Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הדמיה אוטופלואורסצנטית שלב אחר שלב והערכה של שינויים בחלבון פיקובילין באצות אדומות בהתבסס על אנליזה ספקטרלית. זוהי שיטה נטולת תוויות ולא הרסנית להערכת הסתגלות התאית לבתי גידול קיצוניים, כאשר רק חומר נדיר זמין ותאים גדלים לאט, או בכלל לא, בתנאי מעבדה.
Abstract
אצות אדומות (Rhodophyta) מכילות חלבוני פיקובילין ומאכלסות בתי גידול באור עמום, אולם חלקן (למשל, כמה מיני Chroothece ) יכולות להתפתח גם בשמש מלאה. רוב הרודופיטים הם אדומים, אולם חלקם יכולים להיראות כחלחלים, בהתאם לחלקם של חלבוני ביליבואין כחולים ואדומים (פיקוציאנין ופיקואריתרין). חלבוני פיקובילין שונים יכולים ללכוד אור באורכי גל שונים ולהעביר אותו לכלורופיל a, מה שמאפשר פוטוסינתזה בתנאי אור שונים מאוד. פיגמנטים אלה מגיבים לשינויים בבתי גידול באור, והאוטופלואורסצנטיות שלהם יכולה לסייע בחקר תהליכים ביולוגיים. באמצעות Chroothece mobilis כאורגניזם מודל ומצב סריקת למבדה ספקטרלי במיקרוסקופ קונפוקלי, ההתאמה של פיגמנטים פוטוסינתטיים לאורות מונוכרומטיים שונים נחקרה ברמה התאית כדי לנחש את תנאי הגידול האופטימליים של המין. התוצאות הראו כי גם כאשר הזן הנחקר בודד ממערה, הוא הסתגל לעוצמות אור עמומות ובינוניות כאחד. השיטה המוצגת שימושית במיוחד לחקר אורגניזמים פוטוסינתטיים שאינם גדלים או גדלים לאט מאוד בתנאי מעבדה, וזה בדרך כלל המקרה עבור אלה החיים בבתי גידול קיצוניים.
Introduction
אצות אדומות, כמו הסוג Chroothece, יכולות לגדול בבתי גידול קיצוניים, שם הן נאלצות להתמודד לעתים קרובות עם שינויים סביבתיים ניכרים1. שיטפונות ובצורות שכיחים באזורים צחיחים למחצה שבהם ניתן למצוא סוג זה, וכמה מינים דווחו בנחלים, צוקים, מערות או אפילו מים תרמיים2. עם זאת, רוב הזמן, משתנים ביולוגיים, כגון תחרות או מרעה, דוחקים מינים לתנאים לא אופטימליים לגידולם. מכיוון שאורגניזמים אלה לעתים קרובות קשים לתרבית ואינם גדלים או גדלים לאט מאוד בתנאי מעבדה, מגבלה עיקרית אחת היא גודל הדגימה הזמין. לכן, חשוב מאוד לעקוב אחר שיטות לא הרסניות או שיטות הכוללות מניפולציה מדגם מינימלי 3,4.
ניתן לעקוב אחר הכישורים הפיזיולוגיים הדרושים כדי לשרוד בסביבות קשות אלה על ידי מעקב אחר שינויים במערכות הפוטוסינתטיות שלהם. מנגנונים מטבוליים, יעילות פוטוסינתטית ורגישות לתנאי אור או תרבית יכולים להתגלות על ידי פרופילי פליטה פלואורסצנטיים של פיגמנטים, עקב שינויים מדויקים בהעברת האנרגיה שלהם או בלכידה 5,6,7,8.
Autofluorescence של תרכובות תאיות יכול לשמש סמן עבור cytodiagnosis או כאינדיקטור טבעי של מצב הסלולר או מטבוליזם בתגובה אותות חיצוניים ופנימיים באמצעות שינויים פליטה9. ניתן להשתמש בו גם כדי להבחין בין קבוצות שונות מבחינה טקסונומית של אורגניזמים פוטוסינתטיים10. בהתאם למיקום הפילוגנטי של מיקרואורגניזמים פוטוטרופיים, ניתן למצוא תכונות פלואורסצנטיות שונות in vivo. לכן, זיהוי טקסונומי המבוסס על מאפייני in vivo של פלואורסצנטיות פוטוטרופית (כולל ספיגה פלואורסצנטית וספקטרום פליטה) נוסה במספר הזדמנויות11,12. בגלל הגיוון בפיגמנטים הנלווים בין פיטופלנקטון טקסה, ניתן להשתמש בהבדלים באורכי הגל שבהם מגורה פלואורסצנטיות כלורופיל A (Chl a), או הבדלים בספקטרום הפליטה, כדי להסיק טקסונומיה13. ספקטרום העירור והפליטה הפלואורסצנטי in vivo של דגימות אלה מסתמך לא רק על פילה של אצות, אלא גם על הסתגלות פוטוסיסטם14. יעילות העברת האנרגיה ל- Chl a, או היחס בין Chl a לפיגמנטים אביזרים, ותכולת הפיגמנט התאית רגישים לתנאי גידול5.
לאצות אדומות, במיוחד Chroothece, יש מספר פיגמנטים פלואורסצנטיים נלווים - חלבוני פיקובילין וקרוטנואידים; הראשון מתרכז בפיקוביליזומים המחוברים לתילקואידים של כלורופלסטים. חלבוני פיקובילין (פיקוציאנין, פיקואריתרין ואלופיקוציאנין) יכולים ללכוד אור באורכי גל שונים ולהעבירו ל-Chl a, מה שמאפשר פוטוסינתזה בתנאי אור ותרבות שונים מאוד15. לדוגמה, מיני Chroothece יכולים לגדול בתוך מערות או כמעט להופיע בנחלים גירניים מלוחים מעט2.
אורות מונוכרומטיים משפיעים על הגדילה והרכב הפיגמנטים של אורגניזמים פוטוסינתטיים, ונחקרו כדי למנוע או לשלוט בגדילה של אורגניזמים פוטוסינתטיים במערות. Mulec et al. הראו כי תאורה מועשרת באדום מקדמת צמיחה של ציאנובקטריה, אצות וצמחים16. מחקרים קודמים דיווחו גם כי אור ירוק משפיע על הרכב הפיגמנטים של ציאנובקטריה17, בעוד שאחרים גילו כי אור ירוק מונע את צמיחתם של רוב האורגניזמים הפוטוסינתטיים וחלק מהציאנובקטריה מציגים ירידה בתילקואידים ועוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת חלשה יותר18.
כדי להבין את יכולתו של Chroothece כאורגניזם מודל להתגבר על תנאים קשים, תאים בתרבית נחשפו לעוצמות אור הולכות וגדלות ולאור מונוכרומטי (ירוק או אדום)15, כדי לראות כיצד הוא מתמודד עם התנאים העמומים של מערות (שבהן האור האדום שולט). הפרוטוקול המוצג כאן משחזר את ההשפעה של המשתנים הנ"ל על חלבוני הפיקובילין של Chroothece ברמה התאית באמצעות אוטופלואורסצנטיות משלו.
כיום, פלואורסצנטיות משמשת בדרך כלל ככלי לחקר התגובות הפיזיולוגיות של צמחים וסקולריים, מיקרו-אצות, מאקרו-אצות וציאנובקטריה13,14,16. מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי ספקטרלי הוא כלי מעולה למחקרי in vivo להערכת הפיזיולוגיה של דגימות פוטוסינתטיות ברמת התא הבודד 10,17,18,19,20, על ידי הימנעות מבעיות הקשורות לקצב הגידול הנמוך במעבדה ולקשיים בהשגת מספיק ביומסה למיצוי ולשיטות הביוכימיות הנלוות8 . לאחר טיפול בתאים בתנאי תרבית שונים במשך שבועיים, ניתן למדוד את פרופיל סריקת הלמבדה in vivo. למרות שישנם מספר פרסומים בהם נעשה שימוש באורכי גל שונים של עירור על ידי הדמיה קונפוקלית 3,4,10,17, ניתן לזהות את רוב חלבוני הפיקובילין ו- Chl a באמצעות קו עירור אורך גל של 561 ננומטר, וטווח הפליטה שזוהה נע בין 570 ל -760 ננומטר. קריטריונים אלה התבססו על ניתוח שבוצע בעבר 10 עם פיגמנטים טהורים מסחריים (טבלה 1) על ידי הדמיה קונפוקלית והתוצאות שהתקבלו במינים שונים של אצות20,21,22.
| פיגמנטים | λflmax (NM) | λ exc (NM) | |||||||
| 351 | 364 | 458 | 476 | 488 | 514 | 543 | 633 | ||
| צ'ל א | 660.9-678.1 | 69.9 ± 1.8 | 18.1 ± 0.2 | 1.8 ± 0.05 | 2.2 ± 0.08 | 19.7 ± 0.7 | 6.0 ± 0.3 | 4.2 ± 0.16 | 80.7 ± 1.5 |
| R-PE | 569.2-583.3 | 5.9 ± 0.6 | 5.9 ± 0.16 | 17.1 ± 0.04 | 67.9 ± 0.3 | 100.0 ± 0 | 90.0 ± 0.3 | 992.2 ± 0.08 | - |
| 652.1-668.6 | - | - | 1.5 ± 0.01 | 3.7 ± 0.04 | 42.9 ± 0.5 | 8.7 ± 0.16 | 11.1 ± 0.16 | 18.2 ± 0.2 | |
| C-PC | 636.2-676.4 | 2.3 ± 0.04 | 1.0 ± 0.01 | 0.6 ± 0.004 | 0.7 ± 0.008 | 2.2 ± 0.08 | 2.2 ± 0.04 | 3.3 ± 0.16 | 54.1 ± 0.9 |
| APC-XL | 667.3-683.8 | 19.8 ± 1.5 | 9.6 ± 0.98 | 1.0 ± 0.04 | 1.2 ± 0.08 | 5.9 ± 0.7 | 4.6 ± 0.5 | 37.3 ± 3.5 | 91.9 ± 2.3 |
טבלה 1: מידע הפיגמנט הטהור המשמש להפעלת ניתוח סריקת למדא. טבלה זו מציגה שיאי פליטה וכתפיים/פס פלואורסצנטי מקסימלי של פלואורוכרומים/פיגמנטים שונים על ידי ספקטרופוטומטריה של הדמיה קונפוקלית עבור כל אורכי גל העירור, ואחוז פליטת האור על ידי פיגמנטים/פלואורוכרומים. הערכים חושבו לפי הנוסחה: = MFI*100/255. כל ערך הוא הממוצע ± SE (ממוצע ± שגיאת תקן מהממוצע). פיגמנטים טהורים שימשו לכיול מיקרוסקופ לייזר סורק קונפוקלי כדלקמן 1,2,10. כלורופיל a התקבל מ-Spinacia oleracea, R-phycoerythrin (R-PE) מ-Porphyra tenera, ו-C-phycocyanin (C-PE) מ-Spirulina sp. כל המינים הומסו במים מזוקקים מסוננים. Allophycocyanin-XL (APC-XL) התקבל מ Mastigocladus laminosus, אשר היה מומס אמוניום סולפט (60%) ופוספט אשלגן (pH = 7) כדי להשיג ריכוז של 38 mM. הסריקות בוצעו עם 400 μL מכל תמיסת פיגמנט (ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל) באמצעות תא תחתון מזכוכית מכוסה 8 היטב.
המחקר של אורך גל עירור יחיד הוא קירוב ראשון שימושי למדי. במקרה זה, עם זאת, יש צורך להבהיר את התרומה היחסית של קומפלקסים שונים אות פלואורסצנטי, אשר מומלץ לבצע יחס פלואורסצנטי או ניתוח ספקטרום במספר אורכי גל, בין שיטות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מין האצות Chroothece mobilis שימש במחקר הנוכחי. המין התקבל מאוסף התרביות Microalgae Edaphic SE Spain, MAESE 20.29. סקירה כללית של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.
איור 1: סקירה כללית של המחקר. Chroothece mobilis מודגר בתנאי בית גידול קיצוניים, כגון אורות מונוכרומטיים שונים, במשך שבועיים. ההשפעה על הפיזיולוגיה של Chroothece מוערכת על ידי autofluorescence של החלבונים הכלולים phycobilisome ו photosystems באמצעות מיקרוסקופ לייזר סורק קונפוקלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
1. הכנת מדגם
- הכינו את החיסון של Chroothece mobilis מתרבות האגר של האוסף על ידי העברתו למדיום הנוזלי SWES (טבלה 2).
הערה: SWES "Seewasser + Erddekokt + Salze" = מדיום מי ים23. - שמור על כל התרביות במשך שבועיים עם פוטופריוד בהיר / כהה 16: 8 ב 20 ° C בתנאים של עוצמת אור לבן נמוכה (LL: 80 μM/m2/s) וללא רעידות, עד לקבלת צפיפות התאים הרצויה (ראה שלב 1.3).
הערה: תנאי אור הגידול הם עוצמת אור של 80 מיקרומטר/מ"ר2/s (קרינה פוטוסינתטית פעילה, PAR). תנאים אלה משמשים כתנאי תאורה חלשה (בקרה). הרכב מדיום SWES מובא בטבלה 2. - לבצע חיסונים לניסויים השונים בשלב התרבית המעריכית עם צפיפות תאים של 5 x 103 תאים / מ"ל בצלחת 24 בארות, באמצעות 1 מ"ל לכל באר.
הערה: בצע ספירת תאים עם תא נויבאואר24, ודלל את התרבית עם SWES בעת הצורך.
| SWES הרכב בינוני | |
| רכיב | ריכוז |
| KNO3 | 1.98 מ"מ |
| K2HPO4 | 115 מיקרומטר |
| מגסו4 | 81 מיקרומטר |
| ZnSO4, 7H2O | 17 נאנומטר |
| MnSO4, 7H2O | 45 נאנומטר |
| ח 3BO3, 4H2O | 3.1 מ"מ |
| Co(NO3)2 | 17 מ"מ |
| Na 2 MoO4, 6H2O | 21 נאנומטר |
| CuSO4, 2H2O | 0.1 נאנומטר |
| פס'4, 5ח2O | 13 מיקרומטר |
| EDTA, 7H2O | 11 מיקרומטר |
| ויטמין B12 | 5 מיקרוגרם |
| תמצית קרקע | 30 מ"ל |
| מי נהר מסוננים | 455 מ"ל |
טבלה 2: הרכב בינוני SWES.
2. שחזור תנאי בית גידול קיצוניים של אצות: אפקט אור מונוכרומטי ירוק ואדום
- הוסף 1 מ"ל של תרבית תאים מתרבית המלאי שהוכנה בצפיפות התאים הנ"ל (שלב 1.2) כדי לחסן כל באר של צלחת 24 בארות.
- שמור את תרבית התא מכוסה במשך 2 שבועות כדי לשחזר את אפקט האור מונוכרומטי.
- השתמש בפילטר הירוק המאפשר לאור ירוק לעבור בין 470 ל -570 ננומטר עם שיא באורך גל של 506 ננומטר (על פי מפרט היצרן; ראה טבלת חומרים) ולחשוף אותו לתרבית25.
- השתמש במסנן האדום המאפשר אור אדום בין 590 ל- 720 ננומטר ומגיע לשיא של 678 ננומטר (לפי מפרט היצרן; ראה טבלת חומרים) כדי לחשוף אותו לתרבית25.
הערה: עוצמת האור הלבן הנמוכה (LL: 80 μM/m2/s; ראה טבלת חומרים) משמשת כבקרת עוצמת האור כדי להשוות את ההשפעות המתקבלות. יחידות עוצמת האור המשמשות הן מיקרומול לשנייה ומטר מרובע (μmol m-2 s-1) או צפיפות שטף פוטונים פוטוסינתטי (PPFD).
3. הדמיה אוטופלואורסצנטית
הערה: הגדרת תוכנת ההדמיה (ראה טבלת חומרים) מודגמת באיור 2.
- הפעל את כל רכיבי מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי ההפוך (CLSM; ראה טבלת חומרים), כולל הלייזר.
- הרכיבו את התאים מכל באר ניסויית של צלחת 24 בארות במצע גידול SWES לצלחת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ (ראו טבלת חומרים) לצורך הדמיה.
- בחר את מטרת טבילת גליצרול NA 63x/1.30 והנח גליצרול מעל העדשה (ראה טבלת חומרים).
- הניחו את צלחת הבאר על במת המיקרוסקופ וודאו שהדגימה אינה זזה במהלך רכישת התמונה.
- מרכז את הדגימה בנתיב האור והתמקד במרכז התא על ידי בחירת המישור בעל עוצמת הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר.
- פתח את תוכנת רכישת התמונות ובחר xyλ מהרשימה הנפתחת במצב רכישה26.
- בחר את קו העירור של הלייזר ל- DPSS של 561 ננומטר, טווח דינמי של 8 סיביות ו- 1024 x 1024 פיקסלים.
הערה: ודא שלמיקרוסקופ הקונפוקלי יש לייזר DPSS של 561 ננומטר או לייזר אור לבן (WLL). - אסוף את ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטית ברוחב הפס של 10 ננומטר ואת גודל שלב הלמבדה של 4 ננומטר בטווח של 570-760 ננומטר.
- הגדר את חור הסיכה ביחידה אוורירית אחת והפעל את רכישת סריקת למדא.
- חזור על תהליך זה פעמים רבות ככל האפשר בתחומי ראייה שונים כדי לאסוף כמות מקובלת של נתונים לניתוח סטטיסטי (בדרך כלל סטיית תקן נמוכה מ -10% 22).
- חזור על השלב האחרון בתנאים השונים (תחת אורות אדומים וירוקים) ושמור את הנתונים.
הערה: השתמש באותן הגדרות רכישה עבור הדגימות והתנאים השונים כדי להשוות ולבצע את הניתוח הסטטיסטי.
איור 2: הגדרת תוכנה. ממשק משתמש של תוכנת הדמיה להגדרת פרמטרי סריקת lambda. (A) משמאל לימין, כדי לבחור את מצב הרכישה xyλ מהרשימה הנפתחת, המתאים לשלב 3.6 בפרוטוקול, ולבחור את סוג עדשת הטבילה הימנית, המתאים לשלב 3.3 בפרוטוקול. הקפד להסיר מסנן כלשהו מנתיב האור בשלב 3.9. (B) החלונית להגדרת פרמטרי סריקת lambda מתאימה לשלב 3.8 בפרוטוקול. (C) הפעל את סריקת lambda בשלב 3.10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
4. פרמטרים להערכת הפיזיולוגיה של Chroothece
- לאחר רכישת סריקת הלמדא, לחץ על חלון הכימות בחלק העליון של התוכנה (כפי שמוצג באיור 3) כדי להעריך את ספקטרום הפליטה הפלואורסצנטי שנאסף. עבור אל חלון פתיחת הפרויקט ובחר קובץ xyλ אחד (איור 3).
- בחר ניתוח פרופיל מחסנית בתוכנת ההדמיה.
- הגדר אזור עניין (ROI) של 4 מיקרומטר2 במרכז התא כדי לנתח את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת (MFI). יצא את הנתונים בתבנית CSV.
הערה: חשוב להימנע מנוכחות פיקסלים שחורים (כדי להבטיח שהפיקסלים שנבחרו מכילים ערכים חיוביים) ולשמור תמיד על החזר השקעה באותו גודל. - חזור על תהליך זה עם תאים שונים בתנאים שונים כדי לייצר מספיק נתונים לביצוע ניתוח סטטיסטי.
- פתחו את קובצי ה-CSV כדי לבחור את שיאי הפלואורסצנטיות השונים מחלבוני הפיקובילין והכלורופילים של כל ה-ROI שנמדדו.
- בחר את הנתונים הפלואורסצנטיים של phycoerythrin-phycocyanobilin (PE-PCB; 620 nm), C-phycocyanin (CPC; 648 nm), allophycocyanin (APC; 660 nm) ו- chlorophyll a (Chl a; 680 nm), בהתאמה, בקובץ csv.
- צור טבלה חדשה עם כל ערכי הפלואורסצנטיות המרביים המתקבלים מכל שיא של פיקובילין וכלורופיל והתווה את הנתונים על גרף.
- לבצע ניתוח סטטיסטי.
- לנתח אם הנתונים המתקבלים עונה על נורמליות הומוסדסטיות27.
- המשך לניתוח מבחן t27,28 אם התנאי הראשון מתקיים. אם לא, הפעל מבחן Mann-Whitney U29.
- שקול את ההבדלים משמעותיים בערכי p <0.05.
איור 3: הערכת האוטופלואורסצנטיות של Chroothece. כדי לבצע את ניתוח הפלואורסצנטיות האוטומטית, הקפד לבחור את חלון הכימות וקובץ xyλ אחד בחלון הפרויקטים הפתוחים (שלב 4.1); בחר תצוגה חזותית של פרופיל מחסנית (שלב 4.2); בחר החזר השקעה של 4 מיקרומטר2 במרכז התא ולחץ על כפתור הדוח כדי לייצא את נתוני סריקת Lambda בפורמט CSV (שלב 4.3). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כלורופיל A בולע בדרך כלל אורכי גל כחולים ואדומים של אור נראה, בעוד שחלבוני פיקובילין משתמשים באורכי גל ירוקים, צהובים וכתומים7. האוטופלואורסצנטיות של פיגמנטים אלה מאפשרת את הגישה הראשונה לחקר חלבוני פיקובילין והתנהגות כלורופיל בתנאי ניסוי ושדה.
על-ידי השוואת הנתונים המתקבלים והתווייתם בגרפים שונים, ניתן להבחין בשינויים משמעותיים בעוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת (MFI) (איור 4). מחקר סטטיסטי נסתר של שיאי הפליטה השונים שהתקבלו בפרופילי סריקת למדא (620, 648, 660 ו-680 ננומטר) הראה הבדלים מובהקים (מובהקות סטטיסטית: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).
ה-MFI של PE-PCB ירד באופן משמעותי כאשר התאים נחשפו לאור מונוכרומטי ירוק (GL), אולם לא נצפה הבדל בהשוואה לביקורת באור אדום (RL) (איור 4A). עם זאת, ל- GL הייתה השפעה הפוכה על APC ו- Chl a (איור 4B,C), שבהם ה- MFI גדל באופן משמעותי עקב הסתגלות של מתחמי אנטנות, בין היתר בגלל כמות מוגברת או קישוריות משופרת של מתחמי האנטנות. ה-RL הניב עלייה לא משמעותית הן ב-APC והן ב-Chl פלואורסצנטיותשל 17,24,25,26.
איור 4: השפעות על הפלואורסצנטיות של חלבוני פיקובילין Chroothece וכלורופיל A תחת טיפול באור מונוכרומטי. (א-ג) עוצמת הפליטה הפלואורסצנטית המתקבלת באורך גל עירור של 561 ננומטר בסריקת למדא ולאחר שניתחה את הנתונים הקשורים לחלבוני פיקובילין שונים (A: PE-PCB; B: APC) וכלורופיל (C: Chl a). הקופסאות מכילות את הערכים החציוניים, המינימליים והמרביים של עוצמת הפליטה הפלואורסצנטית. קופסאות ירוקות: מצב אור מונוכרומטי ירוק (GL); תיבות אדומות: אור מונוכרומטי אדום (RL); ותיבות כחולות: מצב תאורה חלשה (LL, שליטה). מובהקות סטטיסטית: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חלק מהאצות האדומות החד-תאיות או הקולוניאליות, כגון Chroothece, גדלות לאט במבחנה, אך מכילות תרכובות אוטופלואורסצנטיות מרובות שניתן לנתח באמצעות אנליזה ספקטרלית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי, שם ניתן לזהות הבדלים בשיאי פליטת פיגמנטים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי ספקטרלי אפשר לנו לערוך מחקרי in vivo כדי להעריך את ההסתגלות או ההתאקלמות של אורגניזמים פוטוסינתטיים 8,10,17,18,19,20. רוב הטכניקות האחרות, כגון ניתוח חלבונים, דורשות כמויות גדולות של דגימות, הן הרסניות, או יקרות הרבה יותר.
אורך הגל של 561 ננומטר נבחר כאן מכיוון שהוא סלקטיבי יותר עבור חלבוני פיקובילין (בהתבסס על דו"ח קודם23); הוא אישר את התוצאות של מחקר קודם על השפעות GL על ציאנובקטריה באמצעות שלושה אורכי גל עירור שונים (351, 488 ו-543 ננומטר). כדי לקבל נתונים אמינים, רכישת כל הנתונים תחת אותם תנאי מיקרוסקופ היא קריטית.
פרוטוקול זה הוא גישה ראשונה קלה לחקר ההתנהגות של תאי Chroothece בתנאי אור שונים, תוך שהוא מציע גם את האפשרות להשיג הבדלים משמעותיים בהרכב של phycobiliprotein או chlorophylls שטופלו בתנאי אור מונוכרומטיים מובהקים, הודות לניתוח שלאחר ביצוע. זה עוזר להעריך כיצד תאי אצות אדומות מגיבים לשינויים בתנאי בית הגידול וללמוד את יכולת ההסתגלות שלהם לבתי גידול קיצוניים.
תאי אצות עשירים מאוד בפיגמנטים אוטופלואורסצנטיים (כלורופיל, פיקובילפרוטאינים, קרוטנואידים), כאשר פלואורסצנטיות משתרעת על פני טווח רחב של אורכי גל. עובדה זו עלולה לסבך את ניתוח התמונה CLSM; עם זאת, דימות חיים פלואורסצנטי (FLIM), ביטול ערבוב ספקטרלי ועירור על ידי לייזר לבן עשויים לסייע בהפרדת אותות30,31. בדרך כלל נמצא מתאם טוב בין המצב הפיזיולוגי לבין ביצועי הפיגמנט הפוטוסינתטי במיקרו-אצות3.
עם זאת, טכניקות הרסניות הן חובה להעריך שינויים בתרומה היחסית של קומפלקסים פלואורסצנטיים שונים באות הפלואורסצנטי, או לבצע יחס פלואורסצנטי ו / או ניתוח ספקטרום במספר אורכי גל עירור.
שימוש בשיטה זו חשוב במיוחד כאשר חומר נדיר זמין ו / או תאים אינם גדלים או גדלים לאט מאוד בתנאי מעבדה. טכנולוגיות ספקטרליות עשויות להציע פיתוחים כמו לייזרים של אור לבן (להשגת ספקטרום עירור) וגלאים היברידיים בעלי רגישות גבוהה, אשר, בשילוב עם טכניקות של סופר-רזולוציה, מאפשרים לקבל מידע ספקטרלי ואת מיקומם של חלבונים ברזולוציה ננומטרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
מחקר זה בוצע במסגרת פרויקטים TIN2015-68454-R ו- 20961/PI/18, במימון משרד הכלכלה והתחרותיות הספרדי וקרן Séneca של אזור מורסיה. איירין הרננדס מרטינז ופרנסיסקו חבייר איבנייס לופז מהמחלקה לתמיכה סטטיסטית באזור המדע והמחקר של אוניברסיטת מורסיה (Sección de Apoyo Estadístico (SAE), Área Científica y de Investigación (ACTI), Universidad de Murcia, (איור 1 צוירו באמצעות תמונות מ-Servier Medical Art. Servier Medical Art by Servier הוא בעל רישיון Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Dish 35 mm, high Glass Bottom | Ibidi | 81158 | - |
| 24 black well plate | Ibidi | 82406 | flat and clear bottom for high throughput microscopy |
| Algae Incubator | Panasonic | MLR-352-PE | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | SP8 TCS | - |
| Flask | Fisher Scientific | 15380591 | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| green filter | PNTA, LEE filters | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| HC PL APO 63X/1.30 GLYC CORR CS2 | Leica Microsystems | 506353 | Glycerol immersion lens |
| Image acquisition software. LAS X | Leica Microsystems | SP8 TCS | - |
| Light source | Panasonic | FL40SSENW/37MLR-352-PE | |
| Quantum photoradiometer | DeltaOhm | DO 9721 | - |
| R software | R Core Team, 2020 | 4.0.2. | - |
| red filter | PNTA, LEE filters | - | Can be purchased in a local convenience store or online stores. |
| SWES medium | University of Murcia | - | - |
| Type G Immersion liquid | Leica Microsystems | 11513910 | Glycerol |
References
- Vis, M. L., Necchi, O. Freshwater Red Algae: Phylogeny, Taxonomy and Biogeography. , Springer Nature. (2021).
- Aboal, M., et al. Diversity of Chroothece (Rhodophyta, Stylonematales) including two new species. European Journal of Phycology. 53 (2), 189-197 (2018).
- Millach, L., Obiol, A., Solé, A., Esteve, I. A novel method to analyse in vivo the physiological state and cell viability of phototrophic microorganisms by confocal laser scanning microscopy using a dual laser. Journal of Microscopy. 268 (1), 53-65 (2017).
- Millach, L., Villagrasa, E., Solé, A., Esteve, I. Combined confocal laser scanning microscopy techniques for a rapid assessment of the effect and cell viability of Scenedesmus sp. DE2009 under metal stress. Microscopy and Microanalysis. 25 (4), 998-1003 (2019).
- Poryvkina, L., Babichenko, S., Leeben, A. Analysis of phytoplankton pigments by excitation spectra of fluorescence. Proceedings of EARSeL-SIG-Workshop LIDAR. , Dresden. (2000).
- Beutler, M., et al. A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ. Photosynthesis Research. 72 (1), 39-53 (2002).
- Grigoryeva, N., Chistyakova, L. Fluorescence microscopic spectroscopy for investigation and monitoring of biological diversity and physiological state of cyanobacterial cultures. Cyanobacteria. , (2018).
- Grigoryeva, N. Fluorescence Methods for Investigation of Living Cells and Microorganisms. , (2020).
- Roshchina, V. V. Vital autofluorescence: application to the study of plant living cells. International Journal of Spectroscopy. 2012, 5-18 (2012).
- Roldán, M., Thomas, F., Castel, S., Quesada, A., Hernández-Mariné, M. Noninvasive pigment identification in single cells from living phototrophic biofilms by confocal imaging spectrofluorometry. Applied and Environmental Microbiology. 70 (6), 3745-3750 (2004).
- Hense, B. A., Gais, P., Jütting, U., Scherb, H., Rodenacker, K. Use of fluorescence information for automated phytoplankton investigation by image analysis. Journal of Plankton Research. 30 (5), 587-606 (2008).
- Millie, D. F., Schofield, O. M., Kirkpatrick, G. J., Johnsen, G., Evens, T. J. Using absorbance and fluorescence spectra to discriminate microalgae. European Journal of Phycology. 37 (3), 313-322 (2002).
- Richardson, T. L., et al. Spectral fluorometric characterization of phytoplankton community composition using the Algae Online Analyser. Water Research. 44 (8), 2461-2472 (2010).
- Kieleck, C., Bousquet, B., Le Brun, G., Cariou, J., Lotrian, J. Laser induced fluorescence imaging: application to groups of macroalgae identification. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (16), 2561-2571 (2001).
- Coronado-Parra, T., Roldán, M., Aboal, M. Confocal microscopy in ecophysiological studies of algae: a door to understanding autofluorescence in red algae. Microscopy and Microanalysis. 28 (1), 218-226 (2022).
- Mulec, J., Kosi, G. Lampenflora algae and methods of growth control. Journal of Cave and Karst Studies. 71 (2), 109-115 (2009).
- Nelissen, B., De Baere, R., Wilmotte, A., De Wachter, R. Phylogenetic relationships of nonaxenic filamentous cyanobacterial strains based on 16S rRNA sequence analysis. Journal of Molecular Evolution. 42 (2), 194-200 (1996).
- Roldán, M., Oliva, F., Gónzalez Del Valle, M. A., Saiz-Jimenez, C., Hernández-Mariné, M. Does green light influence the fluorescence properties and structure of phototrophic biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 72 (4), 3026-3031 (2006).
- Topinka, J. A., Bellows, W. K., Yentsch, C. S. Characterization of marine macroalgae by fluorescence signatures. International Journal of Remote Sensing. 11 (12), 2329-2335 (1990).
- Roldán, M., Ascaso, C., Wierzchos, J. Fluorescent fingerprints of endolithic phototrophic cyanobacteria living within halite rocks in the atacama desert. Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 2998-3006 (2014).
- Solé, A., Diestra, E., Esteve, I. Confocal laser scanning microscopy image analysis for cyanobacterial biomass determined at microscale level in different microbial mats. Microbial Ecology. 57 (4), 649-656 (2009).
- Ramírez, O., García, A., Rojas, R., Couve, A., Härtel, S. Confined displacement algorithm determines true and random colocalization in fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 239 (3), 173-183 (2010).
- Universität Gottingen-Georg-August.
- Zhang, M., et al. Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (1), 23024 (2020).
- Wolf, E., Schüßler, A. Phycobiliprotein fluorescence of Nostoc punctiforme changes during the life cycle and chromatic adaptation: Characterization by spectral confocal laser scanning microscopy and spectral unmixing. Plant, Cell and Environment. 28 (4), 480-491 (2005).
- Zucker, R. M., Rigby, P., Clements, I., Salmon, W., Chua, M. Reliability of confocal microscopy spectral imaging systems: Use of multispectral beads. Cytometry Part A. 71 (3), 174-189 (2007).
- Field, A. M. Discovering Statistics Using R. , (2013).
- Linnet, K. Limitations of the paired t-test for evaluation of method comparison data. Clinical Chemistry. 45 (2), 314-315 (1999).
- Rosner, B., Grove, D. Use of the Mann-Whitney U-test for clustered data. Statistics in Medicine. 18 (11), 1387-1400 (1999).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: from probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Borlinghaus, R. The white confical: continuous spectral tuning in excitation and emission. Optical Fluorescence Microscopy. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2011).
