Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल चरण-दर-चरण ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग और वर्णक्रमीय विश्लेषण के आधार पर लाल शैवाल में फाइकोबिलिप्रोटीन परिवर्तनों के मूल्यांकन का वर्णन करता है। यह चरम आवासों के लिए सेलुलर अनुकूलन का मूल्यांकन करने के लिए एक लेबल-मुक्त और गैर-विनाशकारी विधि है, जब केवल दुर्लभ सामग्री उपलब्ध होती है और प्रयोगशाला स्थितियों के तहत कोशिकाएं धीरे-धीरे बढ़ती हैं, या बिल्कुल नहीं।
Abstract
लाल शैवाल (रोडोफाइटा) में फाइकोबिलीप्रोटीन होते हैं और मंद प्रकाश के साथ आवासों को उपनिवेशित करते हैं, हालांकि कुछ (जैसे, कुछ क्रोथेस प्रजातियां) पूर्ण धूप में भी विकसित हो सकते हैं। अधिकांश रोडोफाइट्स लाल होते हैं, हालांकि कुछ नीले और लाल बिलीप्रोटीन (फाइकोसायनिन और फाइकोएरिथ्रिन) के अनुपात के आधार पर नीले दिखाई दे सकते हैं। विभिन्न फाइकोबिलीप्रोटीन विभिन्न तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश को पकड़ सकते हैं और इसे क्लोरोफिल ए तक पहुंचा सकते हैं, जो बहुत अलग प्रकाश परिस्थितियों में प्रकाश संश्लेषण को संभव बनाता है। ये पिगमेंट प्रकाश में निवास स्थान में परिवर्तन का जवाब देते हैं, और उनके ऑटोफ्लोरेसेंस जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में मदद कर सकते हैं। एक मॉडल जीव के रूप में क्रोमोथेस मोबिलाइजेशन और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में वर्णक्रमीय लैम्ब्डा स्कैन मोड का उपयोग करते हुए, प्रजातियों की इष्टतम विकास स्थितियों का अनुमान लगाने के लिए सेलुलर स्तर पर विभिन्न मोनोक्रोमैटिक रोशनी के लिए प्रकाश संश्लेषक वर्णक के अनुकूलन का अध्ययन किया गया था। परिणामों से पता चला है कि, यहां तक कि जब अध्ययन किए गए तनाव को एक गुफा से अलग किया गया था, तब भी यह मंद और मध्यम प्रकाश तीव्रता दोनों के अनुकूल था। प्रस्तुत विधि विशेष रूप से प्रकाश संश्लेषक जीवों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है जो प्रयोगशाला स्थितियों के तहत बहुत धीरे-धीरे नहीं बढ़ते हैं या बढ़ते हैं, जो आमतौर पर चरम आवासों में रहने वालों के लिए मामला है।
Introduction
लाल शैवाल, जैसे जीनस क्रोथेस, चरम आवासों में बढ़ सकते हैं, जहां उन्हें अक्सर चिह्नित पर्यावरणीयपरिवर्तनों का सामना करना पड़ता है। अर्ध-शुष्क क्षेत्रों में बाढ़ और सूखा अक्सर होता है जहां यह जीनस पाया जा सकता है, और कुछ प्रजातियों को खाड़ियों, चट्टानों, गुफाओं या यहां तक किथर्मल पानी में भी रिपोर्ट किया गया है। हालांकि, ज्यादातर समय, जैविक चर, जैसे कि प्रतिस्पर्धा या चराई, प्रजातियों को उनके विकास के लिए गैर-इष्टतम परिस्थितियों में ले जाते हैं। चूंकि इन जीवों को अक्सर संस्कृति करना मुश्किल होता है और या तो प्रयोगशाला स्थितियों के तहत बहुत धीरे-धीरे नहीं बढ़ते हैं या बढ़ते हैं, एक प्रमुख सीमा उपलब्ध नमूना आकार है। इसलिए, गैर-विनाशकारी तरीकों या विधियों का पालन करना बहुत महत्वपूर्ण है जिसमें न्यूनतम नमूना हेरफेर 3,4 शामिल है।
इन कठोर वातावरणों में जीवित रहने के लिए आवश्यक शारीरिक कौशल की निगरानी उनके प्रकाश संश्लेषक प्रणालियों में परिवर्तन का पालन करके की जा सकती है। मेटाबोलिक तंत्र, प्रकाश संश्लेषक दक्षता, और प्रकाश या संस्कृति स्थितियों के प्रति संवेदनशीलता को वर्णक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन प्रोफाइल द्वारा प्रकट किया जा सकता है, उनके ऊर्जा हस्तांतरण में सटीक परिवर्तन या 5,6,7,8 को फंसाने के कारण।
सेलुलर यौगिकों के ऑटोफ्लोरेसेंस का उपयोग साइटोडायग्नोसिस के लिए मार्कर के रूप में या उत्सर्जन में परिवर्तन के माध्यम से बाहरी और आंतरिक संकेतों के जवाब में सेलुलर स्थिति या चयापचय के प्राकृतिक संकेतक के रूप में किया जासकता है। इसका उपयोग प्रकाश संश्लेषक जीवों के विभिन्न समूहों को वर्गीकृत रूप से भेदभाव करने के लिए भी किया जासकता है। फोटोट्रोफिक सूक्ष्मजीवों की फाइटोलैनेटिक स्थिति के आधार पर, कोई विवो फ्लोरेसेंस विशेषताओं में अलग-अलग पा सकता है। इसलिए, फोटोट्रोफिक फ्लोरेसेंस (फ्लोरेसेंस अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा सहित) की इनविवो विशेषताओं के आधार पर एक टैक्सोनोमिक पहचान का प्रयास कई अवसरों परकिया गया है। फाइटोप्लांकटन टैक्सा के बीच सहायक पिगमेंट में विविधता के कारण, तरंग दैर्ध्य में अंतर जिस पर क्लोरोफिल ए (सीएचएल ए) प्रतिदीप्ति उत्तेजित होती है, या उत्सर्जन स्पेक्ट्रा में अंतर, टैक्सोनॉमी13 का अनुमान लगाने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इन नमूनों के विवो फ्लोरेसेंस उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा न केवल शैवाल के फ़ाइला पर निर्भर करते हैं, बल्कि फोटोसिस्टम अनुकूलन14 पर भी निर्भर करते हैं। सीएचएल ए में ऊर्जा हस्तांतरण की दक्षता, या सहायक वर्णक के लिए सीएचएल ए का अनुपात, और सेलुलर वर्णक सामग्रीविकास की स्थिति के प्रति संवेदनशील हैं।
लाल शैवाल, विशेष रूप से क्रोथेस, में कई सहायक फ्लोरोसेंट पिगमेंट-फाइकोबिलीप्रोटीन और कैरोटीनॉयड होते हैं; पूर्व क्लोरोप्लास्ट के थायलाकोइड्स से जुड़े फाइकोबिलिसोम में केंद्रित है। फाइकोबिलीप्रोटीन (फाइकोसायनिन, फाइकोएरिथ्रिन, और एलोफीकोसायनिन) विभिन्न तरंग दैर्ध्य पर प्रकाश को पकड़ सकते हैं और इसे सीएचएल ए में प्रसारित कर सकते हैं, जो प्रकाश संश्लेषण को बहुत अलग प्रकाश और संस्कृति स्थितियोंमें संभव बनाता है। उदाहरण के लिए, क्रोथेस प्रजातियां गुफाओं के अंदर बढ़ सकती हैं या लगभग थोड़ी लवणीय कैल्केरसधाराओं में उभर सकती हैं।
मोनोक्रोमैटिक रोशनी प्रकाश संश्लेषक जीवों के विकास और वर्णक संरचना को प्रभावित करती है, और गुफाओं में प्रकाश संश्लेषक जीवों के विकास को रोकने या नियंत्रित करने के लिए अध्ययन किया गया है। मुलेक एट अल ने दिखाया कि लाल समृद्ध प्रकाश सायनोबैक्टीरिया, शैवाल और पौधों के विकास को बढ़ावा देताहै। पिछले अध्ययनों ने यह भी बताया है कि हरी रोशनी साइनोबैक्टीरिया17 की वर्णक संरचना को प्रभावित करती है, जबकि अन्य ने खुलासा किया है कि हरी रोशनी अधिकांश प्रकाश संश्लेषक जीवों के विकास को रोकती है और कुछ साइनोबैक्टीरिया थायलाकोइड्स में कमी और कमजोर औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता18 प्रदर्शित करते हैं।
कठोर परिस्थितियों को दूर करने के लिए एक मॉडल जीव के रूप में क्रोथेस की क्षमता को समझने के लिए, सुसंस्कृत कोशिकाओं को बढ़ती प्रकाश तीव्रता और मोनोक्रोमैटिक प्रकाश (हरा या लाल) 15 के संपर्क में लाया गया है, यह देखने के लिए कि यह गुफाओं की मंद परिस्थितियों (जहां लाल प्रकाश प्रबल है) के साथ कैसे सामना करता है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल अपने स्वयं के ऑटोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके सेलुलर स्तर पर क्रोमोथेस के फाइकोबिलिप्रोटीन पर उपर्युक्त चर के प्रभाव को पुन: उत्पन्न करता है।
आजकल, फ्लोरेसेंस का उपयोग आमतौर पर संवहनी पौधों, सूक्ष्म शैवाल, मैक्रोएल्गी और साइनोबैक्टीरिया 13,14,16 की शारीरिक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में किया जाता है। स्पेक्ट्रल कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी एकल-कोशिका स्तर 10,17,18,19,20 पर प्रकाश संश्लेषक नमूनों के शरीर विज्ञान का मूल्यांकन करने के लिए विवो अध्ययनों में एक शानदार उपकरण है, प्रयोगशाला में कम विकास दर से जुड़ी समस्याओं से बचकर और संबंधित निष्कर्षण और जैव रासायनिक विधियों के लिए पर्याप्त बायोमास प्राप्त करने में कठिनाइयों से बचकर। . एक बार जब कोशिकाओं को 2 सप्ताह के लिए विभिन्न संस्कृति स्थितियों के तहत इलाज किया जाता है, तो लैम्ब्डा स्कैन प्रोफाइल को विवो में मापा जा सकता है। यद्यपि ऐसे कई प्रकाशन हैं जिनमें कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा उत्तेजना के विभिन्न तरंग दैर्ध्य का उपयोग 3,4,10,17 किया गया है, अधिकांश फाइकोबिलीप्रोटीन और सीएचएल ए का पता 561 एनएम तरंग दैर्ध्य उत्तेजना लाइन का उपयोग करके लगाया जा सकता है, और पता लगाया गया उत्सर्जन 570 से 760 एनएम तरंग दैर्ध्य तक होता है। ये मानदंड पहले वाणिज्यिक शुद्ध पिगमेंट (तालिका 1) के साथ किए गए विश्लेषण पर आधारित हैं, जो कॉन्फोकल इमेजिंग द्वारा किए गए थे और विभिन्न शैवाल प्रजातियों20,21,22 में प्राप्त परिणाम थे।
| पिगमेंट | λflअधिकतम (nm) | λ exc (nm) | |||||||
| 351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
| Chl a | 660.9-678.1 | 43.4 ± 1.8 | 11.2 ± 0.2 | 1.8 ± 0.05 | 2.0 ± 0.08 | 12.2 ± 0.7 | 6.0 ± 0.3 | 4.2 ± 0.16 | 80.7 ± 1.5 |
| R-PE | 569.2-583.3 | 5.9 ± 0.6 | 5.9 ± 0.16 | 11.1 ± 0.04 | 42.2 ± 0.3 | 100.0 ± 0 | 90.0 ± 0.3 | 99.2 ± 0.08 | - |
| 652.1-668.6 | - | - | 1.5 ± 0.01 | 3.7 ± 0.04 | 26.7 ± 0.5 | 8.7 ± 0.16 | 11.1 ± 0.16 | 11.3 ± 0.2 | |
| C-PC | 636.2-676.4 | 2.3 ± 0.04 | 1.0 ± 0.01 | 0.6 ± 0.004 | 0.7 ± 0.008 | 2.0 ± 0.08 | 2.0 ± 0.04 | 3.3 ± 0.16 | 33.6 ± 0.9 |
| APC-XL | 667.3-683.8 | 15.1 ± 1.5 | 9.6 ± 0.98 | 1.0 ± 0.04 | 1.2 ± 0.08 | 5.9 ± 0.7 | 4.1 ± 0.5 | 23.2 ± 3.5 | 91.4 ± 2.3 |
तालिका 1: लैम्ब्डा स्कैन विश्लेषण चलाने के लिए उपयोग की जाने वाली शुद्ध वर्णक जानकारी। यह तालिका सभी उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के लिए कॉन्फोकल इमेजिंग स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा विभिन्न फ्लोरोक्रोम / पिगमेंट के उत्सर्जन चोटियों और कंधों / फ्लोरेसेंस बैंड मैक्सिमा को दर्शाती है, और पिगमेंट / फ्लोरोक्रोम द्वारा प्रकाश उत्सर्जन का प्रतिशत। मानों की गणना सूत्र द्वारा की गई थी: = एमएफआई * 100/255। प्रत्येक मान एसई ± माध्य है (माध्य से औसत ± मानक त्रुटि)। शुद्ध पिगमेंट का उपयोग कॉन्फोकल स्कैनिंग लेजर माइक्रोस्कोप को कैलिब्रेट करने के लिए किया गया था, जो निम्नानुसार 1,2,10 था। क्लोरोफिल ए को स्पिनेशिया ओलेरेसिया से, आर-फाइकोएरिथ्रिन (आर-पीई) को पोर्फिरी टेनेरा से और सी-फाइकोसायनिन (सी-पीई) को स्पिरुलिना एसपी से प्राप्त किया गया था। सभी प्रजातियों को फ़िल्टर किए गए आसुत जल में भंग कर दिया गया था। एलोफिकोसायनिन-एक्सएल (एपीसी-एक्सएल) को मास्टिगोक्लेडस लैमिनोसस से प्राप्त किया गया था, जिसे 38 एमएम की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए अमोनियम सल्फेट (60%) और पोटेशियम फॉस्फेट (पीएच = 7) में भंग कर दिया गया था। स्कैन 8-अच्छी तरह से कवर किए गए ग्लास बॉटम चैंबर का उपयोग करके प्रत्येक वर्णक समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता) के 400 μL के साथ किया गया था।
एकल उत्तेजना तरंगदैर्ध्य का अध्ययन काफी उपयोगी पहला अनुमान है। इस मामले में, हालांकि, प्रतिदीप्ति संकेत में विभिन्न परिसरों के सापेक्ष योगदान को स्पष्ट करना आवश्यक है, जिसे अन्य तरीकों के बीच कई तरंग दैर्ध्य पर प्रतिदीप्ति अनुपात या स्पेक्ट्रम विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है।
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Protocol
वर्तमान अध्ययन के लिए अल्गल प्रजाति क्रोथेस मोबिलाइजेशन का उपयोग किया गया था। प्रजाति को माइक्रोएल्गी एडाफिक एसई स्पेन, एमएईएसई 20.29 संस्कृति संग्रह से प्राप्त किया गया था। प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्रा 1 में दिखाया गया है।
चित्र 1: अध्ययन का अवलोकन। क्रोमोथेस मोबिलाइजेशन को 2 सप्ताह के लिए विभिन्न मोनोक्रोमैटिक रोशनी जैसे चरम निवास स्थितियों के तहत इनक्यूबेट किया जाता है। क्रोमोथेस के शरीर विज्ञान पर प्रभाव का मूल्यांकन एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फाइकोबिलिसोम और फोटोसिस्टम में निहित प्रोटीन के ऑटोफ्लोरेसेंस द्वारा किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
1. नमूना तैयार करना
- संग्रह की आगर संस्कृति से क्रोमोथेस मोबिलाइजेशन के इनोकुलम को एसडब्ल्यूईएस तरल माध्यम में स्थानांतरित करके तैयार करें (तालिका 2)।
नोट: SWES "सीवर + एर्डडेकोकट + साल्ज़े" = समुद्री जल माध्यम23। - सभी संस्कृतियों को 2 सप्ताह के लिए 2 सप्ताह के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 16: 8 प्रकाश / अंधेरे फोटोअवधि के साथ कम सफेद प्रकाश तीव्रता (एलएल: 80 μM / m2 / s) स्थितियों के तहत और बिना हिलाए बनाए रखें, जब तक कि वांछित सेल घनत्व प्राप्त न हो जाए (चरण 1.3 देखें)।
नोट: विकास प्रकाश की स्थिति 80 μM / m2 / s प्रकाश तीव्रता (सक्रिय प्रकाश संश्लेषक विकिरण, PAR) है। इन स्थितियों का उपयोग कम प्रकाश की स्थिति (नियंत्रण) के रूप में किया जाता है। एसडब्ल्यूईएस माध्यम की संरचना तालिका 2 में प्रदान की गई है। - 1 एमएल प्रति अच्छी तरह से उपयोग करके 24-वेल प्लेट में 5 x 103 कोशिकाओं / एमएल के सेल घनत्व के साथ घातीय संस्कृति चरण में विभिन्न प्रयोगों के लिए टीकाकरण करें।
नोट: न्यूबॉयर कक्ष24 के साथ सेल गिनती करें, और जब भी आवश्यक हो एसडब्ल्यूईएस के साथ संस्कृति को पतला करें।
| SWES मध्यम संरचना | |
| घटक | एकाग्रता |
| KNO3 | 1.98 mM |
| K2HPO4 | 115 μM |
| MgSO4 | 81 μM |
| ZnSO4, 7H2O | 17 nM |
| एमएनएसओ4, 7 एच2ओ | 45 एनएम |
| H3BO3, 4H2O | 3.1 mM |
| Co(NO3)2 | 17 mM |
| Na2MoO4, 6H2O | 21 nM |
| CuSO4, 2H2O | 0.1 nM |
| FeSO4, 5H2O | 13 μM |
| EDTA, 7H2O | 11 μM |
| Vit B12 | 5 μg |
| मिट्टी का अर्क | 30 mL |
| नदी का फिल्टर किया हुआ पानी | 455 mL |
तालिका 2: एसडब्ल्यूईएस मध्यम संरचना।
2. चरम शैवाल निवास की स्थिति का प्रजनन: हरे और लाल मोनोक्रोमैटिक प्रकाश प्रभाव
- 24-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं को टीका लगाने के लिए उपर्युक्त सेल घनत्व (चरण 1.2) पर तैयार स्टॉक कल्चर से सेल संस्कृति का 1 एमएल जोड़ें।
- मोनोक्रोमैटिक प्रकाश प्रभाव को पुन: उत्पन्न करने के लिए सेल संस्कृति को 2 सप्ताह तक कवर रखें।
- हरे रंग के फिल्टर का उपयोग करें जो हरी रोशनी को 506 एनएम तरंग दैर्ध्य (निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार; सामग्री की तालिका देखें) पर शिखर के साथ 470 से 570 एनएम तक गुजरने की अनुमति देता है और इसेसंस्कृति 25 में उजागर करता है।
- लाल फिल्टर का उपयोग करें जो 590 और 720 एनएम के बीच लाल प्रकाश की अनुमति देता है और 678 एनएम (निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार; सामग्री की तालिका देखें) पर चोटियों कोसंस्कृति 25 में उजागर करने के लिए।
नोट: कम सफेद प्रकाश तीव्रता (एलएल: 80 μM / m2 / s; सामग्री की तालिका देखें) स्थिति का उपयोग प्राप्त प्रभावों की तुलना करने के लिए प्रकाश तीव्रता नियंत्रण के रूप में किया जाता है। नियोजित प्रकाश तीव्रता इकाइयाँ माइक्रोमोल प्रति सेकंड और वर्ग मीटर (μmol m-2 s-1) या प्रकाश संश्लेषक फोटॉन फ्लक्स घनत्व (PPFD) हैं।
3. ऑटोफ्लोरेसेंस इमेजिंग
नोट: इमेजिंग सॉफ्टवेयर का सेटअप ( सामग्री की तालिका देखें) चित्रा 2 में चित्रित किया गया है।
- लेजर सहित उल्टे कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (सीएलएसएम; सामग्री की तालिका देखें) के सभी घटकों को चालू करें।
- इमेजिंग के लिए एसडब्ल्यूईएस विकास माध्यम में 24-वेल प्लेट के प्रत्येक प्रयोगात्मक कुएं से कोशिकाओं को 35 मिमी ग्लास बॉटम डिश ( सामग्री की तालिका देखें) में माउंट करें।
- 63x/1.30 NA ग्लिसरॉल विसर्जन उद्देश्य चुनें और लेंस के ऊपर ग्लिसरॉल रखें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- माइक्रोस्कोप स्टेज पर वेल प्लेट रखें और सुनिश्चित करें कि छवि अधिग्रहण के दौरान नमूना आगे न बढ़े।
- नमूना को प्रकाश पथ में केंद्रित करें और उच्चतम प्रतिदीप्ति तीव्रता वाले विमान का चयन करके सेल के केंद्र पर ध्यान केंद्रित करें।
- छवि अधिग्रहण सॉफ़्टवेयर खोलें और अधिग्रहण मोड26 में ड्रॉप-डाउन सूची से xys चुनें।
- 561 एनएम डीपीएसएस, गतिशील रेंज के 8 बिट्स और 1024 x 1024 पिक्सेल के लिए लेजर की उत्तेजना रेखा का चयन करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में 561 एनएम डीपीएसएस लेजर या एक सफेद प्रकाश लेजर (डब्ल्यूएलएल) है। - 10 एनएम बैंडविड्थ में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा और 570-760 एनएम रेंज के भीतर 4 एनएम के लैम्ब्डा चरण आकार को इकट्ठा करें।
- पिनहोल को 1 ऐरी यूनिट पर सेट करें और लैम्ब्डा स्कैन अधिग्रहण चलाएं।
- सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए डेटा की स्वीकार्य मात्रा एकत्र करने के लिए विभिन्न क्षेत्रों में इस प्रक्रिया को जितनी बार संभव हो उतनी बार दोहराएं (आमतौर पर 10% 22 से कम मानक विचलन)।
- विभिन्न परिस्थितियों (लाल और हरी रोशनी के तहत) के तहत अंतिम चरण दोहराएं और डेटा को सहेजें।
नोट: सांख्यिकीय विश्लेषण की तुलना और संचालन करने के लिए विभिन्न नमूनों और शर्तों के लिए एक ही अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करें।
चित्रा 2: सॉफ्टवेयर सेटअप। लैम्ब्डा स्कैन पैरामीटर सेट करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर यूजर इंटरफेस। (ए) बाएं से दाएं, ड्रॉप-डाउन सूची से अधिग्रहण मोड xys का चयन करने के लिए, जो प्रोटोकॉल में चरण 3.6 से मेल खाता है, और प्रोटोकॉल में चरण 3.3 के अनुरूप दाएं विसर्जन लेंस प्रकार का चयन करना। चरण 3.9 में प्रकाश पथ से किसी भी फ़िल्टर को निकालना सुनिश्चित करें। (बी) लैम्ब्डा स्कैन पैरामीटर स्थापित करने के लिए पैनल प्रोटोकॉल में चरण 3.8 से मेल खाता है। (सी) चरण 3.10 में लैम्ब्डा स्कैन चलाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
4. क्रोथेस के शरीर विज्ञान का मूल्यांकन करने के लिए पैरामीटर
- एक बार लैम्ब्डा स्कैन प्राप्त हो जाने के बाद, एकत्र किए गए प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा का मूल्यांकन करने के लिए सॉफ्टवेयर के शीर्ष पर मात्रा विंडो पर क्लिक करें (जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है)। ओपन प्रोजेक्ट विंडो पर जाएं और एक xyλ फ़ाइल का चयन करें (चित्रा 3)।
- इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में स्टैक प्रोफ़ाइल विश्लेषण का चयन करें।
- औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) का विश्लेषण करने के लिए एक सेल के केंद्र में 4 μm2 के रुचि के क्षेत्र (ROI) को परिभाषित करें। डेटा को CSV स्वरूप में निर्यात करें.
नोट: काले पिक्सेल की उपस्थिति से बचना महत्वपूर्ण है (यह सुनिश्चित करने के लिए कि चयनित पिक्सेल में सकारात्मक मान हैं) और हमेशा एक ही आकार का आरओआई बनाए रखें। - सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त डेटा का उत्पादन करने के लिए विभिन्न परिस्थितियों में विभिन्न कोशिकाओं के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं।
- सभी मापा आरओआई के फाइकोबिलिप्रोटीन और क्लोरोफिल से विभिन्न प्रतिदीप्ति उत्सर्जन चोटियों का चयन करने के लिए सीएसवी फाइलें खोलें।
- सीएसवी फ़ाइल में क्रमशः फाइकोएरिथ्रिन-फाइकोसाइनोबिलिन (पीई-पीसीबी; 620 एनएम), सी-फाइकोसायनिन (सीपीसी; 648 एनएम), एलोफिकोसाइनिन (एपीसी; 660 एनएम), और क्लोरोफिल ए (सीएचएल ए; 680 एनएम) के प्रतिदीप्ति डेटा का चयन करें।
- प्रत्येक फाइकोबिलिप्रोटीन और क्लोरोफिल शिखर से प्राप्त सभी अधिकतम प्रतिदीप्ति मूल्यों के साथ एक नई तालिका बनाएं और एक ग्राफ पर डेटा प्लॉट करें।
- सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
- विश्लेषण करें कि क्या प्राप्त डेटा सामान्यता और समरूपता को पूरा करताहै।
- यदि पहली स्थिति सही है तोटी-टेस्ट विश्लेषण 27,28 पर आगे बढ़ें। यदि नहीं, तो मान-व्हिटनी यू टेस्ट29 चलाएं।
- पी मान <0.05 पर महत्वपूर्ण अंतरों पर विचार करें।
चित्रा 3: क्रोथेस के ऑटोफ्लोरेसेंस का मूल्यांकन। ऑटोफ्लोरेसेंस विश्लेषण करने के लिए, खुली परियोजना विंडो (चरण 4.1) में मात्रा विंडो और एक xys फ़ाइल का चयन करना सुनिश्चित करें; स्टैक प्रोफ़ाइल विज़ुअलाइज़ेशन का चयन करें (चरण 4.2); सेल के केंद्र में 4 μm2 ROI का चयन करें और CSV प्रारूप (चरण 4.3) में लैम्ब्डा स्कैन डेटा निर्यात करने के लिए रिपोर्ट बटन पर क्लिक करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Representative Results
क्लोरोफिल ए आम तौर पर दृश्य प्रकाश के नीले और लाल तरंग दैर्ध्य को अवशोषित करता है, जबकि फाइकोबिलिप्रोटीन हरे, पीले और नारंगी तरंग दैर्ध्य काउपयोग करते हैं। इन पिगमेंट का ऑटोफ्लोरेसेंस प्रयोगात्मक और क्षेत्र स्थितियों के तहत फाइकोबिलिप्रोटीन और क्लोरोफिल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए पहला दृष्टिकोण संभव बनाता है।
प्राप्त डेटा की तुलना करके और विभिन्न ग्राफ़ पर प्लॉटिंग करके, औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) में महत्वपूर्ण परिवर्तनों को अलग किया जा सकता है (चित्रा 4)। लैम्ब्डा स्कैन प्रोफाइल (620, 648, 660 और 680 एनएम) में प्राप्त विभिन्न उत्सर्जन चोटियों के एक गुप्त सांख्यिकीय अध्ययन ने महत्वपूर्ण अंतर दिखाए (सांख्यिकीय महत्व: * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001)।
पीई-पीसीबी के एमएफआई में काफी कमी आई जब कोशिकाओं को हरे मोनोक्रोमैटिक लाइट (जीएल) के संपर्क में लाया गया, लेकिन लाल प्रकाश (आरएल) (चित्रा 4 ए) में नियंत्रण की तुलना में कोई अंतर नहीं देखा गया। हालांकि, जीएल का एपीसी और सीएचएल ए (चित्रा 4 बी, सी) पर विपरीत प्रभाव पड़ा, जिसमें एंटीना परिसरों के अनुकूलन के कारण एमएफआई में काफी वृद्धि हुई, क्योंकि एंटीना परिसरों की बढ़ी हुई मात्रा या बेहतर कनेक्टिविटी के कारण। आरएल ने एपीसी और सीएचएल दोनों में प्रतिदीप्ति 17,24,25,26 में एक गैर-महत्वपूर्ण वृद्धि का उत्पादन किया।
चित्रा 4: मोनोक्रोमैटिक प्रकाश उपचार के तहत क्रोमोथेस फाइकोबिलिप्रोटीन और क्लोरोफिल ए की प्रतिदीप्ति पर प्रभाव। (ए-सी) लैम्ब्डा स्कैन में 561 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर प्राप्त प्रतिदीप्ति उत्सर्जन तीव्रता और विभिन्न फाइकोबिलीप्रोटीन (ए: पीई-पीसीबी) से संबंधित डेटा का विश्लेषण किया गया है। बी: एपीसी) और क्लोरोफिल (सी: सीएचएल ए)। बक्से में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन तीव्रता के प्लॉट किए गए माध्य, न्यूनतम और अधिकतम मान होते हैं। हरे बक्से: हरे मोनोक्रोमैटिक प्रकाश की स्थिति (जीएल); लाल बक्से: लाल मोनोक्रोमैटिक लाइट (आरएल); और नीले बक्से: कम रोशनी की स्थिति (एलएल, नियंत्रण)। सांख्यिकीय महत्व: *p < 0.05, **p < 0.01, **p < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
कुछ एककोशिकीय या औपनिवेशिक लाल शैवाल, जैसे कि क्रोमोथेस, विट्रो में धीरे-धीरे बढ़ते हैं, लेकिन इसमें कई ऑटोफ्लोरोसेंट यौगिक होते हैं जिनका विश्लेषण एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत वर्णक्रमीय विश्लेषण द्वारा किया जा सकता है, जहां वर्णक उत्सर्जन चोटियों में अंतर का पता लगाया जा सकता है। स्पेक्ट्रल कॉन्फोकल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी ने हमें प्रकाश संश्लेषक जीवों 8,10,17,18,19,20 के अनुकूलन या अनुकूलन का मूल्यांकन करने के लिए विवो अध्ययन में संचालन करने की अनुमति दी है। अधिकांश अन्य तकनीकों, जैसे प्रोटीन विश्लेषण, को बड़ी मात्रा में नमूनों की आवश्यकता होती है, विनाशकारी होते हैं, या बहुत अधिक महंगे होते हैं।
561 एनएम तरंग दैर्ध्य को यहां चुना गया था क्योंकि यह फाइकोबिलिप्रोटीन के लिए अधिक चयनात्मक है (पिछली रिपोर्ट23 के आधार पर); इसने तीन अलग-अलग उत्तेजना तरंग दैर्ध्य (351, 488 और 543 एनएम) का उपयोग करके साइनोबैक्टीरिया पर जीएल प्रभावों पर पिछले अध्ययन के परिणामों की पुष्टि की। विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए, एक ही माइक्रोस्कोप स्थितियों के तहत सभी डेटा प्राप्त करना महत्वपूर्ण है।
यह प्रोटोकॉल विभिन्न प्रकाश स्थितियों के तहत क्रोमोथेस कोशिकाओं के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक आसान पहला दृष्टिकोण है, जबकि यह फाइकोबिलीप्रोटीन या क्लोरोफिल की संरचना में महत्वपूर्ण अंतर प्राप्त करने की संभावना भी प्रदान करता है, जिन्हें अलग-अलग मोनोक्रोमैटिक प्रकाश स्थितियों के तहत इलाज किया गया है, पोस्ट-प्रदर्शन विश्लेषण के लिए धन्यवाद। यह मूल्यांकन करने में मदद करता है कि लाल शैवाल कोशिकाएं आवास की स्थिति में परिवर्तन का जवाब कैसे देती हैं और चरम आवासों के लिए अपनी अनुकूलन क्षमता सीखती हैं।
शैवाल कोशिकाएं ऑटोफ्लोरोसेंट पिगमेंट (क्लोरोफिल, फाइकोबिलीप्रोटीन, कैरोटीनॉयड) में बहुत समृद्ध होती हैं, जिसमें प्रतिदीप्ति तरंग दैर्ध्य की एक विस्तृत श्रृंखला में फैली होती है। यह तथ्य सीएलएसएम छवि विश्लेषण को जटिल कर सकता है; हालांकि, फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग (एफएलआईएम), स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग, और सफेद लेजर द्वारा उत्तेजना सिग्नल30,31 को अलग करने में मदद कर सकती है। आमतौर पर माइक्रोएल्गी3 में शारीरिक स्थिति और प्रकाश संश्लेषक वर्णक प्रदर्शन के बीच एक अच्छा सहसंबंध पाया जाता है।
फिर भी, प्रतिदीप्ति संकेत में विभिन्न प्रतिदीप्ति परिसरों के सापेक्ष योगदान में परिवर्तन का आकलन करने के लिए विनाशकारी तकनीकें अनिवार्य हैं, या कई उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर प्रतिदीप्ति अनुपात और / या स्पेक्ट्रम विश्लेषण करने के लिए।
इस पद्धति को नियोजित करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब दुर्लभ सामग्री उपलब्ध है और / या कोशिकाएं या तो प्रयोगशाला स्थितियों में बहुत धीरे-धीरे नहीं बढ़ती हैं या बढ़ती हैं। वर्णक्रमीय प्रौद्योगिकियां सफेद प्रकाश लेजर (उत्तेजना स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए) और उच्च-संवेदनशीलता हाइब्रिड डिटेक्टरों जैसी प्रगति की पेशकश कर सकती हैं, जो सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों के साथ संयुक्त होने पर वर्णक्रमीय जानकारी और नैनोमेट्रिक रिज़ॉल्यूशन वाले प्रोटीन के स्थान को प्राप्त करने की अनुमति देती हैं।
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Disclosures
लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
यह शोध परियोजनाओं टिन 2015-68454-आर और 20961/पीआई/18 के हिस्से के रूप में किया गया था, जिसे स्पेनिश अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धा मंत्रालय और मर्सिया क्षेत्र के सेनेका फाउंडेशन द्वारा वित्तपोषित किया गया था। मर्सिया विश्वविद्यालय के वैज्ञानिक और अनुसंधान क्षेत्र के सांख्यिकीय सहायता अनुभाग से आइरीन हर्नांडेज़ मार्टिनेज और फ्रांसिस्को जेवियर इबानेज़ लोपेज़ (सेकिओन डी एपोयो एस्टाडिस्टिको (एसएई), एरिया साइंटिफिका वाई डी इन्वेस्टिगासियोन (एसीटीआई), यूनिवर्सिड डी मर्सिया, (चित्रा 1 सर्वियर मेडिकल आर्ट से चित्रों का उपयोग करके तैयार किया गया था)। सर्वियर द्वारा सर्वियर मेडिकल आर्ट को क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन 3.0 अनपोर्टेड लाइसेंस (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/) के साथ लाइसेंस प्राप्त है
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | - |
| 24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
| Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | - |
| Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| green filter | PNTA, LEE filters | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
| Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | - |
| Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | - |
| R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | - |
| red filter | PNTA, LEE filters | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| SWES medium | University of Murcia | - | - |
| Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |
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