Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die schrittweise Autofluoreszenz-Bildgebung und Bewertung von Phycobiliprotein-Veränderungen in Rotalgen auf der Grundlage einer Spektralanalyse. Dies ist eine markierungsfreie und zerstörungsfreie Methode, um die zelluläre Anpassung an extreme Lebensräume zu bewerten, wenn nur knappes Material verfügbar ist und Zellen unter Laborbedingungen langsam oder gar nicht wachsen.
Abstract
Rotalgen (Rhodophyta) enthalten Phycobiliproteine und besiedeln Lebensräume mit schwachem Licht, einige (z. B. einige Chroothece-Arten ) können sich jedoch auch bei voller Sonneneinstrahlung entwickeln. Die meisten Rhodophyten sind rot, einige können jedoch bläulich erscheinen, abhängig vom Anteil an blauen und roten Biliproteinen (Phycocyanin und Phycoerythrin). Verschiedene Phycobiliproteine können Licht mit unterschiedlichen Wellenlängen einfangen und an Chlorophyll a weiterleiten, was die Photosynthese unter sehr unterschiedlichen Lichtbedingungen ermöglicht. Diese Pigmente reagieren auf Veränderungen des Lebensraums im Licht, und ihre Autofluoreszenz kann helfen, biologische Prozesse zu untersuchen. Unter Verwendung von Chroothece mobilis als Modellorganismus und dem spektralen Lambda-Scan-Modus in einem konfokalen Mikroskop wurde die Anpassung photosynthetischer Pigmente an verschiedene monochromatische Lichter auf zellulärer Ebene untersucht, um die optimalen Wachstumsbedingungen der Spezies zu erraten. Die Ergebnisse zeigten, dass sich der untersuchte Stamm, selbst wenn er aus einer Höhle isoliert wurde, sowohl an schwache als auch an mittlere Lichtintensitäten anpasste. Die vorgestellte Methode ist besonders nützlich für die Untersuchung von photosynthetischen Organismen, die unter Laborbedingungen nicht oder nur sehr langsam wachsen, was normalerweise bei Menschen der Fall ist, die in extremen Lebensräumen leben.
Introduction
Rotalgen, wie die Gattung Chroothece, können in extremen Lebensräumen wachsen, wo sie häufig mit starken Umweltveränderungen zurechtkommen1. Überschwemmungen und Dürren sind in halbtrockenen Regionen, in denen diese Gattung vorkommt, häufig, und einige Arten wurden in Bächen, Klippen, Höhlen oder sogar Thermalwasser gemeldet2. In den meisten Fällen werden Arten jedoch aufgrund biologischer Variablen wie Konkurrenz oder Beweidung in nicht optimale Wachstumsbedingungen verbannt. Da diese Organismen oft schwer zu kultivieren sind und unter Laborbedingungen entweder nicht oder nur sehr langsam wachsen, ist eine wesentliche Einschränkung die verfügbare Stichprobengröße. Daher ist es sehr wichtig, zerstörungsfreie Methoden oder Methoden zu befolgen, die eine minimale Probenmanipulation erfordern 3,4.
Die physiologischen Fähigkeiten, die zum Überleben in diesen rauen Umgebungen erforderlich sind, können überwacht werden, indem Veränderungen in ihren photosynthetischen Systemen verfolgt werden. Stoffwechselmechanismen, photosynthetische Effizienz und Empfindlichkeit gegenüber Licht oder Kulturbedingungen können durch Pigmentfluoreszenz-Emissionsprofile aufgrund genauer Änderungen ihrer Energieübertragung oder ihres Einfangensaufgedeckt werden 5,6,7,8.
Die Autofluoreszenz zellulärer Verbindungen kann als Marker für die Zytodiagnostik oder als natürlicher Indikator für den zellulären Zustand oder den Metabolismus als Reaktion auf äußere und innere Signale durch Änderungen der Emissionverwendet werden 9. Es kann auch verwendet werden, um taxonomisch verschiedene Gruppen von photosynthetischen Organismen zu unterscheiden10. Abhängig von der phylogenetischen Position phototropher Mikroorganismen kann man unterschiedliche In-vivo-Fluoreszenzmerkmale finden. Daher wurde mehrfach versucht, eine taxonomische Identifizierung auf der Grundlage der in vivo Eigenschaften der phototrophen Fluoreszenz (einschließlich Fluoreszenzabsorptions- und Emissionsspektren) durchzuführen11,12. Aufgrund der Vielfalt der akzessorischen Pigmente unter den Phytoplankton-Taxa können Unterschiede in den Wellenlängen, bei denen die Chlorophyll a (Chl a)-Fluoreszenz stimuliert wird, oder Unterschiede in den Emissionsspektren verwendet werden, um auf die Taxonomie13 zu schließen. Die in vivo Fluoreszenzanregungs- und Emissionsspektren dieser Proben beruhen nicht nur auf dem Stamm der Algen, sondern auch auf der Anpassung des Photosystems14. Die Effizienz der Energieübertragung auf Chl a oder das Verhältnis von Chl a zu akzessorischen Pigmenten und der zelluläre Pigmentgehalt sind empfindlich gegenüber Wachstumsbedingungen5.
Rotalgen, insbesondere Chroothece, haben mehrere akzessorische fluoreszierende Pigmente - Phycobiliproteine und Carotinoide; Ersteres Konzentrat in Phycobilisomen, die an die Thylakoide von Chloroplasten gebunden sind. Phycobiliproteine (Phycocyanin, Phycoerythrin und Allophycocyanin) können Licht unterschiedlicher Wellenlängen einfangen und an Chl a weiterleiten, was die Photosynthese unter sehr unterschiedlichen Licht- und Kulturbedingungen ermöglicht15. Zum Beispiel können Chroothece-Arten in Höhlen wachsen oder fast in leicht salzhaltigen kalkhaltigen Bächen auftauchen2.
Monochromatisches Licht beeinflusst das Wachstum und die Pigmentzusammensetzung von photosynthetischen Organismen und wurde untersucht, um das Wachstum von photosynthetischen Organismen in Höhlen zu verhindern oder zu kontrollieren. Mulec et al. zeigten, dass rot angereichertes Licht das Wachstum von Cyanobakterien, Algen und Pflanzen fördert16. Frühere Studien haben auch berichtet, dass grünes Licht die Pigmentzusammensetzung von Cyanobakterien beeinflusst17, während andere gezeigt haben, dass grünes Licht das Wachstum der meisten photosynthetischen Organismen verhindert und einige Cyanobakterien eine Verringerung der Thylakoide und eine schwächere mittlere Fluoreszenzintensität aufweisen18.
Um die Fähigkeit von Chroothece als Modellorganismus zu verstehen, raue Bedingungen zu überwinden, wurden kultivierte Zellen zunehmenden Lichtintensitäten und monochromatischem Licht (grün oder rot) ausgesetzt15, um zu sehen, wie sie mit den dunklen Bedingungen von Höhlen (wo rotes Licht vorherrscht) zurechtkommen. Das hierin vorgestellte Protokoll reproduziert die Wirkung der oben genannten Variablen auf die Phycobiliproteine von Chroothece auf zellulärer Ebene unter Verwendung seiner eigenen Autofluoreszenz.
Heutzutage wird die Fluoreszenz häufig als Werkzeug verwendet, um die physiologischen Reaktionen von Gefäßpflanzen, Mikroalgen, Makroalgen und Cyanobakterien zu untersuchen13,14,16. Die spektrale konfokale Fluoreszenzmikroskopie ist ein hervorragendes Werkzeug für In-vivo-Studien zur Bewertung der Physiologie photosynthetischer Proben auf Einzelzellebene 10,17,18,19,20, indem Probleme im Zusammenhang mit der geringen Wachstumsrate im Labor und den Schwierigkeiten bei der Gewinnung von genügend Biomasse für die damit verbundenen Extraktions- und biochemischen Methoden vermiedenwerden 8 . Sobald die Zellen 2 Wochen lang unter verschiedenen Kulturbedingungen behandelt wurden, kann das Lambda-Scan-Profil in vivo gemessen werden. Obwohl es mehrere Veröffentlichungen gibt, in denen verschiedene Wellenlängen der Anregung durch konfokale Bildgebung verwendet wurden 3,4,10,17, können die meisten Phycobiliproteine und Chl a unter Verwendung einer Anregungslinie mit einer Wellenlänge von 561 nm nachgewiesen werden, und die detektierte Emission reicht von 570 bis 760 nm Wellenlänge. Diese Kriterien basieren auf einer zuvor durchgeführten Analyse 10 mit handelsüblichen reinen Pigmenten (Tabelle 1) durch konfokale Bildgebung und den erhaltenen Ergebnissen in verschiedenen Algenarten20,21,22.
| Pigmente | λflmax (nm) | λ EXC (nm) | |||||||
| 351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
| Chl a | 660.9-678.1 | 43,4 ± 1,8 | 11,2 ± 0,2 | 1,8 ± 0,05 | 2,0 ± 0,08 | 12,2 ± 0,7 | 6,0 ± 0,3 | 4,2 ± 0,16 | 80,7 ± 1,5 |
| R-PE | 569.2-583.3 | 5,9 ± 0,6 | 5,9 ± 0,16 | 11,1 ± 0,04 | 42,2 ± 0,3 | 100.0 ± 0 | 90,0 ± 0,3 | 99,2 ± 0,08 | - |
| 652.1-668.6 | - | - | 1,5 ± 0,01 | 3,7 ± 0,04 | 26,7 ± 0,5 | 8,7 ± 0,16 | 11,1 ± 0,16 | 11,3 ± 0,2 | |
| C-PC | 636.2-676.4 | 2,3 ± 0,04 | 1,0 ± 0,01 | 0,6 ± 0,004 | 0,7 ± 0,008 | 2,0 ± 0,08 | 2,0 ± 0,04 | 3,3 ± 0,16 | 33,6 ± 0,9 |
| APC-XL | 667.3-683.8 | 15,1 ± 1,5 | 9,6 ± 0,98 | 1,0 ± 0,04 | 1,2 ± 0,08 | 5,9 ± 0,7 | 4,1 ± 0,5 | 23,2 ± 3,5 | 91,4 ± 2,3 |
Tabelle 1: Die reinen Pigmentinformationen, die zur Durchführung der Lambda-Scan-Analyse verwendet werden. Diese Tabelle zeigt die Emissionsspitzen und Schulter-/Fluoreszenzbandmaxima verschiedener Fluorochrome/Pigmente durch konfokale bildgebende Spektrophotometrie für alle Anregungswellenlängen sowie den prozentualen Anteil der Lichtemission durch Pigmente/Fluorochrome. Die Werte wurden nach folgender Formel berechnet: = MFI*100/255. Jeder Wert ist der Mittelwert ± SE (Mittelwert ± Standardfehler aus dem Mittelwert). Reine Pigmente wurden zur Kalibrierung des konfokalen Rasterlasermikroskops wie folgt verwendet: 1,2,10. Chlorophyll a wurde aus Spinacia oleracea, R-Phycoerythrin (R-PE) aus Porphyra tenera und C-Phycocyanin (C-PE) aus Spirulina sp. Alle Arten wurden in gefiltertem destilliertem Wasser gelöst. Allophycocyanin-XL (APC-XL) wurde aus Mastigocladus laminosus gewonnen, das in Ammoniumsulfat (60%) und Kaliumphosphat (pH = 7) gelöst wurde, um eine Konzentration von 38 mM zu erreichen. Die Scans wurden mit 400 μl jeder Pigmentlösung (Konzentration von 1 mg/ml) unter Verwendung einer mit 8 Vertiefungen abgedeckten Glasbodenkammer durchgeführt.
Die Untersuchung einer einzelnen Anregungswellenlänge ist eine recht nützliche erste Näherung. In diesem Fall ist es jedoch notwendig, den relativen Beitrag der verschiedenen Komplexe im Fluoreszenzsignal aufzuklären, was unter anderem empfohlen wird, um ein Fluoreszenzverhältnis oder eine Spektrumanalyse bei mehreren Wellenlängen durchzuführen.
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Protocol
Für die vorliegende Studie wurde die Algenart Chroothece mobilis verwendet. Die Art stammt aus der Mikroalgen-Edaphic SE Spanien, MAESE 20.29 Kultursammlung. Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1: Überblick über die Studie. Chroothece mobilis wird 2 Wochen lang unter extremen Lebensraumbedingungen, wie z.B. verschiedenen monochromatischen Lichtern, inkubiert. Die Wirkung auf die Physiologie von Chroothece wird durch Autofluoreszenz der in Phycobilisom- und Photosystemen enthaltenen Proteine unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops bewertet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
1. Probenvorbereitung
- Bereiten Sie das Inokulum von Chroothece mobilis aus der Agarkultur der Sammlung vor, indem Sie es in das flüssige Medium SWES überführen (Tabelle 2).
HINWEIS: SWES "Seewasser + Erddekokt + Salze" = Meerwassermedium23. - Alle Kulturen werden 2 Wochen lang mit einer Hell/Dunkel-Photoperiode von 16:8 bei 20 °C unter Bedingungen mit geringer Weißlichtintensität (LL: 80 μM/m2/s) und ohne Schütteln gehalten, bis die gewünschte Zelldichte erreicht ist (siehe Schritt 1.3).
HINWEIS: Die Wachstumslichtbedingungen betragen 80 μM/m2/s Lichtintensität (aktive photosynthetische Strahlung, PAR). Diese Bedingungen werden als schwache Lichtverhältnisse (Kontrolle) verwendet. Die Zusammensetzung des SWES-Mediums ist in Tabelle 2 angegeben. - Durchführung von Impfungen für die verschiedenen Experimente in der exponentiellen Kulturphase mit einer Zelldichte von 5 x 103 Zellen/ml in einer 24-Well-Platte unter Verwendung von 1 ml pro Well.
HINWEIS: Führen Sie eine Zellzählung mit einer Neubauer-Kammer24 durch und verdünnen Sie die Kultur bei Bedarf mit SWES.
| Zusammensetzung des SWES-Mediums | |
| Bestandteil | Konzentration |
| KNO3 | 1,98 mM |
| K2HPO4 | 115 μM |
| MgSO4 | 81 μM |
| ZnSO4, 7H2O | 17 nM |
| MnSO4, 7H2O | 45 Nm |
| H3 BO3, 4H2O | 3,1 mM |
| Co(NO3)2 | 17 mM |
| Na2MoO4, 6H2O | 21 nM |
| CuSO4, 2H2O | 0,1 nM |
| FeSO4, 5H2O | 13 μM |
| EDTA, 7H2O | 11 μM |
| Vit B12 | 5 μg |
| Bodenextrakt | 30 ml |
| Gefiltertes Flusswasser | 455 mL |
Tabelle 2: Zusammensetzung des SWES-Mediums.
2. Reproduktion extremer Algenlebensraumbedingungen: grüner und roter monochromatischer Lichteffekt
- 1 ml der Zellkultur aus der Stammkultur, die mit der oben genannten Zelldichte (Schritt 1.2) hergestellt wurde, wird hinzugefügt, um jede Vertiefung einer 24-Well-Platte zu beimpfen.
- Halten Sie die Zellkultur 2 Wochen lang bedeckt, um den monochromatischen Lichteffekt zu reproduzieren.
- Verwenden Sie den Grünfilter, der grünes Licht von 470 bis 570 nm mit einem Peak bei der Wellenlänge von 506 nm durchlässt (gemäß den Angaben des Herstellers; siehe Materialtabelle) und setzen Sie es der Kultur25 aus.
- Verwenden Sie den Rotfilter, der rotes Licht zwischen 590 und 720 nm zulässt und bei 678 nm seinen Höhepunkt erreicht (gemäß Herstellerangaben; siehe Materialtabelle), um es der Kultur25 auszusetzen.
HINWEIS: Die Bedingung der niedrigen weißen Lichtintensität (LL: 80 μM/m2/s; siehe Materialtabelle) wird als Lichtintensitätssteuerung verwendet, um die erzielten Effekte zu vergleichen. Die verwendeten Lichtintensitätseinheiten sind Mikromol pro Sekunde und Quadratmeter (μmol m-2 s-1) oder die photosynthetische Photonenflussdichte (PPFD).
3. Autofluoreszenz-Bildgebung
HINWEIS: Die Einrichtung der Bildgebungssoftware (siehe Materialtabelle) ist in Abbildung 2 dargestellt.
- Schalten Sie alle Komponenten des inversen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (CLSM; siehe Materialtabelle) ein, einschließlich des Lasers.
- Montieren Sie die Zellen aus jeder experimentellen Vertiefung der 24-Well-Platte in SWES-Wachstumsmedium zur Bildgebung auf eine 35-mm-Glasbodenschale (siehe Materialtabelle).
- Wählen Sie das 63x/1,30 NA Glycerin-Immersionsobjektiv und legen Sie Glycerin über das Objektiv (siehe Materialtabelle).
- Legen Sie die Well-Platte auf den Mikroskoptisch und stellen Sie sicher, dass sich die Probe während der Bildaufnahme nicht bewegt.
- Zentrieren Sie die Probe im Lichtweg und fokussieren Sie auf das Zentrum der Zelle, indem Sie die Ebene mit der höchsten Fluoreszenzintensität auswählen.
- Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware und wählen Sie xyλ aus der Dropdown-Liste im Aufnahmemodus26.
- Wählen Sie die Anregungslinie des Lasers mit 561 nm DPSS, 8 Bit Dynamikbereich und 1024 x 1024 Pixeln.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das konfokale Mikroskop über einen 561-nm-DPSS-Laser oder einen Weißlichtlaser (WLL) verfügt. - Sammeln Sie die Fluoreszenzemissionsspektren in der Bandbreite von 10 nm und die Lambda-Schrittweite von 4 nm im Bereich von 570-760 nm.
- Stellen Sie die Lochblende auf 1 Airy-Einheit ein und führen Sie die Lambda-Scan-Erfassung durch.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang so oft wie möglich in verschiedenen Sichtfeldern, um eine akzeptable Datenmenge für die statistische Analyse zu sammeln (in der Regel eine Standardabweichung von weniger als 10 %22).
- Wiederholen Sie den letzten Schritt unter den verschiedenen Bedingungen (unter roter und grüner Ampel) und speichern Sie die Daten.
HINWEIS: Verwenden Sie die gleichen Erfassungseinstellungen für die verschiedenen Proben und Bedingungen, um die statistische Analyse zu vergleichen und durchzuführen.
Abbildung 2: Software-Setup. Benutzeroberfläche der Imaging-Software zum Einrichten der Lambda-Scan-Parameter. (A) Wählen Sie von links nach rechts den Aufnahmemodus xyλ aus der Dropdown-Liste aus, der Schritt 3.6 im Protokoll entspricht, und wählen Sie den rechten Tauchlinsentyp aus, der Schritt 3.3 im Protokoll entspricht. Stellen Sie sicher, dass Sie in Schritt 3.9 alle Filter aus dem Lichtweg entfernen. (B) Das Panel zum Einrichten der Lambda-Scan-Parameter entspricht Schritt 3.8 im Protokoll. (C) Führen Sie den Lambda-Scan in Schritt 3.10 aus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
4. Parameter zur Bewertung der Physiologie von Chroothece
- Sobald der Lambda-Scan erfasst ist, klicken Sie auf das Quantifizierungsfenster oben in der Software (wie in Abbildung 3 gezeigt), um die gesammelten Fluoreszenzemissionsspektren auszuwerten. Wechseln Sie zum Fenster Projekt öffnen , und wählen Sie eine xyλ-Datei aus (Abbildung 3).
- Wählen Sie in der Imaging-Software die Option Stack-Profilanalyse aus.
- Definieren Sie eine Region of Interest (ROI) von 4 μm2 in der Mitte einer Zelle, um die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) zu analysieren. Exportieren Sie die Daten im CSV-Format.
HINWEIS: Es ist wichtig, das Vorhandensein von schwarzen Pixeln zu vermeiden (um sicherzustellen, dass die ausgewählten Pixel positive Werte enthalten) und immer einen gleich großen ROI beizubehalten. - Wiederholen Sie diesen Vorgang mit verschiedenen Zellen unter verschiedenen Bedingungen, um genügend Daten für eine statistische Analyse zu erhalten.
- Öffnen Sie die CSV-Dateien, um die verschiedenen Fluoreszenzemissionsspitzen aus den Phycobiliproteinen und Chlorophyllen aller gemessenen ROIs auszuwählen.
- Wählen Sie die Fluoreszenzdaten von Phycoerythrin-Phycocyanobilin (PE-PCB; 620 nm), C-Phycocyanin (CPC; 648 nm), Allophycocyanin (APC; 660 nm) bzw. Chlorophyll a (Chl a; 680 nm) in der CSV-Datei aus.
- Erstellen Sie eine neue Tabelle mit allen maximalen Fluoreszenzwerten, die von jedem Phycobiliprotein- und Chlorophyll-Peak erhalten wurden, und zeichnen Sie die Daten in einem Diagramm auf.
- Führen Sie statistische Analysen durch.
- Analysieren Sie, ob die erhaltenen Daten der Normalität und Homoskedastizität entsprechen27.
- Fahren Sie mit der t-Test-Analyse27,28 fort, wenn die erste Bedingung erfüllt ist. Wenn nicht, führen Sie einen Mann-Whitney-U-Test29 durch.
- Betrachten Sie die Unterschiede, die bei p-Werten <0,05 signifikant sind.
Abbildung 3: Bewertung der Autofluoreszenz von Chroothece. Um die Autofluoreszenzanalyse durchzuführen, stellen Sie sicher, dass Sie das Quantifizierfenster und eine xyλ-Datei im geöffneten Projektfenster auswählen (Schritt 4.1); Wählen Sie Stack Profile Visualization (Schritt 4.2) aus. Wählen Sie einen ROI von 4 μm2 in der Mitte einer Zelle aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Bericht, um die Lambda-Scandaten im CSV-Format zu exportieren (Schritt 4.3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Representative Results
Chlorophyll a absorbiert im Allgemeinen blaue und rote Wellenlängen des sichtbaren Lichts, während Phycobiliproteine grüne, gelbe und orangefarbene Wellenlängen verwenden7. Die Autofluoreszenz dieser Pigmente ermöglicht den ersten Ansatz zur Untersuchung des Verhaltens von Phycobiliproteinen und Chlorophyll unter Versuchs- und Feldbedingungen.
Durch den Vergleich der erhaltenen Daten und die Darstellung in verschiedenen Diagrammen können signifikante Änderungen der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) unterschieden werden (Abbildung 4). Eine weitere statistische Untersuchung der verschiedenen Emissionsspitzen, die in den Lambda-Scan-Profilen (620, 648, 660 und 680 nm) erhalten wurden, zeigte signifikante Unterschiede (statistische Signifikanz: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).
Der MFI von PE-PCB nahm signifikant ab, wenn die Zellen grünem monochromatischem Licht (GL) ausgesetzt wurden, aber es wurde kein Unterschied im Vergleich zur Kontrolle bei rotem Licht (RL) beobachtet (Abbildung 4A). Die GL hatte jedoch den gegenteiligen Effekt auf APC und Chl a (Abbildung 4B,C), bei denen der MFI aufgrund der Anpassung von Antennenkomplexen, unter anderem aufgrund einer erhöhten Menge oder einer verbesserten Konnektivität der Antennenkomplexe, signifikant zunahm. Die RL führte zu einem nicht signifikanten Anstieg sowohl der APC- als auch der Chl-a-Fluoreszenz 17,24,25,26.
Abbildung 4: Auswirkungen auf die Fluoreszenz von Chroothece phycobiliproteinen und Chlorophyll a unter monochromatischer Lichtbehandlung. (A-C) Die Fluoreszenzemissionsintensität, die bei der Anregungswellenlänge von 561 nm im Lambdascan erhalten wurde, und nach Analyse der Daten in Bezug auf verschiedene Phycobiliproteine (A: PE-PCB; B: APC) und Chlorophyll (C: Chl a). Die Felder enthalten die dargestellten Median-, Minimal- und Maximalwerte der Fluoreszenzemissionsintensität. Grüne Kästchen: grüner monochromatischer Lichtzustand (GL); rote Kästen: rotes monochromatisches Licht (RL); und blaue Kästchen: schlechte Lichtverhältnisse (LL, Steuerung). Statistische Signifikanz: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Einige einzellige oder koloniale Rotalgen, wie z. B. Chroothece, wachsen in vitro langsam, enthalten jedoch mehrere autofluoreszierende Verbindungen, die durch Spektralanalyse unter einem konfokalen Mikroskop analysiert werden können, wo Unterschiede in den Pigmentemissionsspitzen festgestellt werden können. Die spektrale konfokale Fluoreszenzmikroskopie hat es uns ermöglicht, In-vivo-Studien durchzuführen, um die Anpassung oder Akklimatisierung von photosynthetischen Organismen 8,10,17,18,19,20 zu bewerten. Die meisten anderen Techniken, wie z. B. die Proteinanalyse, erfordern große Mengen an Proben, sind destruktiv oder viel teurer.
Die Wellenlänge von 561 nm wurde hier gewählt, da sie selektiver für Phycobiliproteine ist (basierend auf einem früheren Bericht23); Es bestätigte die Ergebnisse einer früheren Studie zu den GL-Effekten auf Cyanobakterien unter Verwendung von drei verschiedenen Anregungswellenlängen (351, 488 und 543 nm). Um zuverlässige Daten zu erhalten, ist es entscheidend, alle Daten unter den gleichen Mikroskopbedingungen zu erfassen.
Dieses Protokoll ist ein einfacher erster Ansatz, um das Verhalten von Chroothece-Zellen unter verschiedenen Lichtbedingungen zu untersuchen, und bietet gleichzeitig die Möglichkeit, signifikante Unterschiede in der Zusammensetzung von Phycobiliprotein oder Chlorophyllen zu erhalten, die unter verschiedenen monochromatischen Lichtbedingungen behandelt wurden, dank der nachträglichen Analyse. Dies hilft zu bewerten, wie Rotalgenzellen auf veränderte Lebensraumbedingungen reagieren und ihre Anpassungsfähigkeit an extreme Lebensräume zu erlernen.
Algenzellen sind sehr reich an autofluoreszierenden Pigmenten (Chlorophyll, Phycobiliproteine, Carotinoide), wobei die Fluoreszenz einen weiten Wellenlängenbereich abdeckt. Diese Tatsache kann die CLSM-Bildanalyse erschweren. Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebung (FLIM), spektrale Entmischung und Anregung durch den weißen Laser können jedoch dazu beitragen, Signale30,31 zu trennen. In der Regel findet sich eine gute Korrelation zwischen dem physiologischen Zustand und der photosynthetischen Pigmentleistung in Mikroalgen3.
Nichtsdestotrotz sind destruktive Techniken zwingend erforderlich, um Änderungen des relativen Beitrags verschiedener Fluoreszenzkomplexe im Fluoreszenzsignal zu beurteilen oder eine Fluoreszenzverhältnis- und/oder Spektrumanalyse bei mehreren Anregungswellenlängen durchzuführen.
Der Einsatz dieser Methode ist vor allem dann wichtig, wenn knappes Material zur Verfügung steht und/oder Zellen unter Laborbedingungen nicht oder nur sehr langsam wachsen. Spektrale Technologien könnten Fortschritte wie Weißlichtlaser (zur Gewinnung von Anregungsspektren) und hochempfindliche Hybriddetektoren bieten, die in Kombination mit hochauflösenden Techniken spektrale Informationen und die Position von Proteinen mit einer nanometrischen Auflösung ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde im Rahmen der Projekte TIN2015-68454-R und 20961/PI/18 durchgeführt, die vom spanischen Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit und der Séneca-Stiftung der Region Murcia finanziert wurden. Irene Hernández Martínez und Francisco Javier Ibáñez López von der Abteilung für statistische Unterstützung des Wissenschafts- und Forschungsbereichs der Universität Murcia (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (Abbildung 1 wurden unter Verwendung von Bildern von Servier Medical Art gezeichnet. Servier Medical Art von Servier ist lizenziert mit einer Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | - |
| 24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
| Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | - |
| Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| green filter | PNTA, LEE filters | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
| Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | - |
| Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | - |
| R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | - |
| red filter | PNTA, LEE filters | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| SWES medium | University of Murcia | - | - |
| Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |
References
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