Summary
소핵(MN) 분석은 DNA 손상을 정량화하기 위한 잘 확립된 검사입니다. 그러나 수동 현미경 또는 특징 기반 이미지 분석과 같은 기존 기술을 사용하여 분석에 점수를 매기는 것은 힘들고 어렵습니다. 이 논문은 이미징 유세포 분석 데이터를 사용하여 MN 분석의 점수를 매기는 인공 지능 모델을 개발하는 방법론을 설명합니다.
Abstract
소핵(MN) 분석은 유전 독성에 대한 화학 물질을 평가하기 위해 전 세계적으로 규제 기관에서 사용됩니다. 분석은 두 가지 방법으로 수행할 수 있습니다: 한 번 분할된 사이토카인시스 차단 이핵세포 또는 완전히 분할된 단핵구 세포에서 MN을 채점합니다. 역사적으로 광학 현미경은 분석에 점수를 매기는 황금 표준 방법이었지만 힘들고 주관적입니다. 유세포 분석은 최근 몇 년 동안 분석의 점수를 매기기 위해 사용되었지만 세포 이미지의 주요 측면을 시각적으로 확인할 수 없기 때문에 제한적입니다. 이미징 유세포 분석(IFC)은 고처리량 이미지 캡처와 자동화된 이미지 분석을 결합하며, MN 분석에서 모든 주요 이벤트의 이미지를 빠르게 획득하고 점수를 매기는 데 성공적으로 적용되었습니다. 최근에는 컨볼루션 신경망을 기반으로 하는 인공 지능(AI) 방법을 사용하여 IFC에서 획득한 MN 분석 데이터의 점수를 매길 수 있음이 입증되었습니다. 이 백서에서는 AI 소프트웨어를 사용하여 딥 러닝 모델을 만들어 모든 주요 이벤트에 점수를 매기고 이 모델을 적용하여 추가 데이터에 자동으로 점수를 매기는 모든 단계를 설명합니다. AI 딥 러닝 모델의 결과는 수동 현미경과 잘 비교되므로 IFC와 AI를 결합하여 MN 분석의 완전 자동 스코어링이 가능합니다.
Introduction
소핵(micronucleus, MN) 분석은 인체용 화장품, 의약품 및 화학물질 개발에서 DNA 손상을 평가하기 위한 유전독성학의 기본이다 1,2,3,4. 소핵은 분열 후 핵에 통합되지 않고 핵과 분리된 작은 원형체로 응축되는 전체 염색체 또는 염색체 조각으로 형성됩니다. 따라서, MN은 유전독성 시험1에서 DNA 손상을 정량화하기 위한 종말점으로 사용될 수 있다.
MN을 정량화하는 데 선호되는 방법은 Cyt-B(Cyt-B)를 사용하여 분열을 차단하여 일회성 분열 이핵 세포(BNC) 내에서 하는 것입니다. 이 버전의 분석에서 세포 독성은 단핵구(MONO) 및 다핵구(POLY) 세포의 점수를 매겨 평가됩니다. 이 분석은 또한 증식을 평가하기 위해 노출 전 및 노출 후 세포 수를 사용하여 세포 독성을 평가하여 더 빠르고 쉽게 점수를 매길 수 있는 차단되지 않은 MONO 세포에서 MN을 채점하여 수행할 수 있습니다 5,6.
분석의 물리적 채점은 역사적으로 수동 현미경을 통해 수행되어 왔으며, 이를 통해 모든 주요 이벤트를 시각적으로 확인할 수 있습니다. 그러나 수동 현미경 검사는 어렵고 주관적입니다1. 따라서 현미경 슬라이드 스캐닝 및 유세포 분석을 포함한 자동화 기술이 개발되었으며 각각 고유한 장점과 한계가 있습니다. 슬라이드 스캐닝 방법을 사용하면 주요 이벤트를 시각화할 수 있지만 슬라이드는 최적의 세포 밀도로 생성되어야 하므로 달성하기 어려울 수 있습니다. 또한, 이 기술은 종종 세포질 시각화가 부족하여 MONO 및 POLY 세포의 스코어링을 손상시킬 수 있습니다 7,8. 유세포 분석은 고처리량 데이터 캡처를 제공하지만 세포를 용해해야 하므로 Cyt-B 형태의 분석을 사용할 수 없습니다. 추가적으로, 비이미징 기술로서, 종래의 유세포 분석은 주요 이벤트(9,10)의 시각적 검증을 제공하지 않는다.
따라서, MN 분석을 수행하기 위해 이미징 유세포 분석법(IFC)이 조사되었다. ImageStreamX Mk II는 기존 유세포 분석의 속도 및 통계적 견고성과 현미경의 고분해능 이미징 기능을 단일 시스템11에 결합합니다. IFC를 사용함으로써, 모든 주요 이벤트들의 고해상도 이미지가 캡처될 수 있고, 특징-기반(12,13) 또는 인공지능(AI) 기술들(14,15)을 사용하여 자동으로 스코어링될 수 있다는 것이 보여졌다. IFC를 사용하여 MN 분석을 수행함으로써 더 짧은 시간 내에 현미경에 비해 더 많은 세포의 자동 스코어링을 달성할 수 있습니다.
이 작업은 이전에 설명된 이미지 분석 워크플로우(16 )에서 벗어나 Amnis AI 소프트웨어(이하 "AI 소프트웨어"로 지칭됨)를 사용하여 랜덤 포레스트(RF) 및/또는 컨볼루션 신경망(CNN) 모델을 개발하고 훈련하는 데 필요한 모든 단계를 논의합니다. AI 지원 태깅 도구를 사용하여 실측 데이터를 채우고, 모델 학습 결과를 해석하고, 추가 데이터를 분류하기 위한 모델 적용, 유전독성 및 세포독성계산 허용 등 필요한 모든 단계를 설명합니다 15.
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Protocol
1. 이미징 유세포 분석을 이용한 데이터 수집
참고: 최적의 이미지 캡처를 위해 IFC를 사용하는 획득 영역을 수정해야 할 수도 있다는 점에 유의하여 다음과 같이 수정한 Rodrigues et al.16 을 참조하십시오.
- non-Cyt-B 방법의 경우, 배양 직전 및 회수 기간 직후의 각 배양물에 대해 제조업체의 지침( 재료 표 참조)에 따라 시판되는 세포 계수기를 사용하여 세포 계수를 수행합니다.
- 단일 카메라 이미징 유세포분석기에서 샘플을 실행하는 경우 명시야(BF)를 채널 4에 배치합니다. M01을 M04로, M07을 M01로 바꿉니다.
알림: "M"은 IFC의 카메라 채널을 나타냅니다. - 획득 중에 40x 배율을 사용합니다.
- 획득 중 BF 영역 대 BF 종횡비 플롯에서 다음 영역 좌표를 사용합니다.
X 좌표 : 100 및 900; Y 좌표: 0.7 및 1(Cyt-B 방법)
X 좌표: 100 및 600; Y 좌표: 0.7 및 1 - Hoechst 강도 그림에서 다음 영역 좌표를 사용합니다.
X 좌표 : 55 및 75; Y 좌표: 9.5 및 15(Cyt-B 방법)
X 좌표 : 55 및 75; Y 좌표: 13 및 21(비 Cyt-B 방법) - 데이터에서 세포자멸사 및 괴사 물체의 이미지를 제거하려면 IDEAS 6.3 소프트웨어 패키지(이하 "이미지 분석 소프트웨어"라고 함, 재료 표 참조)를 시작합니다.
참고: AI 소프트웨어는 최신 버전의 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 처리된 .daf 파일과 함께 작동하도록 설계되었습니다. 이미지 분석 소프트웨어가 최신 버전인지 확인합니다. - 이 작업을 서식 파일(.ast)로 저장합니다.
2. 모든 .rif 파일에 대한 .daf 파일 만들기
- AI 소프트웨어는 .daf 파일 가져오기만 허용합니다. 일괄 처리를 통해 실험의 모든 .rif 파일에 대한 .daf 파일을 만듭니다.
- Tools( 도구 ) 메뉴에서 Batch Data Files(배치 데이터 파일 )를 클릭한 다음 Add Batch(배치 추가)를 클릭합니다.
- 새 창에서 파일 추가를 선택하고 배치에 추가할 .rif 파일을 선택합니다. 템플릿 또는 데이터 분석 파일(.ast, .daf) 선택 옵션에서 이전에 만든 .ast 파일을 선택합니다.
- 필요한 경우 배치 이름을 지정하고 확인을 클릭하여 로드된 모든 .rif 파일에 대해 .daf 파일을 만듭니다.
3. AI 소프트웨어에서 실험 만들기
- AI 소프트웨어를 사용하여 딥러닝 모델을 생성하는 과정을 설명하는 그림 1 의 순서도를 참조하십시오.
- AI 소프트웨어를 실행하고 창의 왼쪽 하단 모서리에 있는 정보를 클릭하여 최신 버전이 설치되어 있는지 확인합니다. 최신 버전이 설치되어 있지 않으면 support@luminexcorp.com 문의하여 구하십시오.
- 소프트웨어의 기본 화면은 새 실험 화면입니다. 폴더 아이콘을 사용하여 실험을 저장할 위치를 선택하고 실험 이름(예: "MN 모델")을 입력합니다.
- 실험 유형에서 학습 실험 옆에 있는 라디오 단추를 클릭하여 CNN 모델 빌드를 시작합니다. 다음을 클릭합니다.
- 선택 사항: 모델이 이전에 학습된 경우 새 AI 모델의 템플릿으로 사용할 수 있으며 템플릿 모델 선택 화면에서 새 모델을 만들기 위한 템플릿으로 선택할 수 있습니다. 템플릿 모델이 없으면 다음을 클릭하여 이 단계를 건너뜁니다.
- 다음 화면은 새 모델 정의(Define New Model ) 화면입니다. 모델 아래에는 3.3단계에서 모델에 지정된 이름이 자동으로 채워집니다.
- 설명에서 모델에 대한 설명(선택 사항)을 입력하고 최대 이미지 크기를 150픽셀로 유지합니다.
- 채널에서 BF 추가를 클릭하여 명시야 채널을 목록에 추가합니다. 이름에서 Brightfield를 두 번 클릭하고 이 채널의 이름을 BF로 바꿉니다. Add FL(FL 추가)을 클릭하여 목록에 형광 채널을 추가합니다. 이름에서 형광등을 두 번 클릭하고 이 채널의 이름을 DNA로 바꿉니다.
- Class Names(클래스 이름)에서 Add(추가)를 클릭합니다. 팝업 창에서 Mononucleated를 입력하고 확인을 클릭합니다. 이렇게 하면 단핵화된 클래스가 클래스 이름 목록에 추가됩니다. 이 프로세스를 반복하여 다음 6개의 클래스가 목록에 정의되어 있는지 확인합니다.
단핵성
MN으로 단핵화
이핵화
MN으로 이중화
다핵(Polynucleated)
불규칙한 형태
다음을 클릭합니다.
참고: 이 6개의 실측 모델 클래스는 채점할 주요 이벤트와 허용된 채점 기준5와 다른 형태의 이미지를 나타냅니다.- 선택 사항: 원하는 경우 1.7의 분석 템플릿을 포함하여 이미지 분석 소프트웨어의 기능을 사용할 수 있습니다. AI 모델에 이러한 기능을 포함하려면 .ast 파일을 찾은 다음 채널별 드롭다운에서 포함할 기능 하위 집합을 선택합니다.
- 파일 선택에서 파일 추가를 클릭하고 AI 소프트웨어에 추가할 원하는 파일을 찾아 실측 데이터를 구축합니다. 다음을 클릭합니다.
참고: 충분한 수의 모든 주요 이벤트를 포함하는 여러 데이터 파일(예: 양성 및 음성 대조군 데이터)을 추가하는 것이 중요합니다.
- 다음으로, Select Base Populations(기본 모집단 선택) 화면에서 모집단 계층에서 Non-Apoptotic 모집단을 찾습니다. Non-Apoptotic 모집단을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Select All Matching Populations를 선택합니다. 다음을 클릭합니다.
참고: 분류해서는 안 되는 개체군(예: 구슬, 파편, 이중선 등)을 제외하는 것이 중요합니다. - 이 화면은 진실 모집단 선택 화면입니다.
- 이미지 분석 소프트웨어에서 주요 이벤트의 태그가 지정된 진실 모집단이 생성되지 않은 경우 Next(다음)를 클릭합니다.
- 이미지 분석 소프트웨어에서 태그가 지정된 진리 모집단이 생성된 경우 적절한 모델 클래스에 할당합니다.
- MN을 사용하여 MONO 세포의 태그가 지정된 진리 집단을 할당하려면 왼쪽의 Model Classes(모델 클래스)에서 Mononucleated with MN(MN으로 단핵화됨) 클래스를 클릭합니다. 그런 다음 이러한 이벤트가 포함된 오른쪽의 적절한 태그가 지정된 진실 모집단을 클릭합니다.
- 태그가 지정된 진리 집단이 둘 이상의 데이터 파일에서 생성된 경우 진리 집단 중 하나를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 일치하는 모든 모집단 선택을 선택하여 여러 파일의 태그가 지정된 모집단을 적절한 클래스에 추가합니다.
- 모든 적절한 진리 집단이 할당되면 다음을 클릭합니다.
- 채널 선택 화면에서 실험에 적합한 채널을 선택합니다. 여기에서 BF를 채널 1로, Hoechst를 채널 7로 설정합니다. 채널을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Apply to All(모두 적용)을 선택합니다. 다음을 클릭합니다.
- 마지막으로 확인 화면에서 실험 만들기를 클릭합니다.
- AI 소프트웨어는 데이터 파일에서 이미지를 로드하고 3.7단계에서 할당된 실측 영상을 사용하여 3.5.3단계에서 정의된 모델 클래스를 생성합니다. Finish( 마침)를 클릭합니다.
- 실험이 만들어지면 다음과 같은 5가지 옵션이 제공됩니다.
실험: 로드된 데이터 파일, 선택한 채널, 정의된 실측 자료 모델 클래스를 포함하여 실험의 세부 정보를 제공합니다.
태깅: 사용자가 실측 데이터를 채울 수 있는 태깅 도구를 시작합니다.
학습: 실측 데이터를 기반으로 모델을 학습합니다.
분류: 학습된 모델을 사용하여 데이터를 분류합니다.
결과: 학습 실험과 분류 실험의 결과를 모두 제공합니다.
4. AI 지원 태깅 도구를 사용하여 실측 자료 채우기
- Tagging (태깅)을 클릭하여 태깅 도구 인터페이스를 시작합니다.
- 확대/축소 도구(돋보기 아이콘)를 클릭하여 더 쉽게 볼 수 있도록 이미지를 자릅니다.
- 슬라이더 막대를 클릭하여 이미지 크기를 조정하여 갤러리에 표시되는 이미지 수를 변경합니다.
- 디스플레이 설정 옵션을 클릭하고 모든 주요 이벤트를 식별하는 데 가장 적합한 대비 이미지를 제공하는 Min-Max를 선택합니다.
- 갤러리 디스플레이 설정을 클릭하여 DNA 이미지의 색상을 노란색 또는 흰색으로 변경하면 작은 물체(예: MN)의 시각화가 향상됩니다.
- Cluster( 클러스터 )를 클릭하여 유사한 형태의 객체를 함께 그룹화하는 알고리즘을 실행합니다. 클러스터링이 완료되면 클러스터당 개체 수가 있는 개별 클러스터가 알 수 없는 모집단(Unknown Populations) 아래의 목록에 표시됩니다. 개별 군집을 선택하여 군집 내의 객체를 보고 이러한 객체를 적절한 모델 클래스에 지정합니다.
- 각 모델 클래스에 최소 25개의 개체가 할당되면 예측 알고리즘을 사용할 수 있게 됩니다. 예측을 클릭합니다.
참고: 어떤 모집단에도 잘 맞지 않는 개체는 알 수 없음으로 분류됩니다. 더 많은 객체가 진리 모집단에 추가될수록 예측 정확도가 향상됩니다. - 각 클래스의 충분한 개체 수에 도달할 때까지 Ground Truth Model 클래스를 적절한 이미지로 계속 채웁니다.
- 각 모델 클래스에 최소 100개의 개체가 할당되면 화면 상단의 학습 탭을 클릭합니다. 학습(Train ) 버튼을 클릭하여 랜덤 포레스트(Random Forest) 및 CNN 알고리즘을 사용하여 모델을 생성합니다.
참고: AI 소프트웨어는 랜덤 포레스트와 CNN 알고리즘을 모두 사용하여 모델을 생성하며, 확인란을 사용하면 CNN 알고리즘의 랜덤 포레스트만 사용하여 모델을 생성할 수 있습니다.
5. 모델 정확도 평가
- 모델 학습이 완료되면 결과 보기를 클릭합니다.
- 결과 화면을 사용하여 모델 정확도를 평가합니다. 풀다운 메뉴를 사용하여 랜덤 포레스트와 CNN 사이를 전환합니다.
참고: 진리 모집단을 업데이트할 수 있으며, 모델을 다시 훈련하거나 있는 그대로 사용하여 추가 데이터를 분류할 수 있습니다.- 진실 모집단을 업데이트하려면 상단의 태그 지정 을 클릭하고 섹션 4를 따르십시오.
6. 모델을 이용한 데이터 분류
- AI 소프트웨어를 실행합니다. 기본 화면은 새 실험 화면입니다. 폴더 아이콘을 사용하여 실험을 저장할 위치를 선택하고 실험의 이름을 입력합니다.
- 실험 유형에서 분류 옆에 있는 라디오 버튼을 클릭하여 분류 실험을 시작합니다. 다음을 클릭합니다.
- 분류에 사용할 모델을 클릭한 후 Next(다음)를 클릭합니다.
- 파일 선택 화면에서 파일 추가를 클릭하고 CNN 모델로 분류할 파일을 찾습니다. 다음을 클릭합니다.
- 그런 다음 Select Base Populations 화면에서 로드된 파일 중 하나에서 Non-Apoptotic 모집단 옆에 있는 확인란을 클릭합니다. Non-Apoptotic 모집단을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Select All Matching Populations 를 클릭하여 로드된 모든 파일에서 이 모집단을 선택합니다. 다음을 클릭합니다.
- 선택 사항: 분류할 데이터에 진리 집단이 포함된 경우 진리 모집단 선택 화면에서 적절한 모델 클래스에 지정할 수 있습니다. 그렇지 않으면 다음을 클릭하여 이 단계를 건너뜁니다.
- 채널 선택 화면에서 명시야의 경우 채널 1을 선택하고 DNA 염색의 경우 채널 7을 선택합니다. 채널을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Apply to All(모두 적용)을 클릭합니다. 그런 다음 다음을 클릭합니다.
- 마지막으로 확인 화면에서 실험 만들기를 클릭합니다. AI 소프트웨어는 선택한 데이터 파일에서 선택한 모델과 모든 이미지를 로드합니다. Finish( 마침)를 클릭합니다.
- Classify를 클릭하여 분류 화면을 시작합니다. 분류 버튼을 클릭합니다. 이렇게 하면 RF 및 CNN 모델을 사용하여 추가 데이터를 분류하고 지정된 모델 클래스에 속하는 모든 객체를 식별하는 프로세스가 시작됩니다.
알림: 확인란을 사용하여 RF 모델 및/또는 CNN 모델을 선택할 수 있습니다. - 분류가 완료되면 결과 보기를 클릭합니다.
- Update DAFs 버튼을 클릭하여 Update DAFs with Classification Results(분류 결과로 DAF 업데이트 ) 창을 표시합니다. 확인을 클릭하여 .daf 파일을 업데이트합니다.
7. 분류 결과 보고서 생성
- Results( 결과 ) 화면에서 Generate Report(보고서 생성)를 클릭합니다. 각 입력 DAF에 대한 개별 보고서가 필요한 경우 각 입력 DAF에 대한 보고서 만들기 옆의 확인란을 선택합니다. 확인을 클릭합니다.
- 완료되면 보고서 파일이 저장된 폴더를 엽니다. 폴더 내에는 실험 .pdf 보고서와 리소스 폴더가 있습니다.
- .pdf 열어 보고서를 봅니다. 이 보고서에는 모형 및 실험 정보, 입력 .daf 파일 목록, 표 형식 및 히스토그램 형식의 클래스 개수 및 클래스 백분율, 모든 입력 .daf 파일의 예측 확률 중앙값을 요약하는 혼동행렬이 포함되어 있습니다.
- Resources 폴더를 연 다음 CNN 폴더를 엽니다. 이 폴더 안에는 클래스 개수 및 백분율 막대 그래프의 .png 파일과 혼동 행렬이 있습니다. 또한 각 입력 파일에 대한 클래스 개수 및 백분율을 포함하는 .csv 파일이 있습니다.
8. MN 빈도 및 세포 독성 결정
- MN 주파수 계산
- Non Cyt-B 방법: MN 빈도를 확인하려면 7.4단계의 class_count.csv 파일을 엽니다. 각 입력 파일에 대해 "MN으로 단핵화된" 모집단의 카운트를 "모노핵화된" 모집단의 카운트로 나누고 100을 곱합니다.
- Cyt-B 방법: MN 주파수를 확인하려면 7.4단계의 class_count.csv 파일을 엽니다. 각 입력 파일에 대해 "MN으로 이중화된" 모집단의 개수를 "이분자형" 모집단의 개수로 나누고 100을 곱합니다.
- Non Cyt-B 방법: MN 빈도를 확인하려면 7.4단계의 class_count.csv 파일을 엽니다. 각 입력 파일에 대해 "MN으로 단핵화된" 모집단의 카운트를 "모노핵화된" 모집단의 카운트로 나누고 100을 곱합니다.
- 세포 독성 계산
- 비 Cyt-B 방법:
- 초기 세포 계수 및 처리 후 세포 계수를 사용하여 먼저 각 샘플 2에 대한 모집단 배가(PD)를 계산합니다.
- 다음으로, 상대 모집단을 두 배로 늘리는2를 계산합니다.
- 마지막으로, 각 샘플에 대한 세포독성2 을 계산한다.
- 초기 세포 계수 및 처리 후 세포 계수를 사용하여 먼저 각 샘플 2에 대한 모집단 배가(PD)를 계산합니다.
- Cyt-B 방법:
- CBPI(Cytokinesis-Block Proliferation Index)2를 계산하려면 class_count.csv 파일의 각 샘플에 대해 단핵, 이핵화 및 다핵화 클래스의 카운트를 사용합니다.
- 세포독성2를 계산하려면 대조군 배양(C)과 노출된 배양(T)의 CBPI를 사용합니다.
- CBPI(Cytokinesis-Block Proliferation Index)2를 계산하려면 class_count.csv 파일의 각 샘플에 대해 단핵, 이핵화 및 다핵화 클래스의 카운트를 사용합니다.
- 비 Cyt-B 방법:
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Representative Results
그림 1은 AI 소프트웨어를 사용하여 MN 분석을 위한 모델을 생성하는 워크플로우를 보여줍니다. 사용자는 원하는 .daf 파일을 AI 소프트웨어에 로드한 다음 AI 지원 클러스터(그림 2) 및 예측(그림 3) 태깅 알고리즘을 사용하여 실측 자료 모델 클래스에 객체를 할당합니다. 모든 실측 모델 클래스가 충분한 객체로 채워지면 RF 또는 CNN 알고리즘을 사용하여 모델을 훈련할 수 있습니다. 훈련 후에는 클래스 분포 히스토그램, 정확도 통계 및 대화형 혼동 행렬을 포함한 도구를 사용하여 모델의 성능을 평가할 수 있습니다(그림 4). AI 소프트웨어의 결과 화면에서 사용자는 워크플로의 훈련 부분으로 돌아가 실측 데이터를 향상시키거나, 충분한 정확도가 달성된 경우 모델을 사용하여 추가 데이터를 분류할 수 있습니다.
군집 알고리즘과 예측 알고리즘을 모두 사용하여 모든 클래스가 1,500개에서 10,000개 사이의 이미지로 채워질 때까지 총 285,000개의 개체가 있는 190개의 세그먼트가 적절한 실측 클래스에 할당되었습니다. 총 31,500개의 개체(로드된 초기 개체의 10.5%)가 이 모델의 학습에 사용되었습니다. 정밀도(거짓 양성 비율), 재현율(거짓 음성 비율) 및 F1 점수(정밀도와 재현율 간의 균형)는 딥러닝 소프트웨어 패키지에서 모델 정확도를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서 이러한 통계는 86.0%에서 99.4% 사이였으며 이는 높은 모델 정확도를 나타냅니다(그림 4).
Cyt-B를 사용하여 모든 대조군 샘플에 대한 배경 MN 빈도는 0.43%에서 1.69% 사이였으며 문헌17과 잘 비교되었습니다. (미토마이신 C) MMC의 경우 2.09%에서 9.50%, 에토포사이드의 경우 2.99%에서 7.98% 범위의 MN 빈도의 통계적으로 유의미한 증가가 용매 대조군과 비교했을 때 관찰되었으며 수동 현미경 점수와 잘 비교되었습니다. 음성 대조군 만니톨을 검사할 때, MN 빈도의 유의한 증가는 관찰되지 않았다. 또한 Etoposide와 MMC 모두에서 용량에 따른 세포 독성 증가가 관찰되었으며 현미경과 AI 모두 용량 범위 전반에 걸쳐 유사한 경향을 보였습니다. 만니톨의 경우, 관찰 가능한 세포독성 증가는 관찰되지 않았다(도 5).
Cyt-B를 사용하지 않을 때, 모든 대조군 샘플에 대한 배경 MN 빈도는 0.38% 내지 1.0% 사이였으며, 이는 문헌17에 발표된 결과와 일치하였다. MMC의 경우 2.55%에서 7.89%, Etoposide의 경우 2.37%에서 5.13% 범위의 MN 빈도의 통계적으로 유의미한 증가가 용매 대조군과 비교되었을 때 관찰되었으며 수동 현미경 점수와 잘 비교되었습니다. 음성 대조군 만니톨을 검사할 때, MN 빈도의 유의한 증가는 관찰되지 않았다. 또한, Etoposide와 MMC 모두에서 용량에 따른 세포 독성 증가가 관찰되었으며, 현미경과 AI 모두 용량 범위 전반에 걸쳐 유사한 경향을 보였습니다. 만니톨의 경우, 관찰 가능한 세포독성 증가는 관찰되지 않았다(도 5).
현미경으로 점수를 매길 때 각 배양물에서 1,000개의 이핵세포에 점수를 매겨 MN 빈도를 평가하고 또 다른 500개의 단핵, 이중핵 또는 다핵구세포를 채점하여 Cyt-B 버전의 분석에서 세포독성을 확인했습니다. 분석의 non-Cyt-B 버전에서, MN 빈도를 평가하기 위해 1,000개의 단핵구 세포에 점수를 매겼습니다. IFC에 의해, 배양 당 평균 7,733 개의 양핵 세포, 6,493 개의 단핵 세포 및 2,649 개의 다핵 세포를 채점하여 세포 독성을 측정하였다. MN 빈도는 분석의 Cyt-B 버전을 위해 이핵화된 세포 집단 내에서 결정되었습니다. non-Cyt-B 버전의 분석의 경우, 평균 27,866개의 단핵구가 MN의 존재에 대해 평가되었습니다(그림 5).
그림 1: AI 소프트웨어 워크플로. 사용자는 AI 소프트웨어에 로드할 .daf 파일을 선택하는 것으로 시작합니다. 데이터가 로드되면 사용자는 사용자 인터페이스를 통해 실측 모델 클래스에 객체를 할당하기 시작합니다. 실측 모집단을 지원하기 위해 군집 및 예측 알고리즘을 사용하여 유사한 형태의 이미지를 식별할 수 있습니다. 각 모델 클래스에 충분한 개체가 추가되면 모델을 학습할 수 있습니다. 훈련 후 사용자는 대화형 혼동 행렬을 포함하여 제공된 도구를 사용하여 모델의 성능을 평가할 수 있습니다. 마지막으로, 사용자는 워크플로의 훈련 부분으로 돌아가 실측 데이터를 향상시키거나, 충분한 정확도가 달성된 경우 훈련/태깅 워크플로 루프에서 벗어나 모델을 사용하여 추가 데이터를 분류할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 클러스터 알고리즘. 클러스터 알고리즘은 입력 데이터에서 임의로 선택된 1,500개 객체의 세그먼트에서 언제든지 실행할 수 있습니다. 이 알고리즘은 분류되지 않은 객체와 지상 실측 모델 클래스에 할당된 객체의 형태에 따라 세그먼트 내의 유사한 객체를 그룹화합니다. 예시 영상은 이핵, 단핵, 다핵 세포와 불규칙한 형태를 가진 세포를 보여줍니다. 단핵세포가 포함된 군집은 객체 맵의 한쪽에 속하고, 다핵세포가 있는 군집은 객체 맵의 반대편에 있습니다. Binucleated 세포 클러스터는 단일 핵 세포 클러스터와 다핵 세포 클러스터 사이 어딘가에 있습니다. 마지막으로, 불규칙한 형태를 가진 클러스터는 객체 맵의 다른 영역에 완전히 속합니다. 사용자 인터페이스를 사용하면 전체 클러스터를 추가하거나 클러스터 내의 객체를 지상 실측 모델 클래스에 추가할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 예측 알고리즘. 예측 알고리즘은 각 실측 자료 모델 클래스에 최소 25개의 개체가 필요하며 세그먼트 내에서 분류되지 않은 개체를 할당하기 위해 가장 적합한 모델 클래스를 예측하려고 시도합니다. 예측 알고리즘은 이미지에서 미묘한 형태(즉, MN[노란색]이 있는 단핵세포 대 MN[빨간색]이 없는 단핵구)의 식별과 관련하여 클러스터 알고리즘에 비해 더 강력합니다. 이러한 유사성을 가진 객체는 객체 맵에 근접하게 배치됩니다. 그러나 사용자는 예측된 각 클래스의 이미지를 쉽게 검사하고 적절한 모델 클래스에 개체를 할당할 수 있습니다. 알고리즘이 클래스를 예측할 수 없는 개체는 '알 수 없음'으로 유지됩니다. 예측 알고리즘을 사용하면 사용자가 실측 모델 클래스를 빠르게 채울 수 있으며, 특히 미세핵 세포와 같이 입력 데이터 내에서 찾기 어렵고 찾기 어려운 이벤트의 경우 더욱 그렇습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 모델 결과와의 혼동 행렬. AI 소프트웨어의 결과 화면은 사용자에게 모델 정확도를 평가할 수 있는 세 가지 도구를 제공합니다. (A) 클래스 분포 히스토그램을 통해 사용자는 히스토그램의 빈을 클릭하여 진리 모집단의 객체와 해당 모델 클래스에 속하는 것으로 예측된 객체 간의 관계를 평가할 수 있습니다. 일반적으로 주어진 모형 클래스에 대해 진실 모집단과 예측 모집단 사이의 백분율 값이 서로 가까울수록 모형이 더 정확합니다. (B) 정확도 통계 테이블을 통해 사용자는 세 가지 일반적인 기계 학습 메트릭을 평가하여 모델 정확도를 평가할 수 있습니다(정밀도, 재현율 및 F1). 일반적으로 이러한 메트릭이 100%에 가까울수록 모델이 모델 클래스에서 이벤트를 식별하는 데 더 정확합니다. 마지막으로, (C) 상호작용성 혼동행렬은 모델이 이벤트들을 잘못 분류하고 있는 위치를 나타낸다. 축상 항목(녹색)은 훈련 중에 올바르게 분류된 실측 데이터의 객체를 나타냅니다. 축외 항목(주황색 음영)은 잘못 분류된 실측 데이터의 객체를 나타냅니다. (i) MN을 갖는 단핵세포로서 분류된 단핵세포, (ii) MN을 갖는 이핵세포로서 분류된 이핵세포, (iii) 불규칙한 형태를 갖는 세포로서 분류된 단핵세포, (iv) 불규칙한 형태를 갖는 세포로서 분류된 MN을 갖는 이핵세포, 및 (v) 이핵세포로서 분류된 MN을 갖는 이핵세포, 및 (v) 이핵세포로서 분류된 MN을 갖는 이핵세포를 포함하는 오분류된 객체의 다양한 예가 도시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 유전독성 및 세포독성 결과. (A-C) Cyt-B 및 (D-F) non-Cyt-B 방법을 모두 사용하여 Mannitol, Etoposide 및 MMC에 대한 3시간 노출 및 24시간 회복 후 현미경(투명 막대) 및 AI(점선 막대)에 의한 MN의 백분율로 측정된 유전독성. 대조군에 비해 MN 빈도의 통계적으로 유의한 증가는 별표로 표시됩니다(*p < 0.001, Fisher's Exact Test). 오차 막대는 현미경에 의한 MMC를 제외하고 각 투여 지점에서 3개의 복제 배양에서 평균의 표준 편차를 나타내며, 여기서 중복 배양물만 채점되었습니다. 이 수치는 Rodrigues et al.15에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 작업은 딥 러닝 알고리즘을 사용하여 MN 분석의 스코어링을 자동화하는 방법을 설명합니다. 몇몇 최근의 간행물들은 직관적이고, 상호작용적인 도구들이 심층적인 계산 지식(18,19)에 대한 필요 없이 이미지 데이터를 분석하기 위한 딥 러닝 모델들의 생성들을 허용한다는 것을 보여주었다. 사용자 인터페이스 기반 소프트웨어 패키지를 사용하여 이 작업에서 설명하는 프로토콜은 매우 큰 데이터 파일에서 잘 작동하고 딥 러닝 모델을 쉽게 생성할 수 있도록 설계되었습니다. AI 소프트웨어 패키지에서 RF 및 CNN 모델을 생성하고 훈련하는 데 필요한 모든 단계에 대해 설명하여 Cyt-B 및 non-Cyt-B 버전의 분석에서 모든 주요 이벤트를 매우 정확하게 식별하고 정량화할 수 있습니다. 마지막으로, 이러한 딥 러닝 모델을 사용하여 추가 데이터를 분류하고 화학적 세포 독성 및 MN 빈도를 평가하는 단계를 설명합니다.
이 작업에 사용된 AI 소프트웨어는 편리한 사용자 인터페이스로 제작되었으며 IFC 시스템에서 생성된 대규모 데이터 세트와 쉽게 작업할 수 있도록 구성되었습니다. 딥 러닝 모델의 학습, 평가 및 향상은 간단한 반복 접근 방식을 따르며(그림 1), 학습된 모델을 적용하여 추가 데이터를 분류하는 작업은 몇 단계만 거치면 수행할 수 있습니다. 이 소프트웨어에는 고유한 클러스터(그림 2) 및 예측(그림 3) 알고리즘이 포함되어 있어 객체를 적절한 실측 자료 모델 클래스에 신속하게 할당할 수 있습니다. 이 백서의 프로토콜은 AI 소프트웨어를 사용하여 구축 및 훈련된 CNN 모델이 MN 분석의 모든 주요 이벤트를 강력하게 식별할 수 있는 방법을 보여줍니다. 기존 현미경과 비교할 수 있는 결과를 얻을 수 있으므로 이미지 분석 및 컴퓨터 코딩 경험이 필요하지 않습니다. 또한 대화형 모델 결과(그림 4)를 통해 모델이 잘못 분류하는 특정 이벤트를 조사할 수 있습니다. 반복 프로세스를 통해 이러한 잘못 분류된 이벤트를 적절한 모델 클래스에 할당하여 모델을 다시 학습시켜 정확도를 높일 수 있습니다.
여기에 제시된 결과(그림 5)는 현미경과 AI 소프트웨어에서 생성된 CNN 모델을 사용하여 만니톨, 에토포사이드 및 MMC를 평가한 것을 보여줍니다. 단일 AI 모델로 평가된 MN 분석의 두 가지 버전을 모두 사용하여 세포독성의 증가는 MMC와 에토포사이드 모두에 대한 용량 증가와 일치하는 반면, 만니톨에 노출되면 예상대로 세포독성이 증가하지 않습니다. 유전독성 평가를 위해 MMC와 에토포사이드를 사용했지만 만니톨을 사용하지 않은 MN 빈도의 유의미한(Fisher's Exact Test, 단측) 증가가 입증되었습니다. 현미경과 AI 모델의 결과는 테스트된 각 화학 물질의 용량 범위에서 잘 비교되었습니다.
이전의 여러 간행물에서, IFC 기반 MN 분석은 마스크(이미지에서 픽셀을 강조하는 관심 영역) 및 이러한 마스크를 사용하여 계산된 기능을 사용하여 계산된 이미지 기반 분석과 함께 간단하고 간단한 샘플 준비 단계로 수행될 수 있는 것으로 나타났습니다12,13,16 . 이 IFC 기반 분석은 고처리량 이미지 캡처, 간단한 DNA 염료를 사용한 단순화된 샘플 처리, 공개된 MN 분석 점수 기준에 부합하는 형태와 세포 이미지의 자동 차별화를 포함하여 IFC의 강점을 활용합니다. 그러나, 이 워크플로우는 또한 단점들을 포함하였는데, 이를테면 종종 경직되고 이미지 분석 소프트웨어 패키지들에 대한 고급 지식을 필요로 하는 특징-기반 분석 기술들의 복잡성(12)을 필요로 한다. IFC가 획득한 MN 데이터를 분석하기 위해 딥 러닝을 사용하면 CNN을 사용하여 특징 기반 분석의 제한과 어려움에서 벗어나 매우 정확하고 현미경 점수14,15와 잘 비교되는 결과를 얻을 수 있음을 보여줍니다. 이 AI 기반 접근 방식은 유망하지만 기술의 견고성을 추가로 테스트하고 검증하기 위해 잘 설명된 화학 물질의 확장된 선택에 대한 추가 연구를 수행해야 합니다. 이 연구는 현미경 및 기존 유세포 분석과 같은 보다 전통적인 방법에 비해 IFC의 장점을 추가로 입증하여 까다로운 형태와 엄격한 채점 요구 사항이 있는 분석의 성능을 향상시킵니다.
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Disclosures
저자는 DiaSorin Company인 Luminex Corporation, ImageStream 이미징 유세포 분석기 및 이 작업에 사용된 Amnis AI 소프트웨어 제조업체에 고용되어 있습니다.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Cleanser - Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546931 | Fill container with 200 mL of Cleanser. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/ 1/0/asc/2/8546931///0/1//0/ |
| Colchicine | MilliporeSigma | 64-86-8 | |
| Corning bottle-top vacuum filter | MilliporeSigma | CLS430769 | 0.22 µm filter, 500 mL bottle |
| Cytochalasin B | MilliporeSigma | 14930-96-2 | 5 mg bottle |
| Debubbler - 70% Isopropanol | MilliporeSigma | 1.3704 | Fill container with 200 mL of Debubbler. http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | 67-68-5 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | EMD Millipore | BSS-1006-B | PBS Ca++MG++ Free |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences, Inc. | 04018 | This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed. Irritating to the eyes, respiratory systems and skin. May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes. Potential cancer hazard. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/ |
| Guava Muse Cell Analyzer | Luminex | 0500-3115 | A standard configuration Guava Muse Cell Analyzer was used. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | 10 mg/mL solution |
| Mannitol | MilliporeSigma | 69-65-8 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100X | HyClone | SH30238.01 | |
| MIFC - ImageStreamX Mark II | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405 nm, 488 nm, and 642 nm lasers was used. |
| MIFC analysis software - IDEAS | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image analysis sofware" The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| MIFC software - INSPIRE | Luminex, a DiaSorin company | 100220 | "Image acquisition software" This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII) |
| Amnis AI software | Luminex, a DiaSorin company | 100221 | "AI software" This is the software that permits the creation of artificial intelligence models to analyze data |
| Mitomycin C | MilliporeSigma | 50-07-7 | |
| NEAA Mixture 100x | Lonza BioWhittaker | 13-114E | |
| Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X | Gibco | 15070063 | |
| Potassium Chloride (KCl) | MilliporeSigma | P9541 | |
| Rinse - Ultrapure water or deionized water | NA | NA | Use any ultrapure water or deionized water. Fill container with 900 mL of Rinse. |
| RNase | MilliporeSigma | 9001-99-4 | |
| RPMI-1640 Medium 1x | HyClone | SH30027.01 | |
| Sheath - PBS | MilliporeSigma | BSS-1006-B | This is the same as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x Ca++MG++ free. Fill container with 900 mL of Sheath. |
| Sterile water | HyClone | SH30529.01 | |
| Sterilizer - 0.4%–0.7% Hypochlorite | VWR | JT9416-1 | This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water. Fill container with 200 mL of Sterilzer. |
| T25 flask | Falcon | 353109 | |
| T75 flask | Falcon | 353136 | |
| TK6 cells | MilliporeSigma | 95111735 |
References
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