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Neuroscience

एजिंग रिसर्च के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए मजबूत ऊतक निर्माण

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64586
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Applied Stem Cell Technologies, TechMed Centre Enschede, University of Twente, 2Centro de Biotecnología-FEMSA, Tecnologico de Monterrey, 3Department of Genetics, Harvard Medical School

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल मानव-प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (आईपीएससी) से प्राप्त सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी, रखरखाव और उम्र बढ़ने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान करता है। यह विधि विस्तारित अवधि के लिए सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स को संवर्धन और परिपक्व करने में सक्षम बनाती है, जो मस्तिष्क की उम्र बढ़ने और उम्र से संबंधित रोगजनन में शामिल प्रक्रियाओं के मॉडलिंग की सुविधा प्रदान करती है।

Abstract

वर्तमान में उपलब्ध पशु और सेलुलर मॉडल उम्र बढ़ने वाले मानव मस्तिष्क में होने वाले परिवर्तनों की जटिलता को पूरी तरह से पुन: परिभाषित नहीं करते हैं। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं (आईपीएससी) से प्राप्त मानव सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की पीढ़ी का वर्णन करने वाली प्रक्रियाओं के एक हालिया विकास में मानव मस्तिष्क और संबंधित रोगजनक प्रक्रियाओं की उम्र बढ़ने को मॉडल करने और समझने की क्षमता को मौलिक रूप से बदलने की क्षमता है। यहां, मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स को उत्पन्न करने, बनाए रखने, उम्र बढ़ने और विशेषता के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। इस प्रोटोकॉल को प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए लागू किया जा सकता है और एक चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका के रूप में कार्य करता है, जिसमें नवीनतम तकनीकों को शामिल किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप संस्कृति में बेहतर ऑर्गेनॉइड परिपक्वता और उम्र बढ़ने होता है। ऑर्गेनॉइड परिपक्वता, परिगलन, परिवर्तनशीलता और बैच प्रभाव से संबंधित विशिष्ट मुद्दों को संबोधित किया जा रहा है। एक साथ लिया गया, ये तकनीकी प्रगति विभिन्न प्रकार के युवा और वृद्ध मानव दाताओं के साथ-साथ उम्र से संबंधित मस्तिष्क विकारों से पीड़ित व्यक्तियों से प्राप्त ऑर्गेनोइड्स में मस्तिष्क की उम्र बढ़ने के मॉडलिंग की अनुमति देगी, जिससे मानव मस्तिष्क की उम्र बढ़ने के शारीरिक और रोगजनक तंत्र की पहचान की जा सकेगी।

Introduction

उम्र बढ़ने के रोग मॉडल तेजी से प्रासंगिक हो गए हैं क्योंकि मानव जीवन प्रत्याशा में वृद्धि जारी है। बड़े पैमाने पर जीनोमिक अध्ययनों ने आणविक प्रक्रियाओं की विकृति और जीवन की गुणवत्ता को प्रभावित करने वाले आनुवंशिक परिवर्तनों के साथ वृद्ध आबादी को उजागरकिया है। उम्र बढ़ने की प्रक्रिया को जीव की कार्यक्षमता के सामान्य नुकसान की विशेषता है, जिसमें संज्ञानात्मक कार्य का नुकसान, न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों के लिए जोखिम में वृद्धि और पुरानी बीमारियों कीमेजबानी शामिल है।

वर्तमान सेल कल्चर तकनीक उचित रूप से उम्र बढ़ने की बहुक्रियात्मक प्रकृति का प्रतिनिधित्व नहीं करती है, क्योंकि इन शिथिलताओं को उत्परिवर्तन, विषाक्त पदार्थों यासंक्रमणों का उपयोग करके ठीक से दोहराया नहीं जा सकता है। उम्र बढ़ने की प्रक्रिया का पता लगाने वाले पशु मॉडल अक्सर लंबे प्रयोगात्मक समय और उच्च लागत से जुड़े होते हैं, लेकिन उनके साथ नैतिक विचार भी लाते हैं। रोगियों से प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) का उपयोग आणविक तंत्र को स्पष्ट कर सकता है जो रोग की प्रगति को कम करता है क्योंकि आईपीएससी परिपक्व ऊतक में कोशिकाओं के प्राकृतिक विकास की अनुमतिदेता है। आईपीएससी न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों की जांच करने वाली कई प्रयोगशालाओं का कामकाजी घोड़ा बन गया है, क्योंकि कटी हुई कोशिकाओं की सेलुलर रीप्रोग्रामिंगदाताओं की बीमारी या उम्र बढ़ने की छाप को मिटाती नहीं है। ये छाप मानव और पशु मॉडल में प्रदर्शित सेलुलर फेनोटाइप्स को पुन: प्रस्तुत करते हैं, जिससे आईपीएससी अत्यधिक घने मस्तिष्क ऊतक 5,6 की व्यक्तिगत सेलुलर गिरावट की जांच के लिए उपयुक्त हो जाते हैं। आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड ऊतक के त्रि-आयामी संवर्धन के लिए प्रमुख मॉडल बन गए हैं, जो अधिक जटिल सेल-टू-सेल इंटरैक्शन और एक बेहतर विकासात्मक पुनर्पूंजीकरण को सक्षम करते हैं। यद्यपि मुख्य रूप से विकास ता्मक डेटा के लिए उपयोग किया जाता है, ऑर्गेनोइड्स को रोग मॉडलिंग की ओर तेजी से लागू किया गया है, विशेष रूप से सूजन, न्यूरोडीजेनेरेशन और उम्र बढ़ने के लिए मॉडल7। पिछले आईपीएससी अध्ययनों के आधार पर, ऑर्गेनोइड ऊतक जैसे नेटवर्क कनेक्शन8,9 के शारीरिक संदर्भ में रोग फेनोटाइप और सेलुलर फेनोटाइप को बनाए रखते हैं। हालांकि, कुछ आयामों के त्रि-आयामी ऊतक की खेती करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, खासकर विस्तारित अवधि के लिए।

यह काम सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करता है जो ऊतक को लंबे समय तक आकार में काफी हद तक परिपक्व होने की अनुमति देता है। सेरेब्रल ऑर्गेनॉइड निर्माण अपेक्षाकृत मानकीकृत रहा है, कई प्रमुख प्रोटोकॉल10,11 से तरीकों को अपनाते हुए। हालांकि, बेहतर भेदभाव और रखरखाव के लिए कई संशोधनों का सुझाव दिया गया है। इन वैकल्पिक तरीकों में तंत्रिका विभेदन को बढ़ाने के लिए न्यूरोजेनिक कारकों का उपयोग करना शामिल है12, सेलुलर दीर्घायु को बढ़ावा देने वाले बेहतर पोषक तत्व विनिमय के लिए अतिरिक्त मचान13, और लंबे समय तक संस्कृतिऔर विकास के लिए कम तनाव आंदोलन। न्यूरोडीजेनेरेटिव और उम्र बढ़ने के फेनोटाइप को व्यक्त करने में सक्षम परिपक्व ऑर्गेनोइड विकसित करने के लिए इन सुधारों को इस विधि में शामिल किया गया है।

Protocol

रोगी अध्ययन संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किए गए थे। सभी प्रतिभागियों ने अपने डेटा और जैव नमूनों को पुन: उपयोग करने की अनुमति देने के लिए लिखित सूचित सहमति और रिपॉजिटरी सहमति पर हस्ताक्षर किए। आईआरबी और संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करते हुए आईपीएससी लाइनें उत्पन्न की गई थीं। चित्रा 1 इस प्रोटोकॉल के वर्कफ़्लो का एक योजनाबद्ध अवलोकन दिखाता है।

1. आईपीएससी रीप्रोग्रामिंग और रखरखाव

  1. सोडियम साइट्रेट के साथ सेल तैयारी ट्यूबों (सीपीटी) में या ईडीटीए या हेपरिनाइज्ड ट्यूबों में विषय के रक्त के 8 एमएल (वृद्ध या रोग रोगी; 65 वर्ष और उससे अधिक उम्र) को इकट्ठा करें।
  2. कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए 1,800 x g पर सेंट्रीफ्यूज केवल परिधीय रक्त और बिना सीरम15 वाले पेलेट को इकट्ठा करने के लिए।
  3. आईपीएससी16 प्राप्त करने के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल (सामग्री की तालिका देखें) के अनुसार विशेष रीप्रोग्रामिंग वैक्टर का उपयोग करें।
  4. फीडर-मुक्त, लैक्टोज डिहाइड्रोजनेज एलिवेटिंग वायरस (एलडीईवी) मुक्त कम विकास कारक बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स में 5% सीओ 2 के साथ आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर आवश्यक 8 (ई 8) मीडिया ( सामग्री की तालिका देखें) में 6-वेल कल्चर प्लेटों को लेपितकिया गया।
  5. भीड़भाड़ या सहज भेदभाव से बचने के लिए 3-4 दिनों के लिए ई 8 मीडिया में आईपीएससी बनाए रखें।
  6. इम्यूनोफ्लोरोसेंट मार्करों (चरण 2) का उपयोग करके आईपीएससी लाइनों की प्लूरिपोटेंसी को मान्य करें और माइकोप्लाज्मा (चरण 3) के लिए परीक्षण करें।

2. प्लूरिपोटेंसी धुंधला होना

  1. समाधान और एंटीबॉडी के संरक्षण के लिए, विश्लेषण से 3-4 दिन पहले लेपित (चरण 1.4) 24-वेल कल्चर प्लेटों पर कोशिकाओं को बीज दें। माध्यम को पिपेट के साथ एस्पिरेट करें और आरटी पर 15-20 मिनट के लिए फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (1एक्स पीबीएस) में 4% फॉर्मलाडेहाइड के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
  2. कोशिकाओं को 1x PBS के साथ 3x धोएं और कम से कम 15 मिनट के लिए पीबीएस में 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) में 0.1% ट्राइटन-एक्स 100 के साथ परमेबिलाइज करें, लेकिन आरटी में 1 घंटे से अधिक नहीं।
  3. 3x को 1x PBS के साथ धोएं और RT पर 30 मिनट के लिए PBS में 5% BSA के साथ ब्लॉक करें।
  4. 1x PBS के साथ फिर से 3x धोएं और एंटीबॉडी Sox2 और Oct3/4 (1:100 कमजोर पड़ने; सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें, और न्यूक्लिक दाग DAPI को 1% बीएसए (1: 4,000 तनुकरण) में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर जोड़ें। प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें।
  5. 1x PBS के साथ 3x धोएं और कोशिकाओं को पीबीएस में छोड़ दें। 10-20x आवर्धन पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ छवि। सुनिश्चित करें कि प्लुरिपोटेंसी मार्कर सॉक्स 2 और अक्टूबर 3/4 कोशिकाओं17,18 के नाभिक में स्थानीयकृत हैं।

3. माइकोप्लाज्मा परीक्षण

नोट: विस्तृत परख निष्पादन और विश्लेषण चरणों के लिए डिटेक्शन किट के प्रोटोकॉल ( सामग्री की तालिका देखें) देखें। डिटेक्शन किट माइकोप्लाज्मा परीक्षण के लिए अभिकर्मक, सब्सट्रेट और परख बफर प्रदान करती है।

  1. कोशिकाओं या ताज़ा माध्यम को पास करने से पहले, सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 2-3 एमएल सेल कल्चर माध्यम एकत्र करें और आरटी में 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर किसी भी कोशिका या मलबे को गोली ≤ मार दें। एक पता लगाने योग्य संकेत सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 24 घंटे के लिए माध्यम के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  2. एक ताजा ट्यूब या सफेद दीवार वाली 96-वेल प्लेट के कुएं में 100 μL सेल सुपरनैटेंट जोड़ें (अपारदर्शी तल अनुशंसित, सामग्री की तालिका देखें)। परख बफर में अभिकर्मक और सब्सट्रेट का पुनर्गठन करें और आरटी में 15 मिनट के लिए समतुल्य करें।
  3. नमूने में अभिकर्मक का 100 μL जोड़ें और RT पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ल्यूमिनोमीटर (माप # 1) के साथ ल्यूमिनेसेंस को मापें।
  4. नमूने में सब्सट्रेट का 100 μL जोड़ें और RT पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ल्यूमिनेसेंस (माप # 2) को मापें।
  5. माप # 2 से # 1 के अनुपात से माइकोप्लाज्मा संदूषण का निर्धारण करें। परिणामों की व्याख्या के लिए किट के मैनुअल का संदर्भ लें।

4. माइक्रोफिलामेंट तैयारी

  1. पॉली (लैक्टिक-को-ग्लाइकोलिक एसिड) (पीएलजीए, सामग्री की तालिका देखें) माइक्रोफिलामेंट्स की तैयारी शुरू करें, जो सीवन स्ट्रैंड को स्केलपेल के कुंद छोर के साथ फैलाते हैं। 70% इथेनॉल के साथ फटे हुए फाइबर को हल्के से पकाएं।
  2. माइक्रोस्कोप के तहत और एक शासक का उपयोग करके, पीएलजीए फाइबर को 500 μm से 1 मिमी लंबे किस्में के टुकड़ों में काटना शुरू करें। कुल मिलाकर फाइबर के लगभग 25 मिमी काटें। फिलामेंट्स को 1 एमएल एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान के साथ 15 एमएल ट्यूब में रखें।
    1. हुड में, फाइबर समाधान को डीएमईएम / एफ -12 के 10 एमएल के साथ पतला करें (तालिका 1)। घोल को अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए भंवर।
      नोट: एक सेल संस्कृति में काम एक बाँझ वातावरण में हुड प्रवाह करता है।
  3. 96-वेल प्लेट के कुओं का निर्माण करने वाले तीन भ्रूणीय शरीर (ईबी) में फाइबर समाधान के 20 μL जोड़ें। ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी के तहत, फाइबर को प्रति अच्छी तरह से गिनती और औसत करें। प्रति कुएं औसतन 5-10 पीएलजीए माइक्रोफिलामेंट्स को पतला या केंद्रित करें। प्रत्येक को इस तरह से अच्छी तरह से तैयार करें।
  4. कुएं अब कोशिकाओं के साथ बीज ति होने के लिए तैयार हैं। प्लेट को कमरे के तापमान पर तब तक स्टोर करें जब तक कि आवश्यक न हो या अगले दिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।

5. भ्रूण शरीर (ईबी) गठन

नोट: सभी मीडिया और समाधानों को आरटी में गर्म किया जाना चाहिए।

  1. एक बार जब आईपीएससी 70% -80% कंफ्लुएंसी (चित्रा 2 ए) तक पहुंच जाते हैं, तो वे पारित होने और ईबी गठन के लिए उपयोग करने के लिए तैयार होते हैं। 10x-20x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं की जांच करें। सुनिश्चित करें कि कॉलोनियां सहज भेदभाव के न्यूनतम (<10%) क्षेत्रों को प्रदर्शित करती हैं।
  2. माध्यम को पिपेट के साथ एस्पिरेट करें और डीपीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार धो लें। सेल डिटेचमेंट समाधान के 500 μL या एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए) के 0.5 mM जोड़कर कॉलोनियों को अलग करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: एक सेल संस्कृति में काम एक बाँझ वातावरण में हुड प्रवाह करता है।
  3. प्रत्येक कुएं में 1 एमएल ताजा ई 8 मीडिया जोड़कर जारी कोशिकाओं को इकट्ठा करें और धीरे से पिपेट करें जब तक कि सभी कोशिकाएं अलग न हो जाएं।
  4. 1.5 एमएल सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 2.5 एमएल की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए ताजा ई 8 मीडिया का एक और 1 एमएल जोड़ें।
  5. आरटी पर 3 मिनट के लिए 290 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  6. एक पिपेट के साथ सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेटेड करें, सेल पेलेट को आवश्यक 6 (ई 6, सामग्री की तालिका देखें) मीडिया के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें, जिसे 50 μM रॉक अवरोधक के साथ पूरक किया गया है, और हेमोसाइटोमीटर19 का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  7. वांछित सीडिंग घनत्व के आधार पर 60,000-90,000 कोशिकाओं / एमएल का सेल निलंबन तैयार करें, ई 6 मीडिया में रॉक अवरोधक के 50 μM के साथ पूरक ( सामग्री की तालिका देखें)।
  8. 96-वेल यूएलए प्लेट (या तैयार अवतल प्लेट20) के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन का 150 μL जोड़ें। बीज 9,000-11,000 कोशिकाएं प्रति कुएं।
  9. आरटी में 1 मिनट के लिए 290 x g पर कोशिकाओं को बल-एकत्रित करने के लिए प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें। प्लेट को 5% CO2 के साथ आर्द्र वातावरण में 37 °C पर इनक्यूबेटर में रखें।

6. न्यूरोएपिथेलियल प्रेरण

  1. 24 घंटे के बाद, सावधानीपूर्वक एक पिपेट के साथ मीडिया के 120 μL को शांत करें। सुनिश्चित करें कि पिपेट टिप को कुएं में बहुत दूर तक कम करके ईबी को उत्तेजित न करें।
  2. XAV939 के 2 μM और SMAD इनहिबिटर के साथ पूरक E6 मीडिया (RT पर) के 150 μL जोड़ें: SB431542 के 10 μM और LDN 193189 के 500 nM प्रति अच्छी तरह से ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. ताजा तैयार ई 6 मीडिया के साथ माध्यम को दैनिक रूप से बदलें, जिसमें एक्सएवी 939 के 2 μM, SB431542 के 10 μM और LDN 193189 के 500 nM के साथ पूरक किया गया है।
    नोट: दिन 6 (DIV6) तक, ईबी का व्यास 550-600 μm होना चाहिए और आगे के भेदभाव के लिए तैयार होना चाहिए।

7. ऑर्गेनॉइड भेदभाव और परिपक्वता

नोट: सभी मीडिया को आरटी में गर्म करने की आवश्यकता है।

  1. लगभग DIV7 पर, जांचें कि क्या सभी ईबी 550-600 μm के व्यास तक पहुंच गए हैं और एक चिकनी और स्पष्ट किनारे प्रदर्शित करते हैं (चित्रा 2 बी); इस स्तर पर, वे एक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) में एम्बेडेड होने के लिए तैयार हैं।
    नोट: बाँझ वातावरण में काम करें।
  2. एक खाली पी 200 बॉक्स पर फिल्म शीट (लगभग 4 इंच लंबी) रखकर थर्मोप्लास्टिक सीलिंग फिल्म ( सामग्री की तालिका देखें) से डिंपल एम्बेडिंग शीट तैयार करें। 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब या 500 μL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग करके, 12 डिंपल बनाने के लिए धीरे से फिल्म शीट को छेद में दबाएं। फिल्म शीट को 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे करें और इसे कम से कम 30 मिनट के लिए यूवी लाइट चालू होने के साथ प्रवाह हुड के अंदर सूखने दें।
  3. बर्फ पर बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स (मैट्रिगेल, सामग्री की तालिका देखें) की पर्याप्त मात्रा को पिघलाएं और इसे प्रवाह हुड के अंदर रखें।
    नोट: प्रति ईबी, लगभग 30 μL अनडिल्यूटेड झिल्ली मैट्रिक्स की आवश्यकता होती है। झिल्ली मैट्रिक्स को हमेशा 4 डिग्री सेल्सियस से नीचे रखें ताकि इसे गेलिंग से बचाया जा सके। प्री-चिल्ड पिपेट युक्तियों की भी सिफारिश की जाती है क्योंकि वे पाइपिंग के दौरान मैट्रिक्स को टिप में पॉलीमराइजिंग से कम करते हैं, जिससे सामग्री का नुकसान कम हो जाता है।
  4. एक वाइड-बोर पी 200 टिप का उपयोग करके, प्रत्येक डिंपल में एक ईबी स्थानांतरित करें, और सामान्य पिपेट टिप के साथ जितना संभव हो उतना मीडिया हटा दें। ध्यान रखें कि ईबी को सूखने न दें। एक नियमित पी 200 टिप का उपयोग करके, प्रत्येक ऑर्गेनॉइड में ~ 30 μL अनडिल्यूटेड झिल्ली मैट्रिक्स जोड़ें, यह सुनिश्चित करते हुए कि ईबी बूंद के केंद्र में है।
  5. एक बार जब सभी ईबी मैट्रिक्स में एम्बेडेड हो जाते हैं, तो ईबी युक्त फिल्म शीट को बाँझ पेट्री डिश में रखें।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, बाँझ पानी से भरे एक छोटे पेट्री डिश को वाष्पीकरण को रोकने के लिए फिल्म शीट के बगल में बड़े पेट्री डिश में रखा जा सकता है।
    1. डिश को एक इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें और झिल्ली मैट्रिक्स को जमने देने के लिए लगभग 10 मिनट के लिए 5% सीओ2 के साथ आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. 12 एम्बेडेड ऑर्गेनोइड्स के प्रत्येक सेट के लिए, यूएलए 6-वेल प्लेट के एक कुएं में विटामिन ए (तालिका 1) के बिना बी 27 के साथ 5 एमएल भेदभाव मीडिया तैयार करें। एक इनक्यूबेटर में प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  7. एक बार इनक्यूबेशन समय समाप्त हो जाने के बाद, एम्बेडेड ईबी को फिल्म शीट लेकर और शीट के पीछे से डिंपल को बाहर धकेलकर यूएलए 6-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। यदि आवश्यक हो, तो कुएं से 1 एमएल लें और बूंदों को फिल्म से अलग करने में मदद करने के लिए इसे शीट पर रखें।
    नोट: एम्बेडिंग के 1 दिन बाद महत्वपूर्ण रूपात्मक परिवर्तन देखे जा सकते हैं; ईबी चिकनी किनारों से उभरी हुई प्रोट्रूशियंस बनाने वाली कलियों तक जाते हैं (चित्रा 2 सी)।
  8. 2 दिनों (DIV9) के बाद, आधा मीडिया परिवर्तन करें। इस प्रक्रिया में झिल्ली मैट्रिक्स बूंदों को एस्पिरेट या नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधान रहें।
  9. 2 और दिनों (DIV11) के बाद, एक पूर्ण मीडिया परिवर्तन करें, मीडिया को CHIR99021 के 3 μM के साथ पूरक करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  10. DIV14 में, ऑर्गेनॉइड आकार में क्रमिक वृद्धि के लिए विटामिन ए (तालिका 1) के साथ B27 के साथ मीडिया को विभेदन मीडिया में बदलें।
  11. DIV16 पर, एक इनक्यूबेटर के अंदर 90 आरपीएम पर कक्षीय शेकर पर वेल-प्लेट रखें। हर दो दिन में मीडिया बदलें।
  12. मीडिया में अतिरिक्त पोषक तत्वों के लिए हर 40 DIV, प्रत्येक 50 एमएल मीडिया के लिए झिल्ली मैट्रिक्स के 500 μL को पतला करें।

Representative Results

पीएलजीए फाइबर, डिंपल एम्बेडिंग और आंदोलन को एकीकृत करने से सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की एक मजबूत पीढ़ी होती है जो आईपीएससी-व्युत्पन्न संस्कृतियों को विस्तारित अवधि के लिए बनाए रखने में सक्षम बनाती है (चित्रा 1)।

Figure 1
चित्र 1: इस विधि के वर्कफ़्लो और टाइमलाइन का योजनाबद्ध चित्रण. कृपया इस आरेख का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रारंभिक तंत्रिका प्रेरण अवधि पहले प्रकाशित प्रक्रियाओं11 के बराबर है। भ्रूण यी निकाय (ईबी) सफेद या पारदर्शी किनारों के साथ गोलाकार समुच्चय (चित्रा 2 बी) के रूप में शुरू होते हैं। चूंकि ईबी को डीआईवी 7 में तंत्रिका प्रेरण मीडिया से तंत्रिका रखरखाव मीडिया में बदल दिया जाता है, प्रोट्रूशियंस और नवोदित परिपत्र ऊतक (चित्रा 2 सी) से 24 घंटे के भीतर उभरते हैं। इसके अलावा, जैसे-जैसे ऑर्गेनॉइड बढ़ता रहता है, पीएलजीए फाइबर का सतह क्षेत्र ऑर्गेनोइड को लम्बी होने में मदद करता है (चित्रा 2 डी)। परिपक्वता के दौरान, ऑर्गेनॉइड के किनारों को बरकरार रखने की आवश्यकता होती है, क्योंकि यह स्वस्थ कोशिकाओं और विकास का एक अच्छा संकेत है; अन्यथा, अतिरिक्त पोषक तत्व प्रदान किए जाने चाहिए13 (चित्रा 2 ई)। ऑर्गेनोइड्स के विकास को ऑर्गेनोइड संस्कृति के आंदोलन द्वारा और सुविधाजनक बनाया जाता है, क्योंकि यह पोषक तत्वों के साथ छिड़काव में सुधार करता है।

Figure 2
चित्रा 2: सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स का भेदभाव और परिपक्वता। (ए) 70% -80% कंफ्लुएंसी पर एक आईपीएससी संस्कृति की प्रतिनिधि छवि। (बी) भ्रूण निकाय (ईबी) उत्पन्न किए गए थे और न्यूरोएपिथेलियल गठन को डीआईवी 7 तक प्रेरित किया गया था। ईबी को तब झिल्ली मैट्रिक्स में एम्बेडेड किया गया था और आगे सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स की ओर विभेदित किया गया था। (ग) DIV10 पर ऑर्गेनोइड्स अलग-अलग उभरती संरचनाओं को प्रदर्शित करते हैं। ऑर्गेनोइड्स को (डी) डिंपल या (ई) सैंडविच एम्बेडिंग का उपयोग करके झिल्ली मैट्रिक्स में और परिपक्व किया जा सकता है, यहां डीआईवी 30 में दिखाया गया है। (एफ) दीर्घकालिक संस्कृति सेरेब्रल ऑर्गेनोइड्स को महत्वपूर्ण आकार (DIV70) तक बढ़ते हुए दिखाती है। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ऑर्गेनॉइड के आयाम और बाहरी आकृति विज्ञान ऑर्गेनोइड के अंदर एक जटिल वास्तुकला द्वारा पूरक हैं। विभेदन के पहले चरण के बाद DIV7 पर ऊतक को ठीक करने के बाद, EB की कोशिकाएं SOX2 को व्यक्त करती हैं, एक HMG बॉक्स प्रतिलेखन कारक जो मल्टीपोटेंट न्यूरल स्टेम सेल21 के लिए मार्कर के रूप में कार्य करता है, साथ ही युग्मित प्रोटीन बॉक्स पैक्स -6, तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं का संकेत देता है (चित्रा 3)। टीयूजे 1 (वर्ग III β-ट्यूबुलिन) 22 द्वारा चिह्नित अपरिपक्व न्यूरॉन्स को पहले से ही पूरे ऊतक में बिखरे हुए देखा जा सकता है।

इस स्तर पर, स्व-संगठन का एक उदाहरण जो ये ऑर्गेनोइड्स गुजरते हैं, स्पष्ट हो जाता है। रेडियल संरचनाओं का संगठन, जिसे रोसेट कहा जाता है, तंत्रिका ट्यूब के अनुरूप होता है, जिसमें रोसेट केंद्र21 में एसओएक्स 2 + कोशिकाएं होती हैं और पैक्स 6 रोसेट परिधि की ओर होती है। ये रोसेट न्यूरॉन्स को जन्म देते हैं क्योंकि वे बाहर चले जाते हैं। ये विकिरण कोशिकाएं शुरू में तंत्रिका स्टेम / पूर्वज सेल मार्कर नेस्टीन23 और ग्लियल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) के लिए डबल पॉजिटिव होती हैं, जो विवो मस्तिष्क के न्यूरोजेनिक क्षेत्रों में पाए जाने वाले रेडियल ग्लिया के समान होती हैं। जैसे-जैसे ये माइग्रेटिंग न्यूरॉन्स परिपक्व होते हैं, साइटोस्केलेटल मार्कर इस परिवर्तन कोदर्शाते हैं। प्रारंभिक चरण तंत्रिका भेदभाव मार्कर टीयूजे 122 रोसेट के आंतरिक सर्कल में दिखाई देता है और सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन 2 (एमएपी 2)24 में बदल जाता है, जो परिधि में एक न्यूरॉन-विशिष्ट परिपक्वता मार्कर है।

Figure 3
चित्रा 3: DIV7 में भ्रूण निकाय संरचनात्मक संगठन और अपरिपक्व लक्षण वर्णन दिखाते हैं। DIV7 पर एक ईबी की संपूर्ण माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि। (ए) ईबी की एक समग्र छवि प्रदर्शित करती है (बी) एसओएक्स 2 + तंत्रिका रोसेट, (सी) अपरिपक्व न्यूरॉन्स (टीयूजे 1) पूरे ईबी में बिखरे हुए, (डी) तंत्रिका पूर्वज कोशिकाएं (पैक्स 6), और (ई) डीएपीआई द्वारा कल्पना की गई नाभिक। स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

जैसे-जैसे ऑर्गेनोइड्स की उम्र बढ़ती है, विकासशील न्यूरॉन्स के संगठन और मार्कर शारीरिक स्थितियों की नकल करना शुरू कर देते हैं। DIV30 में, विकासशील मस्तिष्क के बराबर न्यूरोजेनिक क्षेत्रों को जन्म देने वाले कई रोसेट देखे जा सकतेहैं। DIV60 द्वारा, ये SOX2+ न्यूरोजेनिक क्षेत्र अस्तित्वहीन हैं और परिपक्व MAP2 और NeuN26, एक न्यूरॉन भेदभाव मार्कर, और सकारात्मक न्यूरॉन्स (चित्रा 4 और चित्रा 5) द्वारा प्रतिस्थापित किए जाते हैं।

Figure 4
चित्रा 4: DIV120 में ऑर्गेनोइड्स परिपक्व न्यूरोनल लक्षण वर्णन दिखाते हैं। "DIV 120 पर एक ऑर्गेनॉइड सेक्शन की इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि". (ए) अनुभाग की एक समग्र छवि (बी) एमएपी 2 (बैंगनी) और (सी) न्यून (हरा) के परिपक्व न्यूरोनल मार्कर दिखाती है। (घ) नाभिक की कल्पना DAPI द्वारा की गई थी। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: DIV120 ऑर्गेनोइड्स की डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर। डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर ग्राफ़ (ए) एमएपी 2 (ऊपर, नीला) और (बी) न्यून (नीचे, हरा) के पूर्ण अभिव्यक्ति मूल्य को दर्शाते हैं। कटी हुई पीली रेखाएं अलग-अलग आईपीएससी लाइनों (ए, बी, सी, आदि) को अलग करती हैं, और ऑर्गेनोइड्स को एक साथ बैच किया गया है। N = 5. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इन साइटोस्केलेटल मार्करों का उपयोग अन्य पोस्ट-माइटोटिक मार्करों (जैसे डबलकोर्टिन27 और सिनैप्सिन28) के साथ संयोजन के रूप में किया जा सकता है ताकि सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी और अन्य उम्र से संबंधित गिरावट (चित्रा 6), साथ ही एस्ट्रोसाइट्स और ग्लिया जैसे अतिरिक्त मस्तिष्क ऊतक (चित्रा 7) की जांच की जा सके।

Figure 6
चित्रा 6: सिनैप्टिक टर्मिनल विश्लेषण का उदाहरण। DIV 120 पर ऑर्गेनॉइड के एक खंड की इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि। (ए) (बी) एमएपी 2, (सी) डबलकॉर्टिन (डीसीएक्स), और (डी) सिनैप्सिन आई (सिन) के लिए सना हुआ अनुभाग की एक समग्र छवि। (ई) नाभिक की कल्पना DAPI द्वारा की गई थी। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: ग्लियल विकास के सबूत। DIV 120 पर ऑर्गेनॉइड के एक खंड की इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री छवि। (ए) (बी) आयनित कैल्शियम-बाइंडिंग एडाप्टर अणु 1 (आईबीए 1) और (सी) न्यूएन के लिए सना हुआ अनुभाग की एक समग्र छवि। (घ) नाभिक की कल्पना DAPI द्वारा की गई थी। स्केल पट्टी = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) अंतिम एकाग्रता आयतन (50 एमएल कुल)
DMEM-F12 50% 25 mL
न्यूरोबेसल माध्यम 50% 25 mL
N2 पूरक (100x) 1x 0.25 एमएल
बी 27 पूरक -/ + विटामिन ए (50x) 0.5x 0.5 mL
इन्सुलिन 0.25% 12.5 μL
ग्लूटामैक्स (100x) 1x 0.5 mL
MEM-NEAA (100x) 0.5x 0.25 एमएल
HEPES (1 M) 10 mM 0.5 mL
एंटीबायोटिक / एंटीमाइकोटिक (100x) 1x 0.5 mL
2-β-मर्काप्टोएथेनॉल 50 μM 17.5 μL
* नोट: कुछ डीएमईएम-एफ 12 में पहले से ही ग्लूटामैक्स शामिल है, अतिरिक्त जोड़ने की कोई आवश्यकता नहीं है।

तालिका 1: वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले भेदभाव मीडिया की संरचना।

Discussion

ईबी का मानकीकृत गठन प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के मस्तिष्क ऑर्गेनोइड्स में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रूपांतरण में एक महत्वपूर्ण कदम है। एकवचन ऊतकों में स्टेम कोशिकाओं का बल एकत्रीकरण अवतल कुओं की ज्यामिति, सीडिंग घनत्व और अच्छी तरह से उपचार के आधार पर भिन्न हो सकता है। यद्यपि वर्तमान विधि 6 दिनों के बाद 500-600 μm की व्यास सीमा का हवाला देती है, ये व्यास उचित ऑर्गेनोइड गठन के अन्य व्यास को बाहर नहीं करते हैं, क्योंकि कई अन्य व्यास सफल साबित हुए हैं। हालांकि, अलग-अलग व्यास को भेदभाव दर और सफलता को प्रभावित करने के लिए दिखाया गयाहै। प्रजनन क्षमता उद्देश्यों के लिए, 50 μm से नीचे व्यास भिन्नताएंअत्यधिक अनुशंसित हैं। इसके अतिरिक्त, तंत्रिका प्रेरण दिनों की संख्या को ईबी को व्यास में बढ़ने की अनुमति देने के लिए 6 से 10 दिनों तक बढ़ाया जा सकता है, क्योंकि एसएमएडी अवरोधकों का उपयोग केवल 5 दिनों के एक्सपोजर30 के बाद न्यूरोएपिथेलिया गठन का कुशलतापूर्वक उत्पादन और रखरखाव करने के लिए दिखाया गया है। एसएमएडी अवरोधकों की अनुपस्थिति में, तंत्रिका प्रेरण असंगत परिणाम दे सकता है, जिसके लिए लंबी प्रेरण अवधि की आवश्यकता होती है। इस काम में उद्धृत एसएमएडी अवरोधक सबसे प्रभावी हैं, लेकिन अन्य डोर्सोमॉर्फिन और टीजीएफ-β छोटे अणुओं का उपयोग उनकी प्रभावी एकाग्रता पर किया जा सकता है।

तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स विकास के लिए एक उत्कृष्ट सब्सट्रेट प्रदान करता है और इसे अलग तरह से प्रशासित किया जा सकता है। मैट्रिक्स के शुरुआती उपयोगों में बेसल झिल्ली को एक अच्छी तरह से कोटिंग 31 के रूप में शामिल कियागया था। हालांकि, ऊतक को एम्बेड करने के लिए मैट्रिक्स के उपयोग नेइन ऊतकों में भेदभाव और परिपक्वता में सुधार किया। ऑर्गेनोइड्स के लिए, मैट्रिक्स का उपयोग ऑर्गेनोइड्स में ईबी भेदभाव में सुधार करने, परिपक्वता को बढ़ावा देने और संस्कृति अवधि33 का विस्तार करने के लिए दिखाया गया है। जबकि ऑर्गेनोइड्स अभी भी मैट्रिक्स के बिना बनाए जा सकते हैं, क्योंकि कई समूहों ने मैट्रिक्स-मुक्त ऊतकसंस्कृति 34,35 को पूरा करने का प्रयास किया है, अध्ययनों में पाया गया है कि मैट्रिक्स-एम्बेडेड ऑर्गेनोइड्स में लंबे समय तक संस्कृति समय की अधिक संभावना होती है औरकम रखरखाव की आवश्यकता होती है। एम्बेडिंग की डिंपल विधि ऑर्गेनॉइड सतह का समान कवरेज प्रदान करती है, समान प्रसार, पोषक तत्वों तक पहुंच और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य भेदभाव सुनिश्चित करती है। वैकल्पिक रूप से, गुंबद एम्बेडिंग को ऑर्गेनोइड्स37 को पूरी तरह से समाहित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

झिल्ली मैट्रिक्स डिंपल में ईबी का हस्तांतरण एक महत्वपूर्ण कदम है। यद्यपि 1 एमएल पिपेट टिप में ईबी को स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त चौड़ा उद्घाटन होता है, स्थानांतरण में आसानी के लिए 200 μL टिप को प्राथमिकता दी जाती है। 200 μL युक्तियों को एक बड़ा पर्याप्त उद्घाटन बनाने के लिए काटने की आवश्यकता है, जिससे पाइपिंग करते समय कतरनी तनाव को कम करने के लिए एक चिकनी धार सुनिश्चित होती है। वैकल्पिक रूप से, स्थानांतरण में आसानी के लिए वाइड-बोर 200 μL युक्तियां मौजूद हैं। पाइपिंग को धीरे-धीरे करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि तेजी से पाइपिंग ऑर्गेनोइड परिधि को बाधित कर सकती है और उचित विकास में बाधा डाल सकती है। पोषक तत्व प्रदान करने के लिए पर्याप्त माध्यम हस्तांतरित किया जाता है, यह सुनिश्चित करने के लिए विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। बहुत कम माध्यम से ऑर्गेनोइड के सूखने का खतरा होता है, जिससे नेक्रोसिस होता है। ईबी को बहुत अधिक संस्कृति मीडिया के साथ स्थानांतरित करने से मैट्रिक्स बहुत पतला हो सकता है और ऑर्गेनॉइड को सुरक्षित रूप से समाहित करने में विफल हो सकता है। आदर्श रूप से, मैट्रिक्स को 50% से अधिक पतला नहीं किया जाना चाहिए ताकि इसके पोलीमराइजेशन को सुनिश्चित किया जा सके और ईबी के लिए ईसीएम के रूप में कार्य किया जा सके। यदि एम्बेडिंग असफल है, तो ईबी को पुनर्प्राप्त किया जा सकता है और फिर से समझाया जा सकता है। ताजा मैट्रिक्स में पुन: एनकैप्सुलेशन किसी भी बिंदु पर ऑर्गेनोइड को अतिरिक्त सहायता प्रदान करने के लिए किया जा सकता है।

मचान के लिए मैट्रिक्स एम्बेडिंग के समान, पीएलजीए फाइबर त्रि-आयामी विकास के लिए अतिरिक्त सहायता प्रदान करते हैं। मूल रूप से लम्बी ऑर्गेनोइड्स का उत्पादन करने और सतह क्षेत्र38 को बढ़ाने के लिए शामिल किया गया है, पीएलजीए फाइबर के समावेश को उत्तरोत्तर ऑर्गेनोइड भेदभाव और परिपक्वता में सुधार के लिए एक अतिरिक्त उपकरण के रूप में पहचाना गयाहै। जैसा कि अधिक प्रयोगशालाएं मैट्रिक्स के उपयोग को कम करने या इसे पूरी तरह से समाप्त करने की तलाश करती हैं, शामिल तंतुओं द्वारा समर्थित ऑर्गेनोइड्स के स्व-आयोजन गुण त्रि-आयामी ऊतक निर्माण और भेदभाव के लिए पर्याप्त मचान प्रदान करतेहैं। यहां, दीर्घकालिक संस्कृति38,39 की संभावना बढ़ाने के लिए दोनों तरीकों को जोड़ा गया था। प्रारंभिक एकत्रीकरण के दौरान तंतुओं का समावेश महत्वपूर्ण है, क्योंकि इन्हें बाद के चरण में पेश नहीं किया जा सकता है। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, यह जांचना कि कुछ फाइबर एकत्रित कोशिकाओं में से हैं, यह सुनिश्चित करेगा कि एक फाइबर ईबी में शामिल है। यदि सफल नहीं होता है, तो कुएं की एक कोमल आकांक्षा और पुन: सेंट्रीफ्यूजेशन को मिश्रण सुनिश्चित करना चाहिए।

ऑर्गेनॉइड रखरखाव में एक और महत्वपूर्ण कदम बेहतर मीडिया छिड़काव के लिए एक कक्षीय शेकर की शुरूआत है। ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल के शुरुआती पुनरावृत्तियों में, आंदोलन11 बनाने के लिए एक स्पिनिंग बायोरिएक्टर का उपयोग किया गया था। 90 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर मैट्रिक्स बूंद को नष्ट किए बिना या ऑर्गेनोइड आकृति विज्ञान को नुकसान पहुंचाए बिना पर्याप्त आंदोलन प्रदान करता है। कुछ समूह मैट्रिक्स पाड़ का उपयोग करने से बचते हैं लेकिन उपयुक्त वातावरण प्रदान करने के लिए शेकर आंदोलन को बनाएरखते हैं। सभी प्रोटोकॉल के साथ, कतरनी तनाव की मात्रा को कम करने के लिए शेकर के आधार पर रोटेशन की गति को समायोजित किया जाना चाहिए। यदि एक गुंबद एम्बेडिंग चुना गया था, तो कतरनी तनाव11,34 की मात्रा को कम करने के लिए एक झुका हुआ शेकर नियोजित किया जा सकता है।

एक साथ लिया गया, कई चयनित तकनीकों का एकीकरण आईपीएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड गठन की एक मजबूत विधि प्रदान करता है। ऑर्गेनोइड्स बनाने और बनाए रखने के कई तरीके हैं, लेकिन उनमें से कई प्रारंभिक भेदभाव प्रक्षेपवक्रों पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इस काम में, कई अलग-अलग तकनीकों को विस्तारित अवधि के लिए ऑर्गेनोइड्स को कल्चर करने के लिए जोड़ा गया था, भेदभाव चरण से आगे, और परिपक्वता अवधि में जहां उम्र बढ़ने वाले फेनोटाइप विकसित होना शुरू हो सकते हैं। इन तकनीकों को शामिल करने से संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए बहिर्जात जैविक कारकों की आवश्यकता के बिना लंबे समय तक परिपक्वता की अनुमति मिलती है, जो उम्र बढ़ने के आत्म-संगठन और प्राकृतिक प्रगति को बनाए रखता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नीदरलैंड ऑर्गन-ऑन-चिप पहल, नीदरलैंड सरकार के शिक्षा, संस्कृति और विज्ञान मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित एक एनडब्ल्यूओ गुरुत्वाकर्षण परियोजना (024.003.001) द्वारा समर्थित किया गया था। डी.सी.बी. डॉक्टरेट छात्रवृत्ति के रूप में कॉन्सेजो नेशनल डी सिएनसिया वाई टेक्नोलोजिया (CONACYT) की वित्तीय सहायता को धन्यवाद देता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-β-Mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 31350010
4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) Invitrogen D1306 1:4000
6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate  Greiner Bio-One 657185
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate Corning 3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Fisher Scientific 136101
Accutase Sigma-Aldrich 46964 cell detachment solution 
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco 15240062
B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) Gibco 17504044
B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) Gibco 12587010
BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes Thermo Fisher Scientific 02-685-125
Bovine Serum Albumin  Sigma-Aldrich A9418
Centrifuge Eppendorf 5810 R With plate holders
CHIR99021 Selleck Chemicals S2924
CytoTune Sendai Reprogramming Vector Thermo Fisher Scientific A1378001
ddPCR primers | human | MAPT Bio-Rad dHsaCPE192234
ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN)  Bio-Rad dHsaCPE5052108
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11320074
Doublecortin (DCX) Santa Cruz Biotechnology SC-8066 1:500
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190144 no calcium, no magnesium
Eppendorf cups, 1.5 mL  Eppendorf 0030 125.215
Essential 6 Gibco A1516401
Essential 8 Gibco A1517001
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)  Invitrogen 15575020
Falcon tubes, 15 mL, conical Greiner Bio-One 188271-N
Formaldehyde  Sigma-Aldrich 252549 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
GlutaMax (100x) Gibco 35050038
Hemacytometer cell counter Hausser scientific 1490
HEPES Buffer Thermo Fisher Scientific 15-630-080
Insulin Sigma-Aldrich I9278
LDN 193189 StemCell Technologies 72147
MAP2 Abcam ab32454 1:200
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free Corning 356230 basement membrane matrix
MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) Thermo Fisher Scientific 11140050
Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader Perkin Elmer  1420 luminometer
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit Lonza LT07-318
N-2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 17502-048
NeuN Millipore MAB377 1:500
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103049
Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 Santa Cruz Biotechnology sc-5279 AF647 1:100
Parafilm Bemis PM-996 thermoplastic film sheet
PAX6 Thermo Fisher Scientific 42-6600 1:200
Penicillin/Streptomycin Gibco 15070063
Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments Ethicon J463
QX200 Droplet digital PCR system Bio-Rad 1864001
ROCK inhibitor (Y27632) Selleck Chemicals S1049
SB431542  R&D Systems 1614/50
SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience Invitrogen 53-9811-80 1:100
Synapsin I (SYN) Calbiochem 574777 1:200
Triton-X 100  Sigma-Aldrich T8787
TUJ1 Santa Cruz Biotechnology sc-80005 Beta-3-tubulin; 1:500
XAV939 Tocris Bioscience 3748

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