Le protocole a bien fonctionné avec plusieurs colorants de cellules vivantes utilisés pour la contre-coloration, y compris l’actine SiR pour colorer l’actine et la coloration de membrane plasmique rouge foncé pour colorer la membrane cellulaire. Pour examiner la réponse à une plaie, l’épithélium cornéen est blessé à l’aide d’une aiguille de 25 G et les globes sont placés dans un support imprimé en 3D. Les dimensions du support imprimé en 3D sont calibrées pour assurer l’immobilisation du globe pendant toute la durée de l’expérience et peuvent être modifiées pour accueillir des yeux de différentes tailles. L’imagerie cellulaire vivante de la réponse de la plaie est réalisée en continu à différentes profondeurs dans tout le tissu au fil du temps à l’aide de la microscopie confocale. Ce protocole nous permet de générer des images haute résolution et de qualité publication à l’aide d’un objectif d’air 20x sur un microscope confocal. D’autres objectifs peuvent également être utilisés pour ce protocole. Il représente une amélioration significative de la qualité de l’imagerie des cellules vivantes dans les globes murins ex vivo et permet l’identification des nerfs et de l’épithélium.
Introduction
Cornée
La cornée est une structure avasculaire claire recouvrant la surface antérieure de l’œil qui réfracte la lumière pour permettre la vision et protéger l’intérieur de l’œil contre les dommages. Comme la cornée est exposée à l’environnement, elle est sensible aux dommages causés à la fois par des causes mécaniques (rayures) et par une infection. Une lésion cornéenne chez un patient par ailleurs en bonne santé guérit généralement en 1 à 3 jours. Cependant, chez les patients atteints de maladies sous-jacentes, notamment un déficit en cellules souches limbiques et un diabète de type II, le processus de cicatrisation des plaies cornéennes peut être considérablement prolongé1. La cornée étant fortement innervée, ces ulcères cornéens non cicatrisants et ces érosions cornéennes récurrentes sont très douloureux et diminuent grandement la qualité de vie des patients qui en souffrent1.
Signalisation cellulaire
Lorsqu’une cornée par ailleurs saine est blessée, les événements de signalisation calcique dans les cellules adjacentes à la plaie précèdent et provoquent la migration cellulaire dans le lit de la plaie, où ils ferment la blessure sans risque de cicatrisation 2,3. Ces événements de signalisation ont été bien caractérisés dans des modèles de culture de cellules épithéliales cornéennes utilisant l’imagerie de cellules vivantes2. Des expériences préliminaires démontrent significativement plus de signalisation calcique après une lésion dans les cellules non diabétiques par rapport aux cellules diabétiques. Cependant, la caractérisation des événements de signalisation cellulaire dans les globes ex vivo s’est avérée être un défi technique.
Imagerie de cellules vivantes
Des études antérieures ont enregistré avec succès des événements de signalisation du calcium à partir de modèles de culture cellulaire in vitro de cicatrisation des plaies cornéennes 4,5,6. Le développement d’une méthodologie pour produire des images de haute qualité de ces événements de signalisation dans des tissus ex vivo est d’un grand intérêt car cela permettrait l’étude de ces événements dans un système plus complexe et réaliste. Les approches précédentes ont impliqué la dissection de la cornée suivie d’une immobilisation dans un gel PEG induit par UV 7,8,9. L’immobilisation est une étape essentielle mais difficile lorsque l’on travaille avec des tissus vivants, car ils doivent rester viables et hydratés tout au long de l’expérience. De plus, l’immobilisation ne doit pas endommager le tissu. Bien que la solution de PEG ait immobilisé le tissu, la résolution et la qualité des images produites n’étaient pas cohérentes. Par conséquent, les supports imprimés en 3D ont été développés pour immobiliser les globes intacts afin de produire des images de meilleure qualité avec moins de risque de lésions tissulaires.
L’approche
Un support unique imprimé en 3D a été développé pour immobiliser des globes ex vivo intacts pour l’imagerie de cellules vivantes. Ce support prévient les dommages provenant de deux sources principales: il permet l’imagerie d’un globe énucléé sans avoir besoin de disséquer la cornée, et il élimine l’exposition à la lumière UV. Sans ces sources de dommages, les images obtenues représentaient plus précisément la réponse aux blessures par égratignures faites expérimentalement. De plus, le support imprimé en 3D a été calibré aux dimensions précises de l’œil murin. Cela a fourni un bien meilleur ajustement que l’immobilisation dans la solution PEG, conduisant à une image de meilleure qualité à des objectifs de puissance inférieure en raison de la diminution du mouvement des tissus. Une barre de couverture fixée au sommet du support garantit que le globe reste immobile pendant toute la durée de l’expérience et qu’il n’y a pas de déplacement du globe lorsque le milieu de croissance est appliqué pour maintenir l’hydratation et la viabilité. La possibilité d’imprimer le support à des dimensions précises nous permet également de générer un ajustement optimal pour les yeux murins de différentes tailles en raison de l’âge ou de l’état de la maladie. Cette technologie peut être appliquée plus largement pour développer des supports pour les yeux de différentes espèces en fonction de leurs dimensions.
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Protocol
Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par l’Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic Care and Vision Research et le protocole IACUC de l’Université de Boston (201800302).
1. Conception des supports imprimés en 3D et de la barre de couverture
- Concevoir les supports imprimés en 3D et la barre de couverture en tenant compte du diamètre moyen des globes de souris et imprimer la conception en 3D (Figure 1A, B).
- Gardez le diamètre de la paroi interne du support légèrement plus grand que le diamètre moyen du globe pour tenir compte des différentes tailles de souris individuelles. Maintenez la hauteur du support à environ la moitié du diamètre du globe, en assurant un ajustement serré du globe lorsqu’il est fixé par la barre de couverture imprimée en 3D.
- Dimensionnez la barre de couverture du support à la longueur du diamètre extérieur du support avec une largeur comprise entre 1/4 et 1/2 du diamètre du support. La barre de couverture est dimensionnée pour permettre l’accès au globe lorsqu’il est fixé dans le support pour l’hydratation et le retrait de l’œil à la fin de l’expérience.
- Imprimez le support et la barre de couverture.
2. Prélèvement d’échantillons
- Euthanasier des souris (des souris mâles C57BL/6 âgées de 9 à 12 semaines et de 27 semaines ont été utilisées pour cette étude) en utilisant des protocoles établis conformément aux lignes directrices de l’établissement. Pour ce protocole, pratiquer l’euthanasie au dioxyde de carbone suivie d’une décapitation.
- Retirez la tête de souris et placez-la immédiatement sur de la glace pour préserver la viabilité du tissu. Énucléez les globes à l’aide d’outils de dissection tout en prévenant les lésions tissulaires.
- Proptose le globe à l’aide d’une pince à épiler. Coupez le nerf optique à l’aide de ciseaux à dissection juste en dessous de l’endroit où il est maintenu par la pince à épiler.
REMARQUE: Pour plus de précautions, effectuez les étapes suivantes dans une hotte à flux laminaire. - Incuber les globes dans 2 mL de milieu dans une boîte de culture cellulaire p35 comprenant un indicateur de calcium et/ou une coloration de membrane cellulaire pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 dans des conditions de faible luminosité. Assurez-vous que les globes sont immergés dans le milieu de coloration pour une coloration uniforme.
- Pour les expériences réalisées ici, utilisez l’indicateur de calcium, Fluo4-AM (1:100)2, et la coloration de compteur de membrane cellulaire, coloration de membrane plasmique rouge foncé (1:10 000)2, avec une concentration finale de 1 % (v/v) de DMSO et 0,1 % (p/v) d’acide pluronique dans 2 mL de milieu sans sérum kératinocytaire (KSFM) avec les suppléments de croissance suivants : extrait hypophysaire bovin de 25 μg/mL, 0,02 nM de facteur de croissance épidermique, 0,3 mM CaCl2 et pénicilline-streptomycine (100 unités/mL et 100 μg/mL, respectivement).
REMARQUE: Les conditions et les temps d’incubation sont variables en fonction de l’indicateur de calcium, du type de tissu et du volume de l’échantillon. Lors de l’utilisation de l’acide pluronique, la prudence est recommandée car il rend les tissus perméables. Ce protocole fait appel à 10% d’acide pluronique. Des concentrations plus faibles d’acide pluronique ont été déterminées expérimentalement comme étant inefficaces, et des concentrations plus élevées risquent d’endommager les tissus.
- Pour les expériences réalisées ici, utilisez l’indicateur de calcium, Fluo4-AM (1:100)2, et la coloration de compteur de membrane cellulaire, coloration de membrane plasmique rouge foncé (1:10 000)2, avec une concentration finale de 1 % (v/v) de DMSO et 0,1 % (p/v) d’acide pluronique dans 2 mL de milieu sans sérum kératinocytaire (KSFM) avec les suppléments de croissance suivants : extrait hypophysaire bovin de 25 μg/mL, 0,02 nM de facteur de croissance épidermique, 0,3 mM CaCl2 et pénicilline-streptomycine (100 unités/mL et 100 μg/mL, respectivement).
3. Préparation des porte-échantillons
- Collez les supports à un couvercle à fond de verre propre avec de la colle qui n’a pas été utilisée auparavant. La colle utilisée dans ce protocole provient de contenants à usage unique pour assurer la stérilité et un nouveau récipient non ouvert est utilisé à chaque fois.
- Lavez le support dans de l’éthanol à 70%. Placez la colle sur le support et collez le support au couvercle inférieur en verre. Assurez-vous qu’aucune colle ne se trouve dans la zone interne du support, car la colle peut devenir fluorescente, ce qui complique l’imagerie.
- Attendez que la colle se solidifie. Vérifiez que le support est bien fixé contre le bordereau.
NOTE: Des plaques de cellules P35 avec des lamelles de couverture à fond de verre ont été utilisées pour les expériences présentées dans ce manuscrit. D’autres lames et/ou plaques à fond de verre peuvent être remplacées en fonction des besoins de l’expérience.
4. Blessure des globes oculaires
- Retirez les globes de la solution de coloration à l’aide de compte-gouttes oculaires stériles, en prenant soin d’éviter d’endommager les tissus de la région d’intérêt. Laver les globes pendant 5 minutes à température ambiante en utilisant une solution saline tamponnée au phosphate stérile pour éliminer l’excès de tache, et placer les globes dans le milieu pour le transport au microscope.
- Enrouler les globes à l’aide d’une aiguille stérile de 25 G dans la région d’intérêt.
- À l’aide d’un compte-gouttes stérile, ramasser et tenir le globe à l’arrière de l’œil. Cela gardera le globe stable, l’empêchera de rouler et permettra de faire des blessures constantes. En utilisant cette configuration, le nerf optique sera à l’intérieur de la buse du compte-gouttes et la cornée sera tournée vers l’extérieur.
- Pour une plaie en cas d’égratignure, déplacez doucement une aiguille stérile de 25 G sur la cornée exposée. Pour une plaie perforante, appuyez doucement l’aiguille directement dans la cornée centrale. Assurez-vous que la plaie ne perce pas la cornée.
REMARQUE : ignorez cette étape si une réponse de plaie ou un environnement blessé n’est pas requis pour l’expérience. Des études antérieures ont montré que les plaies par égratignures et les plaies perforantes sur les cornées murines réalisées à l’aide de cette méthode sont cohérentes en diamètre et en profondeur10. La confirmation des dimensions de la plaie entre des globes indépendants a été réalisée à l’aide d’une analyse de région d’intérêt.
5. Placement de l’échantillon sur le support
- Placez la cornée ou la région limbique sur la lamelle de couverture dans la zone interne du support et stabilisez-la à l’aide du couvercle imprimé en 3D (Figure 1C-H).
- Vérifiez que le globe est correctement positionné et que le site d’intérêt est en contact avec la lamelle de couverture en verre. Une fois que le globe a été placé dans le support, n’essayez pas de retirer le globe car cela pourrait causer des dommages aux tissus.
- Collez le couvercle imprimé en 3D au support à l’aide de colle, assurant ainsi la stabilisation. Assurez-vous que la barre de couverture adhère au support et non au globe.
REMARQUE: La zone à imager est placée vers le bas car le protocole est écrit pour être utilisé sur un microscope inversé. Le protocole peut être adapté pour les microscopes verticaux en utilisant des supports avec un rayon intérieur plus petit et le retrait de la barre de couverture. Cela se traduira par moins de stabilisation du globe.
6. Imagerie des échantillons
- Allumez le microscope et la chambre environnementale et vérifiez que la chambre est humidifiée. Régler la chambre environnementale à 35 °C et 5 % de CO2 pendant toute la durée de l’expérience.
REMARQUE: Les microscopes avec chambres environnementales sont préférables pour cette procédure afin de prévenir la déshydratation et de maintenir le globe à des températures optimales, mais ne sont pas nécessaires. - Placez la lamelle de couverture, le support et le globe stabilisé sur la platine du microscope dans la chambre environnementale et l’image à l’aide de techniques d’imagerie de cellules vivantes9.
- Pipeter un milieu de croissance supplémentaire sur la lamelle de couverture pour prévenir la déshydratation et maintenir la viabilité des tissus. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de milieu dans le puits pour couvrir le globe dans le support. Selon la durée de l’imagerie, ajoutez un nouveau milieu au besoin tout au long de l’expérience.
- Commencez des expériences à l’aide de techniques et de protocoles d’imagerie de cellules vivantes. Utilisez des réglages laser de faible puissance pour préserver le tissu et prévenir les dommages tissulaires dans les expériences de longue durée. Utilisez des objectifs appropriés pour les longues distances de travail. Les expériences de ce manuscrit ont été réalisées à l’aide d’un objectif 20x.
REMARQUE: La puissance et le gain du laser, la durée expérimentale, l’emplacement et le plan d’imagerie sont tous des variables dépendant des paramètres expérimentaux. Des expériences d’imagerie sur des globes intacts d’une durée allant de 1 h à 4 h ont été réalisées avec succès dans des publications antérieures10. - Enregistrez et sauvegardez les données dans le format de fichier préféré. Le logiciel utilisé par le microscope produit des fichiers .czi pour l’enregistrement des données.
- Éliminez les globes conformément aux protocoles institutionnels standard à la fin du protocole.
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Representative Results
Ce protocole a été utilisé pour produire systématiquement des données et des images de qualité publication10. Les images obtenues représentent une amélioration significative par rapport aux approches précédentes (Figure 2). À l’aide du support imprimé en 3D, des images peuvent être capturées à travers les couches de la cornée, et la mobilisation du calcium dans différents plans z peut être observée (Figure 3). Cette approche a été utilisée pour comparer la signalisation cellule-cellule entre les couches de cellules apicales et basales sur une plaie chez des souris jeunes et âgées10.
L’amélioration de la stabilité a également permis d’imager les globes beaucoup plus longtemps qu’auparavant. Cela a permis de prolonger les études de migration cellulaire dans le lit de la plaie de plusieurs heures au-delà des capacités précédentes. Avec cette chronologie prolongée, des différences substantielles dans le comportement cellulaire peuvent être observées au cours de la réponse de cicatrisation des plaies entre les souris jeunes et âgées après une lésion cornéenne10. Pour ce protocole, les données ont été collectées toutes les 5 minutes pendant 4 h. Lors de l’utilisation du support, aucune dérive significative n’a été observée dans les plans x, y ou z tout au long de l’expérience (Figure 4, Vidéo 1).
Un avantage de ce protocole est qu’il permet d’imager différentes régions de la cornée en fonction du placement du globe dans le support. Dans une publication récente, cette caractéristique a été mise à profit pour recueillir des images à la fois au niveau de la cornée centrale et dans la région cornéenne-limbique (Figure 5)10. Une lésion de la cornée centrale s’est avérée produire des événements de signalisation du calcium dans les cellules adjacentes aux nerfs dans la région limbique10. La polyvalence du support va au-delà de la stabilisation du globe pour les expériences d’imagerie et a été utilisée pour plusieurs applications différentes. En plaçant la cornée face vers le haut dans le support, des expériences de nanoindentation ont été réalisées pour mesurer la rigidité de l’épithélium cornéen, de la membrane basale et du stroma chez des souris jeunes et âgées10,11.
Figure 1 : Schémas et configuration du support imprimé en 3D. (A) Conception du support imprimé en 3D avec des dimensions annotées de hauteur et de largeur. (B) Image représentative du fichier CAO du logiciel d’impression 3D. (C) Image représentative du support avec le couvercle attaché contenant un globe murin. (D) Une colle stérile à usage unique est appliquée sur le fond du support imprimé en 3D. (E) Le support imprimé en 3D est collé à une boîte de culture cellulaire p35 à fond de verre. (F) Un globe énucléé est placé cornée dans le support à l’aide d’un compte-gouttes stérile. (G) La barre de couverture est collée au sommet du support imprimé en 3D pour assurer l’immobilisation du globe. (H) La plaque à fond de verre avec un support collé et un globe est placée sur la platine du microscope. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Utilisation de supports d’impression 3D spécialisés pour stabiliser le globe et obtenir des données d’imagerie de meilleure qualité des structures multicouches. (A) et (B) représentent des données d’imagerie en direct typiques d’une cornée ex vivo blessée stabilisée sans et avec un support imprimé en 3D, respectivement. Les événements de signalisation calcique (vert) et la contre-coloration cellulaire (coloration de membrane plasmique rouge foncé) peuvent être clairement identifiés dans les couches apicale, basale et stromale de la cornée en (B) mais pas en (A). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Pile en Z d’une cornée immobilisée dans le support imprimé en 3D. Images représentatives d’une pile Z prises à travers les couches de la cornée à une plaie de grattage (signalées par un astérisque blanc). L’échantillon est coloré avec une coloration de membrane plasmique rouge foncé pour visualiser les membranes cellulaires et Fluo4-AM (vert) pour visualiser la signalisation du calcium. (A) La couche de cellules apicales, (B) les cellules apicales et basales, (C) la couche de cellules basales et (D) le stroma peuvent être vus dans le lit de la plaie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Expérience représentative de séries chronologiques de 4 h d’une cornée révélant peu de mouvement du globe dans les directions x, y ou z. L’image est celle d’une blessure par égratignure (signalée par un astérisque blanc) à la cornée centrale d’un globe murin ex vivo. Le globe est coloré avec une coloration de membrane plasmique rouge foncé pour visualiser les membranes cellulaires et Fluo4-AM (vert) pour visualiser les événements de signalisation du calcium. Le globe est immobilisé à l’aide d’un support imprimé en 3D. Les images ont été prises à 1 h d’intervalle, en commençant 5 minutes après la blessure. Peu de dérive dans les directions x, y ou z a été observée à l’aide de cette configuration d’imagerie tout au long de l’expérience. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Diagramme des emplacements d’imagerie sur un globe intact. Le support imprimé en 3D permet l’imagerie d’un globe ex vivo intact à divers endroits. Le support a été utilisé pour collecter des images des régions centrale et limbique de la cornée. Les globes sont colorés avec une coloration de membrane plasmique rouge foncé pour détecter les membranes cellulaires et Fluo4-AM (vert) pour détecter la signalisation du calcium. (A) Image représentative de la cornée centrale à une plaie d’égratignure. (B) Image représentative de la région limbique de la cornée après une lésion de la cornée centrale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1: Film d’un globe immobilisé dans un support imprimé en 3D pendant 4 h. Un globe a été immobilisé avec le support imprimé en 3D et coloré avec une coloration de membrane plasmique rouge foncé (rouge) pour visualiser les membranes cellulaires et Fluo4-AM (vert) pour visualiser les événements de signalisation du calcium. Une image a été prise toutes les 5 minutes pendant 4 h, commençant 5 minutes après la blessure. Peu de dérive dans les directions x, y ou z a été observée à l’aide de cette configuration d’imagerie tout au long de l’expérience. La vitesse de lecture est de 30 images par seconde. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Ce protocole décrit une technique d’imagerie de cellules vivantes qui utilise un support imprimé en 3D pour stabiliser et immobiliser les yeux intacts des animaux. Il est conçu pour contourner plusieurs inconvénients importants reconnus avec les protocoles précédents d’imagerie de cellules vivantes du tissu cornéen ex vivo . Ce protocole offre de nombreux avantages pour l’imagerie de cellules vivantes de globes intacts. Il réduit considérablement les dommages tissulaires inutiles qui pourraient interférer avec la réponse de cicatrisation des plaies aux égratignures induites expérimentalement. Cela comprend les dommages aux nerfs et à l’épithélium causés par la dissection et l’exposition à la lumière UV. De plus, ce protocole facilite l’hydratation et la viabilité des tissus en immobilisant le tissu de manière à permettre l’application périodique du milieu de croissance sans perturber les expériences. En changeant l’orientation de l’œil dans le support, le protocole permet l’imagerie de différentes régions du globe. L’utilisation de la microscopie confocale avec ce protocole permet l’imagerie de différents plans du globe, permettant l’observation des interactions entre les structures tissulaires. Le protocole est très polyvalent et peut être adapté aux globes de différentes tailles de souris et d’autres espèces. Les supports et les couvercles peuvent être facilement retirés des puits d’imagerie, stérilisés et réutilisés. Le protocole d’impression 3D est efficace et rapide, permettant la création pratique de nombreux supports à la fois. Les globes peuvent être fixés à l’intérieur des supports si les échantillons doivent être conservés et imagés à nouveau à une date ultérieure. Les tissus fixes conservent la coloration de la membrane plasmique rouge foncé et les taches Fluo4-AM pendant plusieurs semaines après la fixation, qui peuvent être utilisées comme marqueurs lors de la coloration d’une ou de plusieurs protéines spécifiques.
Les protocoles précédents prévoyaient la dissection de l’œil et l’utilisation ultérieure d’un gel PEG activé par UV pour immobiliser la cornée pour l’imagerie 7,8,9. Les dommages aux tissus subis par ces techniques pourraient confondre les résultats expérimentaux. Ceci est particulièrement important à prendre en compte lors de l’étude des processus cellulaires et tissulaires impliqués dans la cicatrisation des plaies, car ces dommages supplémentaires au-delà des plaies appliquées expérimentalement peuvent modifier la réponse à la cicatrisationdes plaies 4,12. L’apport des nerfs cornéens sensoriels sera affecté par le protocole précédent, car le processus de dissection sépare les nerfs de leurs corps cellulaires dans le ganglion trijumeau13. De plus, la dissection de la cornée provoquerait elle-même une réponse à une blessure, car les facteurs solubles libérés par une blessure sont responsables de la réponse à la cicatrisation4. Cette nouvelle procédure corrige ces faiblesses en imageant les globes intacts. En utilisant cette méthodologie, les dommages à l’œil sont limités à la coupe du nerf optique lors de l’énucléation et maintiennent la viabilité cellulaire dans la cornée pendant de longues périodes. Ensemble, ces améliorations créent une meilleure simulation de la réponse de la plaie.
L’immobilisation est une étape essentielle mais difficile lorsque l’on travaille avec des tissus vivants, car ils doivent rester viables et hydratés tout au long de l’expérience. Alors que les cornées et les globes pouvaient être fixés avec du gel PEG induit par les UV, la procédure nécessite une irradiation UV après avoir placé le tissu dans le support8. Il a été observé que l’irradiation nécessaire pour polymériser le PEG diminuait la réactivité cellulaire. De plus, le PEG a diminué la résolution des images et la fonction AiryScan était nécessaire pour observer la signalisation cellulaire. Dans ce nouveau protocole, les dimensions du support sont optimisées pour s’adapter précisément aux globes, et la barre de couverture fournit une couche supplémentaire d’immobilisation. Le support et la barre de couverture éliminent le besoin d’utiliser du PEG, qui produit des images de meilleure qualité et de plus haute résolution avec des images en temps réel du processus de cicatrisation. Une solution aux problèmes mentionnés ci-dessus serait de renoncer complètement à l’imagerie de cellules vivantes et de fixer les globes dans le paraformaldéhyde (4%) à des moments prédéterminés après une blessure. Cependant, avec les tissus fixes, les processus cellulaires en cours tels que la signalisation du calcium et les effets de ces processus sur les changements physiques dans le tissu ne peuvent pas être observés. Pour les groupes intéressés par l’enregistrement et la quantification des événements de communication entre les cellules de l’épithélium cornéen, les limites imposées par la fixation tissulaire rendent cette technique impraticable à ces fins.
Ce nouveau protocole comporte deux étapes clés : (1) l’euthanasie et l’énucléation immédiate du globe, et (2) le positionnement et l’orientation du globe à l’intérieur du support. La coupe du nerf optique et l’énucléation du globe doivent être effectuées avec précaution en propulsant l’œil sans placer d’attelle pour préserver les structures internes et externes. Le positionnement et l’orientation sont nécessaires pour l’imagerie des sites d’intérêt et pour s’assurer que le champ de vision le plus large possible est mis au point avec suffisamment de détails. Un placement correct du globe est nécessaire avant d’appliquer la barre de couverture sur le support.
Plusieurs variables du protocole peuvent être ajustées en fonction des exigences des paramètres expérimentaux. Les supports peuvent être imprimés dans différentes tailles pour accueillir des globes de différents volumes. Les paramètres concernant le diamètre et la hauteur du support par rapport à la taille du globe restent les mêmes dans toutes les gammes de tailles. Si l’utilisateur éprouve une dérive dans le plan z, la raison potentielle pourrait être que le tissu n’est pas immobilisé et que le support doit être refabriqué. La coloration des globes intacts peut être ajustée en fonction des paramètres expérimentaux, des colorations utilisées, de l’environnement optimal et des concentrations pour le tissu d’intérêt. La durée expérimentale peut être ajustée tant que la viabilité des tissus est maintenue. Des expériences à court terme impliquant 1 h d’imagerie constante du tissu et des expériences à long terme impliquant l’imagerie du tissu à intervalles réguliers sur une période de 4 heures ont toutes deux été réalisées avec succès. Ces expériences ont été réalisées sur un microscope inversé, et ce protocole a été conçu pour une utilisation optimale avec une configuration d’imagerie similaire. Une fois que le globe est stabilisé et positionné à l’intérieur du support, le retrait du globe peut entraîner des lésions tissulaires; Ainsi, un positionnement et une orientation optimaux du globe avant de fixer la barre de couverture sont essentiels. Les globes peuvent être fixés dans du paraformaldéhyde à 4% tout en restant dans les supports pour une analyse plus approfondie de la localisation des protéines. Les données préliminaires ont montré que la coloration de la membrane plasmique rouge foncé et la coloration Fluo4-AM sont toutes deux conservées tout au long du processus de fixation.
Bien que ce protocole présente de nombreux avantages par rapport aux protocoles précédents, cette approche expérimentale présente quelques limites. Un inconvénient est qu’il est difficile de retirer le globe du support sans endommager l’épithélium cornéen. Ainsi, le globe doit être fixé dans le support pour une nouvelle imagerie à l’aide de méthodes de localisation de protéines ou d’ARN à une date ultérieure. Cela peut limiter les études de suivi. Un autre inconvénient de ce protocole lors de protocoles d’imagerie prolongés est que l’hydratation doit être maintenue. La nécessité de réappliquer manuellement le média à intervalles réguliers nécessite que quelqu’un surveille activement le processus d’imagerie pour l’étendue de l’expérience. Cela peut s’avérer difficile sur le plan logistique pour les protocoles d’imagerie étendus.
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Disclosures
Nous n’avons aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les NIH pour le soutien de subvention suivant: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) et 5T32GM008541-24 (KS). Nous tenons également à remercier le Massachusetts Lions Eye Research Fund et le New England Corneal Transplant Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioengineering. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
