Summary
Detta protokoll tillhandahåller en steg-för-steg-procedur för reproducerbar generering, underhåll och åldrande av cerebrala organoider härrörande från humaninducerade pluripotenta stamceller (iPSC). Denna metod möjliggör odling och mognad av cerebrala organoider under längre perioder, vilket underlättar modelleringen av processer som är involverade i hjärnans åldrande och åldersrelaterad patogenes.
Abstract
De för närvarande tillgängliga djur- och cellmodellerna rekapitulerar inte helt komplexiteten hos förändringar som sker i den åldrande mänskliga hjärnan. En ny utveckling av procedurer som beskriver genereringen av humana cerebrala organoider, härledda från humant inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs), har potential att fundamentalt förändra förmågan att modellera och förstå åldrandet av den mänskliga hjärnan och relaterade patogena processer. Här presenteras ett optimerat protokoll för att generera, underhålla, åldra och karakterisera humana iPSC-härledda cerebrala organoider. Detta protokoll kan implementeras för att generera hjärnorganoider på ett reproducerbart sätt och fungerar som en steg-för-steg-guide, som innehåller de senaste teknikerna som resulterar i förbättrad organoidmognad och åldrande i kulturen. Specifika frågor relaterade till organoid mognad, nekros, variabilitet och batcheffekter behandlas. Sammantaget kommer dessa tekniska framsteg att möjliggöra modellering av hjärnans åldrande i organoider härrörande från en mängd unga och åldrade mänskliga givare, liksom individer som lider av åldersrelaterade hjärnsjukdomar, vilket möjliggör identifiering av fysiologiska och patogena mekanismer för mänsklig hjärnåldring.
Introduction
Åldrande sjukdomsmodeller har blivit alltmer relevanta eftersom människans livslängd fortsätter att öka. Storskaliga genomiska studier har avslöjat åldrade populationer med dysreglering av molekylära processer och genetiska förändringar som påverkar livskvaliteten1. Åldringsprocessen kännetecknas av en allmän förlust av organismens funktionalitet, inklusive förlust av kognitiv funktion, ökad risk för neurodegenerativa störningar och en mängd kroniska sjukdomar2.
Nuvarande cellodlingstekniker representerar inte på lämpligt sätt åldrandets multifaktoriella natur, eftersom dessa dysfunktioner inte kan replikeras korrekt genom att använda mutationer, toxiner eller infektioner3. Djurmodeller som utforskar åldrandeprocessen är ofta förknippade med långa försökstider och höga kostnader, men tar också etiska överväganden med sig. Användning av inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) från patienter kan belysa de molekylära mekanismer som ligger till grund för sjukdomsprogression eftersom iPSC möjliggör den naturliga utvecklingen av celler till mogen vävnad3. iPSC har blivit arbetshästen i många laboratorier som undersöker neurodegenerativa störningar, eftersom cellulär omprogrammering av skördade celler inte verkar radera givarnas sjukdom eller åldrande avtryck4. Dessa avtryck rekapitulerar cellulära fenotyper som har visats i human- och djurmodeller, vilket gör iPSC lämpliga för att undersöka individuell cellulär försämring av den mycket täta hjärnvävnaden 5,6. IPSC-härledda organoider har blivit den främsta modellen för tredimensionell odling av vävnad, vilket möjliggör mer komplexa cell-till-cell-interaktioner och en förbättrad utvecklingsrekapitulation. Även om de främst används för utvecklingsdata har organoider i allt högre grad tillämpats mot sjukdomsmodellering, särskilt modeller för inflammation, neurodegeneration och åldrande7. Baserat på tidigare iPSC-studier behåller organoider sjukdomsfenotyper och cellulära fenotyper inom det fysiologiska sammanhanget av vävnadsliknande nätverksanslutningar 8,9. Att odla tredimensionell vävnad av vissa dimensioner kan dock vara utmanande, särskilt under längre perioder.
Detta arbete presenterar en detaljerad metod för reproducerbar generering av cerebrala organoider som gör att vävnaden kan mogna väsentligt i storlek under längre perioder. Cerebral organoidskapande har förblivit relativt standardiserad och antagit metoder från flera framstående protokoll10,11. Flera modifieringar har dock föreslagits för förbättrad differentiering och underhåll. Dessa alternativa metoder inkluderar användning av neurogena faktorer för att förbättra neural differentiering12, ytterligare byggnadsställningar för förbättrat näringsutbyte som främjar cellulär livslängd13 och låg ren stressagitation för långvarig kultur och tillväxt14. Dessa förbättringar har införlivats i denna metod för att utveckla mogna organoider som kan uttrycka neurodegenerativa och åldrande fenotyper.
Protocol
Patientstudier godkändes av Institutional Review Board. Alla deltagare undertecknade skriftligt informerat samtycke och samtycke till förvaret för att tillåta att deras data och biospecimen återanvänds. iPSC-linjer genererades enligt IRB och institutionella riktlinjer. Figur 1 illustrerar en schematisk översikt över arbetsflödet för detta protokoll.
1. Omprogrammering och underhåll av iPSC
- Samla 8 ml av patientens blod (åldrad eller sjukdomspatient, 65 år och äldre) i cellberedningsrör (CPT) med natriumcitrat eller i EDTA eller hepariniserade rör.
- Centrifugera vid 1 800 x g i 30 minuter vid rumstemperatur (RT) för att samla upp pelleten som endast innehåller perifert blod och inget serum15.
- Använd specialiserade omprogrammeringsvektorer enligt tillverkarens protokoll (se materialförteckning) för att erhålla iPSC16.
- Odla iPSC i matarfria, laktosdehydrogenashöjande virus (LDEV)-fria basalmembranmatriser med reducerad tillväxtfaktor belagda 6-brunnsodlingsplattor i essentiella 8 (E8) medier (se materialtabell) vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 5% CO2.
- Underhåll iPSC i E8-media i 3-4 dagar för att undvika överbeläggning eller spontan differentiering.
- Validera pluripotensen hos iPSC-linjerna med immunofluorescerande markörer (steg 2) och testa för mykoplasma (steg 3).
2. Färgning av pluripotens
- För att bevara lösningar och antikroppar, frö cellerna på belagda (steg 1.4) 24-brunns odlingsplattor 3-4 dagar före analys. Aspirera mediet med en pipett och fixera cellerna med 4% formaldehyd i fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS) i 15-20 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta cellerna 3x med 1x PBS och permeabilisera med 0,1% Triton-X 100 i 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS i minst 15 minuter, men inte mer än 1 timme vid RT.
- Tvätta 3x med 1x PBS och blockera med 5% BSA i PBS i 30 minuter vid RT.
- Tvätta igen 3x med 1x PBS och tillsätt antikropparna Sox2 och Oct3/4 (1:100 spädning; se materialtabell) och nukleinfläcken DAPI i 1% BSA (1:4 000 spädning) över natten vid 4 °C. Slå in i aluminiumfolie för att skydda mot ljus.
- Tvätta 3x med 1x PBS och lämna cellerna i PBS. Bild med ett fluorescensmikroskop med 10-20x förstoring. Se till att pluripotensmarkörerna Sox2 och Oct3/4 är lokaliserade i kärnorna i cellerna17,18.
3. Mykoplasma testning
Se detektionssatsens protokoll (se Materialförteckning) för detaljerade analysexekverings- och analyssteg. Detektionssatsen tillhandahåller reagenset, substratet och analysbufferten för mykoplasmatestning.
- Innan celler eller uppfriskande medium passeras, samla 2-3 ml cellodlingsmedium i ett centrifugrör och pellet eventuella celler eller skräp vid 200 x g i 5 minuter vid RT. Förvara supernatanten vid 4 °C i ≤5 dagar. Inkubera cellerna med mediet i minst 24 timmar för att säkerställa en detekterbar signal.
- Tillsätt 100 μL cellsupernatant till ett nytt rör eller brunn på en vitväggig 96-brunnsplatta (ogenomskinlig botten rekommenderas, se materialtabell). Bered reagenset och substratet i analysbufferten och balansera i 15 min vid rumstemperatur.
- Tillsätt 100 μl av reagenset till provet och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur. Mät luminiscensen med en luminometer (mått #1).
- Tillsätt 100 μl av substratet till provet och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur. Mät luminiscensen (mätning #2).
- Bestäm mykoplasmakontamineringen med förhållandet mellan mätning #2 och #1. Se satsens manual för tolkning av resultaten.
4. Beredning av mikrofilament
- Börja beredningen av poly (mjölksyra-co-glykolsyra) (PLGA, se Materialförteckning) mikrofilament genom att fransa sutursträngen med den trubbiga änden av en skalpell. Spay den slitna fibern lätt med 70% etanol.
- Under mikroskopet och med hjälp av en linjal börjar du skära PLGA-fibern i fragment av 500 μm till 1 mm långa trådar. Skär ca 25 mm av fibern totalt. Förvara filamenten i ett 15 ml rör med en 1 ml antibiotika-antimykotisk lösning.
- Späd fiberlösningen i huven med 10 ml DMEM/F-12 (tabell 1). Vortex väl för att blanda lösningen.
OBS: Arbeta i en cellodlingsflödeshuv i en steril miljö.
- Späd fiberlösningen i huven med 10 ml DMEM/F-12 (tabell 1). Vortex väl för att blanda lösningen.
- Tillsätt 20 μL av fiberlösningen till tre embryoidkroppar (EB) som bildar brunnar på en 96-brunnsplatta. Under brightfieldmikroskopi, räkna och genomsnittliga fibrerna per brunn. Späd eller koncentrera till i genomsnitt 5-10 PLGA-mikrofilament per brunn. Förbered var och en väl på detta sätt.
- Brunnarna är nu redo att sås med celler. Förvara plattan i rumstemperatur tills den behövs eller vid 4 °C följande dag.
5. Embryoid Body (EB) bildning
OBS: Alla medier och lösningar måste värmas till RT.
- När iPSC har nått 70% -80% sammanflöde (figur 2A) är de redo att passeras och användas för EB-bildning. Kontrollera cellerna med ett mikroskop vid 10x-20x förstoring. Se till att kolonierna uppvisar minimala (<10%) områden med spontan differentiering.
- Aspirera mediet med en pipett och tvätta cellerna en gång med DPBS. Dissociera kolonierna genom att tillsätta 500 μL cellavskiljningslösning (se materialtabell) eller 0,5 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och inkubera i 3-5 minuter vid 37 °C.
OBS: Arbeta i en cellodlingsflödeshuv i en steril miljö. - Samla upp de frigjorda cellerna genom att tillsätta 1 ml färskt E8-medium till varje brunn och pipettera försiktigt tills alla celler lossnar.
- Överför 1,5 ml cellsuspension till ett 15 ml rör och tillsätt ytterligare 1 ml färskt E8-medium för att nå en total volym på 2,5 ml.
- Centrifugera vid 290 x g i 3 min vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten med en pipett, suspendera cellpelleten i 1 ml essentiellt 6-medium (E6, se materialtabell) kompletterat med 50 μM ROCK-hämmare och räkna cellerna med en hemocytometer19.
- Bered en cellsuspension av 60 000-90 000 celler/ml, beroende på önskad sådddensitet, i E6-substrat kompletterat med 50 μM ROCK-hämmare (se Materialförteckning).
- Tillsätt 150 μL av cellsuspensionen i varje brunn på en 96-brunns ULA-platta (eller en beredd konkav platta20). Frö 9 000-11 000 celler per brunn.
- Centrifugera plattan för att tvinga samman cellerna vid 290 x g i 1 min vid rumstemperatur. Placera plattan i inkubatorn vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 5%CO2.
6. Neuroepitelial induktion
- Efter 24 timmar aspirerar du försiktigt 120 μL av mediet med en pipett. Se till att inte aspirera EB genom att sänka pipettspetsen för långt ner i brunnen.
- Tillsätt 150 μL E6-media (vid RT) kompletterat med 2 μM XAV939 och SMAD-hämmarna: 10 μM SB431542 och 500 nM LDN 193189 per brunn (se materialtabell).
- Byt medium dagligen med nyberedda E6-medier kompletterat med 2 μM XAV939, 10 μM SB431542 och 500 nM LDN-193189.
OBS: Vid dag 6 (DIV6) bör EB: erna ha en diameter på 550-600 μm och vara redo för ytterligare differentiering.
7. Organoid differentiering och mognad
OBS: Alla medier måste värmas till RT.
- Vid ungefär DIV7, kontrollera om alla EB har nått en diameter på 550-600 μm och visa en jämn och tydlig kant (figur 2B). i detta skede är de redo att bäddas in i en extracellulär matris (ECM).
OBS: Arbeta i en steril miljö. - Förbered gropiga inbäddningsark från den termoplastiska tätningsfilmen (se materialförteckning) genom att placera ett filmark (cirka 4 tum långt) på en tom P200-låda. Använd ett 15 ml koniskt rör eller ett 500 μL mikrocentrifugrör och tryck försiktigt ner filmade arket i hålen för att göra 12 gropar. Spraya filmduken med 70% etanol och låt den torka inuti flödeshuven med UV-ljuset påslaget i minst 30 minuter.
- Tina en tillräcklig mängd basalmembranmatris (Matrigel, se materialförteckning) på is och placera den inuti flödeshuven.
OBS: Per EB behövs cirka 30 μL outspädd membranmatris. Håll alltid membranmatrisen under 4 °C för att förhindra att den gelar. Förkylda pipettspetsar rekommenderas också eftersom de bromsar matrisen från polymerisering i spetsen under pipettering, vilket minskar materialförlusten. - Använd en P200-spets med bred borrning, överför en EB till varje grop och ta bort så mycket media som möjligt med en vanlig pipettspets. Tänk på att inte låta EB: erna torka. Använd en vanlig P200-spets, tillsätt ~ 30 μL outspädd membranmatris till varje organoid, så att EB är i mitten av droppen.
- När alla EB är inbäddade i matrisen, placera filmarket som innehåller EB: erna i en steril petriskål.
OBS: Eventuellt kan en liten petriskål fylld med sterilt vatten placeras i den större petriskålen bredvid filmarket för att förhindra avdunstning.- Överför skålen till en inkubator och inkubera vid 37 °C i en fuktad atmosfär med 5 %CO2 i cirka 10 minuter så att membranmatrisen stelnar.
- För varje uppsättning av 12 inbäddade organoider, förbered 5 ml differentieringsmedia med B27 utan vitamin A (tabell 1) i en brunn på en ULA 6-brunnsplatta. Förvärm plattan till 37 °C i en inkubator.
- När inkubationstiden är klar, överför de inbäddade EB: erna till ULA 6-brunnsplattan genom att ta filmarket och trycka ut groparna från baksidan av arket. Ta vid behov 1 ml från brunnen och pipettera den på arket för att hjälpa dropparna att lossna från filmen.
OBS: Viktiga morfologiska förändringar kan ses 1 dag efter inbäddning; EB går från att ha släta kanter till utbuktande utsprång som bildar knoppar (figur 2C). - Efter 2 dagar (DIV9) utför du en halv medieändring. Var försiktig så att du inte aspirerar eller skadar membranmatrisdropparna i processen.
- Efter ytterligare 2 dagar (DIV11), utför en fullständig mediebyte och komplettera mediet med 3 μM CHIR99021 (se materialtabell).
- Vid DIV14, byt media till differentieringsmedia med B27 med vitamin A (tabell 1) för en gradvis ökning av organoidstorleken.
- Vid DIV16, placera brunnplattan på en orbitalskakare vid 90 rpm inuti en inkubator. Byt media var 2: e dag.
- Var 40:e DIV, späd 500 μL av membranmatrisen för varje 50 ml medium för ytterligare näringsämnen i mediet.
Representative Results
Integrering av PLGA-fibrer, dimple-inbäddning och agitation leder till en robust generation av cerebrala organoider som gör att iPSC-härledda kulturer kan bibehållas under längre perioder (figur 1).
Figur 1: Schematisk illustration av arbetsflödet och tidslinjen för den här metoden. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Den initiala neurala induktionsperioden är jämförbar med tidigare publicerade procedurer11. Embryoidkropparna (EB) börjar som cirkulära aggregat (figur 2B) med vita eller transparenta kanter. När EB ändras från neurala induktionsmedier till neurala underhållsmedier vid DIV7 uppstår utsprång och spirande inom 24 timmar från den cirkulära vävnaden (figur 2C). Dessutom, när organoiden fortsätter att växa, hjälper PLGA-fiberns yta organoiden att förlängas (figur 2D). Under mognad måste organoidens kanter förbli intakta, eftersom det är ett gott tecken på friska celler och utveckling. annars måste ytterligare näringsämnen tillhandahållas13 (figur 2E). Tillväxten av organoiderna underlättas ytterligare genom omrörningen av organoidkulturen, eftersom detta förbättrar perfusion med näringsämnen.
Figur 2: Differentiering och mognad av cerebrala organoider . (A) Representativ bild av en iPSC-kultur vid 70% -80% sammanflöde. (B) Embryoidkroppar (EB) genererades och neuroepitelbildning inducerades fram till DIV7. EB var sedan inbäddade i membranmatrisen och differentierades ytterligare mot cerebrala organoider. (C) Organoider vid DIV10 som uppvisar distinkta spirande formationer. Organoider kan mogna ytterligare i membranmatrisen med antingen (D) dimple eller (E) sandwichinbäddning, här visas på DIV30. (F) Långtidsodling visar cerebrala organoider som växer till betydande storlekar (DIV70). Skalstapel = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Organoidens dimensioner och yttre morfologi kompletteras med en komplex arkitektur inuti organoiden. Efter fixering av vävnaden vid DIV7 efter det första differentieringssteget uttrycker celler i EB SOX2, en HMG-boxtranskriptionsfaktor som fungerar som en markör för multipotenta neurala stamceller21, samt parad proteinbox Pax-6, vilket indikerar neurala stamceller (figur 3). Omogna nervceller märkta med TuJ1 (klass III β-tubulin)22 kan redan ses utspridda i vävnaden.
I detta skede blir ett exempel på den självorganisation som dessa organoider går igenom uppenbar. Organisationen av radiella strukturer, kallade rosetter, är analog med neuralröret, med SOX2 + -celler i rosettcentret21 och PAX6 mot rosettperiferin. Dessa rosetter ger upphov till neuroner när de migrerar ut. Dessa strålande celler är initialt dubbelt positiva för neuralstammen/stamcellsmarkören Nestin23 och gliafibrillärt surt protein (GFAP), liknande det radiella glia som finns i neurogena områden i in vivo-hjärnan . När dessa migrerande neuroner mognar återspeglar cytoskeletala markörer denna förändring22. Den tidiga neurala differentieringsmarkören TuJ1 22 är synlig i rosettens inre cirkel och skiftar till mikrotubuliassocierat protein 2 (MAP2 )24, en neuronspecifik mognadsmarkör i periferin.
Figur 3: Embryoidkroppar vid DIV7 visar strukturell organisation och omogen karakterisering. Helmonterad immunhistokemibild av en EB vid DIV7. (A) En sammansatt bild av EB som visar (B) SOX2+ neurala rosetter, (C) omogna neuroner (TUJ1) spridda över EB, (D) neurala stamceller (PAX6) och (E) kärnor visualiserade av DAPI. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
När organoiderna åldras börjar organisationen och markörerna för de utvecklande neuronerna replikera fysiologiska förhållanden. Vid DIV30 kan många rosetter som ger upphov till neurogena regioner motsvarande den utvecklande hjärnan observeras25. Med DIV60 är dessa SOX2 + neurogena regioner obefintliga och ersätts av mogna MAP2 och NeuN26, en neurondifferentieringsmarkör och positiva neuroner (figur 4 och figur 5).
Figur 4: Organoider vid DIV120 visar mogen neuronal karakterisering. Immunhistokemisk bild av en organoidsektion vid DIV 120. (A) En sammansatt bild av sektionen som visar mogna neuronala markörer för (B) MAP2 (lila) och (C) NeuN (grön). (D) Kärnor visualiserades av DAPI. Skalstapel = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Digital dropp-PCR av DIV120-organoider. Digitala dropp-PCR-grafer som visar det absoluta uttrycksvärdet för (A) MAP2 (överst, blått) och (B) NeuN (nederst, grönt). Snedstreckade gula linjer separerar olika iPSC-linjer (A, B, C, etc.), och organoider har satsats ihop. N = 5. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Dessa cytoskeletala markörer kan användas tillsammans med andra postmitotiska markörer (som dubbelkortin27 och synapsin28) för att undersöka synaptisk plasticitet och andra åldersrelaterade nedgångar (figur 6), liksom ytterligare hjärnvävnad som astrocyter och glia (figur 7).
Figur 6: Exempel på synaptisk terminalanalys. Immunhistokemisk bild av en sektion av organoiden vid DIV 120. (A) En sammansatt bild av sektionen färgad för (B) MAP2, (C) dubbelkortin (DCX) och (D) synapsin I (SYN). (E) Kärnor visualiserades av DAPI. Skalstapel = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Bevis på gliautveckling. Immunhistokemisk bild av en sektion av organoiden vid DIV 120. A) En sammansatt bild av sektionen färgad för (B) joniserad kalciumbindande adaptermolekyl 1 (Iba1) och (C) NeuN. (D) Kärnor visualiserades av DAPI. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Reagens | Slutlig koncentration | Volym (totalt 50 ml) |
| DMEM-F12 | 50% | 25 ml |
| Neurobasalt medium | 50% | 25 ml |
| N2-tillägg (100x) | 1x | 0,25 ml |
| B27 Tillägg -/+ Vitamin A (50x) | 0,5x | 0,5 ml |
| Insulin | 0.25% | 12,5 μL |
| GlutaMAX (100x) | 1x | 0,5 ml |
| MEM-NEAA (100x) | 0,5x | 0,25 ml |
| HEPES (1 M) | 10 mM | 0,5 ml |
| Antibiotika/Antimykotiska (100x) | 1x | 0,5 ml |
| 2-β-merkaptoetanol | 50 μM | 17,5 μL |
| *OBS: vissa DMEM-F12 innehåller redan GlutaMAX, inget behov av att lägga till ytterligare. | ||
Tabell 1: Sammansättning av differentieringsmedier som används i denna studie.
Discussion
Den standardiserade bildningen av EBs är ett kritiskt steg i den reproducerbara omvandlingen av pluripotenta stamceller till hjärnorganoider. Kraftaggregeringen av stamceller i singulära vävnader kan variera beroende på geometrin hos de konkava brunnarna, sådddensitet och brunnsbehandling. Även om den nuvarande metoden citerar ett diameterområde på 500-600 μm efter 6 dagar, utesluter dessa diametrar inte andra diametrar med korrekt organoidbildning, eftersom många andra diametrar har visat sig framgångsrika. Varierande diametrar har dock visat sig påverka differentieringshastigheter och framgång29. För reproducerbarhetsändamål rekommenderas starkt diametervariationer under 50 μm20. Dessutom kan antalet neurala induktionsdagar förlängas från 6 till 10 dagar för att möjliggöra EB: erna att växa i diameter, eftersom användningen av SMAD-hämmare har visat sig effektivt producera och upprätthålla neuroepitelbildning efter bara 5 dagars exponering30. I frånvaro av SMAD-hämmare kan neural induktion ge inkonsekventa resultat, vilket kräver längre induktionsperioder. SMAD-hämmare som citeras i detta arbete är de mest effektiva, men andra dorsomorfin och TGF-β små molekyler kan användas vid deras effektiva koncentration.
Basalmembranmatrisen ger ett utmärkt substrat för tillväxt och kan administreras annorlunda. Tidiga användningar av matrisen inkluderade basalmembranet som en brunnsbeläggning31. Användningen av matrisen för inbäddning av vävnad visade sig dock förbättra differentiering och mognad i dessa vävnader32. För organoider har användningen av matrisen visat sig förbättra EB-differentiering till organoider, främja mognad och förlänga odlingsperioder33. Medan organoider fortfarande kan bildas utan matrisen, eftersom många grupper har strävat efter att uppnå en matrisfri vävnadskultur 34,35, har studier visat att de matrisinbäddade organoiderna har större chans att förlänga odlingstiderna och kräver mindre underhåll36. Den dimple metoden för inbäddning ger lika täckning av organoidytan, vilket säkerställer liknande diffusion, tillgång till näringsämnen och reproducerbar differentiering. Alternativt kan kupolinbäddning användas för att helt kapsla in organoiderna37.
Överföringen av EB: erna till membranmatrisgroparna är ett kritiskt steg. Även om en 1 ml pipettspets har en tillräckligt bred öppning för att överföra EB: erna, föredras en 200 μL spets för enkel överföring. Spetsarna på 200 μl måste skäras för att skapa en tillräckligt stor öppning, vilket säkerställer en jämn kant för att minska skjuvspänningen vid pipettering. Alternativt finns bredborrade 200 μL-spetsar för enkel överföring. Pipettering måste göras långsamt, eftersom snabb pipettering kan störa organoidperiferin och hindra korrekt tillväxt. Särskild uppmärksamhet måste ägnas åt att säkerställa att tillräckligt medium överförs för att ge näringsämnen. För lite medium riskerar att torka ut organoiden och orsaka nekros. Överföring av EB med för mycket odlingsmedia kan orsaka att matrisen blir för utspädd och misslyckas med att kapsla in organoiden säkert. Helst får matrisen inte spädas med mer än 50% för att säkerställa dess polymerisation och fungera som en ECM för EB: erna. Om inbäddningen misslyckas kan EB återställas och kapslas in igen. Re-inkapsling i den färska matrisen kan göras när som helst för att ge organoiden ytterligare stöd.
I likhet med matrisinbäddning för byggnadsställningar ger PLGA-fibrer ytterligare stöd för tredimensionell tillväxt. Ursprungligen införlivat för att producera långsträckta organoider och öka ytan38, har införlivandet av PLGA-fibrer gradvis identifierats som ett ytterligare verktyg för att förbättra organoiddifferentiering och mognad39. Eftersom fler laboratorier ser ut att minska användningen av matrisen eller avskaffa den helt och hållet, ger de självorganiserande egenskaperna hos organoider som stöds av de införlivade fibrerna tillräckligt med byggnadsställningar för tredimensionell vävnadsskapande och differentiering39. Här kombinerades båda metoderna för att öka chanserna för långsiktig kultur38,39. Inkorporeringen av fibrer under den initiala aggregeringen är kritisk, eftersom dessa kanske inte introduceras i ett senare skede. Efter centrifugering kommer kontroll av att ett par fibrer finns bland de aggregerade cellerna att säkerställa att en fiber införlivas i EB. Om det inte lyckas bör en mild aspiration av brunnen och omcentrifugering säkerställa blandning.
Ett annat kritiskt steg i organoidunderhåll är introduktionen av en orbital shaker för bättre mediaperfusion. I tidiga iterationer av organoidprotokoll användes en snurrande bioreaktor för att skapa agitation11. En orbitalskakare vid 90 rpm ger tillräcklig omrörning utan att förstöra matrisdroppen eller skada organoidmorfologin. Vissa grupper avstår från att använda matrisställningen men behåller shakeragitation för att ge en lämplig miljö34. Som med alla protokoll måste rotationshastigheten justeras beroende på skakapparaten för att minska mängden skjuvspänning. Om en kupolinbäddning valdes kunde en lutande skakapparat användas för att minska mängden skjuvspänning11,34.
Sammantaget ger integrationen av flera utvalda tekniker en robust metod för iPSC-härledd organoidbildning. Det finns flera sätt att skapa och underhålla organoider, men många av dem fokuserar på tidiga differentieringsbanor. I detta arbete kombinerades flera olika tekniker för att odla organoider under längre perioder, förbi differentieringsfasen och in i en mognadsperiod där åldrande fenotyper kan börja utvecklas. Att införliva dessa tekniker möjliggör långvarig mognad utan behov av exogena biologiska faktorer för att upprätthålla kulturerna, behålla självorganisationen och den naturliga utvecklingen av åldrandet.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Netherlands Organ-on-Chip Initiative, ett NWO Gravitation-projekt (024.003.001) finansierat av ministeriet för utbildning, kultur och vetenskap i Nederländernas regering. D.C.B. erkänner tack och lov det ekonomiska stödet från Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) i form av ett doktorandstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-β-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 1:4000 |
| 6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate | Greiner Bio-One | 657185 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Fisher Scientific | 136101 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | 46964 | cell detachment solution |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) | Gibco | 17504044 | |
| B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) | Gibco | 12587010 | |
| BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-685-125 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | With plate holders |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune Sendai Reprogramming Vector | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| ddPCR primers | human | MAPT | Bio-Rad | dHsaCPE192234 | |
| ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN) | Bio-Rad | dHsaCPE5052108 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Doublecortin (DCX) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8066 | 1:500 |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | no calcium, no magnesium |
| Eppendorf cups, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| Essential 6 | Gibco | A1516401 | |
| Essential 8 | Gibco | A1517001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | |
| Falcon tubes, 15 mL, conical | Greiner Bio-One | 188271-N | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| GlutaMax (100x) | Gibco | 35050038 | |
| Hemacytometer cell counter | Hausser scientific | 1490 | |
| HEPES Buffer | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LDN 193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| MAP2 | Abcam | ab32454 | 1:200 |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356230 | basement membrane matrix |
| MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader | Perkin Elmer | 1420 | luminometer |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NeuN | Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 AF647 | 1:100 |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | thermoplastic film sheet |
| PAX6 | Thermo Fisher Scientific | 42-6600 | 1:200 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments | Ethicon | J463 | |
| QX200 Droplet digital PCR system | Bio-Rad | 1864001 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Selleck Chemicals | S1049 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614/50 | |
| SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience | Invitrogen | 53-9811-80 | 1:100 |
| Synapsin I (SYN) | Calbiochem | 574777 | 1:200 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TUJ1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-80005 | Beta-3-tubulin; 1:500 |
| XAV939 | Tocris Bioscience | 3748 |
References
- Liu, G. H., et al. Aging Atlas: a multi-omics database for aging biology. Nucleic Acids Research. 49, 825-830 (2021).
- Ferrucci, L., et al. Measuring biological aging in humans: A quest. Cell. 19 (2), 13080 (2020).
- Mertens, J., Reid, D., Lau, S., Kim, Y., Gage, F. H. Aging in a dish: iPSC-derived and directly induced neurons for studying brain aging and age-related neurodegenerative diseases. Annu Rev Genet. 52, 271-293 (2018).
- Mertens, J., et al. Age-dependent instability of mature neuronal fate in induced neurons from Alzheimer's patients. Cell Stem Cell. 28 (9), 1533-1548 (2021).
- Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer's disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1141-1154 (2018).
- Fang, E. F., et al. Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 22 (3), 401-412 (2019).
- Hu, J. L., Todhunter, M. E., LaBarge, M. A., Gartner, Z. J. Opportunities for organoids as new models of aging. Journal of Cell Biology. 217 (1), 39-50 (2018).
- Choi, S. H., et al. A three-dimensional human neural cell culture model of Alzheimer's disease. Nature. 515 (7526), 274-278 (2014).
- Gonzalez, C., et al. Modeling amyloid beta and tau pathology in human cerebral organoids. Molecular Psychiatry. 23 (12), 2363-2374 (2018).
- Yoon, S. -J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Muratore, C. R., Srikanth, P., Callahan, D. G., Young-Pearse, T. L. Comparison and optimization of hiPSC forebrain cortical differentiation protocols. PLoS ONE. 9 (8), 105807 (2014).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2020).
- Goto-Silva, L., et al. Computational fluid dynamic analysis of physical forces playing a role in brain organoid cultures in two different multiplex platforms. BMC Developmental Biology. 19 (1), 1-10 (2019).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. Journal of Visualized Experiments. (68), e4327 (2012).
- Beers, J., et al. A cost-effective and efficient reprogramming platform for large-scale production of integration-free human induced pluripotent stem cells in chemically defined culture. Scientific Reports. 5 (1), 1-9 (2015).
- Wakao, S., et al. Morphologic and gene expression criteria for identifying human induced pluripotent stem cells. PLoS ONE. 7 (12), e48677 (2012).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
- Choy Buentello, D., Koch, L. S., Trujillo-De Santiago, G., Alvarez, M. M., Broersen, K. Use of standard U-bottom and V-bottom well plates to generate neuroepithelial embryoid bodies. PLOS ONE. 17 (5), 0262062 (2022).
- Ellis, P., et al. SOX2, a persistent marker for multipotential neural stem cells derived from embryonic stem cells, the embryo or the adult. Developmental Neuroscience. 26 (2-4), 148-165 (2004).
- Lee, S., et al. TuJ1 (class III β-tubulin) expression suggests dynamic redistribution of follicular dendritic cells in lymphoid tissue. European Journal of Cell Biology. 84 (2-3), 453-459 (2005).
- Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
- Soltani, M. H., et al. Microtubule-associated protein 2, a marker of neuronal differentiation, induces mitotic defects, inhibits growth of melanoma cells, and predicts metastatic potential of cutaneous melanoma. The American Journal of Pathology. 166 (6), 1841-1850 (2005).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2 (1), 67-77 (2006).
- Gusel'nikova, V. V., Korzhevskiy, D. E. NeuN as a neuronal nuclear antigen and neuron differentiation marker. Acta Naturae. 7 (25), 42-47 (2015).
- Rao, M. S., Hattiangady, B., Shetty, A. K. The window and mechanisms of major age-related decline in the production of new neurons within the dentate gyrus of the hippocampus. Aging Cell. 5 (6), 545-558 (2006).
- Meng, L., et al. A synapsin I cleavage fragment contributes to synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Aging Cell. 21 (5), 13619 (2022).
- Moon, S. H., et al. Optimizing human embryonic stem cells differentiation efficiency by screening size-tunable homogenous embryoid bodies. Biomaterials. 35 (23), 5987-5997 (2014).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Lee, S. -W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19 (3), 175-180 (2015).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Hocevar, S. E., Liu, L., Duncan, R. K. Matrigel is required for efficient differentiation of isolated, stem cell-derived otic vesicles into inner ear organoids. Stem Cell Research. 53, 102295 (2021).
- Birey, F., et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).
- Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Communications Biology. 4 (1), 1-15 (2021).
- Kaiser, A., Kale, A., Novozhilova, E., Olivius, P. The effects of Matrigel® on the survival and differentiation of a human neural progenitor dissociated sphere culture. The Anatomical Record. 303 (3), 441-450 (2020).
- Kakni, P., et al. Intestinal organoid culture in polymer film-based microwell arrays. Advanced Biosystems. 4 (10), 2000126 (2020).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
- Tejchman, A., Znój, A., Chlebanowska, P., Frączek-Szczypta, A., Majka, M. Carbon fibers as a new type of scaffold for midbrain organoid development. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 5959 (2020).
