Summary
Den nåværende protokollen gir en trinnvis prosedyre for reproduserbar generering, vedlikehold og aldring av cerebrale organoider avledet fra humaninduserte pluripotente stamceller (iPSCs). Denne metoden muliggjør dyrking og modning av cerebrale organoider i lengre perioder, noe som letter modelleringen av prosesser involvert i hjernens aldring og aldersrelatert patogenese.
Abstract
De tilgjengelige dyre- og cellulære modellene rekapitulerer ikke fullt ut kompleksiteten av endringer som finner sted i den aldrende menneskelige hjerne. En nylig utvikling av prosedyrer som beskriver genereringen av humane cerebrale organoider, avledet fra humane induserte pluripotente stamceller (iPSCs), har potensial til å fundamentalt transformere evnen til å modellere og forstå aldring av den menneskelige hjerne og relaterte patogene prosesser. Her presenteres en optimalisert protokoll for generering, vedlikehold, aldring og karakterisering av humane iPSC-avledede cerebrale organoider. Denne protokollen kan implementeres for å generere hjerneorganoider på en reproduserbar måte og fungerer som en trinnvis veiledning, som inneholder de nyeste teknikkene som resulterer i forbedret organoid modning og aldring i kultur. Spesifikke problemer knyttet til organoid modning, nekrose, variabilitet og batcheffekter blir adressert. Samlet sett vil disse teknologiske fremskrittene tillate modellering av hjernens aldring i organoider avledet fra en rekke unge og eldre menneskelige givere, samt personer som er rammet av aldersrelaterte hjernesykdommer, noe som gjør det mulig å identifisere fysiologiske og patogene mekanismer for menneskelig hjerne aldring.
Introduction
Aldringssykdomsmodeller har blitt stadig mer relevante ettersom menneskets forventede levealder fortsetter å stige. Store genomiske studier har avdekket eldre populasjoner med dysregulering av molekylære prosesser og genetiske endringer som påvirker livskvaliteten1. Aldringsprosessen er preget av et generelt tap av funksjonalitet av organismen, inkludert tap av kognitiv funksjon, økt risiko for neurodegenerative lidelser og en rekke kroniske sykdommer2.
Nåværende cellekulturteknikker representerer ikke hensiktsmessig aldringens multifaktorielle natur, da disse dysfunksjonene ikke kan replikeres riktig ved bruk av mutasjoner, toksiner eller infeksjoner3. Dyremodeller som utforsker aldringsprosessen er ofte forbundet med lange eksperimentelle tider og høye kostnader, men bringer også etiske hensyn med seg. Bruk av induserte pluripotente stamceller (iPSCs) fra pasienter kan belyse de molekylære mekanismene som ligger til grunn for sykdomsprogresjon ettersom iPSCs tillater naturlig utvikling av celler i modent vev3. iPSCs har blitt arbeidshesten til mange laboratorier som undersøker nevrodegenerative lidelser, da den cellulære omprogrammeringen av høstede celler ikke ser ut til å slette sykdommen eller aldringsavtrykkene til giverne4. Disse avtrykkene rekapitulerer cellulære fenotyper som har blitt demonstrert i modeller av mennesker og dyr, noe som gjør iPSCer egnet til å undersøke individuell cellulær forverring av det svært tette hjernevevet 5,6. IPSC-avledede organoider har blitt den fremste modellen for tredimensjonal dyrking av vev, noe som muliggjør mer komplekse celle-til-celle-interaksjoner og en forbedret utviklingsmessig rekapitulasjon. Selv om de primært brukes til utviklingsdata, har organoider i økende grad blitt brukt mot sykdomsmodellering, spesielt modeller for betennelse, nevrodegenerasjon og aldring7. Ved å bygge på tidligere iPSC-studier, beholder organoider sykdomsfenotyper og cellulære fenotyper innenfor den fysiologiske konteksten av vevslignende nettverksforbindelser 8,9. Imidlertid kan dyrking av tredimensjonalt vev av visse dimensjoner være utfordrende, spesielt i lengre perioder.
Dette arbeidet presenterer en detaljert metode for reproduserbar generering av cerebrale organoider som gjør at vevet kan modnes vesentlig i størrelse i lengre perioder. Cerebral organoid opprettelse har forblitt relativt standardisert, ved å ta i bruk metoder fra flere fremtredende protokoller10,11. Det er imidlertid foreslått flere modifikasjoner for forbedret differensiering og vedlikehold. Disse alternative metodene inkluderer bruk av nevrogene faktorer for å forbedre nevral differensiering 12, ekstra stillaser for forbedret næringsutveksling som fremmer cellulær levetid13 og lavren stressagitasjon for langvarig kultur og vekst14. Disse forbedringene har blitt innlemmet i denne metoden for å utvikle modne organoider som er i stand til å uttrykke nevrodegenerative og aldrende fenotyper.
Protocol
Pasientstudier ble godkjent av Institutional Review Board. Alle deltakerne signerte skriftlig informert samtykke og samtykke til depot for å tillate at deres data og bioprøver kan gjenbrukes. iPSC-linjer ble generert etter IRB og institusjonelle retningslinjer. Figur 1 illustrerer en skjematisk oversikt over arbeidsflyten til denne protokollen.
1. iPSC omprogrammering og vedlikehold
- Samle 8 ml av individets blod (alder eller sykdom pasient, alder 65 og eldre) i cellepreparasjon rør (CPT) med natriumsitrat eller inn i EDTA eller hepariniserte rør.
- Sentrifuge ved 1,800 x g i 30 minutter ved romtemperatur (RT) for å samle pellet som bare inneholder perifert blod og ikke serum15.
- Bruk spesialiserte omprogrammeringsvektorer i henhold til produsentens protokoll (se Materialfortegnelse) for å oppnå iPSCs16.
- Dyrknings-iPSCer i materfri, laktosedehydrogenaseforhøyende virus (LDEV)-fri matrise med redusert vekstfaktor kjellermembranbelagte 6-brønnskulturplater i essensielle 8 (E8) medier (se materialtabell) ved 37 °C i fuktet atmosfære med 5 % CO2.
- Oppretthold iPSCs i E8-medier i 3-4 dager for å unngå overbefolkning eller spontan differensiering.
- Valider pluripotensen til iPSC-linjene ved hjelp av immunfluorescerende markører (trinn 2) og test for mykoplasma (trinn 3).
2. Pluripotens farging
- For å bevare løsninger og antistoffer, frø cellene på belagte (trinn 1.4) 24-brønns kulturplater 3-4 dager før analyse. Aspirer mediet med en pipette og fikser cellene med 4% formaldehyd i fosfatbufret saltvann (1x PBS) i 15-20 minutter ved RT.
- Vask cellene 3x med 1x PBS og permeabiliser med 0,1% Triton-X 100 i 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i minst 15 minutter, men ikke mer enn 1 time ved RT.
- Vask 3x med 1x PBS og blokk med 5% BSA i PBS i 30 min ved RT.
- Vask igjen 3x med 1x PBS og tilsett antistoffene Sox2 og Oct3/4 (1:100 fortynning; se materialfortegnelse), og nukleinflekken DAPI i 1% BSA (1:4,000 fortynning) over natten ved 4 °C. Pakk inn i aluminiumsfolie for å beskytte mot lys.
- Vask 3x med 1x PBS og la cellene ligge i PBS. Bilde med fluorescensmikroskop ved 10-20x forstørrelse. Sørg for at pluripotensmarkørene Sox2 og Oct3/4 er lokalisert i cellekjernene17,18.
3. Mycoplasma testing
MERK: Se deteksjonssettets protokoll (se Materialfortegnelse) for detaljert analyseutførelse og analysetrinn. Deteksjonssettet gir reagenset, substratet og analysebufferen for mykoplasmatesting.
- Før du passerer celler eller forfriskende medium, samle 2-3 ml cellekulturmedium i et sentrifugerør og pellet eventuelle celler eller rusk ved 200 x g i 5 minutter ved RT. Oppbevar supernatanten ved 4 °C i ≤5 dager. Inkuber cellene med mediet i minst 24 timer for å sikre et detekterbart signal.
- Tilsett 100 μL cellesupernatant til et nytt rør eller brønn på en hvitvegget 96-brønnsplate (ugjennomsiktig bunn anbefales, se materialfortegnelse). Rekonstituer reagenset og substratet i analysebufferen og utjevn i 15 minutter ved RT.
- Tilsett 100 μL av reagenset til prøven og inkuber i 5 minutter ved RT. Mål luminescensen med et luminometer (måling #1).
- Tilsett 100 μL av substratet til prøven og inkuber i 10 minutter ved RT. Mål luminescensen (måling #2).
- Bestem mykoplasmaforurensningen ved forholdet mellom måling #2 og #1. Se bruksanvisningen for settet for tolkning av resultatene.
4. Forberedelse av mikrofilament
- Begynn fremstillingen av poly (melkesyre-co-glykolsyre) (PLGA, se materialtabell) mikrofilamenter ved å frynse suturstrengen med den stumpe enden av en skalpell. Sterilisere frynsete fiber lett med 70% etanol.
- Under mikroskopet og bruk en linjal, begynn å kutte PLGA-fiberen i fragmenter på 500 μm til 1 mm lange tråder. Skjær ca 25 mm av fiberen totalt. Hold filamentene i et 15 ml rør med en 1 ml antibiotika-antimykotisk løsning.
- Fortynn fiberoppløsningen med 10 ml DMEM/F-12 i hetten (tabell 1). Vortex godt for å blande løsningen.
MERK: Arbeid i en cellekulturflythette i et sterilt miljø.
- Fortynn fiberoppløsningen med 10 ml DMEM/F-12 i hetten (tabell 1). Vortex godt for å blande løsningen.
- Tilsett 20 μL av fiberløsningen til tre embryoide legemer (EB) som danner brønner på en 96-brønnplate. Under brightfield-mikroskopi, tell og gjennomsnitt fibrene per brønn. Fortynn eller konsentrer til gjennomsnittlig 5-10 PLGA mikrofilamenter per brønn. Forbered hver brønn på denne måten.
- Brønnene er nå klare til å bli sådd med celler. Oppbevar tallerkenen i romtemperatur til det er nødvendig eller ved 4 °C neste dag.
5. Dannelse av embryoid kropp (EB)
MERK: Alle medier og løsninger må varmes opp til RT.
- Når iPSCene har nådd 70%-80% konfluens (figur 2A), er de klare til å passeres og brukes til EB-dannelse. Sjekk cellene med et mikroskop ved 10x-20x forstørrelse. Sørg for at koloniene viser minimale (<10%) områder med spontan differensiering.
- Aspirer mediet med en pipette og vask cellene en gang med DPBS. Dissosiere koloniene ved å tilsette 500 μL celledetachmentløsning (se materialtabell) eller 0,5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og inkuber i 3-5 minutter ved 37 °C.
MERK: Arbeid i en cellekulturflythette i et sterilt miljø. - Samle de frigjorte cellene ved å tilsette 1 ml ferske E8-medier til hver brønn og pipette forsiktig til alle cellene er løsnet.
- Overfør 1,5 ml cellesuspensjon til et 15 ml rør, og tilsett ytterligere 1 ml ferske E8-medier for å nå et totalt volum på 2,5 ml.
- Sentrifuge ved 290 x g i 3 min ved RT.
- Aspirer supernatanten med en pipette, resuspender cellepelleten i 1 ml Essential 6 (E6, se materialtabellen) medier supplert med 50 μM ROCK-hemmer, og tell cellene ved hjelp av et hemocytometer19.
- Forbered en cellesuspensjon på 60 000-90 000 celler/ml, avhengig av ønsket såtetthet, i E6-medier supplert med 50 μM ROCK-hemmer (se materialtabell).
- Tilsett 150 μL av cellesuspensjonen i hver brønn i en 96-brønns ULA-plate (eller en forberedt konkav plate20). Frø 9.000-11.000 celler per brønn.
- Sentrifuger platen for å tvinge cellene ved 290 x g i 1 min ved RT. Plasser platen i inkubatoren ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 5% CO2.
6. Neuroepitelial induksjon
- Etter 24 timer, aspirer forsiktig 120 μL av mediet med en pipette. Pass på at du ikke aspirerer EB ved å senke pipettespissen for langt ned i brønnen.
- Tilsett 150 μL E6-medier (ved RT) supplert med 2 μM XAV939 og SMAD-hemmerne: 10 μM SB431542 og 500 nM LDN 193189 per brønn (se materialfortegnelse).
- Bytt medium daglig med nytilberedte E6-medier supplert med 2 μM XAV939, 10 μM SB431542 og 500 nM LDN-193189.
MERK: Ved dag 6 (DIV6) skal EB-ene ha en diameter på 550-600 μm og være klare for ytterligere differensiering.
7. Organoid differensiering og modning
MERK: Alle medier må varmes opp til RT.
- Ved omtrent DIV7 kontrollerer du om alle EB-ene har nådd en diameter på 550-600 μm og viser en jevn og klar kant (figur 2B); på dette stadiet er de klare til å bli innebygd i en ekstracellulær matrise (ECM).
MERK: Arbeid i et sterilt miljø. - Forbered fordypede innebyggingsplater fra den termoplastiske forseglingsfilmen (se materialfortegnelse) ved å plassere et filmark (ca. 4 i lang) på en tom P200-boks. Bruk et 15 ml konisk rør eller et 500 μL mikrosentrifugerør, trykk forsiktig ned filmarket i hullene for å lage 12 groper. Spray filmarket med 70 % etanol og la det tørke inne i strømningshetten med UV-lyset slått på i minst 30 minutter.
- Tine en tilstrekkelig mengde kjellermembranmatrise (Matrigel, se materialfortegnelse) på is og plasser den inne i strømningshetten.
MERK: Per EB er det nødvendig med ca. 30 μL ufortynnet membranmatriks. Hold alltid membranmatrisen under 4 °C for å unngå at den gelerer. Forkjølte pipettespisser anbefales også, da de bremser matriksen fra polymerisering i spissen under pipettering, og reduserer dermed materialtap. - Bruk en P200-spiss med bred boring, overfør en EB til hvert smilehull og fjern så mye media som mulig med en vanlig pipettespiss. Vær oppmerksom på at EB-ene ikke tørker. Bruk en vanlig P200-spiss, tilsett ~ 30 μL ufortynnet membranmatrise til hver organoid, slik at EB er i midten av dråpen.
- Når alle EB-ene er innebygd i matrisen, legger du filmarket som inneholder EB-ene i en steril petriskål.
MERK: Eventuelt kan en liten petriskål fylt med sterilt vann plasseres i den større petriskålen ved siden av filmarket for å forhindre fordampning.- Overfør parabolen til en inkubator og inkuber ved 37 °C i en fuktet atmosfære med 5% CO2 i ca. 10 minutter for å la membranmatrisen stivne.
- For hvert sett med 12 innebygde organoider, lag 5 ml differensieringsmedier med B27 uten vitamin A (tabell 1) i en brønn på en ULA 6-brønnsplate. Forvarm platen til 37 °C i en inkubator.
- Når inkubasjonstiden er ferdig, overfør de innebygde EB-ene til ULA 6-brønnsplaten ved å ta filmarket og skyve ut gropene fra baksiden av arket. Ta om nødvendig 1 ml fra brønnen og pipett den på arket for å hjelpe dråpene å løsne fra filmen.
MERK: Viktige morfologiske endringer kan sees 1 dag etter innebygging; EB går fra å ha glatte kanter til svulmende fremspring som danner knopper (figur 2C). - Etter 2 dager (DIV9), utfør en halvmedieendring. Vær forsiktig så du ikke aspirerer eller skader membranmatriksdråpene i prosessen.
- Etter ytterligere 2 dager (DIV11), utfør en full medieendring, supplere mediet med 3 μM CHIR99021 (se materialfortegnelse).
- Ved DIV14 bytter du mediet til differensieringsmedier med B27 med vitamin A (tabell 1) for en gradvis økning i organoidstørrelse.
- Ved DIV16 plasserer du brønnplaten på en orbital shaker ved 90 o / min inne i en inkubator. Bytt media hver 2.
- Hver 40 DIV, fortynn 500 μL av membranmatrisen for hver 50 ml media for ytterligere næringsstoffer i mediet.
Representative Results
Integrering av PLGA-fibre, innebygging av smilehull og agitasjon fører til en robust generering av cerebrale organoider som gjør det mulig å opprettholde iPSC-avledede kulturer i lengre perioder (figur 1).
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av arbeidsflyten og tidslinjen for denne metoden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Den initiale nevrale induksjonsperioden er sammenlignbar med tidligere publiserte prosedyrer11. Embryoidlegemene (EB) begynner som sirkulære aggregater (figur 2B) med hvite eller gjennomsiktige kanter. Når EB endres fra nevrale induksjonsmedier til nevrale vedlikeholdsmedier ved DIV7, oppstår fremspring og knopper innen 24 timer fra det sirkulære vevet (figur 2C). Videre, ettersom organoiden fortsetter å vokse, hjelper overflaten av PLGA-fiberen organoiden til å forlenge (figur 2D). Under modning må kantene på organoid forbli intakte, da det er et godt tegn på friske celler og utvikling; ellers må ytterligere næringsstoffer tilføres13 (figur 2E). Veksten av organoider blir ytterligere tilrettelagt ved omrøring av organoidkulturen, da dette forbedrer perfusjonen med næringsstoffer.
Figur 2 Differensiering og modning av cerebrale organoider. (A) Representativt bilde av en iPSC-kultur ved 70%-80% konfluens. (B) Embryoide legemer (EB) ble generert og nevroepiteldannelse ble indusert til DIV7. EB ble deretter innebygd i membranmatrisen og videre differensiert mot cerebrale organoider. (C) Organoider ved DIV10 som viser distinkte spirende formasjoner. Organoider kan modnes videre i membranmatrisen ved å bruke enten (D) smilehull eller (E) sandwichembedding, her vist på DIV30. (F) Langsiktig kultur viser cerebrale organoider som vokser til betydelige størrelser (DIV70). Skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Dimensjonene og den ytre morfologien til organoiden suppleres med en kompleks arkitektur inne i organoiden. Etter å ha fiksert vevet ved DIV7 etter det første differensieringstrinnet, uttrykker celler i EB SOX2, en HMG-bokstranskripsjonsfaktor som fungerer som markør for multipotente nevrale stamceller21, samt parret proteinboks Pax-6, som indikerer nevrale stamceller (figur 3). Umodne nevroner merket av TuJ1 (klasse III β-tubulin)22 kan allerede sees spredt over hele vevet.
På dette stadiet blir et eksempel på selvorganisasjonen som disse organoidene går gjennom, tydelig. Organiseringen av radiale strukturer, kalt rosetter, er analog med nevralrøret, med SOX2+-celler i rosettsenteret21 og PAX6 mot rosettperiferien. Disse rosettene gir opphav til nevroner når de migrerer ut. Disse utstrålende cellene er i utgangspunktet dobbelt positive for nevrale stam-/stamcellemarkøren Nestin23 og glialfibrillært surt protein (GFAP), tilsvarende den radiale glia som finnes i nevrogene områder i in vivo-hjernen . Når disse migrerende nevronene modnes, reflekterer cytoskjelettmarkørene denne endringen22. Den tidlige stadium nevrale differensieringsmarkøren TuJ1 22 er synlig i rosettens indre sirkel og skifter til mikrotubuli-assosiert protein 2 (MAP2 ) 24, en nevronspesifikk modningsmarkør i periferien.
Figur 3: Embryoide legemer ved DIV7 viser strukturell organisering og umoden karakterisering. Hele mount immunhistokjemi bilde av en EB på DIV7. (A) Et sammensatt bilde av EB som viser (B) SOX2+ nevrale rosetter, (C) umodne nevroner (TUJ1) spredt over EB, (D) nevrale stamceller (PAX6) og (E) kjerner visualisert av DAPI. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Etter hvert som organoidene blir eldre, begynner organisasjonen og markørene til de utviklende nevronene å replikere fysiologiske forhold. Ved DIV30 kan mange rosetter som gir opphav til nevrogene regioner tilsvarende den utviklende hjernen observeres25. Ved DIV60 er disse SOX2+ nevrogene regionene ikke-eksisterende og erstattes av modne MAP2 og NeuN26, en nevrondifferensieringsmarkør og positive nevroner (figur 4 og figur 5).
Figur 4: Organoider ved DIV120 viser moden nevronkarakterisering. Immunhistokjemi bilde av en organoid seksjon ved DIV 120. (A) Et sammensatt bilde av seksjonen som viser modne nevronmarkører av (B) MAP2 (lilla) og (C) NeuN (grønn). (D) Kjerner ble visualisert av DAPI. Skala bar = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Digital dråpe-PCR for DIV120-organoider. Digitale dråpe-PCR-grafer som viser den absolutte uttrykksverdien av (A) MAP2 (topp, blå) og (B) NeuN (nederst, grønn). Kuttede gule linjer skiller forskjellige iPSC-linjer (A, B, C, etc.), og organoider har blitt batchet sammen. N = 5. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Disse cytoskjelettmarkørene kan brukes sammen med andre postmitotiske markører (som dobbeltkortin27 og synapsin28) for å undersøke synaptisk plastisitet og andre aldersrelaterte fall (figur 6), samt ytterligere hjernevev som astrocytter og glia (figur 7).
Figur 6: Eksempel på synaptisk terminalanalyse. Immunhistokjemi bilde av en del av organoid ved DIV 120. (A) Et sammensatt bilde av seksjonen farget for (B) MAP2, (C) dobbeltkortin (DCX) og (D) synapsin I (SYN). (E) Kjerner ble visualisert av DAPI. Skala bar = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Tegn på gliautvikling. Immunhistokjemi bilde av en del av organoid ved DIV 120. (A) Et sammensatt bilde av seksjonen farget for (B) ionisert kalsiumbindende adaptermolekyl 1 (Iba1) og (C) NeuN. (D) Kjerner ble visualisert av DAPI. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagent | Endelig konsentrasjon | Volum (50 ml totalt) |
| DMEM-F12 | 50% | 25 ml |
| Nevrobasalt medium | 50% | 25 ml |
| N2-tillegg (100x) | 1x | 0,25 ml |
| B27 Supplement -/+ Vitamin A (50x) | 0,5 ganger | 0,5 ml |
| Insulin | 0.25% | 12,5 μL |
| GlutaMAX (100x) | 1x | 0,5 ml |
| MEM-NEAA (100x) | 0,5 ganger | 0,25 ml |
| HEPES (1 M) | 10 mM | 0,5 ml |
| Antibiotika/antimykotisk (100x) | 1x | 0,5 ml |
| 2-β-merkaptoetanol | 50 μM | 17,5 μL |
| * MERK: noen DMEM-F12 inneholder allerede GlutaMAX, ikke nødvendig å legge til ekstra. | ||
Tabell 1: Sammensetning av differensieringsmediene brukt i denne studien.
Discussion
Den standardiserte dannelsen av EB er et kritisk trinn i reproduserbar omdannelse av pluripotente stamceller til hjerneorganoider. Kraftaggregeringen av stamceller i singulært vev kan variere avhengig av geometrien til de konkave brønnene, såtetthet og brønnbehandling. Selv om den nåværende metoden angir et diameterområde på 500-600 μm etter 6 dager, utelukker disse diametrene ikke andre diametre med riktig organoiddannelse, da mange andre diametre har vist seg vellykket. Imidlertid har varierende diametre vist seg å påvirke differensieringsrater og suksess29. For reproduserbarhetsformål anbefales diametervariasjoner under 50 μm sterkt20. I tillegg kan antall nevrale induksjonsdager forlenges fra 6 til 10 dager for å tillate EBs å vokse i diameter, da bruk av SMAD-hemmere har vist seg å effektivt produsere og opprettholde nevroepiteldannelse etter bare 5 dagers eksponering30. I fravær av SMAD-hemmere kan nevral induksjon gi inkonsistente resultater, noe som krever lengre induksjonsperioder. SMAD-hemmere sitert i dette arbeidet er de mest effektive, men andre dorsomorfin og TGF-β små molekyler kan brukes ved effektiv konsentrasjon.
Kjellermembranmatrisen gir et utmerket substrat for vekst og kan administreres annerledes. Tidlig bruk av matrisen inkluderte basalmembranen som et brønnbelegg31. Imidlertid viste bruken av matrisen for innebygging av vev å forbedre differensiering og modning i disse vevene32. For organoider har bruken av matrisen vist seg å forbedre EB-differensiering til organoider, fremme modning og forlenge kulturperioder33. Mens organoider fortsatt kan dannes uten matrisen, da mange grupper har forsøkt å oppnå en matrisefri vevskultur 34,35, har studier funnet at matrise-innebygde organoider har større sjanse for langvarige kulturtider og krever mindre vedlikehold36. Dimple-metoden for innebygging gir lik dekning av organoidoverflaten, noe som sikrer lignende diffusjon, tilgang til næringsstoffer og reproduserbar differensiering. Alternativt kan kuppelinnebygging brukes til å kapsle inn organoidenefullt ut 37.
Overføringen av EB-ene til membranmatrisegropene er et kritisk trinn. Selv om en 1 ml pipettespiss har en bred nok åpning til å overføre EB-ene, foretrekkes en spiss på 200 μL for enkel overføring. De 200 μL-spissene må kuttes for å skape en stor nok åpning, noe som sikrer en jevn kant for å redusere skjærspenningen ved pipettering. Alternativt finnes det brede bore 200 μL spisser for enkel overføring. Pipettering må gjøres langsomt, da rask pipettering kan forstyrre organoidperiferien og hindre riktig vekst. Spesiell oppmerksomhet må tas for å sikre at tilstrekkelig medium overføres for å gi næringsstoffer. For lite medium risikerer å tørke ut organoidet og forårsake nekrose. Overføring av EB med for mye dyrkningsmedium kan føre til at matriksen blir for fortynnet og ikke klarer å kapsle inn organoiden sikkert. Ideelt sett må matriksen ikke fortynnes med mer enn 50% for å sikre polymerisasjon og funksjon som ECM for EB. Hvis innebyggingen mislykkes, kan EB gjenopprettes og kapsles inn på nytt. Re-innkapsling i den friske matrisen kan gjøres når som helst for å gi organoid ekstra støtte.
I likhet med matriseinnbygging for stillas, gir PLGA-fibre ekstra støtte for tredimensjonal vekst. Opprinnelig innlemmet for å produsere langstrakte organoider og øke overflatearealet38, har inkorporering av PLGA-fibre gradvis blitt identifisert som et ekstra verktøy for å forbedre organoid differensiering og modning39. Etter hvert som flere laboratorier ser ut til å redusere bruken av matrisen eller avskaffe den helt, gir de selvorganiserende egenskapene til organoider støttet av de inkorporerte fibrene nok stillas for tredimensjonal vevsopprettelse og differensiering39. Her ble begge metodene kombinert for å øke sjansene for langsiktig kultur38,39. Inkorporering av fibre under den første aggregeringen er kritisk, da disse kanskje ikke blir introdusert på et senere tidspunkt. Etter sentrifugering vil kontroll av at et par fibre er blant de aggregerte cellene sikre at en fiber er innlemmet i EB. Hvis det ikke lykkes, bør en mild aspirasjon av brønnen og re-sentrifugering sikre blanding.
Et annet kritisk skritt i organoid vedlikehold er innføringen av en orbital shaker for bedre media perfusjon. I tidlige iterasjoner av organoidprotokoller ble en spinnende bioreaktor brukt til å skape agitasjon11. En orbital shaker ved 90 o / min gir tilstrekkelig agitasjon uten å ødelegge matriksdråpen eller skade organoid morfologi. Noen grupper avstår fra å bruke matrisestillaset, men beholder shaker-agitasjonen for å gi et passende miljø34. Som med alle protokoller, må rotasjonshastigheten justeres avhengig av risteren for å redusere mengden skjærspenning. Hvis en kuppelinnebygging ble valgt, kunne en skråstilt rister brukes til å redusere mengden skjærspenning11,34.
Til sammen gir integreringen av flere utvalgte teknikker en robust metode for iPSC-avledet organoiddannelse. Det er flere måter å skape og vedlikeholde organoider på, men mange av dem fokuserer på tidlige differensieringsbaner. I dette arbeidet ble flere forskjellige teknikker kombinert for å dyrke organoider i lengre perioder, forbi differensieringsfasen, og inn i en modningsperiode hvor aldrende fenotyper kan begynne å utvikle seg. Innlemming av disse teknikkene muliggjør langvarig modning uten behov for eksogene biologiske faktorer for å opprettholde kulturen, beholde selvorganisasjonen og den naturlige utviklingen av aldring.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Netherlands Organ-on-Chip Initiative, et NWO Gravitation-prosjekt (024.003.001) finansiert av departementet for utdanning, kultur og vitenskap i regjeringen i Nederland. DCB anerkjenner heldigvis den økonomiske støtten fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) i form av et doktorgradsstipend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-β-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 1:4000 |
| 6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate | Greiner Bio-One | 657185 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Fisher Scientific | 136101 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | 46964 | cell detachment solution |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) | Gibco | 17504044 | |
| B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) | Gibco | 12587010 | |
| BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-685-125 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | With plate holders |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune Sendai Reprogramming Vector | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| ddPCR primers | human | MAPT | Bio-Rad | dHsaCPE192234 | |
| ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN) | Bio-Rad | dHsaCPE5052108 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Doublecortin (DCX) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8066 | 1:500 |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | no calcium, no magnesium |
| Eppendorf cups, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| Essential 6 | Gibco | A1516401 | |
| Essential 8 | Gibco | A1517001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | |
| Falcon tubes, 15 mL, conical | Greiner Bio-One | 188271-N | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| GlutaMax (100x) | Gibco | 35050038 | |
| Hemacytometer cell counter | Hausser scientific | 1490 | |
| HEPES Buffer | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LDN 193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| MAP2 | Abcam | ab32454 | 1:200 |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356230 | basement membrane matrix |
| MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader | Perkin Elmer | 1420 | luminometer |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NeuN | Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 AF647 | 1:100 |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | thermoplastic film sheet |
| PAX6 | Thermo Fisher Scientific | 42-6600 | 1:200 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments | Ethicon | J463 | |
| QX200 Droplet digital PCR system | Bio-Rad | 1864001 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Selleck Chemicals | S1049 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614/50 | |
| SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience | Invitrogen | 53-9811-80 | 1:100 |
| Synapsin I (SYN) | Calbiochem | 574777 | 1:200 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TUJ1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-80005 | Beta-3-tubulin; 1:500 |
| XAV939 | Tocris Bioscience | 3748 |
References
- Liu, G. H., et al. Aging Atlas: a multi-omics database for aging biology. Nucleic Acids Research. 49, 825-830 (2021).
- Ferrucci, L., et al. Measuring biological aging in humans: A quest. Cell. 19 (2), 13080 (2020).
- Mertens, J., Reid, D., Lau, S., Kim, Y., Gage, F. H. Aging in a dish: iPSC-derived and directly induced neurons for studying brain aging and age-related neurodegenerative diseases. Annu Rev Genet. 52, 271-293 (2018).
- Mertens, J., et al. Age-dependent instability of mature neuronal fate in induced neurons from Alzheimer's patients. Cell Stem Cell. 28 (9), 1533-1548 (2021).
- Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer's disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1141-1154 (2018).
- Fang, E. F., et al. Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 22 (3), 401-412 (2019).
- Hu, J. L., Todhunter, M. E., LaBarge, M. A., Gartner, Z. J. Opportunities for organoids as new models of aging. Journal of Cell Biology. 217 (1), 39-50 (2018).
- Choi, S. H., et al. A three-dimensional human neural cell culture model of Alzheimer's disease. Nature. 515 (7526), 274-278 (2014).
- Gonzalez, C., et al. Modeling amyloid beta and tau pathology in human cerebral organoids. Molecular Psychiatry. 23 (12), 2363-2374 (2018).
- Yoon, S. -J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Muratore, C. R., Srikanth, P., Callahan, D. G., Young-Pearse, T. L. Comparison and optimization of hiPSC forebrain cortical differentiation protocols. PLoS ONE. 9 (8), 105807 (2014).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2020).
- Goto-Silva, L., et al. Computational fluid dynamic analysis of physical forces playing a role in brain organoid cultures in two different multiplex platforms. BMC Developmental Biology. 19 (1), 1-10 (2019).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. Journal of Visualized Experiments. (68), e4327 (2012).
- Beers, J., et al. A cost-effective and efficient reprogramming platform for large-scale production of integration-free human induced pluripotent stem cells in chemically defined culture. Scientific Reports. 5 (1), 1-9 (2015).
- Wakao, S., et al. Morphologic and gene expression criteria for identifying human induced pluripotent stem cells. PLoS ONE. 7 (12), e48677 (2012).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
- Choy Buentello, D., Koch, L. S., Trujillo-De Santiago, G., Alvarez, M. M., Broersen, K. Use of standard U-bottom and V-bottom well plates to generate neuroepithelial embryoid bodies. PLOS ONE. 17 (5), 0262062 (2022).
- Ellis, P., et al. SOX2, a persistent marker for multipotential neural stem cells derived from embryonic stem cells, the embryo or the adult. Developmental Neuroscience. 26 (2-4), 148-165 (2004).
- Lee, S., et al. TuJ1 (class III β-tubulin) expression suggests dynamic redistribution of follicular dendritic cells in lymphoid tissue. European Journal of Cell Biology. 84 (2-3), 453-459 (2005).
- Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
- Soltani, M. H., et al. Microtubule-associated protein 2, a marker of neuronal differentiation, induces mitotic defects, inhibits growth of melanoma cells, and predicts metastatic potential of cutaneous melanoma. The American Journal of Pathology. 166 (6), 1841-1850 (2005).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2 (1), 67-77 (2006).
- Gusel'nikova, V. V., Korzhevskiy, D. E. NeuN as a neuronal nuclear antigen and neuron differentiation marker. Acta Naturae. 7 (25), 42-47 (2015).
- Rao, M. S., Hattiangady, B., Shetty, A. K. The window and mechanisms of major age-related decline in the production of new neurons within the dentate gyrus of the hippocampus. Aging Cell. 5 (6), 545-558 (2006).
- Meng, L., et al. A synapsin I cleavage fragment contributes to synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Aging Cell. 21 (5), 13619 (2022).
- Moon, S. H., et al. Optimizing human embryonic stem cells differentiation efficiency by screening size-tunable homogenous embryoid bodies. Biomaterials. 35 (23), 5987-5997 (2014).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Lee, S. -W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19 (3), 175-180 (2015).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Hocevar, S. E., Liu, L., Duncan, R. K. Matrigel is required for efficient differentiation of isolated, stem cell-derived otic vesicles into inner ear organoids. Stem Cell Research. 53, 102295 (2021).
- Birey, F., et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).
- Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Communications Biology. 4 (1), 1-15 (2021).
- Kaiser, A., Kale, A., Novozhilova, E., Olivius, P. The effects of Matrigel® on the survival and differentiation of a human neural progenitor dissociated sphere culture. The Anatomical Record. 303 (3), 441-450 (2020).
- Kakni, P., et al. Intestinal organoid culture in polymer film-based microwell arrays. Advanced Biosystems. 4 (10), 2000126 (2020).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
- Tejchman, A., Znój, A., Chlebanowska, P., Frączek-Szczypta, A., Majka, M. Carbon fibers as a new type of scaffold for midbrain organoid development. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 5959 (2020).
