הפרוטוקול הנוכחי מתאר הדמיה אוטופלואורסצנטית שלב אחר שלב והערכה של שינויים בחלבון פיקובילין באצות אדומות בהתבסס על אנליזה ספקטרלית. זוהי שיטה נטולת תוויות ולא הרסנית להערכת הסתגלות התאית לבתי גידול קיצוניים, כאשר רק חומר נדיר זמין ותאים גדלים לאט, או בכלל לא, בתנאי מעבדה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה אוטופלואורסצנטית להערכת פיזיולוגיה של אצות אדומות
במאמר זה
סיכום
תקציר
אצות אדומות (Rhodophyta) מכילות חלבוני פיקובילין ומאכלסות בתי גידול באור עמום, אולם חלקן (למשל, כמה מיני Chroothece ) יכולות להתפתח גם בשמש מלאה. רוב הרודופיטים הם אדומים, אולם חלקם יכולים להיראות כחלחלים, בהתאם לחלקם של חלבוני ביליבואין כחולים ואדומים (פיקוציאנין ופיקואריתרין). חלבוני פיקובילין שונים יכולים ללכוד אור באורכי גל שונים ולהעביר אותו לכלורופיל a, מה שמאפשר פוטוסינתזה בתנאי אור שונים מאוד. פיגמנטים אלה מגיבים לשינויים בבתי גידול באור, והאוטופלואורסצנטיות שלהם יכולה לסייע בחקר תהליכים ביולוגיים. באמצעות Chroothece mobilis כאורגניזם מודל ומצב סריקת למבדה ספקטרלי במיקרוסקופ קונפוקלי, ההתאמה של פיגמנטים פוטוסינתטיים לאורות מונוכרומטיים שונים נחקרה ברמה התאית כדי לנחש את תנאי הגידול האופטימליים של המין. התוצאות הראו כי גם כאשר הזן הנחקר בודד ממערה, הוא הסתגל לעוצמות אור עמומות ובינוניות כאחד. השיטה המוצגת שימושית במיוחד לחקר אורגניזמים פוטוסינתטיים שאינם גדלים או גדלים לאט מאוד בתנאי מעבדה, וזה בדרך כלל המקרה עבור אלה החיים בבתי גידול קיצוניים.
מבוא
אצות אדומות, כמו הסוג Chroothece, יכולות לגדול בבתי גידול קיצוניים, שם הן נאלצות להתמודד לעתים קרובות עם שינויים סביבתיים ניכרים1. שיטפונות ובצורות שכיחים באזורים צחיחים למחצה שבהם ניתן למצוא סוג זה, וכמה מינים דווחו בנחלים, צוקים, מערות או אפילו מים תרמיים2. עם זאת, רוב הזמן, משתנים ביולוגיים, כגון תחרות או מרעה, דוחקים מינים לתנאים לא אופטימליים לגידולם. מכיוון שאורגניזמים אלה לעתים קרובות קשים לתרבית ואינם גדלים או גדלים לאט מאוד בתנאי מעבדה, מגבלה עיקרית אחת היא גודל הדגימה הזמין. לכן, חשוב מאוד לעקוב אחר שיטות לא הרסניות או שיטות הכוללות מניפולציה מדגם מינימלי 3,4
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
מין האצות Chroothece mobilis שימש במחקר הנוכחי. המין התקבל מאוסף התרביות Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29. סקירה כללית של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
איור 1: סקירה כללית של המחקר. Chroothece mobilis מודגר בתנאי בית גידול קיצוניים, כגון אורות מונוכרומטיים שונים, במשך שבועיים. ההשפעה על הפיזיולוגיה של Chroothece מוערכת על ידי autofluorescence של החלבונים הכלולים phycobilisome....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כלורופיל A בולע בדרך כלל אורכי גל כחולים ואדומים של אור נראה, בעוד שחלבוני פיקובילין משתמשים באורכי גל ירוקים, צהובים וכתומים7. האוטופלואורסצנטיות של פיגמנטים אלה מאפשרת את הגישה הראשונה לחקר חלבוני פיקובילין והתנהגות כלורופיל בתנאי ניסוי ושדה.
על-ידי השוואת הנתונים המתקבלים והתווייתם בגרפים שונים, ניתן להבחין בשינויים משמעותיים בעוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת (MFI) (איור 4). מחקר סטטיסטי נסתר של שיאי הפליטה השונים שהתקבלו בפרופילי סריקת למדא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
חלק מהאצות האדומות החד-תאיות או הקולוניאליות, כגון Chroothece, גדלות לאט במבחנה, אך מכילות תרכובות אוטופלואורסצנטיות מרובות שניתן לנתח באמצעות אנליזה ספקטרלית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, שם ניתן לזהות הבדלים בשיאי פליטת פיגמנטים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי ספקטרלי אפשר לנו לערוך מחקרי in vivo כדי להעריך את ההסתגלות או ההתאקלמות של אורגניזמים פוטוסינתטיים 8,10,17,18,19,20.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
תודות
מחקר זה בוצע במסגרת פרויקטים TIN2015-68454-R ו- 20961/PI/18, במימון משרד הכלכלה והתחרותיות הספרדי וקרן Séneca של אזור מורסיה. איירין הרננדס מרטינז ופרנסיסקו חבייר איבנייס לופז מהמחלקה לתמיכה סטטיסטית באזור המדע והמחקר של אוניברסיטת מורסיה (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (איור 1 צוירו באמצעות תמונות מ-Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier הוא בעל רישיון Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| &מיקרו;-צלחת 35 מ"מ, עידית תחתית זכוכית גבוהה | 81158-24 | ||
| לוחית באר שחורה | Ibidi | 82406 | תחתית שטוחה וברורה למיקרוסקופיה בתפוקה גבוהה |
| חממת אצות | Panasonic | MLR-352-PE | |
| מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי | Leica Microsystems | SP8 TCS-Flask | |
| Fisher Scientific | 15380591 | ניתן לרכוש בחנות נוחות מקומית או בחנויות מקוונות. | |
| מסנן ירוק | PNTA, מסנני LEE | - | ניתן לרכוש בחנות נוחות מקומית או בחנויות מקוונות. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | של עדשת טבילה גליצרול |
| . LAS X | Leica Microsystems | SP8 | TCS-מקור |
| אור | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| פוטורדיומטר קוונטי | DeltaOhm | DO 9721-R | |
| תוכנה | R צוות ליבה, 2020 | 4.0.2. | - |
| מסנן אדום | PNTA, מסנני LEE | - | ניתן לרכוש בחנות נוחות מקומית או בחנויות מקוונות. |
| SWES בינוני | אוניברסיטת מורסיה | - | |
| טבילה נוזלית מסוג G | Leica Microsystems | 11513910 | גליצרול |
מקורות
- Vis, M. L., Necchi, O. Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , Springer Nature. (2021).
- Aboal, M., et al. Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species. European Journal of Phycology. 53 (2), ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
