Summary
Immunmærkning af unormalt prionprotein ved hjælp af immunhistokemiske protokoller kræver specifikke prøve- og anti-PrP-antistofpræparationsmetoder. Denne protokol beskriver de vigtigste trin i epitopmaskering for at sikre korrekt PrP-immunmærkning og for at minimere ikke-specifik baggrundsfarvning. Denne tilgang overvejer også biosikkerhedsforanstaltninger ved udførelse af immunhistokemiske undersøgelser med de prioninficerede væv.
Abstract
Unormale prionproteiner (PrPSc) er den sygdomsassocierede isoform af cellulært prionprotein og diagnostiske markører for transmissible spongiforme encephalopatier (TSE'er). Disse neurodegenerative sygdomme påvirker mennesker og flere dyrearter og omfatter scrapie, zoonotisk bovin spongiform encephalopati (BSE), chronic wasting disease hos hjortedyr (CWD) og den nyligt identificerede kamelprionsygdom (CPD). Diagnosticering af TSE er afhængig af immunpåvisning af PrPSc ved anvendelse af både immunhistokemi (IHC) og vestlige immunoblotmetoder (WB) på encefalonvæv, nemlig hjernestammen (obex-niveau). IHC er en meget anvendt metode, der bruger primære antistoffer (monoklonale eller polyklonale) mod antigener af interesse i celler i en vævssektion. Antistof-antigenbindingen kan visualiseres ved en farvereaktion, der forbliver lokaliseret i det område af vævet eller cellen, hvor antistoffet var målrettet. Som sådan anvendes immunhistokemiske teknikker i prionsygdomme som inden for andre forskningsområder ikke kun til diagnostiske formål, men også i patogeneseundersøgelser. Sådanne undersøgelser involverer påvisning af PrPSc-mønstre og -typer fra dem, der tidligere er beskrevet, for at identificere de nye prionstammer. Da BSE kan inficere mennesker, anbefales det, at faciliteter og/eller praksis på biosikkerhedslaboratorieniveau 3 (BSL-3) anvendes til håndtering af kvæg, små drøvtyggere og hjortedyrprøver, der indgår i TSE-overvågningen. Derudover anbefales indeslutnings- og priondedikeret udstyr, når det er muligt, for at begrænse kontaminering. PrPSc IHC-proceduren består af et myresyreepitop-demmaskeringstrin, der også fungerer som en prioninaktiveringsforanstaltning, da formalinfikseret og paraffinindlejret væv, der anvendes i denne teknik, forbliver smitsomt. Ved fortolkning af resultaterne skal man sørge for at skelne ikke-specifik immunmærkning fra målmærkning. Til dette formål er det vigtigt at genkende artefakter af immunmærkning opnået i kendte TSE-negative kontroldyr for at skelne dem fra specifikke PrP Sc-immunmærkningstyper, som kan variere mellem TSE-stammer, værtsarter og prnp-genotype, yderligere beskrevet heri.
Introduction
Ifølge prionhypotesen er den abnorme isoform (PrPSc) den primære eller eneste komponent i det infektiøse agens i transmissible spongiforme encephalopatier (TSE'er). Bekræftelse til diagnosticering af TSE afhænger af immunpåvisning af PrPSc ved anvendelse af immunhistokemiske (IHC) protokoller og/eller vestlige immunblotmetoder (WB) af encefalonvæv1.
IHC er en metode, der anvender monoklonale eller i nogle tilfælde polyklonale antistoffer (som primære antistoffer) som et første trin i immunfarvning af specifikt målrettede antigener af interesse placeret i celler i en vævssektion. Enhver effektiv primær antistof-antigenbinding visualiseres derefter ved hjælp af sekundære antistoffer, der er specifikke for de primære antistoffer. Disse sekundære antistoffer konjugeres til enzymer, såsom peberrodsperoxidase (HRP) eller alkalisk fosfatase (AP). Visualisering opnås derefter ved at tilføje et substrat til disse enzymer, der producerer uopløselige farveprodukter lokaliseret i områder, hvor de primære antistoffer er bundet til de målrettede antigener. Forbedret visualisering kan opnås ved modfarvning, hvor et farvestof bruges til at skabe en kontrast mellem immunmærket og ikke-immunmærket væv2.
Ved IHC ved anvendelse af formalinfikseret paraffinindlejret væv (FFPE) kan formalinfiksering ophæve effektiviteten af primære antistoffer på grund af tværbinding med formaldehyd og opvarmning og dehydrering under paraffinindlejring. Disse ændrer konformationen af proteiner, ødelægger, denaturerer eller maskerer epitoperne og mindsker eller ophæver dermed deres påvisning3. Som sådan kræver dette antigenhentning (AR). AR-teknikkerne forstyrrer formaldehydrelateret kemisk gruppetværbinding i de antigene molekyler og genopretter eller afslører således den oprindelige antigen-proteinkonformation. Dette resulterer i at genvinde antistof-antigen (epitop) affinitet til immunmærkning. Den endelige effekt af AR afhænger af kvaliteten af det målrettede antigen og / eller det primære antistof2.
Varmeinduceret antigen (epitop) hentning (HIER) er en procedure i AR3 og anvendes rutinemæssigt til PrPSc IHC-detektion, som beskrevet heri. IHC er afgørende for diagnose og anvendes i forskningslaboratorier til at bestemme vævsfordelingen af et patologiassocieret antigen. Det bruges i vid udstrækning til diagnosticering og forskning i kræft, neurovidenskab og infektionssygdomme4, blandt andre. For TSE spiller IHC en vigtig rolle i diagnosticering og forskning til bekræftelse og undersøgelse af PrPSc-fordeling i naturlige værter og eksperimentelle modeller. IHC bidrager til prionpatogeneseundersøgelser og analyse af PrP Sc-aflejringstyper og -mønstre, nemlig i neurale væv5, for at påvise afvigelser fra rutinemæssigt beskrevne infektioner og identificere formodede nye prionstammer.
Da prioner af bovin spongiform encephalopati (BSE) kan inficere mennesker, kan visse laboratorieprotokoller, der er involveret i arbejdet med BSE, kræve anvendelse af BSL-3-faciliteter og -praksis6. Disse omfatter anvendelse af en forseglet sekundær beholder til transport af potentielle BSE-inficerede vævsprøver inden for instituttet og laboratoriet. Det omfatter også udpegelse af indeslutningsområder og prionsærligt udstyr til BSE-forskning og -analyse, når det er muligt. Dette gøres for at forhindre kontaminering uden for arbejdsområdet og give et begrænset rum, da dekontamineringsprocedurer bliver nødvendige.
I overensstemmelse hermed følger laboratoriet for patologi i INIAV anbefalede faciliteter og praksis for biosikkerhedsniveau-3 (BSL-3)6 for at håndtere potentielle prioninficerede prøver af væv fra kvæg, små drøvtyggere og hjortedyr, der er forbundet med TSE-overvågningen.
Formalinfikseret og paraffinindlejret væv, der indgår i TSE-diagnosticerings- eller forskningsprocedurer, især i centralnervesystemet, kan være potentielt smitsomt. Derfor skal disse faste væv behandles med myresyre for at reducere smitsomheden af prioner, hvis de er til stede, før vævsbehandling. Dette udføres ved at placere faste, trimmede væv (ca. 2-4 mm tykkelse) i en behandlingskassette. Kassetten nedsænkes derefter i 98% myresyre (i 1 time). Efter nedsænkning vaskes kassetterne med væv i rindende ledningsvand i 30 minutter og returneres til fikseringsmidlet inden videre behandling. Hvis vævssektioner ikke behandles før behandling, skal postmikrotomiske vævssektioner nedsænkes i ufortyndet myresyre i mindst 5 minutter før histologisk farvning7. IHC-protokollen for PrPSc inkluderer et rutinemæssigt myresyreepitop-demmaskeringstrin, der også tjener til at inaktivere prioner7. Efter disse prioninaktiveringstrin kan det resulterende faste væv derefter behandles ved BSL-2 ved hjælp af standard BSL-2-praksis.
Minimumskravet til vævsprøvetagning til TSE-diagnosticering hos alle dyr, der er omfattet af TSE-overvågningen, er indsamling af hjernestammen (på obex-niveau). For at påvise atypisk BSE og scrapie anbefales det desuden, at en del af lillehjernen også indsamles 1,8. Til CWD-diagnose bør både hjernestamme (obex) og retropharyngeale lymfeknuder testes, da PrP Sc kunne påvises i lymfoide væv uden påviselig PrPSc i obex9, gennemgået af Machado et al.10.
Den obex-del af hjernestammen omfatter diagnostiske TSE-målsteder, nemlig dorsal vagalkernen (DVN), ensomhedskanalkernen (STN) og rygmarvskernen i trigeminusnerven (V). Disse områder udviser konsekvent bilateral akkumulering af PrPSc , selv i de tidlige stadier af BSE og klassisk scrapie. I kliniske tilfælde af fremskreden TSE viser alle gråstofområder i hjernestammen udbredt PrPSc-fordeling 11.
Før sektionering og behandling evalueres hjerneprøverne (figur 1) for at fastslå autolyseniveauet og tilstedeværelsen af eventuelle vævsskader, der potentielt kan kompromittere prøvens egnethed til IHC-baseret bekræftende diagnose8. For at validere integriteten af de præparative protokoller og analyseresultaterne indgår TSE-positive og negative vævsprøver som kontroller i forbindelse med fremstilling af væv fra testtilfælde i hvert assay.
Figur 1: PrPSc IHC-proceduren. Repræsentation, der viser den trinvise sekvens af PrPSc IHC-proceduren fra deparaffinisering af vævssektioner til eventuel immunfarvning og detektion (FFPE - Formalin-fixed paraffin-embedded; Mab - monoklonalt antistof; DAB - 3,3' diaminobenzidin). Denne figur blev oprettet i BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
IHC-proceduren, der er beskrevet heri, er en del af forskningsprojektet FAIRJ-CT98-7021, "Etablering af et europæisk netværk til overvågning af TSE hos drøvtyggere og standardisering og harmonisering af processen og kriterierne for identifikation af mistænkte tilfælde". Det følger de diagnosekriterier, der er fastlagt af Verdensorganisationen for Dyresundhed, WOAH (tidligere benævnt Det Internationale Kontor for Epizootier, OIE)1 og Det Europæiske Referencelaboratorium for TSE hos Dyr 8,11. Den beskrevne IHC-procedure er også akkrediteret i henhold til NPISOIEC17025 (generelle krav til prøvnings- og kalibreringslaboratoriers kompetence) siden 2008. En sådan akkreditering indebærer et styringssystem af høj kvalitet, der omfatter operative standardprocedurer, kvalificeret personale, nøjagtigt kalibreret udstyr, streng kontrol med data og reagenser, deltagelse i præstationsanalyser mellem laboratorier, ikke-overensstemmende arbejde og risikovurdering for at øge styringssystemets effektivitet, opnå forbedrede resultater og forebygge laboratoriefarer. Prioninficerede vævskontroller med BSE, klassisk scrapie, atypisk scrapie og CWD blev indsamlet (formalinfikseret, paraffinindlejret, FFPE) fra forskellige kilder. Kvæg- og fåresektionerne er fra de tilfælde, der er diagnosticeret under et TSE-overvågningsprogram for dyr. CWD-sektionerne er fra kontrolprøverne, der venligst blev leveret af professor Stefanie Czub (Canadian Food Inspection Agency, National Center for Animal Diseases) i 2003, og fra CWD Proficiency testing 2008 arrangeret af European Reference Laboratory for TSE (APHA, Weybridge).
1. Vævssektionering og diasforberedelse
- Skær sektioner af formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) væv ved 3-5 μm tykkelse ved hjælp af et mikrotom.
- Flydesektionerne flyder på renset vand med en temperatur på ca. 10 °C under smeltepunktet for den anvendte paraffin. Løft sektionerne fra vandet op på specielt behandlede mikroskopglas (se Materialetabel). Lad vandet løbe grundigt ud af gliderne.
- Objektglassene inkuberes natten over ved 50 °C for at forbedre vævets vedhæftning af objektglasset.
BEMÆRK: Det foretrækkes at forberede frisk snitvævet til IHC-protokoller, selvom TSE-positive og negative kontrolsektioner kan forberedes på forhånd og opbevares. Trin 2 til 4 skal udføres i en kemisk damphætte.
2. Deparaffinisering og rehydrering
- Anbring objektglassene med vævssektionerne i en rustfri stålkurv (se materialetabel). Nedsænk kurven i et xylenbad (rustfri stålbejdsebeholder) i 3 minutter, fjern og nedsænk igen.
- Fjern xylen og rehydrer sektioner ved at nedsænke dem i et absolut ethanolbad i 3 minutter. Fjern og fordyb igen.
- Lufttør sektionerne og læg dem i et 90% ethanolbad i 1 min. Overfør til et 70% ethanolbad i endnu et minut, efterfulgt af en endelig overførsel til et 50% ethanolbad i 1 min. For hver ethanolbadbehandling omrøres glidekurven forsigtigt to gange og tømmes kurven inden næste overførsel.
3. Hentning af epitop
- Nedsænk forsigtigt vævssektionerne i 98% myresyre ved stuetemperatur i 30 min. Skyl sektionerne i ledningsvand i 5 min, efterfulgt af skylning to gange i destilleret vand.
FORSIGTIG: Myresyre er stærkt ætsende. Beskyttelsesbriller og handsker skal bæres. - Udfør varmeinduceret antigenhentning (HIER) ved at følge nedenstående trin.
BEMÆRK: Dette trin udføres ved hydreret autoklavering ved 121 °C i 30 minutter i et specifikt trykkammer (se materialetabel).- Forvarm citratbufferen (10 mM, pH 6,1, se materialetabellen) ved 98 °C i ca. 20 minutter i en rustfri stålbejdsebeholder placeret inde i trykkammeret fyldt med 500 ml destilleret vand.
BEMÆRK: I denne undersøgelse var programmet Set Point 1 (SP1) for det specifikke anvendte udstyr. - Når alarmen angiver, at udstyret har opnået den programmerede tid og temperatur, skal du nedsænke kurven med dias og starte programmet til indstillingspunkt 2 (121 ° C i 30 minutter). Til kvalitetskontrolformål skal du placere et afsnit af selvklæbende autoklaveindikatortape på kurven for at overvåge temperatur og tryk og registrere det indledende og endelige tryk i dette program.
- Hvis antallet af dias, der skal immunfarves, ikke når kurvens kapacitet, skal du bruge rene, tomme dias til at optage tomme positioner. Når programmet er afsluttet, skal du tillade kammerets passive tilbagevenden til omgivende tryk (mindst 30 min).
BEMÆRK: Længere varighed kan reducere ikke-specifik baggrundsfarvning. - Overfør forsigtigt glidekurven til en rustfri stålbejdsebeholder fyldt med destilleret vand i 5 min.
- Forvarm citratbufferen (10 mM, pH 6,1, se materialetabellen) ved 98 °C i ca. 20 minutter i en rustfri stålbejdsebeholder placeret inde i trykkammeret fyldt med 500 ml destilleret vand.
4. Inaktivering af endogen peroxidase
- Slidekurven med prøvesektionerne nedsænkes i et bad med 3% hydrogenperoxid (H2O2) i methanol i 30 minutter. Skyl sektionerne under rindende vand (5 min). Dræn og nedsænk sektionerne i 1x Tris-bufret saltvand (TBS) i yderligere 5 min.
5. Immundetektion
BEMÆRK: I dette studie blev immundetektion udført ved hjælp af kapillærgabsformatet7 ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt diasklipsamlingssystem (se materialetabel). Andre immunhistokemiske diassystemer er også anvendelige.
- Hvert objektglas anbringes på en dækpladeholder, der fås i handelen, (se materialetabellen), fugtet med TBS, idet der undgås bobler, og vævssiden vender mod holderen og glidekanterne falder sammen med holderens to nederste punkter.
- Hold lysbilledholderenheden mellem tommel- og pegefinger med den ene finger oven på prøveglasset og den anden i bunden af holderen. Placer derefter samlingen i systemets galleri.
- For at sikre, at sættet er godt samlet, skal du fylde brønden mellem prøveglasset og holderen med TBS, som ikke straks må løbe over. Fra dette tidspunkt skal det sikres, at ca. 80 μL TBS tilbageholdes mellem holderen og objektglasset. Lad ikke sektionerne tørre.
- Når du er i systemet, for at reducere baggrundsfarvning før behandling med primært antistof (anti-PrP, se materialetabel), skal prøveobjektglassene forinkuberes med 20% normalt serum fra samme art som den sekundære antistofvært, der anvendes til immunfarvning (i dette tilfælde hesteserum) i 30 minutter i TBS.
- Antallet af delprøver af antistof, der skal anvendes, angives afhængigt af den dyreart, der analyseres, antallet af prøvesektioner, der skal undersøges, og mængden af fortynding.
BEMÆRK: For de bedste resultater skal du bruge 10% normalt serum fra samme art som kilden til de sekundære antistof- og primære antistofopløsninger. Hvis det er muligt, for at opnå de bedste resultater, bør værtskilden for det normale serum og sekundære antistof være fra samme art. - Uden at vaske sektionerne påføres den primære antistofopløsning direkte (200 μL) i hvert hul i diasholdersættet og inkuberes i 60 minutter ved stuetemperatur.
- Til vask skal du fylde hullerne i diasholdersættene med TBS og vente i 5 min. Gentag to gange.
- Fortynd det biotinylerede sekundære antistof (monoklonalt antimurin Horse Ab, se materialetabel) ved 1:200 i TBS med 10% hesteserum. Forbered det krævede volumen afhængigt af antallet af sektioner, der skal behandles.
- Påfør den sekundære antistofopløsning (200 μL) på hvert hul i glideholdersættet. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask som beskrevet i trin 5.5.
- Til inkubation med avidin-biotinkompleks peroxidase (ABC/HRP-kompleks, se materialetabel) fremstilles reagenset 30 minutter før brug. Påfør ABC/HRP's komplekse opløsning (200 μL) i hvert hul i glidepladeholdersættet. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask som beskrevet i trin 5.5.
6. Udvikling med DAB-kromogen
FORSIGTIG: DAB er et potentielt kræftfremkaldende stof. Som følge heraf er passende pleje nødvendig, mens du arbejder med dette reagens, herunder øjenbeskyttelse, laboratoriefrakker, handsker og gode laboratorieprocedurer. Bortskaf i henhold til lokale regler.
- Fortynd kromogen i henhold til producentens anvisninger (se materialetabellen) umiddelbart før brug. Kromogenopløsningen (400 μL) påføres hvert hul i glidepladesættet.
- Inkuber i op til 30 minutter ved stuetemperatur. I PrPSc-positive sektioner er en inkubationsperiode på 10 minutter normalt tilstrækkelig.
- Fjern den resterende kromogenopløsning ved at vaske diasene i destilleret vand. Fjern gliderne fra dækpladeholderne, og læg dem i en plastikbeholder med destilleret vand.
7. Hæmatoxylin modfarvning
- Nedsænk rustfri stålfarvekurv med sektionerne i hæmatopylinopløsningsbadet (se materialetabel) i 1 min. Skyl forsigtigt i koldt rindende vand i 10 min eller lunkent vand i 5 min.
- Dehydrer sektionerne ved at placere dem i 90% ethanol i 1 min, efterfulgt af et bad i absolut ethanol i 1 min. Placer derefter diasene i et xylenbad i 1 min.
- Monter sektionerne med et kommercielt tilgængeligt monteringsmedium (se materialetabel).
BEMÆRK: Disse trin udføres i en kemisk damphætte ved stuetemperatur (19 °C-24 °C). Denne procedure omfatter en testjournal (supplerende fil 1) til registrering af færdiggørelsen af alle trin, det anvendte udstyr og laboratorieteknikeren. Derudover er der udarbejdet et arbejdsark (supplerende fil 2), som let kan bestemme rumfanget af reagenserne i henhold til antallet af sektioner i hvert assay, arbejdsfortyndingerne og producentens anvisninger samt registrere rumtemperatur, udstyr og reagensbatcher.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Da ikke-specifik målimmunmærkning er mulig, er det vigtigt at fastslå niveauet for ikke-specifik immunmærkning hos kendte TSE-negative kontroldyr. Dette er et vigtigt skridt til korrekt fortolkning af specifik PrPSc-immunmærkning 7 (figur 2). Ikke-målmærkning med anti-PrP-antistoffer er blevet bemærket at forekomme som diskret intraneuronal finpartikelfarvning (mere tydelig i hypoglossalkernen og tilbehørscuneatkernen), uregelmæssige finlineære tråde af plet i neuropil (STN, V, olivarykerne, tilbehørscuneatkerne, lateral fascikulær kerne, retikulær dannelse dorsal til olivarykernerne og område postrema)12 , diffus ikke-partikelformet mærkning i nogle grå og hvide stofområder og diffus cytoplasmatisk mærkning af neuroner13 (figur 3).
Baseret på flere undersøgelser kan specifik, målrettet PrPSc-immunmærkning findes i mange forskellige typer afhængigt af TSE-stammen, værtsarten og prnp-genotypen . Følgende PrPSc-typer er blevet beskrevet (gennemgået af Orge et al.5): Intraneuronal; Intraglial; Stellat; Perivascular; Subpial; Subependimal; Lineær; Fin granulær; Aggregater (eller grove granulære, grove partikler til sammensmeltning og moslignende); Perineuronal; Plaque-lignende (eller plaques, vaskulære plaques); Punkteret; Kugleformede.
Figur 2: Repræsentative billeder efter immunmærkning for PrPSc af vævssektioner fra ikke-inficerede kontroller og prioninficerede dyr med BSE, klassisk scrapie, atypisk scrapie og CWD. (A,B,C) Snit fra negative kontroller af henholdsvis kvæg, får og hjortedyr; D) BSE-positive: granulære PrP Sc-aflejringer i DVN's neuropil og (E) STN F) Klassisk scrapiepositiv hos får: granulær PrPSc i neuropil og intraneuronal i DVN og G) stellat-PrPsc i retikulær dannelse (H) Får atypisk scrapie: granulær PrP Sc i neuropil af V i obex-regionen, granulær ved molekylære (m) og (I) granulære (g) lag af lillehjernen og (J) punkteret (pil) og kugleformet (pilespids) PrPSc ved hjernestammens hvide substans; K) CWD: granulær PrPSc ved V og (L) retikulær dannelse og perivaskulær ved retikulær dannelse. For A, B, C og D- Skalabjælke = 50 μm; E, F, G, H og L- Skalabjælke = 20 μm; I og K- Skalastang = 1 mm; J- Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative billeder, der viser eksempler på immunfarvningsartefakter observeret efter PrPSc IHC-proceduren. (A) Diffus neuropil baggrund (DVN). (B) Diffus cytoplasmatisk (hovedpil) mærkning af neuroner (retikulær dannelse). C) Artifactual chromogen deposits (pile) (retikulær dannelse). (D) Uregelmæssige fine linjer (pile) af farvning i neuropil (retikulær dannelse). Prøver af PrPSc-negative kvægsektioner fra immunhistokemisk teknisk færdighedstest tilrettelagt af Det Europæiske Referencelaboratorium for TSE. A og B- Skala bar = 20 μm; C og D- Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1 opsummerer beskrivelsen af immunmærkede PrPSc-typer observeret i BSE, klassisk og atypisk scrapie og CWD for en positiv diagnose og etablerede kriterier for negative, inkonklusive og uegnede resultater11 og gennemgået af Orge et al.5.
Tabel 1: Sammenfatning af PrPSc-typer observeret i BSE, klassisk og atypisk scrapie og CWD for en positiv diagnose og kriterier for negative, inkonklusive og uegnede resultater. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende fil 1: Formular, der tjener som INIAV "TSE Immunohistochemical test record". Opgaven afsluttes, da hvert trin i IHC-protokollen er afsluttet og certificeret af den tekniker, der udfører den respektive opgave. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Arbejdsark til fremstilling af reagens for TSE-immunhistokemisk protokol. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TSE er potentielle zoonotiske sygdomme. Efter fremkomsten af BSE i 1986 i Det Forenede Kongerige blev Portugal en af de EU-medlemsstater, der havde en højere forekomst af denne sygdom14,15. For at bekæmpe denne sygdom er der udviklet andre TSE'er (klassisk og atypisk scrapie, BSE-varianter og i øjeblikket overvågning af chronic wasting disease hos hjortedyr), overvågningsmekanismer af Generaldirektoratet for Fødevarer og Veterinær (DGAV) og National Institute for Agricultural and Veterinary Research, IP (INIAV), der udfører TSE-diagnosen som TSE National Veterinary Laboratory. Dette laboratorium følger de anbefalede BSL-3-faciliteter og -praksis6 i forbindelse med håndtering af potentielle prioninficerede prøver af væv fra kvæg, små drøvtyggere og hjortedyr, der er forbundet med TSE-overvågning. Immunpåvisning af PrPSc ved immunhistokemi (IHC) og/eller vestlige immunblotmetoder (WB) af encephalon og lymfevæv er referencemetoderne til bekræftelse af diagnosen TSE1.
IHC-teknikken er et nyttigt komplementært værktøj til diagnose og anatomipatologisk undersøgelse inden for veterinær- og humanmedicin. Flere kritiske punkter identificeres, og i praksis er det nødvendigt at justere i hvert laboratorium for hver dyreart, det anvendte antistof og også de forskellige testede væv16,17. Fiksering, antigenhentning, baggrund og artefakter ud over den anvendte type antistof (monoklonal versus polyklonal, den anvendte klon, animalsk oprindelse) og testede dyrearter er eksempler på faktorer, der skal kontrolleres og standardiseres korrekt i hvert laboratorium, således at de endelige resultater opnået med immunhistokemi ville blive korrekt fortolket som specifik immunmærkning2, 17.
I det igangværende arbejde blev den protokol, der blev fulgt af det nationale TSE-referencelaboratorium i Portugal, fremlagt med de kritiske punkter og alle referencemetoder, der er foretaget for at sikre en korrekt diagnosticering af TSE-sygdomme. IHC-resultaterne afhænger af prøvens kvalitet, som skal omfatte målstederne for TSE. Manglen på disse TSE-målsteder sammen med fraværet af specifik PrPSc-immunmærkning er en vigtig begrænsning af denne metode for at sikre en diagnose. Selv i tilfælde, hvor nedfrysning eller autolyse fremmer artefakter, er det muligt at stille en endelig diagnose af, om der er TSE til stede, hvis disse målsteder er til stede i prøven. Desuden indikerer identifikationen af immunfarvning i ikke-specifikke mål i forskellige neuronale væv baseret på daglig observation af negative og positive kontroller, der altid er blevet introduceret, når denne teknik udføres, kvaliteten af den protokol, der produceres og præsenteres her, og årsagen til dens certificering 5,12,13.
Som mulige hændelser fremhæves tabet af vævssektioner under hydreret autoklavering og/eller fjernelse af dækpladeholderne, tilstedeværelsen af bobler fanget mellem objektglassene og dækpladerne og utilstrækkelig fortynding af reagenserne. For at overvinde disse hændelser anbefales det at bruge positivt ladede mikroskopglas inden for udløbsdatoen, og som er godt opbevaret, klip vævssektionerne omhyggeligt med dækpladerne, brug kalibreret udstyr, standardiser reagensforberedelsesarket (supplerende fil 2) og test immunmærkning batchreagenser før brug.
Beskrivelsen af nye TSE-varianter, nemlig atypisk scrapie, bekræfter også betydningen af en standardiseret IHC-teknik i denne diagnose. Med denne teknik er det muligt at observere eksistensen af forskellige mønstre for PrPSc-immunfarvning afhængigt af prionstammen, værtsarten og prnp-genotypen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne artikel blev finansieret af projektet POCI-01-0145-FEDER-029947 "Chronic wasting disease risk assessment in Portugal" støttet af FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) - FEDER -Balcão2020. Også forfatterne af forskningsenheden CECAV modtog finansiering fra FCT under projektet UIDB / CVT / 0772/2020.Vi takker Bruce C. Campbell, forskningsdirektør (pensioneret), Western Regional Research Center, USDA, for hans hjælp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | Undituled |
| Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water | |||
| Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase |
Vector Laboratories | PK-6100 | Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing. |
| Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L) | Vector Laboratories | BA-2000-1.5 | Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections. |
| Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase | Vector Laboratories | SK-4100 | Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section. |
| DakoCytomation Pascal pressure chamber | DAKO | S2800 | |
| Ehrlich’s Hematoxylin: | |||
| Hematoxylin | Merck | 115938 | Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use. |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 101830 | |
| Potassium alum | Merck | 1.01047.1000 | |
| Glycerin | Merck | 1.04091.1000 | |
| Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2): | 40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use |
||
| Hydrogen peroxide (30% w/w) | Scharlau | HI0136 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 322415-2L | |
| Formic acid 98% | Merck | 1.00264.1000 | Undiluted |
| Microtome | Shandon-AS325 | Microtome | Shandon-AS325 |
| Mounting medium Entellan | Merck | 107960 | Ready- to- use. |
| Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum |
Gibco |
16050-122 |
Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section). |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11 | BIORAD | MCA2460 | PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time. |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10 | Cayman Chemical Company | 189710 | PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11 |
| Shandon CoverplateTM chamber | Thermo Scientific | 72110017 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining center | Thermo Scientific | 73300001 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack | Thermo Scientific | 73310017 | |
| Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1): | 2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day. |
||
| Tri-sodium citrate dihydrate | Sigma-aldrich | S4641-500G | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C0759 | |
| Staining jar and basket | Deltalab | 19360 | |
| 19361 | |||
| Superfrost Plus microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6): | 10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day. |
||
| TRIZMA BASE | Sigma Aldrich | T6066-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Xylene | Panreac Applied Chem ITW reagents | 251769 | Undiluted |
References
- WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. - Scrapie (Version May 2022). , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2022).
- Ramos-Vara, J. A.
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-Induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Immunocytochemical Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Oliver, C., Jamur, M. 588, 103-119 (2010).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M.
- Orge, L., et al.
- US Department of Health and Human Services Public Health Service Centres for Disease Control and Prevention National Institutes of Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 6th Edition Revised June 2020. , Available from: https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf (2022).
- APHA. Fixation, tissue processing, histology and immunohistochemistry procedures for diagnosis of animal TSE (BSE, scrapie, atypical scrapie, CWD). Histo & IHC protocols for TSE diagnosis_Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2022).
- Sample requirements for TSE testing and confirmation. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- TSE EU Reference Laboratory Guidelines for the detection of Chronic Wasting Disease in cervids. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- Machado, C. N., et al. TSE Monitoring in Wildlife Epidemiology, Transmission, Diagnosis, Genetics and Control. Wildlife Population Monitoring. IntechOpen. , (2019).
- APHA. Neuropathology: Confirmatory diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in cattle and small ruminants. Confirmatory (Histo & IHC) diagnostic criteria Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2019).
- Ryder, S. J., Spencer, Y. I., Bellerby, P. J., March, S. A. Immunohistochemical detection of PrP in the medulla oblongata of sheep: The spectrum of staining in normal and scrapie-affected sheep. The Veterinary Record. 148 (1), 7-13 (2001).
- Simmons, M. M., et al. Experimental classical bovine spongiform encephalopathy: definition and progression of neural PrP immunolabeling in relation to diagnosis and disease controls. Veterinary Pathology. 48 (5), 948-963 (2011).
- Orge, L., et al.
- Orge, L., Simas, J. P., Fernandes, A. C., Ramos, M., Galo, A. Similarity of the lesion profile of BSE in Portuguese cattle to that described in British cattle. Veterinary Record. 147 (17), 486-488 (2000).
- Pires, M. A., Travassos, F. S., Gärtner, F.
- Pires, M. A., et al.
